UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Raja KUŽNIK
NOVI PRISTOPI ZA OBLIKOVANJE PEPTIDOV V RAZVOJU BIOLOŠKO AKTIVNIH UČINKOVIN
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Raja KUŽNIK
NOVI PRISTOPI ZA OBLIKOVANJE PEPTIDOV V RAZVOJU BIOLOŠKO AKTIVNIH UČINKOVIN
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
NEW APPROACHES FOR PEPTIDE DESIGN IN THE DEVELOPMENT OF THERAPEUTICS
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Hrvoje Petkovića.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: prof. dr. Polona JAMNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Hrvoje PETKOVIĆ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum predstavitve: 2. 7. 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 601.2 577.112.6(043.2)
KG biološke učinkovine, aktivne učinkovine, peptidi, sinteza peptidov, pripeti peptidi, interakcije med proteini, razvoj zdravil
AV KUŽNIK, Raja
SA PETKOVIĆ, Hrvoje (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN NOVI PRISTOPI ZA OBLIKOVANJE PEPTIDOV V RAZVOJU BIOLOŠKO AKTIVNIH UČINKOVIN
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 20 str., 1 pregl., 8 sl., 27 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Peptidi, predvsem speti in ciklični, so v zadnjem času vzbudili veliko zanimanja na področju razvoja biološko aktivnih učinkovin. Njihova prednost je majhna velikost, zmožnost prehajanja v celico, hkrati pa tudi visoka selektivnost vezave na tarčno molekulo ter zmožnost vplivanja na interakcije med proteini. Nove tehnologije na področju sintezne biologije omogočajo produkcijo velikih zbirk peptidnih molekul oz.
peptidnih knjižnic ter hitro in učinkovito izbiranje peptidov z najboljšo afiniteto vezave na tarčo. Podjetje PeptiDream, katerega tehnologija je podrobneje opisana v tem diplomskem delu, je izpopolnilo pristope pridobivanja in izboljšave pripetih peptidov, njihovi produkti pa vstopajo v klinične študije.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 601.2 577.112.6(043.2)
CX biologics, active substances, peptides, peptide synthesis, constrained peptides, protein interactions, drug development
AU KUŽNIK, Raja
AA PETKOVIĆ, Hrvoje (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI NEW APPROACHES FOR PEPTIDE DESIGN IN THE DEVELOPMENT OF THERAPEUTICS
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 20 p., 1 tab., 8 fig., 27 ref.
LA sl AL sl/en
AB Peptides, especially constrained and cyclic peptides, are receiving increasing attention in drug discovery. Their advantages are small size, intracellular activity, as well as high selectivity of binding to the target molecule, and the ability to effect interactions between proteins. New synthetic biology technologies enable the production of large constrained peptide libraries and the rapid and efficient selection of peptides with high target binding affinity. The company PeptiDream, whose technology is described in this diploma work, has already established an effective technology for obtaining and improving constrained peptides, and a number of products are already entering clinical trials.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VI KAZALO SLIK VI
1 UVOD ... 1
2 PEPTIDI KOT AKTIVNE UČINKOVINE ... 2
3 PREDNOSTI IN POTENCIALNE SLABOSTI PEPTIDNIH MOLEKUL ... 4
4 PRIPETI PEPTIDI ... 6
5 IZGRADNJA, PREPOZNAVA IN IZBOLJŠAVA PEPTIDNIH UČINKOVIN ... 8
5.1 DE NOVO SINTEZA PEPTIDOV ... 9
5.2 KNJIŽNICE POTENCIALNIH PRIPETIH PEPTIDOV IN NJIHOVO PREGLEDOVANJE ... 11
5.3 IZBOLJŠAVA POTENCIALNIH KANDIDATOV NA PODLAGI RAZMERJA MED STRUKTURO IN AFINITETO VEZAVE (SAR) ... 12
5.4 PRIHODNOST PODJETJA PEPTIDREAM ... 13
6 DELOVANJE PEPTIDOV NA INTERAKCIJE MED PEPTIDI ... 13
6.1 CuAAC PRIPENJANJE LINEARNEGA PEPTIDA ... 14
7 NAPREDEK ... 15
8 ZAKLJUČEK ... 17
9 VIRI ... 18
10 ZAHVALA ... 20
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Primerjava lastnosti majhnih molekul, bioaktivnih peptidov, pripetih peptidov in protiteles
6
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Oblike pripetih peptidov 7
Slika 2: Fleksicim, ki pripne na t-RNA naravne ali nenaravne aminokisline 10 Slika 3: Primerjava kodonske tabele z 20 naravnimi aminokislinami, ter
reprogramirane tabele z uvedenimi nenaravnimi aminokislinami, ki na koncu izgrajujejo pripete in ciklične peptide
11
Slika 4: mRNA prikaz (ang. mRNA display), generiranje knjižnic nestandardnih peptidov in selekcija potencialnih kandidatov z dobro afiniteto vezave na tarčno molekulo
12
Slika 5: SAR tehnika, kjer se spreminja po eno aminokislino v zaporedju in preverja ali se je s to spremembo zmanjšala ali povečala afiniteta vezave na tarčo
13 Slika 6: Prikaz spenjanja linearnega peptida z različnimi povezovalnimi členi in
nastajanja spetih peptidov 14
Slika 7: Speti peptid s CuAAC načinom pripenjanja 15
Slika 8: Nove spojine vodnice (ang. chemical entities) in biološka zdravila odobreni s
strani FDA 16
1 1 UVOD
Peptidni terapevtiki imajo že od odkritja inzulina leta 1920 pomembno vlogo v medicini kot zdravilo za zdravljenje diabetesa. Z razvojem novih tehnologij so peptidne učinkovine presegle endogene peptide človeškega izvora in tako lahko danes sintetiziramo veliko število peptidnih molekul, ki niso naravnega izvora ali pa so kemijsko modificirane. Tako nastajajo peptidi izjemno širokega razpona struktur, ki kažejo velik potencial za uporabo v biomedicini.
Glede na velikost teh spojin jih lahko postavimo med majhne molekule in proteine, kar jim omogoča številne prednostih, ki so značilne za obe skupini molekul. Najpogosteje se s peptidnimi učinkovinami vpliva na interakcije med proteini ali pa blaži pomankanje naravnih peptidov, če je le-teh premalo v telesu, ali pa sploh niso prisotni, zaradi okvare v metabolizmu (Lau in Dunn, 2017).
V zadnjih letih se je razvoj na področju peptidnih terapevtikov močno povečal predvsem med razvojnimi podjetji. Pokazale pa so se številne omejitve, kot so kratka razpolovna doba peptidne aktivne učinkovine v telesu, potreba po bolj agresivnem (intravenoznem) vnosu v telo, ipd. Pri tem so pripeti peptidi (angl. constrained peptides) pokazali številne prednosti, saj imajo izboljšano stabilnost zaradi modifikacij v njihovi strukturi (Ayoub in Scheidegger, 2006). Pomembno vlogo pri strukturi imajo nenaravne aminokisline, ki se jih vgrajuje s pomočjo novih tehnologij modificirane t-RNA in t.i. fleksicimov (angl. flexizymes). Ti novi nenaravni peptidi so pogosto ciklizirani, kar izboljša njihovo stabilnost, poleg tega pa lahko z neomejeno uporabo spremenjenih (nenaravnih) aminokislin pridobijo ogromno število peptidov, med katerimi se lažje najdejo primerni kandidati za zdravljenje z visoko afiniteto vezave na tarčno molekulo, in izboljšanimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi (Cary in sod., 2017). Številni peptidi pridobljeni na ta način so že v kliničnih študijah, tako se v prihodnih letih pričakuje velik porast vrednosti peptidnih zdravil na farmacevtskem trgu (Report Linker.
2021).
Eno izmed podjetjih, ki se je lotilo razvoja takih peptidnih molekul je PeptiDream.Inc, katerih pristop bom tudi opisala v nadaljevanju tega diplomskega dela. Lotili so se popolnoma novega načina pridobivanja peptidnih molekul »in vitro« in postavili sistem, ki temelji na prej omenjenih fleksicimih, ogromnih peptidnih knjižnicah in učinkoviti identifikaciji peptidnih učinkovin z visoko afiniteto vezave na ciljne tarče (Morisson, 2018).
2 2 PEPTIDI KOT AKTIVNE UČINKOVINE
Proteini in peptidi so sestavljeni iz aminokislin povezanih s peptidnimi vezmi (–CONH–) in so eni najpomembnejših gradnikov človeškega organizma. S stališča molekularne biologije in biokemije so zanimivi zaradi velike raznolikosti med aminokislinskimi zaporedji in njihove predvidljive konformacije. Poimenovanje peptidov se nanaša na njihovo dolžino; tako so oligopeptidi sestavljeni iz 10 ali manj aminokislin, peptidi iz 10 do 50 aminokislin, proteini pa obsegajo daljša aminokislinska zaporedja od 50 aminokislin (Sachdeva, 2016).
Po izvoru so lahko peptidi izolirani iz narave ali sintetizirani v sklopu peptidnih knjižnic (Sato in sod., 2006). Sprva so imeli peptidi naravnega izvora velika prednosti, saj so izpostavljeni naravni selekciji in imajo zato povečano in vivo stabilnost in učinkovitost. Danes pa se lahko konstruira in sintetizira veliko število peptidov, ki sestavljajo peptidne knjižnice.
To so zbirke, v katerih se nahaja do 1013 peptidnih molekul, ki so strukturno izredno raznolike, med njimi pa so kandidati z dobro afiniteto vezave na tarčne proteine (Sato in sod., 2006). Pri izgradnji peptidov v knjižnicah se aminokisline dodajajo postopoma in sistematično, velikokrat pa nosijo pripeto svojo DNA sekvenco (Sohrabi in sod., 2020).
V zadnjih letih raste zanimanje na področju peptidnih učinkovin s strani številnih farmacevtskih in biotehnoloških podjetij. Peptidi se lahko uporabljajo na mnogih področjih zdravljenja, kot so na primer proti alergijam, proti vnetjem, v diagnostiki, za potrebe v onkologiji, zdravljenje diabetesa, debelosti, kardiovaskularnih boleznih, artritisu, itd. Poleg tega ima uporaba peptidnih zdravil številne prednosti. So pogosto zelo učinkoviti, z visoko aktivnostjo in specifičnostjo vezave na željeno tarčo. Navadno ne kažejo interakcij z drugimi učinkovinami, se ne akumulirajo v tkivu in so ponavadi manj toksični. Poleg tega so zelo biološko in kemijsko raznovrstni, kar ponuja številne možne uporabe na področju terapevtikov (Ayoub in Scheidegger, 2006).
Prva uporaba peptidov za zdravljenje sega v leto 1920, ko so začeli zdraviti diabetes s prašičjim ali govejim inzulinom, pri čemer je doziranje zadostne količine normalnega proteina edini način za zdravljenje, ko človeško telo proizvaja premalo ali pa sploh nič potrebnega proteina. Z razvojem molekularne biologije po letu 1970 so sledila številna peptidna zdravila, kot so haemofilni globulin, rastni hormoni, eritropoetin, monoklonska protitelesa in virusni ali bakterijski proteini, kot cepiva. Ta sintetična cepiva izzovejo imunski sistem in s tem omogočijo boljšo obrambo če pride do infekcije. V zadnjih letih se izkorišča predvsem prednost peptidov zaradi njihove razlike v sposobnosti v prehajanju membran in endotelnih celic, zaradi česar je porazdelitev peptidov v telesu različna glede na vrsto tkiva. Tako se lahko peptidna zdravila tarčno usmerijo na specifično mesto, s tem pa prinašajo prednosti pred zdravljenjem z majhnimi molekulami (Dulal, 2010).
3
Bakteriocini, so primer peptidov, ki so v zadnjem času postali zanimivi zaradi protimikrobne aktivnosti. Sintetizirajo se na ribosomih Gram pozitivnih in Gram negativnih bakterij.
Delujejo na številne bakterije, glive, in viruse. Načeloma je vsaka bakterija sposobna proizvajati bakteriocine, saj jim pomagajo v kompeticiji s sorodnimi vrstami, kar vodi do številnih možnih antimikrobnih molekul, zanimivih v biotehnologiji in farmaciji. Prav specifičnost delovanja bakteriocinov, ki cilja določen patogen, jim daje potencialno prednost pred antibiotiki, ki jih danes uporabljamo za zdravljenje (Simons in sod., 2020).
Peptidi neribosomalnega izvora (NPRS), ki jih proizvajajo neribosomalne peptidne sintetaze (NPRSs) so trenutno ene najpomembnejših zdravil na trgu, primer teh je tudi penicilin.
Večina NPRS je ciklične oblike, kar jim omogoča dobro interakcijo z dodeljeno tarčno molekulo v celici. To rigidnost lahko pridobijo z oksidativno zamreženostjo (ang. oxidative cross-linking), npr. vankomicin, s heterociklizacijo kot pri penicilinu, ali najpogosteje s ciklizacijo npr. fengicin. Prav ciklizacijo, pa je težko doseči s kemijsko sintezo, zato se v industriji pogosto uporablja encime za ciklizacijo peptidnih molekul. Neribosomalni mehanizmi biosinteze navadno obsegajo velike multiencimske komplekse za postopno sinteze peptidov. Pri tem encimski kompleksi niso omejeni na 20 naravnih aminokislin, saj lahko ustavljajo tudi številne druge gradnike v sklopu postsinteznega preoblikovanja. Podobno kot navadne aminokisline se lahko v sestavo proteina dodajajo neproteinogene aminokisline, kot so na primer D-izomere, karboksilne skupine, in N- metilirani ostanki, poleg tega pa tudi uvedba heterocikličnih obročev in maščobnih kislin. Pogoste so tudi postsintezne modifikacije, kot so glikozilacija in oksidativno zamreženje, ki tudi poteka na NPRS encimskih kompleksih (Sieber in Marahiel, 2003).
Poznavanje delovanja encimskih kompleksov za biosintezo peptidov podaja številne informacije in razumevanja, kako v naravi poteka izgradnja strukturno-raznolikih proteinov.
Prav to znanje usmerja razvoj zdravilnih učinkovin in omogoča nove možnosti pridobivanja in modifikacije proteinskih molekul (Felnagle in sod., 2007). Trenutno je na trgu 197 peptidnih zdravil odobrenih s strani FDA. Več kot 800 jih je trenutno v kliničnih študijah (Bussines wire, 2020), kar kaže da postajajo čedalje pomembnejša skupina molekul in bodo najverjetneje v bližnji prihodnosti nadomestili številne organske farmacevtike (Sachdeva, 2016). Razvoja na področju peptidnih molekul se je lotilo tudi japonsko biofarmacevtsko podjetje PeptiDream Inc. ustanovljeno leta 2006, ki je postavilo celoten sistem pridobivanja velikega števila majhnih peptidov ter določanja njihove potencialne učinkovitosti. Sistem se imenje Peptide Discovery Platform System (PDPS) in omogoča hitro sintezo ogromnih knjižnic zelo raznolikih nestandardnih peptidnih molekul, ter hkrati identificira potencialno aktivne kandidate za različne oblike zdravljenja (Cary in sod., 2017). Podjetje Peptidream je eno najuspešnejših podjetij na področju odkrivanja bioloških aktivnih učinkovin iz skupine peptidnih molekul, zato bo njihova tehnologija v tem diplomskem delu podrobneje razložena.
4
3 PREDNOSTI IN POTENCIALNE SLABOSTI PEPTIDNIH MOLEKUL
V farmaciji se je zanimanje za razvoj zdravil na podlagi peptidnih molekul v zadnjih letih izredno povečalo, vendar še zdaleč ni blizu obsegu raziskav na področju majhnih molekul in protiteles. Z razvojem novih sistemov iskanja kandidatnih peptidov za zdravljenje, kot je na primer PDPS (Peptide Discovery Platform System) podjetja Peptidream, pa se število peptidnih molekul, ki vstopajo v klinične študije hitro povečuje. Kljub temu ostajajo prednosti in slabosti, ki opredeljujejo posamezne tipe biološko aktivnih učinkovin, ki so predvsem odvisne od njihove velikosti, naboja, in drugih lastnosti (Cary in sod., 2017). Podrobneje so te razlike predstavljene v Preglednici 1.
Peptidne molekule so se izkazale kot visoko biološko-aktivne učinkovine, z visoko selektivnostjo, saj tvorijo malo nespecifičnih vezav. Poleg tega je pri peptidih verjetnost interakcije z drugimi učinkovinami majhna. Peptidi se ne nalagajo v tkivu in s tem predstavljajo manjšo nevarnost za potencialno toksičnost. Ena najpomembnejših prednosti peptidov je njihova funkcionalna in strukturna raznolikost, ki ju je enostavno preučevati in optimizirati, ter s tem vplivati na učinkovitost potencialnega peptida na zdravljenje (Ayoub in Scheidegger, 2006). Omejitve peptidnih molekul so predvsem vezane na njihovo stabilnost v telesu, saj jih proteaze lahko hitro razgradijo. Tudi iz telesa se lahko hitro izločijo in imajo tako kratko razpolovno dobo. So slabo dostopni celicam, saj imajo omejen dostop do intracelularnega prostora, lahko pa nosijo tudi potencialno imunogene sekvence (Sato in sod., 2006). Prav to prinaša številne izzive na področju formuliranja peptidnih zdravil. Tudi postopek sinteze je lahko drag, pri čemer omejena topnost in združevanje peptidov prav tako povzročajo težave. Tarče peptidov so omejene na bioaktivne peptide, imajo pa tudi slabšo moč delovanja v primerjavi z protitelesi (Ayoub in Scheidegger, 2006).
Majhne molekule imajo v razvoju zdravil najdaljšo zgodovino, saj jih je relativno lahko bio- sintetizirati, formulirati in vnesti v telo (večinoma oralno). Njihova prednost je tudi naravna permeabilnost, kar jim omogoča enostaven vstop v celice. Njihova majhna molekulska masa pa prinese tudi številne neželene učinke, saj se lahko vežejo na veliko število različnih molekul in tako delujejo tudi izven tarčnega mesta, to pa privede do toksičnosti in nepričakovanih bioloških učinkov. Poleg tega majhne molekule ne morejo tvoriti večjega števila vezav na tarčo, zaradi česar ne morejo razdreti interakcij med peptidi (PPI) (Cary in sod., 2017).
Protitelesa imajo od vseh treh skupin najbolj specifično vezavo, vendar je delovanje zaradi njihove velikosti omejeno na ekstracelularne tarče (Sato in sod., 2006). Problem protiteles je tudi, da se jih lahko vnese v telo le z injiciranjem, dražja in zahtevnejša pa je tudi njihova
5
proizvodnja. V zadnjih letih se je število zdravil na osnovi protiteles izredno povečajo, saj so trenutno ena najbolj učinkovitih in dobičkonosnih zdravil (Cary in sod., 2017).
Peptidi imajo visoko aktivnost, ki je primerljiva s protitelesi, a še vedno predstavljajo izzive pri produkciji končnega izdelka in administraciji (Cary in sod., 2017). Z novimi metodami na področju sinteze in modifikacij peptidov se izboljšuje njihov potencial, saj se jih lahko oblikuje tako, da imajo daljšo razpolovno dobo v plazmi in v nekaterih primerih tudi nizko imunogenost. Vse to vodi do povečanega vlaganja v razvoj na področju peptidnih učinkovin (Sato in sod., 2006).
Bioaktivni peptidi, ki so izolirani iz narave, so imeli v začetku številne prednosti pred peptidi proizvedenimi iz peptidnih knjižnic (to so velike zbirke peptidnih sekvenc), saj so številni zviti (kar jim daje stabilnost), so odporni pred proteazami, imajo ključna mesta za vezavo na receptorje ali tvorbo PPI (ang. protein-protein interaction). Peptidi iz knjižnic pa v zadnjih letih zaradi novih metod presejalnih testov, pridobivajo zanimanje v industriji kot biološko aktivne učinkovine (Sato in sod., 2006).
Še dodatne prednosti prinašajo t.i. pripeti peptidi (ang. constrained peptidi), ki so za razliko od linearnih peptidov (ti se v bioloških sistemih hitro zvijejo in zgubijo možnost delovanja), že predhodno zviti in s tem stabilnejši ter imajo izboljšane fizikalno-kemijske lastnosti (Morrison, 2018). Pripete in ciklične peptide lahko, podobno kot majhne molekule, pridobimo s kemijsko sintezo. Pri tem je možna optimizacija z običajnimi kemijskimi pristopi, pri čemer se lahko modulira in optimizira katerakoli biološka in fizikalna lastnost (npr. afiniteta vezave, specifičnost, proteolitska stabilnost, topnost, itd.). Z različnimi tehnikami presejalnih testov so dokazali, da se lahko pripeti proteini selektivno vežejo na površino peptida, ki je pomembna za interakcijo med proteini. To jim daje prednost pred majhnimi molekulami in jih naredi primerljive s protitelesi (Vinogradov in sod., 2019).
6
Preglednica 1: Primerjava lastnosti majhnih molekul, bioaktivnih peptidov, pripetih peptidov in protiteles (prirejeno po Shen in Corey, 2017 in Cary in sod., 2017).
4 PRIPETI PEPTIDI
Tako imenovani »pripeti peptidi« (ang. constrained peptids) predstavljajo novo kategorijo peptidnih molekul, ki so glede na velikost zapolnili vrzel med majhnih molekulami in monoklonskimi protitelesi (primerjava se nahaja v Preglednici 1). Običajno so veliki od 600- 25000 Da. To so v večini makrociklični in »speti« peptidi, ki so plod dolgoletnega razvoja na področju peptidov, pri čemer jim spremenjena struktura prinaša številne fizikalno-kemijske prednosti pred navadnimi peptidi (Cary in sod., 2017).
Številna podjetja so se lotila razvoja pripetih peptidov z namenom, da bi povečali njihovo stabilnost in s tem dosegli znotrajcelične tarče, omogočili oralno doziranje, itd., vendar večina raziskovalnih skupin ni razvila takšnih molekul. Uspelo je le redkim, ki pa so takoj vzbudili veliko zanimanja s strani farmacevtskih podjetji in eno izmed takih je podjetje PeptiDream (Morrison, 2018). Odkrili so, da imajo peptidi zviti v obroč izboljšane lastnosti v primerjavi z linearnimi peptidi, saj lažje vstopajo v celico. Primer takega naravno zvitega proteina je
Majhne
molekule Bioaktivni peptidi Pripeti peptidi Protitelesa
Molekulska masa <600 500-6000 600-2500 >150000
Aktivnost srednje-
visoka visoka- zelo visoka zelo visoka zelo visoka
Selektivnost relativno
nizka visoka zelo visoka zelo visoka
Znotrajcelična tarča možna običajno ni možna možna ni možna PPI inhibicija težka,
ampak možna
možna možna možna
Stabilnost v plazmi nizka-
srednja zelo nizka- nizka srednje- visoka zelo visoka
Oralno zaužitje možna običajno ni možna možna ni možna
Toksičnost/ stranski učinki visoka nizka nizka nizka
Proizvodni stroški nizka nizka- srednja nizka-srednja visoka Mesto delovanja ekstra- in
intra- celularna
ekstra- in intra-
celularna ekstra- in intra-
celularna ekstracelularna
Način vnosa ponavadi
oralno intravenozno, subkutalno, intratekalno, intravitralno
primarno intravenozno in subkutalno
7
vankomicin, antibiotik, ki se uporablja za zdravljenje bakterijskih infekcij. Tako so raziskovalci s sintezo in vitro ustvarili ciklične proteine, na podlagi že poznanih mehanizmov, ki potekajo v naravi in začeli razvijati makrociklične peptide, sestavljene iz nenaravnih aminokislin (Maarseveena in Timmerman, 2017).
Proteini, ki vstopajo v celice so majhni ciklični peptidi, ki jim uspe prečkati celično membrano. Ti so lahko uporabljeni kot nosilci majhnih molekul v celico, ali pa v analitske namene kot sonde. Lahko tudi delujejo na PPI, interakcije med peptidi (ang. protein-protein interaction), saj so takšni peptidi večji od majhnih molekul (npr. sekunadnih metabolitov), a kljub temu vstopijo v celico in tvorijo več povezav na ciljne proteine in s tem onemogočijo PPI (Maarseveena in Timmerman, 2017).
Konstrukcije pripetih molekul so lahko različne, kot vidimo na Sliki 1. Pripeti peptidi so različnih velikosti in oblik. Najpreprostejši so sestavljeni iz enega obroča aminokislin (Slika 1, a). Speti peptidi so sestavljeni iz α- heliks peptidov, ki so stabilizirani z ogljikovodikovimi povezavami (1, b). Poznamo pa še biciklične (ang. bicycle) peptide (1, c), ki so sestavljeni iz dveh aminokislinskih zank, ki so pripete s kemijskim konektorjem, ki se nahaja v sredini. Ta se ponavadi uporablja za konjugante peptidnih zdravilnih učinkovin kjer se z linkerjem na peptidno molekulo pripne molekula npr. toksin (Morrison, 2018).
Slika 1: Oblike pripetih peptidov. a) klasični pripet peptid, b) speti peptid, c) bicliklični peptid (prirejeno po Morrison, 2018).
Osnova za izgradnjo pripetih peptidov so velike makrociklične knjižnice (vsebujejo lahko do 1013 aminokislinskih zaporedij) v katerih so pri sestavi peptidov uporabljene tudi nenaravne aminokisline, ki se jih doda s tehniko RaPID (ang. Random non-standard Peptide Integration Discovery). Tako se v knjižnicah nahajajo tudi spojine/peptidi, ki imajo lastnosti majhnih molekul in peptidov. Postopki, kot so mRNA prikaz skupaj s presejalnim testom knjižnic (ki bodo opisani v nadaljevanju), imajo veliko sposobnost formiranja potencialnih vodnic
8
pripetih molekul, od katerih bodo nekatere prav gotovo vstopile v klinične študije (Maarseveena in Timmerman, 2017).
5 IZGRADNJA, PREPOZNAVA IN IZBOLJŠAVA PEPTIDNIH UČINKOVIN Številna podjetja so se lotila konstrukcije pripetih peptidov z namenom, da bi bili ti bolj stabilni, dosegali znotrajcelične tarče, njihovo doziranje pa bi bilo možno oralno. Ker pa se je ciklizacija peptidov izkazala za zelo zahtevno, mnogim to ni uspelo. Nekaj inovativnih mladih podjetij je z vzpostavitvijo učinkovitih modelov dejansko prišlo do peptidnih molekul z visokim potencialom za zdravljenje. Eno izmed takih podjetij je PeptiDream Inc. (Morisson, 2018).
PeptiDream je japonsko biofarmacevtsko podjetje ustanovljeno leta 2006 z registriranim sistemom odkrivanja peptidov, PDPS (angl. Peptide Discovery Platform System), ki proizvaja izredno raznolike in po številu obsežne (trilijone) knjižnice nestandardnih peptidov z zmožnostjo prepoznavanja visoko učinkovitih in selektivnih kandidatov za vezavo na tarčno molekulo. Podjetje si prizadeva biti vodilno na področju odkrivanja in razvoja zdravil na področjih, kjer medicina še nima ustreznih učinkovin za uspešno zdravljenje bolezni. Poleg peptidnih terapevtikov pa s PSPS platformo razvijajo tudi številne zdravilne učinkovine, ki so po zgradbi majhne molekule (PeptiDream Inc., 2021 ).
Platformo PDPS sestavljajo tri ključne tehnologije:
Fleksicimi in PDTS (Peptide Discovery Translation System)
Fleksicime je odkril ustanovitelj podjetja Hiroaki Suga in omogočajo pripenjanje skoraj katerekoli naravne ali nenaravne aminokisline na t-RNA. PDTS je »in vitro«
sistem za translacijo in transkripcijo, ki omogoča ribosomalno sintezo peptidov na podlagi šablone. Tako lahko in vitro povsem brez celice tak sistem uporabi do 20 naravnih aminokislin, medtem ko lahko skupaj s fleksicimskim sistemov zgradi peptide iz 400 naravnih ali nenaravnih aminokislin. Prav to pa je ključno za izgradnjo peptidnih knjižnic s skoraj neomejenim številom kemijskih struktur.
Ciklizacija in modifikacijske tehnike
Ciklizacija in spenjanje omogočajo oblikovanje pripetih (angl. constrained) peptidov, ki so za razliko od linearnih veliko bolj rigidni, z boljšo afiniteto vezave in selektivnostjo in bolj stabilni v »in vivo« pogojih. Ostale modifikacijske tehnike (kot so pripenjanje določenih skupin na protein, ipd.) prav tako izboljšajo lastnosti peptidne molekule. Pomembno prednost daje identifikacija potencialnih izboljšanih molekul, ki je zelo pospešena v primerjavi z drugimi pristopi, kar vodi do hitrega razvoja in pridobivanja učinkovitih kandidatnih peptidov.
9 PD metoda prikaza (ang. PD display)
PD (PeptiDream) metoda prikaza omogoča preverjanje potencialnih kandidatov iz ogromnih knjižnic peptidov s katerokoli biološko tarčo. Predhodni sistem pregledovanja knjižnic je temeljil na osnovi fagov, tako imenovana fagna predstavitev (ang. phage display). Ta način je sicer omogočil pregledovanje velikih knjižnic peptidov, a so bili ti omejeni na maksimalno 20 naravnih aminokislin in na linearne peptide, problem pa predstavlja tudi drugačen kodonski zapis fagnega gostitelja (bakterije) v primerjavi z evkariontskim (Sohrabi in sod., 2020). PD metoda je (za razliko od fagne predstavitve) poenostavljena, bolj stroškovno ugodna, kandidatne molekule se prav tako učinkovito vežejo na tarčo, njihova produkcija pa je hkrati izredno hitra. PD metoda temelji na mRNK metodi prikaza (ang. mRNA dispaly), ki je opisana v nadaljevanju (Cary in sod., 2017).
5.1 DE NOVO SINTEZA PEPTIDOV
Podjetje PeptiDream je svoj razvoj usmerilo v nov način sinteze, ki dovoljuje vgradnjo naravnih in nenaravnih aminokislin v peptidno zaporedje pripetih peptidov in s tem reprogramiran genetski kod. Za ta povsem nov pristop sta ključni dve novi tehnologiji in sicer, rekonstrukcija translacije in fleksicimi.
Za in vitro translacijo je potrebna mešanica nukleotidov, soli in pufrov skupaj z makromolekularnimi komponentami (ribosomi, translacijskimi faktorji, aminoacil t-RNA sintetazami (ARS) in nukleinskimi kislinami). Naloga ARS je pripenjanje aminokisline na ustrezno t-RNA. Če določene ARS ni v mešanici se en tip t-RNA ne bo izgradil. Tako lahko tega zamenjajo s t-RNA, ki je že predhodno nabita z nenaravno aminokislino (Ottl in sod., 2019).
Pri pripenjanju različnih (tudi nenaravnih) aminokislin imajo ključno vlogo fleksicimi. To so t-RNA acilacijski ribocimi (ang. tRNA acylation ribozymes) (Goto in sod., 2011), ki prepoznajo aminokisline z aktivirano karboksilno skupino in jih prenesejo na 3' konec tRNA (Slika 2). Na te nenaravne aminokisline so že predhodno dodane skupine, ki jih ne najdemo na 20 naravnih aminokislinah (Ottl in sod., 2019).
10
Slika 2: Fleksicim, ki pripne na t-RNA naravno ali nenaravno aminokislino (prirejeno po Ottl in sod., 2019).
Način sinteze z uporabo fleksicimov privede do ogromnega števila strukturno raznolikih peptidnih molekul, katerih zgradba in sestava ni omejena le na peptide, ki bi jih našli v naravi temveč ponuja številne, do zdaj še ne poznane, kombinacije aminokislin. Primer spremenjenega genskega koda kaže Slika 3, pri čemer kodoni, ki običajno kodirajo narave aminokisline, kodirajo nenaravne ali spremenjene aminokisline. Pri tem se v peptidno zaporedje vgrajujejo aminokisline z nenaravnimi stranskimi verigami, D-amino kisline, N- metilizirane aminokisline, peptoidi (stransko verigo aminokislinskega ostanka imajo vezanega na dušikov atom, namesto na alfa-ogljikov atom, kot je to navadno) in aminokisline, ki omogočajo zamreženje (ang. crosslinking). Ti peptidi so lahko linearni, speti ali makrociklični, slednji pa so se izkazali za najboljše kandidate kot biološko aktivne učinkovine (Cary in sod., 2017).
11
Slika 3: Primerjava kodonske tabele z 20 naravnimi aminokislinami, ter reprogramirane tabele z uvedenimi nenaravnimi aminokislinami, ki na koncu izgrajujejo pripete in ciklične peptide (prirejeno po Cary in sod., 2017).
5.2 KNJIŽNICE POTENCIALNIH PRIPETIH PEPTIDOV IN NJIHOVO PREGLEDOVANJE
Peptidne knjižnice so zbirke, ki vsebujejo ogromno število ( do 1013 ) raznolikih peptidov. Ti peptidi imajo pripeto svojo DNK sekvenco (ang. DNA encoded), kar pospeši njegovo identifikacijo (Heins in Winter, 2015). Povezava med peptidom in nukleinsko kislino, ki nosi zapis o njegovi sestavi, se vzpostavi med translacijo. Najpogostejši način, ki omogoči to povezavo je mRNA prikaz (ang. mRNA display), ki ga prikazuje Slika 4. Antibiotik puromicin se pripne na mRNA verigo s kovalentno vezjo. Nato se med in vitro translacijo, ko ribosom pride do stop kodona, novo sintetizirani peptid prenese na puromicin (4, a), ki deluje kot linker med mRNA in peptidom. Nato se ustvari tioeterski most (ang. thioether bridge) med N terminalnim ClAcPhe koncem in C terminalnim cisteinskim ostankom, ki tvori ciklično obliko peptida (4, b). Sledi reverzna transkripcija mRNA, z nastankom hibridne RNA/DNA, ki daje nukleinski kislini večjo stabilnost (drugače bi se lahko mRNA vezala s proteini, majhnimi molekulami ipd., ki se nahajajo v mešanici) (4, c). Iskanje peptidov z dobro afiniteto vezave (ang. affinity panning) poteka z imobiliziranimi tarčami na trdnem nosilcu (4, d). Z elucijo se odstrani iz kolone tiste peptide, ki so imeli dobro afiniteto vezave.
Nato se s PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) tehniko pomnoži sekvence peptidov, ki so imeli dobro vezavo in izvrši translacija oz. ponovno oblikovanje peptidov (4, e) (Ottl in sod., 2019). Ta postopek selekcije se večkrat ponovi ter s tem izbere peptide z najboljšo afiniteto vezave (Cary in sod., 2017).
12
Slika 4: mRNA prikaz (ang. mRNA display), generiranje knjižnic nestandardnih peptidov in selekcija potencialnih kandidatov z dobro afiniteto vezave na tarčno molekulo (prirejeno po Ottl in sod., 2019).
5.3 IZBOLJŠAVA POTENCIALNIH KANDIDATOV NA PODLAGI RAZMERJA MED STRUKTURO IN AFINITETO VEZAVE (SAR)
Kandidate z visoko močjo in specifičnostjo vezave na tarčo se nato poskuša še izboljšati. Pri tem upoštevajo podatke vezave v povezavi z zgradbo peptida (korelacija med strukturo in afiniteto vezave) (ang. SAR-structure affinity relationship). Kandidatnemu peptidu spreminjajo aminokislinsko zaporedje enega za drugim in primerjajo z ELISA testom ali se je s tem afiniteta na tarčo še povečala ali zmanjšala. Primer kaže Slika 5, kjer so potencialnemu cikličnemu peptidu, dolgemu 15 aminokislin, z missense mutacijo zamenjali vsako aminokislino v zaporedju z L- alaninom (5, b). Z ELISA testom ( 5, c) so nato primerjali vseh 15 peptidov in ugotavljali ali je zamenjava aminokisline spremenila afiniteto vezave na tarčno molekulo (5, d). S tem so našli mesta v aminokislinskem zaporedju, ki so pomembna za vezavo na tarčo. S takimi pristopi se lahko zelo hitro in enostavno ugotovi kateri deli so ključni za vezavo ter pridobivanje visoko afinitetnih peptidov v zelo kratkem času (1 do 2 mesecih) (Cary in sod., 2017).
Z modifikacijami aminokislinskega zaporedja se lahko izboljšajo tudi fizikalno-kemijske lastnosti peptida. SAR tehnika omogoča razumevanje kje lahko pride do adicije določene skupine na peptid, brez da bi se s tem drastično zmanjšala afiniteta vezave na tarčno molekulo. Z vezavo raznih stranskih skupin, N-metiliziranih aminokislin, D aminokislin in ciklizacijo se lahko zmanjša polarnost peptida in s tem izboljša permabilnost čez membrano celic. Povečana stabilnost peptida v organizmu, ki jo prav tako lahko izboljšamo z omenjenimi modifikacijami, pa omogoča oralno dostavljanje peptida, kot biološko aktivne
13
učinkovine (Sohrabi in sod., 2020). Lažja administracija daje peptidom, spremenjenimi s pripenjanjem, ciklizacijo ali dodajanjem stranskih skupin, veliko prednost pred klasičnimi peptidi naravnega izvora (Cary in sod., 2017).
Slika 5: SAR tehnika, kjer se spreminja po eno aminokislino v zaporedju in preverja ali se je s to spremembo zmanjšala ali povečala afiniteta vezave na tarčo (prirejeno po Cary in sod., 2017).
5.4 PRIHODNOST PODJETJA PEPTIDREAM
Podjetje PeptiDream uspešno sodeluje s farmacevtskimi podjetji kot so Novartis, AstraZeneca, Sanofi, Bayer, GSK, Merck, na področju raziskav in razvoja zdravilnih, širi svojo platformo PDPS s prodajo licenc o uporabi te tehnologije in razvija ter izboljšuje PDPS.
Trenutno je 121 peptidnih molekul podjetja PeptiDream vključenih v predklinične študije in dva v 1. fazo kliničnih študij (PeptiDream Inc., 2021).
Oktobra 2020 so se povezali s podjetjem Fujitsu z namenom pospešitve razvoja terapevtikov za zdravljenje infekcije s SARS-Cov-2. Tako je PeptiDream svoj sistem PDPS povezal s tehnologijo Digital Annealer, računalniško tehnologijo, ki hitro rešuje probleme kombinatorne optimizacije. Pri tem nameravajo in silico prepoznavanje stabilnih konformacij cikličnih peptidov skrajšati na 12 ur in izredno pospešiti odkrivanje novih zdravilnih učinkovin (Fujitsu Limited in PeptiDream Inc., 2020). Podobno tudi druga farmacevtska podjetja svoj razvoj usmerjajo v in silico raziskave. Računalniške algoritme uporabljajo za dizajniranje peptidov, katerih učinkovitost nato preverijo eksperimentalno (Usmani in sod., 2018).
6 DELOVANJE PEPTIDOV NA INTERAKCIJE MED PEPTIDI
Interakcije med proteini pomembno prispevajo k celotni celični funkciji in organizaciji. Prav zato inhibicija protein- protein interakcij predstavlja pomemben način manipulacije bioloških procesov in s tem pomembno strategijo pri razvoju novih terapevtikov. Tu pa imajo velik
14
potencial peptidne molekule, predvsem tiste stabilizirane s ciklizacijo ali pripenjanjem (Robertson in Spring, 2018).
PPI (protein-protein interakcije) pogosto vključujejo velika območja interakcije, ki so običajno slabo definirana, zaradi česar se na te interakcije težko vpliva s majhnimi molekulami. Za dobro alternativo so se pokazali inhibitorji na osnovi peptidov, ki izvirajo iz pripadajočega vezavnega epitopa. Če so ti peptidi linearni imajo lahko posledično slabšo afiniteto vezave, ki pa se lahko zelo izboljša z zamreženjem. Za tako zamreženje oz. spenjanje se uporabljajo številne različne tehnike z namenom stabiliziranja sekundarne strukture in izboljšanja bioaktivnosti, v obliki cikličnega ali bicikličnega peptida (Glas in sod., 2014). Pri tem se poslužujejo vstavljanja nenaravnih aminokislin, D-aminokislin, β-aminokislin, uvajanja N-metilacije, izoster z amidnimi vezmi, … (Robertson in Spring, 2018) in utrjevanja vezi s pomožnimi vodikovimi vezmi in zamreženja z α- metiliranimi aminokislinami v α- heliksu in β-strukturah (Glas in sod., 2014). Tako se lahko z različnimi povezovalnimi členi (ang. linkers) iz enega sintetiziranega linearnega peptida ustvari knjižnica različnih spetih peptidov (Slika 6) (Robertson in Spring, 2018).
Slika 6: Prikaz spenjanja linearnega peptida z različnimi povezovalnimi členi in nastajanja spetih peptidov (prirejeno po Robertson in Spring, 2018).
6.1 CuAAC PRIPENJANJE LINEARNEGA PEPTIDA
Za eno zanimivejših in učinkovitejših tehnik dvokomponentnega pripenjanja oz. spenjanja peptidov se je izkazala reakcija CuAAC. Reče se ji tudi sponka (ang. staple) z dvojnim klikom, pri čemer bis-alkinilna vezava reagira z aminokislino, sestavljeno iz dveh azidov in tvori triazole (Slika 7). Pri tem lahko z različnimi linkerji (linearnimi, alifatskimi ali aromatskimi), vplivajo na številne različne protein-protein interakcije (Robertson in Spring, 2018).
15
Slika 7: Speti peptid s CuAAC načinom pripenjanja (Iegre in sod., 2018)
Primer so spiralno (ang. helical) zviti peptidi, ki delujejo na interakcijo med transkripcijskim faktorjem HNF1β in jedrnim transportnim proteinom transportin-α. Ta PPI je ključna pri razvoju raka na jajčnikih. HNF1β vsebuje sekvenco za jedrno lokalizacijo. Kratka peptidna sekvenca se veže na transporter in omogoči prenos v jedro celice. Zviti peptid, ki deluje na to PPI posnema sekvenco za jedrno lokalizacijo iz HNF1β in tako prehiti vezavo na transportin- α. Tako se v jedro celice prenese zviti protein namesto HNF1β ter mu s tem prepreči delovanje v jedru celice (Iegre in sod., 2018).
7 NAPREDEK
V zadnjih nekaj letih se je zgodil velik porast na področju razvoja peptidnih zdravil, kar se kaže v povečanju števila raziskovalnih skupin, ki se ukvarjajo s to temo, pa tudi ustanavljanje številnih podjetij, ki se osredotočajo le na razvoj peptidnih molekul. Prav tako se je povečalo zanimanje iz strani velikih farmacevtskih podjetij. Leta 2018 je bilo na trgu skupno kar 60 zdravil peptidnega izvora, več kot 150 jih je bilo v kliničnih raziskavah (Lau in Dunn, 2018).
FDA je med letoma 2015 in 2019 odobrila 208 novih zdravil, od tega 85 bioloških zdravil, katerih je bilo 15 peptidnih molekul (razvidno iz Slike 8). Odobrene peptidne molekule so izjemno raznolike, saj med njimi najdemo majhne peptide (Ninlar®, Macrilen®), velike peptide (Tymlos®, Lixisenatide®), ciklične peptide (Vyleesi®), peptide sestavljene iz izključno D aminokilsin (Parsabiv®), itd. Večina teh peptidnih molekul je namenjena zdravljenju raka, kardiovaskularnih boleznim pa tudi metabolnih in hormonskih obolenj (Torre in Albericio, 2020).
16
Slika 8: Nove spojine vodnice (ang. chemical entities) in biološka zdravila, odobreni s strani FDA (prirejeno po Torre in Albericio, 2021).
Izjemno rast kažejo tudi raziskave trga, saj je bila za leto 2020 vrednost globalnega trga peptidnih terapevtikov ocenjena na 28.510 milijonov dolarjev, do leta 2026 pa naj bi se ta povečala na 51.360 milijonov dolarjev, kar pomeni 9,66% letno stopnjo rasti. Razloga za tako hitro rast sta povečana razširjenost rakavih in metabolnih obolenj ter povečano vlaganje v raziskave na tem področju (Report Linker. 2021).
V letu 2020 se je začel razvoj peptidnih molekul tudi na področju zdravljenja COVID 19.
Tako je bilo že maja 2020 v razvoju 21 peptidnih zdravil in 15 sintetičnih peptidov za namen zdravljenja akutnega respiratornega distresnega sindroma (ARDS) in drugih respiratornih obolenj povezanih z okužbo SARS-Cov-2 (Report Linker. 2021).
17 8 ZAKLJUČEK
Peptidne molekule danes prinašajo številne prednosti na področju zdravljenja. Zaradi svoje majhne velikosti lahko vstopajo v celice, hkrati pa so visoko specifične pri vezavi na tarčno molekulo. Tako združujejo najpomembnejši lastnosti majhnih molekul in protiteles – biodostopnost in specifičnost. V zadnjih letih se je razvoj na področju peptidnih molekul izredno povečal, saj sinteza de novo konstruiranih peptidnih molekul omogoča pridobivanje povsem novih peptidov, ki jih v naravi sicer ne bi našli. Peptidne knjižnice omogočajo sintezo ogromnega števila peptidov sestavljenih iz praktično neomejenega števila kombinacij številnih aminokislin, učinkovite metode selekcije (presejalnih testov) pa zagotavljajo izbor kandidatov za selekcijo tarčne biološko-aktivne molekule. Ti novi pristopi omogočajo izredno hitro produkcijo peptidov in ovrednotenje potenciala nekega peptida, posledično pa tudi hiter razvoj biološko aktivnih učinkovin za namene zdravljenja.
Možnost izredno hitre sinteze in identifikacije ustrezne peptidne učinkovine se je pokazala tudi v letošnjem letu, ki je bilo zaznamovano z virusom SARS-Cov-2. Že v nekaj mesecih po izbruhu virusa, so v klinične študije vstopila biološka zdravila, ki temeljijo na peptidih in so bila proizvedena z novimi sinteznimi metodami. Z izboljšavami teh metod pa bo v prihodnje možna produkcija ne le visoko specifičnih ampak tudi stabilnih molekul, ki bodo, kot kažejo napovedi, v čedalje večji meri zamenjale zdravila, ki temeljijo na majhnih molekulah.
Podobno kot pri podjetju PeptiDeam, katerega tehnološki pristopi so v tem diplomskem delu podrobneje opisani, se razvoj peptidnih molekul čedalje bolj opira na računalniške algoritme.
PeptiDream namerava svojo PDPS platformo povezati z digitalnimi bazami podatkov o peptidih ter s tem del razvoja prenesti iz in vitro sistemov v in silico. Tako bodo lahko na podlagi znanih podatkov o strukturah peptidov predvideli in sintetizirali potencialne peptidne učinkovine hitreje in učinkoviteje, predvsem pa bodo lahko odkrili nove unikatne peptide z visokimi bioaktivnimi lastnostmi.
18 9 VIRI
Ayoubn M., Scheidegger D. 2006. Peptide drugs, overcoming the challenges, a growing business. Chemistry Today, 24, 4: 46-48
Bussines wire. 2020. Global Peptide Therapeutics Market Clinical Pipeline Insight 2026, https://www.businesswire.com/news/home/20200127005270/en/Global-Peptide-
Therapeutics-Market-Clinical-Pipeline-Insight-2026---ResearchAndMarkets.com (13.
apr. 2021)
Cary D. R., Ohuchi M., Reid P. C., Masuya K. 2017. Constrained Peptides in Drug Discovery and Development. Journal of Synthetic Organic Chemistry Japan, 75, 11: 1171-1178 Dulal P. 2010. Protein or Peptide drugs: Applications, Problems and Solutions. Biotechnology
Society of Nepal (BSN) E-Bulletin, 2: 1-5
https://bsnbiotech.files.wordpress.com/2010/10/bsnebulletin_vol2_2.pdf (13. apr. 2021) Felnagle E. A., Jackson E. E., Chan Y. A., Podevels A. M., Berti A. D., McMahon M. D.,
Thomas M. G. 2007. Nonribosomal Peptide Synthetases Involved in the Production of Medically Relevant Natural Products. Molecular Pharmaceutics, 5, 2: 191-211
Fujitsu Limited, PeptiDream, Inc. 13. okt. 2020. Fujitsu and PeptiDream Achieve Milestone in Joint Research for Peptide Drug Candidates with High-Speed, High-Precision Exploration Technology
https://www.fujitsu.com/global/about/resources/news/press-releases/2020/1013-01.html (29. maj 2021)
Glas A., Bier D., Hahne G., Rademacher C., Ottmann C., Grossmann T. N. 2014. Constrained Peptides with Target-Adapted Cross-Links as Inhibitors of a Pathogenic Protein–Protein Interaction. Angewandte Chemie International Edition, 53: 2489-2493
Goto Y., Katoh T., Suga H. 2011. Flexizymes for genetic code reprogramming. Nature America, 6, 6: 779-790
Heinis C., Winter G. 2015. Encoded libraries of chemically modified peptides. Current Opinion in Chemical Biology, 26: 89-98
Iegre J., Gaynord J. S., Robertson N. S., Sore H. F., Hyvönen M., Spring D. R. 2018. Two- component stapling of biologically active and conformationally constrained peptides:
past, present and future. Advanced Therapeutics, 1, 7, 1800052, doi:
0.1002/adtp.201800052: 22 str.
19
Lau J. L., Dunn M. K. 2018. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 26, 10:
2700-2707
Maarseveen J. H., Timmerman P. 2017. Editorial for the special issue on “constrained peptides”. Drug Discovery Today Technologies, 26: 1-2
Morrison C. 2018. Constrained peptides’ time to shine. Nature Reviews Drug Discovery, 17:
531-533
Ottl J., Leder L., Schaefer J. V., Dumelin C. E. 2019. Encoded Library Technologies as Integrated Lead Finding Platforms for Drug Discovery. Molecules, 24, 8, 1629, doi:
10.3390/molecules24081629: 22 str.
PeptiDream Inc.
https://www.peptidream.com/ (29. maj 2021)
Report Linker. 2021. Peptide Therapeutics Market - Growth, Trends, COVID-19 Impact, and Forecasts (2021 - 2026).
https://www.reportlinker.com/p06028503/Peptide-Therapeutics-Market-Growth-Trends- COVID-19-Impact-and-Forecasts.html?utm_source=GNW (15. maj 2021)
Robertson N.S., Spring D.R. 2018. Using Peptidomimetics and Constrained Peptides as Valuable Tools for Inhibiting Protein–Protein Interactions. Molecules, 23, 4, 959, doi:
10.3390/molecules23040959: 18 str.
Sachdeva S. 2017. Peptides as ‘Drugs’: The Journey so Far. International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 23: 49-60
Sato A. K., Viswanathan M., Kent R. B., Wood C. R. 2006. Therapeutic peptides:
technological advances driving peptides into development, Current Opinion in Biotechnology, 17, 6: 638-642
Shen X., Corey D.R. 2018. Chemistry, mechanism and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research, 46, 4: 1584-1600
Sieber S. A., Marahiel M. A. 2003. Learning from Nature’s Drug Factories: Nonribosomal Synthesis of Macrocyclic Peptides. Journal of Bacteriology, 185, 24: 7036-7046
Simons A., Alhanout K., Duval R. E. 2020. Bacteriocins, Antimicrobial Peptides from Bacterial Origin: Overview of Their Biology and Their Impact against Multidrug- Resistant Bacteria. Microorganisms, 8, 639, doi: 10.3390/microorganisms8050639:31 str.
20
Sohrabi C., Foster A., Tavassoli A. 2020. Methods for generating and screening libraries of genetically encoded cyclic peptides in drug discovery. Nature Reviews Chemistry, 4: 90- 101
Torre B. G., Albericio F. 2020. Peptide Therapeutics 2.0. Molecules, 25, 2293, doi:
10.3390/molecules25102293: 3 str.
Torre B. G., Albericio F. 2021. The Pharmaceutical Industry in 2020. An Analysis of FDA Drug Approvals from the Perspective of Molecules, Molecules. 26, 3, 627, doi:
10.3390/molecules26030627: 14 str.
Usmani S. S., Kumar R., Bhalla S., Kumar V., Raghava G. S. 2018. In Silico Tools and Databases for Designing Peptide-Based Vaccine and Drugs. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology, 112: 221-263
Vinogradov A. A., Yin Y., Suga H. 2019. Macrocyclic Peptides as Drug Candidates: Recent Progress and Remaining Challenges. Journal of the American Chemical Society, 141, 10:
4167-4181
ZAHVALA
Zahvaljujem se mentorju dr. Hrvoje Petkoviću za usmerjanje pri pisanju diplomskega dela.
Prav tako bi se rada zahvalila svoji družini za podporo med študijem, še posebej pa sestri Lani, ki ni nikoli podvomila v mojo diplomo, in Lukatu za polepšane študentske dni.
