UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Špela RUPNIK
UPORABA TEHNOLOGIJE HLADNE PLAZME ZA OBDELAVO SEMEN
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Špela RUPNIK
UPORABA TEHNOLOGIJE HLADNE PLAZME ZA OBDELAVO SEMEN
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
USE OF NON-THERMAL PLASMA TECHNOLOGY FOR SEED TREATMENT
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Katarino Vogel-Mikuš.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Katarina VOGEL-MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: doc. dr. Polonca ŠTEFANIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum predstavitve: 6. 9. 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 631.53.027:601.2:576.31:581.17(043.2)
KG seme, obdelava, hladna plazma, kalitev, izražanje genov, dekontaminacija AV RUPNIK, Špela
SA VOGEL-MIKUŠ, Katarina (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN UPORABA TEHNOLOGIJE HLADNE PLAZME ZA OBDELAVO SEMEN TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)
OP VIII, 20 str., 4 sl., 44 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Plazma predstavlja eno od štirih osnovnih agregatnih stanj snovi in jo lahko delimo na visokotemperaturno in nizkotemperaturno oziroma toplotno in hladno. V kmetijstvu se uporablja hladno plazmo za obdelavo semen, ker se ob primernih nastavitvah plazemskih parametrov kot so npr. vrsta plina, moč in dolžina izpostavitve, lahko izboljša hitrost kalitve, rast sadik, omočljivost semen in poveča donos pridelka. Večja omočljivost je posledica jedkanja semenske ovojnice, s čimer se poveča njena hidrofilnost. Poleg tega lahko vpliva še na gensko ekspresijo, sintezo hormonov in odpornost na biotski (patogeni) in abiotski stres (suša, slanost, težke kovine). Spremeni se predvsem izražanje genov, ki kodirajo rastlinske hormone in s tem pride do spremenjenega ravnovesja rastlinskih hormonov. Poveča se namreč izražanje giberelinske kisline, zmanjša pa izražanje abscizinske kisline, kar pripomore tudi k premagovanju dormance semen. Prav tako lahko pride do inaktivacije patogenov (tako bakterij, gliv in tudi virusov) in povečanega izražanja rezistentnih genov v rastlinah (geni PR). Zato bi lahko hladna plazma v prihodnosti nadomestila kemična sredstva namenjena kontroli rastlinskih škodljivcev. Večino sprememb lahko pripišemo delovanju reaktivnih atomskih in molekularnih zvrsti kot so ROS in RNS, ki so sestavni del hladne plazme.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 631.53.027:601.2:576.31:581.17(043.2)
CX seed, treatment, cold plasma, germination, gene expression, decontamination AU RUPNIK, Špela
AA VOGEL-MIKUŠ, Katarina (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI USE OF NON-THERMAL PLASMA TECHNOLOGY FOR SEED TREATMENT DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)
NO VIII, 20 p., 4 fig., 44 ref.
LA sl AL sl/en
AB Plasma represents one out of the four fundamental states of matter and can be distinguished into thermal and non-thermal or cold plasma. In agriculture, cold plasma is used for seed treatment, as it can improve germination rate, seedling growth, seed wettability and increase crop yield with appropriate settings of plasma parameters, such as type of gas, strength and length of exposure. The higher wettability is due to the etching of the seed coat, thus increasing its hydrophilicity. In addition, it can affect gene expression, hormone synthesis, and resistance to biotic (pathogen) and abiotic stress (drought, salinity, heavy metals). In particular, the expression of genes encoding plant hormones changes, leading to an altered balance of plant hormones. Namely, the expression of gibberellic acid increases and the expression of abscisic acid decreases which also helps to overcome seed dormancy. Inactivation of pathogens (both bacteria, fungi and also viruses) and increased expression of resistant genes in plants (PR genes) can also occur. For this reason, cold plasma could in the future replace chemical agents intended for plant pest control. Most of the changes can be attributed to the action of reactive atomic and molecular species such as ROS and RNS which are an integral part of cold plasma.
V KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VII
1 UVOD 1
1.1 NAMEN IN POVOD DELA 3
2 METODE OBDELAVE SEMEN S HLADNO PLAZMO 3
2.1 RAZELEKTRITEV V REAKTORJU Z DIELEKTRIČNO PREGRADO (DBD; angl. Dielectric barrier discharge)
3
2.2 RADIOFREKVENČNA RAZELEKTRITEV (RF) 4
2.2.1 Atmosferski plazemski curek (APPJ; angl. Atmospheric Pressure Plasma Jet)
4
2.3 MIKROVALOVNA RAZELEKTRITEV (MW) 4
3 VPLIVI HLADNE PLAZME NA SEMENA 5
3.1 VPLIV NA MORFOLOGIJO IN FIZIOLOGIJO SEMEN 5
3.1.1 Semenska ovojnica 5
3.1.2 Izražanje genov, encimska aktivnost in sinteza hormonov 7
3.1.3 Odpornost na abiotski stres 9
3.2 HITROST KALITVE 10
3.3 VPLIV NA PRISOTNOST PATOGENIH MIKROORGANIZMOV 12
4 ZAKLJUČKI 15
5 VIRI 16
ZAHVALA
VI KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Prikaz razelektritve v reaktorju z dielektrično pregrado (Dielectric barier discharge; DBD)
3 Slika 2: Prikaz atmosferskega plazemskega curka (Atmospheric pressure plasma jet;
APPJ)
4 Slika 3: Vodna kapljica na površini pšeničnega semena pred (a) in po obdelavi (b) z
NTP, viden je prehod z delne na popolno omočljivost. 6
Slika 4: Mehanizmi delovanja reaktivnih zvrsti HP pri inaktivaciji mikroorganizmov 13
VII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ABA – abscizinska kislina
AC – izmenični tok
APPJ – atmosferski plazemski curek ATP – adenozin trifosfat
CAT – katalaza
DBD – razelektritev v reaktorju z dielektrično pregrado DC – enosmerni tok
DNA – deoksiribonukleinska kislina GA – giberelinska kislina
GRF – faktor za regulacijo rasti HP – hladna plazma
IAA - indol-3-ocetna kislina IBA - indol-3-butirična kislina ICP – induktivno sklopljena plazma JA – jasmonska kislina
LTE – local thermodynamic equilibrium MAD – malondialdehid
MAPK – z mitogenom aktivirana protein kinaza mRNA – informacijska RNA
MW – mikrovalovna razelektritev
non-LTE – non-local thermodynamic equilibrium PAL – fenilalanin amoniak liaza
PAW – s plazmo aktivirana voda PEG – polietilen glikol
POD – peroksidaza
PR – povezani s patogenezo RF – radiofrekvenčna razelektritev RNA – ribonukleinska kislina RNS – reaktivne dušikove spojine ROS – reaktivne kisikove spojine SA – salicilna kislina
SOD – superoksid dimutaza
VIII T – temperatura
TOR – tarča rampamicina UV– ultravijolično sevanje
1
1 UVOD
Eden izmed poglavitnih problemov v prihodnosti bo zagotavljanje hrane za vso človeško populacijo. To lahko pripišemo globalnemu segrevanju in vedno številčnejši populaciji prebivalstva. Že od 19. stoletja se v atmosferi povečano kopičijo toplogredni plini kot so CO2, CH4 in NO2, ki pripomorejo k višanju povprečne globalne temperature. Višja povprečna temperatura pa ima uničujoč vpliv na kmetijstvo, saj so njene posledice degradacija tal, zmanjšanje produktivnosti kmetijskih zemljišč, dezertifikacija, zmanjšana razpoložljivost vode, krčenje obdelovalnih površin, pričakujemo pa lahko tudi vedno več ekstremnih vremenskih dogodkov (vročinski valovi, suša, poplave, ipd.). Spremenila se bo tudi količina in intenzivnost padavin, kar bo še dodatno negativno vplivalo na produkcijo hrane. Višje temperature omogočajo povečanje območja razširjenosti nekaterih rastlinskih bolezni, zaradi česar bo potrebna večja uporaba gnojil in škropiv (Rossati, 2017). Blažje okoljske razmere (milejše zime) bodo naklonjene mnogim žuželkam in raznim rastlinskim virusom. Večja vlažnost pa bo ugodna tudi za razmnoževanje parazitskih gliv. Med povzročitelje bolezni, za katere se pričakuje, da bodo v prihodnosti bolj razširjene, spadajo npr. virus rumenega zvijanja listov paradižnika, virus Y krompirja, glive Altenaria brassicae (povzroča pegavost), Erysiphe graminis (žitna pepelovka), več naj bi bilo tudi pšenične in ječmenove rje (Roos in sod., 2011).
Opaziti je možno močne demografske spremembe v svetu, saj se rast prebivalstva od 20. stoletja naprej močno narašča. Od leta 1950 nas je več za kar 4 milijarde, do 2050 pa lahko pričakujemo, da nas bo na svetu okrog 10 milijard. Poleg tega bo v državah z veliko rodnostjo populacija zelo mlada, medtem ko bo v razvitem svetu vedno starejša. Na kmetijstvo pa bo imela negativen vpliv tudi hitra urbanizacija, ki še dodatno povzroča krčenje kmetijskih območij (Bongaarts, 2009). Če bomo želeli preprečiti masovne lakote po svetu, bo ključna prilagoditev na klimatske spremembe in povečanje produktivnosti pridelave hrane. Pri slednji si lahko pomagamo s tehnologijo hladne plazme.
Plazma je četrto agregatno stanje snovi in predstavlja 99 % vesolja. Leta 1879 jo je identificiral William Crookes. Plazma je delno ioniziran plin, sestavljen iz ionov, elektronov in nenabitih delcev kot so atomi, molekule, radikali, UV in vidne svetlobe (Hoffman in sod., 2013).
Z makroskopskega stališča je plazma elektro nevtralna. Vsebuje pa proste nosilce naboja in je zato električno prevodna. Nastane z dovajanjem energije plinu, s čimer se reorganizira elektronska struktura atomov in molekul ter nastanejo vzbujene atomske in molekularne zvrsti in ioni. Energija je lahko v obliki toplote ali pa jo generiramo z električnim tokom ali elektromagnetnim sevanjem. Tako se energija prenese na plinske elektrone (najbolj mobilne nabite zvrsti), le te pa energijo prenesejo na nevtralne zvrsti s trki, ki so lahko elastični ali neelastični. Elastični trki vplivajo le na kinetično energijo atomov in molekul ter ne spremenijo notranje energije, medtem ko neelastični lahko spremenijo elektronsko strukturo (če je energija dovolj velika) in ustvarijo vzbujene delce, za katere je značilna kratka življenjska doba.
Vzbujeni delci se vrnejo nazaj v osnovno stanje preko emitiranja fotonov (osnovni delci elektromagnetnega valovanja). Lastnosti plazme se spreminjajo glede na elektronsko gostoto in temperaturo (Tendero in sod., 2006).
Obstajata 2 vrsti plazme: visokotemperaturna (LTE; local thermodynamic equilibrium) in nizkotemperaturna oziroma hladna (non-LTE; non-local thermodynamic equilibrium/cold plasma) plazma.
2
Visokotemperaturna plazma ima elektrone in težke delce (nevtralne in ione) pri enaki temperaturi (Te = Th ≈ 10 000 K). Delci so tako v termodinamičnem ravnovesju. Za hladno plazmo (HP) je značilno, da delci niso v termodinamičnem ravnotežju, ker je temperatura elektronov veliko višja od temperature težkih zvrsti (to so ioni in nevtralne molekule; Te ≈ 10 000–100 000 K, Th ≈ 300–1000 K). Gostota elektronov je nižja (<1019 m-3) v primerjavi z visokotemperaturno plazmo (1021 - 1026 m-3).
Pojavljajo se neelastični trki med elektroni in težkimi delci. Težki delci se le rahlo segrejejo z nekaj elastičnimi trki zaradi česar ostaja energija elektronov zelo visoka (Tendero in sod., 2006). Za produkcijo HP je možno uporabiti več plinov kot so na primer: helij, argon, dušik, mešanica helija in kisika ter zrak (Hoffman in sod., 2013). HP se ustvari z dovajanjem energije nevtralnemu plinu. Pri tem plin postane vedno bolj električno prevoden, saj vsebuje anione, katione, proste elektrone, radikale ter reaktivne kisikove spojine (ROS) in reaktivne dušikove spojine (RNS), v kolikor sta v mešanici prisotna kisik in/ali dušik. Oddaja pa tudi elektromagnetno sevanje (predvsem UV sevanje in vidno svetlobo) (Bernhardt in sod., 2019).
Obstajata dva možna načina pod katerimi generiramo HP in se razlikujeta glede na tlak plina:
➢ atmosferska
➢ nizkotlačna plazma
Za nizkotlačno plazmo je značilno, da se tlak plina giblje med 1 in 100 Pa, poleg tega pa so razdalje med elektrodami velike le nekaj centimetrov. Pri tem je enosmerna napetost, ki je pomembna za vžig plazme, zelo nizka: pod 1 kV. Pri nizkem tlaku bodo namreč nizke tudi frekvence trkov, ki povzročijo, da so energije delcev različne (Ttežkih delcev < Telektronov). Takšna plazma tudi ni v termodinamičnem ravnovesju (nastanek HP) (Bárdos in Baránková, 2008).
Prihaja do neelastičnih trkov med elektroni in težkimi delci, le te pa ne višajo energije težkih delcev (Tendero in sod., 2006). Slabost nizkotlačne plazme je predvsem draga oprema, saj potrebujemo vakuumsko komoro (Bárdos in Baránková, 2008). V nasprotju pa za generiranje atmosferske plazme potrebujemo višje napetosti zaradi česar ponavadi potrebujemo tudi orodja za vžig npr. iskro. Vendar pa proces lahko steče pri sobnem tlaku in ne potrebujemo drage vakuumske opreme (Bárdos in Baránková, 2008). Ker je tlak višji, pride do večjega števila trkov zaradi katerih se težki delci segrevajo. Posledično se manjša razlika med temperaturo težkih delcev in elektronov, vendar še ne doseže termodinamičnega ravnotežja (Tendero in sod., 2006).
Vire atmosferske plazme lahko ločimo glede na način vzbujanja (Tendero in sod., 2006):
➢ električno vzbujene plazme: z enosmernim/direktnim (DC) ali izmeničnim (AC) tokom
➢ radiofrekvenčno (RF) vzbujene plazme
➢ mikrovalovno (MW) vzbujene plazme
3 1.1. NAMEN DELA
Cilj dela je iz literaturnih podatkov povzeti glavne ugotovitve o tem, kako obdelava semen s hladno plazmo vpliva na različne lastnosti semen kot so hitrost kaljenja, rast rastline, izražanje genov, odpornost na stres idr.
2 METODE OBDELAVE SEMEN S HLADNO PLAZMO
Razvitih je bilo več sistemov HP, ki so v uporabi. Za proizvodnjo in vzdrževanje plazme je potrebna energija, ki je lahko toplotna, svetlobna ali električna. Večinoma se uporablja slednja.
Zelo pomembna je frekvenca vzbujanja, ker vpliva na obnašanje elektronov in ionov (Tendero in sod., 2006).
Nekateri primeri sistemov za generacijo HP so predstavljeni v nadaljevanju.
2.1 RAZELEKTRITEV V REAKTORJU Z DIELEKTRIČNO PREGRADO (DBD; angl.
Dielectric barrier discharge)
Sistem je sestavljen iz dveh ravnih kovinskih elektrod prekritih z dielektričnim materialom, kot je prikazano na sliki 1. Plin se premika med elektrodama in se ionizira po dodajanju energije, da se ustvari plazma. Ena elektroda je pod visoko napetostjo, druga pa je ozemljena. Potrebne so visoke napetosti, da pride do razelektritve, za kar se uporabi izmenjujoč tok s frekvencami v območju kHz. Obstaja veliko različic konfiguracije elektrod, vendar princip ostaja enak (Hoffman in sod., 2013).
Slika 1: Prikaz razelektritve v reaktorju z dielektrično pregrado (Dielectric barier discharge; DBD) (prirejeno po Hoffman in sod., 2013)
4
2.2 RADIOFREKVENČNA RAZELEKTRITEV (RF)
Za radiofrekvenčno razelektritev so razvili več sistemov, ki lahko delujejo z visoko ali nizko napetostjo. Napetost vpliva na lastnosti plazme in na njene potencialne aplikacije. Primeri sistemov so: induktivno sklopljena plazma (ICP), sistem z votlo katodo (angl. hollow cathode system), bakle (angl. the cold plasma torch) in atmosferski plazemski curek (APPJ) (Tendero in sod., 2006).
2.2.1 Atmosferski plazemski curek (APPJ; angl. Atmospheric Pressure Plasma Jet) APPJ je sestavljen iz dveh koaksialnih elektrod, med katerimi teče dovodni plin z visoko hitrostjo. Zunanja elektroda je ozemljena, druga elektroda pa ustvarja razelektritev in jo napaja radiofrekvenčni vir energije, kot prikazuje slika 2. Napetost se giblje od 100 do 150 V, da pride do razelektritve plina. Ionizirani plin izstopi skozi šobo (hitrost plina je približno 12 m s-1) (Tendero in sod., 2006).
Slika 2: Prikaz atmosferskega plazemskega curka (Atmospheric pressure plasma jet; APPJ) (prirejeno po Hoffman in sod., 2013)
2.3 MIKROVALOVNA RAZELEKTRITEV (MW)
Za MW je značilno, da se v sistem vodijo mikrovalovi in nato njihovo energijo absorbirajo elektroni. Temu sledijo elastični trki med elektroni in težkimi delci. Ker imajo elektroni veliko manjšo maso v primerjavi s težkimi delci, se odbijejo, njihova hitrost se poveča in s tem dobijo kinetično energijo (mikrovalovna energija se pretvori v kinetično). Če pride do večih trkov, elektroni pridobijo dovolj energije za tvorbo ionizirajočih trkov, s pomočjo katerih nastane delno ioniziran plin oziroma plazma (Tendero in sod., 2006).
Objekt se lahko izpostavi hladni plazmi na dva načina:
➢ Neposredna izpostavitev: tu pride plazma v neposreden stik z biološko tarčo, tako da lahko vse molekule, ki nastanejo v plazmi lahko delujejo na celice (to so nabiti delci, fotoni, reaktivne zvrsti, električno polje…). Te molekule lahko delujejo samostojno ali
5
pa sinergistično. To se lahko uporablja za inaktivacijo mikroorganizmov, sterilizacijo toplotno občutljivih orodij, uničenje biofilmov ipd.
➢ Posredna izpostavitev: tu se uporabi le sij plazme (afterglow) ali pa se direktno s plazmo obdela tekoči medij npr. vodo in se kasneje s to tekočino obdela objekte. Pri slednjem načinu gre za s plazmo aktivirano vodo ali krajše PAW (angl. plasma activated water).
Prednost tega je, da plazemsko aktivirano tekočino lahko shranimo in uporabimo pozneje. Ključno vlogo pri tem načinu igrajo dolgo živeče zvrsti, ki se razpršijo in raztopijo v vodno stanje. Med te zvrsti spadajo H2O2, NO2-, NO3-, peroksinitrit (ONOO- ) in organski radikali. Pri tem so odpravljeni negativni učinki fotonov, električnega polja, kratkoživečih zvrsti (med te spadajo OH*, NO*, HNO2, HNO3 in nastanejo kot posledica interakcij reaktivnih zvrsti med seboj ali z drugimi molekulami) in toplote.
Večinoma se za to uporablja vodo ali pa biološka gojišča. Pri pripravi plazemsko aktiviranega medija le tega za določen čas izpostavimo viru hladne plazme. Ta način bi se lahko v prihodnosti uporabljalo za tudi uničevanje rakavih celic (Laroussi, 2020).
3 VPLIV HLADNE PLAZME NA SEMENA
3.1 VPLIV NA MORFOLOGIJO IN FIZIOLOGIJO SEMEN 3.1.1 Semenska ovojnica
Obdelava semen s HP lahko znatno vpliva na morfologijo ter fizikalno kemijske lastnosti semen. Morfološke spremembe so izrazite predvsem na semenski ovojnici. Pri obdelavi pride namreč do kemičnega jedkanja površine s plazmo, zato na ovojnici nastanejo razpoke. Površina semen prav tako lahko postane bolj hrapava in krhka, kar olajša absorpcijo vode in hranil (Rahman in sod., 2018).
Z optimizacijo procesa se prepreči prekomerno nastajanje razpok na semenski ovojnici, saj bi to lahko oviralo kalitev. Zato je HP lahko še posebej uporabna v primerih, ko kalitev preprečuje trda ovojnica semena. Jedkana ovojnica slabo vpliva na dolgotrajno obstojnost semena. Semena lahko postanejo bolj dovzetna za poškodbe, bolj nagnjena h kontaminaciji in bolj občutljiva na spremembe v nivoju vlage ter temperature. Te potencialno škodljive učinke lahko omilimo s plazemsko obdelavo semen neposredno pred sajenjem, čeprav je treba opozoriti, da obdelava s plazmo učinkovito dekontaminira površine in tako lahko znatno upočasni postopek kontaminacije (Wang in sod., 2017).
Površina semen je navadno hidrofobna, jedkanje pa jo naredi bolj hidrofilno. Poveča se površinska oprijemljivost na molekule vode, kar še dodatno prispeva k večjemu privzemu vode.
Povečano hidrofilnost potrjuje tudi metoda sedeče kapljice (Wang in sod., 2017). Pri tej metodi določamo stični kot, ki nastane med tangento na površino tekočine in površine semena. Kot lahko meri od 0° pa do 180° (0° - popolna omočitev; 180° - popolno nemočenje). Glede na omočljivost semen ima kapljica različne oblike, če je površina hitro omočljiva, se kapljica po njej razporedi in tvori na površini plast vode. Na slabo omočljivi površini pa kapljica dolgo ohrani obliko, kar je značilno za hidrofobne površine. Stični kot je posledica medsebojnega delovanja kemijske sestave in hrapavosti površin. Za semena obdelana s HP je značilno, da se stični kot drastično zmanjša (Bormashenko in sod., 2012).
6
Bormashenko in sod. (2012) so to dokazali pri obdelavi različnih semen z atmosfersko radiofrekvenčno hladno plazmo za 15 minut. Stični koti pri neobdelani leči in fižolu so bili 127
± 2 ° in 98 ± 2 °, pri obdelanih pa 20 ± 1 ° in 53 ± 1,5 ° (ni pa se spremenila topografija semenskih površin). Najbolj izrazito se je omočljivost spremenila pri pšenici, in sicer se je stični kot spremenil iz 115 ± 2 ° na nič (kapljica se takoj razširi po površini). Obdelava s plazmo je v tem primeru povzročila prehod iz delne na popolno omočljivost semen, kot je razvidno iz slike 3.
Slika 3: Vodna kapljica na površini pšeničnega semena pred (a) in po obdelavi (b) s HP, viden je prehod z delne na popolno omočljivost (prirejeno po Bormashenko in sod., 2012)
Glavna komponenta semenske ovojnice je celuloza, ki se lahko razgradi z izpostavljenostjo HP.
Vse tri omenjene spremembe (jedkanje površine, hidrofilnost in delna razgradnja celuloze) povečajo prepustnost semena za vodo in s tem povečajo omočljivost semen. Poveča se vpojnost vode v obdelana semena (povečana je difuzijska sposobnost) in s tem se pospeši tudi kalitev.
Kalitev je namreč proces, ki se začne z privzemom vode v seme (Gómez-Ramírez in sod., 2017).
Obdelava s HP pa povzroči še eno vrsto kemijskih sprememb. Plazemsko okolje je ugodno za tvorbo majhnih bioaktivnih molekul, ki lahko medsebojno delujejo in se nalagajo na ovojnico semena ter prodrejo v seme do globine do 10 nm. Ker je atmosferski zrak v glavnem sestavljen iz dušika in kisika, v produktih zračnega praznjenja prevladujejo molekularni dušik, atomski dušik in atomski kisik. V zelo reaktivnih plazemskih pogojih nastajajo molekule dušikovega oksida, kot so NO, NO2 ali N2O (Wang in sod., 2017).
Površina neobdelanih semen je bogata z ogljikom, ima določeno količino kisika in veliko manjši odstotek dušika in kalija. Po izpostavitvi semen HP pa pride do površinske oksidacije zaradi reaktivnih vrst v plazmi. Na površini se poveča vsebnost kisika in dušika, zmanjša se delež ogljika, rahlo se poveča vsebnost kalija. Pri daljših časih izpostavljenosti so te spremembe lahko bolj drastične (Gómez-Ramírez in sod., 2017).
Reaktivne zvrsti kisika in dušika lahko torej vplivajo na površino semena, delno pa lahko prodrejo tudi v seme, s čimer lahko spodbujajo biokemične procese, ki so potrebni za kalitev semen (Wang in sod., 2017).
7
3.1.2 Izražanje genov, encimska aktivnost in sinteza hormonov
Kalitev je zapleten postopek vrste fizioloških in biokemičnih reakcij, ki vključuje tudi razne genske ekspresije in signalne transdukcije številnih molekul. Med postopkom se ponovno aktivira shranjena energija, pride do translacije shranjene mRNA, transkripcije in translacije novo nastale mRNA. Pri določanju fiziološkega stanja semena in uravnavanju kalitvenega procesa pa igrajo pomembno vlogo tudi vsebnost hormonov, signalizacija in interakcije med njimi. Na izražanje genov pa lahko vplivajo tudi reaktivne zvrsti proizvedene s plazmo (Tong in sod., 2020).
Metilacija citozina je temeljni epigenetski mehanizem pri regulaciji genske ekspresije in transpozonskih elementov v rastlinah. Povezana je s spremembo transkripcije genov, kar vodi do morfoloških sprememb brez spreminjanja zaporedja DNA. Pri obdelanih semenih pride do spremembe vzorca metilacije. Zmanjša se raven metilacije genov ATP, TOR (vodi transkripcijske mreže, ki povezujejo osrednji metabolizem in biosintezo za proizvodnjo energije in biomase) in GRF (rastlinsko specifične beljakovine, ki igrajo pomembno vlogo pri uravnavanju rasti in razvoja rastlin). Demetilacija pa povzroči, da se poveča ekspresija teh genov. Povečanje ravni izražanja TOR poveča rast korenin in poganjkov, velikost celic in donos semen, ne da bi to vidno vplivalo na morfologijo rastlin. Geni GRF delujejo kot pozitivni regulatorji velikosti listov s spodbujanjem in / ali vzdrževanjem aktivnosti celične delitve v listnih primordijih (Zhang in sod., 2017).
Obdelava semen ne vpliva bistveno na transkripcijske dogodke v zgodnji kalitveni fazi, ampak spremeni ekspresijo genov v času vznika radikule. Pri kalitvi imajo ključno vlogo geni povezani z rastlinskimi hormoni (Tong in sod., 2020). Rastlinski hormoni so namreč pomembni za uravnavanje dormance in kalitve. Glavno vlogo imata abscizinska kislina (ABA), ki inhibira kalitev in giberelini (GA), ki jo spodbujajo. Na njuno ravnovesje pa vplivajo tudi drugi rastlinski hormoni kot so avksini (IAA oziroma indol-3-ocetna kislina je negativni regulator kalitev), etilen, citokinini, brazinosteroidi in strigolaktoni spodbujajo kalitev, na različne načine pa delujeta tudi salicilna kislina (SA) in jasmonska kislina (JA) (Mildažienė in sod., 2019).
Pri obdelavi s HP se je izražanje gena GA3ox (povezan z biosintezo GA) povečalo. Izražanje gena NCED5 (za biosintezo ABA) pa se je močno zmanjšalo, kar pomeni, da imajo obdelana semena nižjo vsebnost ABA. Etilen ima pomembno vlogo v pozni fazi kalitve in zavira sintezo ABA (hormona delujeta antagonistično). Torej je količina ABA manjša zaradi delovanja HP (manjše izražanje genov, ki kodirajo ABA) in tudi zaradi večje količine etilena (Tong in sod., 2020). S tem se zmanjša razmerje ABA/GA, to pa je tudi povezano s prehodom semen iz dormance v kalitev. Zmanjša se količina avksinov (IAA in IBA), poveča pa se raven zeatina (gre za citokinin) (Degutytė-Fomins in sod., 2020). Pri obdelanih semenih se poveča izražanje genov, ki kodirajo transkripcijske faktorje odzivne na etilen: RAP2-10, CRF4 in ERF098.
Poveča se tudi ekspresija gena ACO, ki kodira encim za katalizo zadnjega koraka tvorbe etilena.
Te spremembe so nastopile v fazi pozne kalitve ali v fazi po kalitvi. Reaktivne dušikove spojine pospešujejo razgradnjo ABA in pospešujejo sintezo GA, medtem ko reaktivne kisikove spojine vplivajo na zmanjšanje sinteze ABA (Tong in sod., 2020).
Pri obdelavi semen se poveča njihova endogena vsebnost vodikovega peroksida in dušikovega oksida. Pomembno vlogo pri koncentraciji teh dveh spojin pa ima čas izpostavljenosti, saj se
8
pri predolgi obdelavi ustvari prekomerna količina H2O2 in NO ter sproži oksidativni stres. Na bazalni ravni pa H2O2 in NO delujeta kot signalni molekuli v rastlinah. Študije regulacije transkripcije H2O2 in NO so pokazale, da H2O2 in NO medsebojno uravnavata izražanje obrambnih genov. Poveča se izražanje gena MAPK (mitogen aktivirana kinaza), izražanje salicilne in jasmonske kisline ter antioksidativnih encimov (Adhikari in sod., 2019).
Salicilna in jasmonska kislina se v rastlinah sintetizirata kot odgovor na okužbo s patogeni, vplivata pa tudi na vegetativno rast rastlin, kaljivost semen, rast korenin, vnos hranil, aktivnost RuBisCO, vsebnost klorofila ipd. Uravnavata še aktivnost antioksidativnih encimov (SOD, CAT, PAL). Obdelava s HP spodbudi ekspresijo sintezne poti SA in JA ter s tem poveča njihovo vsebnost v rastlinskih listih in koreninah. Če je njuna vsebnost povišana, se poveča odpornost na patogene in rast rastlin (Adhikari in sod., 2019).
Poveča se aktivnost encimov kot so superoksid dismutaza (SOD), peroksidaza (POD) in katalaza (CAT). Ti encimi so ključni za obrambo rastlin pred oksidativnim stresom, saj sodelujejo pri razstrupljanju reaktivnih spojin (ROS in RNS) (Zhang in sod., 2017). Superoksid dismutaza katalizira pretvorbo superoksida v vodikov peroksid, katalaza in peroksidaza pa sodelujeta pri razgradnji celicam strupenega vodikovega peroksida. Encimi zelo učinkovito varujejo celice pred reaktivnimi kisikovimi molekulami in prostimi radikali, tako da jih spremenijo v celici neškodljive molekule (Song in sod., 2020). Obdelava s HP lahko poveča tudi aktivnost encima PAL (fenilalanin amoniak liaza), ki je ključen za sintezo polifenolov (spadajo med antioksidante). V semenih se tako poveča količina fenolnih kislin (npr. cikorna, kaftarna, klorogena kislina), vitamina C in s tem tudi odstranjevanje radikalov (Mildaziene in sod., 2018).
Bolj pa so izraženi tudi geni PR, to so geni povezani s patogenezo, ki se izražajo kot odziv na okužbo. Povečano izražanje le teh naredi rastline bolj odporne na patogene, saj aktivira mehanizme odpornosti rastlin (Adhikari in sod., 2019).
Na hitrost kalitve ne vpliva le absorpcija vode, temveč tudi aktivnost litičnih encimov. Te namreč razgradijo založne snovi v semenu, da jih kalček lahko izrabi, saj lahko vstopijo v presnovne procese. Obdelava semen s plazmo lahko poveča aktivnost amilaz, proteaz in fitaze.
Amilaze katalizirajo razgradnjo škroba v enostavnejše sladkorje, proteaze pospešujejo cepljenje peptidne vezi v proteinih in polipeptidih, fitaze pa pospešijo razgradnjo fitatov. Razgradnja fitatov pa omogoča boljšo biološko uporabnost mineralov, saj se fitati vežejo na minerale in zmanjšajo njihovo biološko dostopnost. Posledica povečane aktivnosti teh encimov je, da se v semenu povečano kopičijo topni sladkorji in beljakovine. Med topnimi sladkorji in abscizinsko kislino pa obstaja pozitivna korelacija, kar pomeni, da je povečana količina sladkorja lahko posledica signalne poti ABA (pri povečani sintezi ABA se količina sladkorja zviša). Izboljšana aktivnosti kalitvenih encimov semen in hitrejša razgradnja notranjih hranilnih snovi semena pa lahko prispevata k boljšemu izkoristku rezerv v semenu. Povečanje aktivnosti proteaz lahko pripišemo tudi spremembi v strukturi proteinov (Holubová in sod., 2020).
Li in sod. (2011) so ugotovili, da obdelava s plazmo v načinu plazemskega curka (ang. plasma jet) vpliva na lipazo tako, da spremeni sekundarno in terciarno strukturo proteina. S spremembo strukture pa se poveča tudi aktivnost tega encima.
9
Sestavni element HP je tudi sevanje UV, vse vrste sevanja UV pa lahko škodujejo različnim rastlinskim procesom. Lahko pride do poškodb DNA, kar povzroči nastanek pirmidinskih dimerov, nastanek dednih mutacij ali motenj v fizioloških procesih kot so zmanjšanje biomase, anatomske deformacije tkiv in drugi učinki (Shapira in sod., 2019). Količina poškodb se povečuje s časom izpostavljenosti HP, odvisna pa je tudi od uporabljenega plina za generacijo plazme. Reaktivne zvrsti, prisotne v plazmi, ki nastane pri različnih uporabljenih plinih, se med seboj razlikujejo po stabilnosti in afiniteti do DNA. Lahko pride do poškodb kot so enojni ali dvojni prelomi DNA vijačnice ali pa oksidativnih poškodb (npr. oksidacija purina). V glavnem nastanejo enoverižni zlomi, dvojni zlomi pa nastanejo le pri dolgih časih izpostavljenosti plazmi. Za nastanek zlomov je odgovoren predvsem atomski kisik (Peťková in sod., 2021). Pri neposrednem obsevanju semen brez teste z UV, nastane znatno število dimerov. Toda pri obdelavi celih semen je to število minimalno, saj ni bilo pomembne razlike v primerjavi z negativno kontrolo (Holubová in sod., 2020).
UV sevanje, ki nastane med obdelavo s plazmo, ni dovolj močno, da bi povzročilo drastične poškodbe DNA (npr. v obliki nastanka pirmidinskih dimerov). Poleg tega pa seme tudi ščiti testa. V njej so prisotne spojine, ki absorbirajo UV, to so predvsem rastlinski flavonoidi, kot na primer proantocianidini, katehin in epikatehin (Shapira in sod., 2019).
Časovne izpostavitve semen, ki se uporabljajo za izboljšanje kalitve, rasti in tolerance na stres, so po raziskavah genotoksikološko varne, saj ne pride do sprememb genskega materiala (Holubová in sod., 2020).
3.1.3 Odpornost na abiotski stres
Rastline se lahko srečujejo z različnimi abiotskimi stresorji kot so suša, slanost ali težke kovine, ki zaviralno vplivajo na njihovo rast. Za zaščito rastlin pred neugodnimi razmerami se uporablja več strategij kot so uporaba gnojil, genska manipulacija in sprožitev adaptivnega odziva oziroma hormeze. Pri slednjem gre za uporabo blagega stresa, s katerim rastlino pripravimo na nek močnejši stres (po principu »kar nas ne ubije, nas okrepi«). To pa lahko aktiviramo tudi z uporabo HP. Intenziven stres namreč močno obremenjuje rastline, saj morajo te energijo preusmeriti v signalno obrambne mehanizme namesto v rast, kar posledično vodi v manjši pridelek. Najlažje je obdelati semena, njihova prednost pa je, da so zaščitena s semensko ovojnico in so zato manj občutljiva kot kalice. Obdelava s HP lahko vodi v hitrejšo kalitev in razrast močnejšega koreninskega sistema, s čimer se poveča odpornost sadik na stres. Večja toleranca na stres pomeni, da rastline lahko proizvedejo več biomase ali plodov tudi v neugodnih okoljskih razmerah. To pa bi bilo zelo koristno glede na podnebne spremembe po vsem svetu (Holubová in sod., 2020).
Ling in sod. (2015) so s HP obdelali semena oljne ogrščice, in sicer sorte, ki je občutljiva na sušo (Zhongshuang 7) in sorte, ki ni občutljiva (Zhongshuang 11). Opazovali so, kako to vpliva na kalitev semen, rast sadik, antioksidativne encime, stopnjo peroksidacije lipidov in produkte osmotske prilagoditve oljne ogrščice v sušnem stresu. Stres zaradi suše povzroči, da se v rastlini kopičijo ROS, ki povzročajo oksidativne poškodbe. Rezultati so pokazali, da sta se kalitev in rast sadik izboljšali v primerjavi s kontrolo, povečala se je vsebnost topnega sladkorja in beljakovin, zmanjšala pa se je količina malondialdehida (MDA). Na splošno se je izboljšala toleranca na sušo, saj so se povečale aktivnosti antioksidativnih encimov, povečala se je
10
količina ozmolitov (gre za topne beljakovine in sladkorje, ki so pomembni za ohranjanje osmotskega ravnovesja in celovitosti membran, še posebej v sušnih razmerah), zmanjšala pa se je peroksidacija lipidov. Učinki pa so bili bolj izraziti pri sorti, ki je občutljiva na sušo. Z izboljšanim delovanjem antioksidativnega sistema se tako zmanjša oksidativna škoda in se omogoči vzdrževanje normalne fiziološke presnovne aktivnosti. Koncentracija MDA se je zmanjšala, kar pomeni, da se je zmanjšala škoda nastala zaradi peroksidacije lipidov v membrani (predvsem na račun povečanja koncentracije SOD in CAT). Zaradi povečane vsebnosti topnega sladkorja in beljakovin so rastline lahko ohranile ugoden koncentracijski gradient za vnos vode v sadike in povečale oskrbo z energijo.
Podobne rezultate pa so dobili Guo Q. in sod. (2017), le da so uporabili semena pšenice. Prav tako sta se izboljšali kalivost in rast, znižala se je vsebnost MDA in povečala se je aktivnost encimov SOD, CAT in POD. Ugotovili pa so, da se je povečala tudi koncentracija ABA, spremenilo pa se je izražanje nekaterih genov. Znižala se je raven izražanja funkcionalnega gena LEA1, povečalo pa se je izražanje regulatornih genov SnRK2 in P5CS. ABA pa je glavni regulator suše in povzroči zapiranje listnih rež, da rastline ne izgubijo še več vode.
Na rastline negativno vpliva tudi prevelika slanost, saj ta povzroča ionska neravnovesja in motnje pri vnosu hranil. Bafoil in sod. (2019) so opazovali kako osmotski stres in stres zaradi slanosti vplivata na kalitev navadnega repnjakovca (Arabidopsis thaliana). Visoka koncentracija NaCl je močno zmanjšala kaljivost, toda pri semenih obdelanih z HP je bil ta učinek blažji. HP pa je zmanjšala še učinek osmotskega stresa, povzročenega zaradi dodatka polietilen glikola, kar se je spet odrazilo v povečani kaljivosti.
Obdelava s HP izboljša tudi toleranco rastlina na težke kovine. Babajani in sod. (2019) so preverjali vpliv nanodelcev selena in cinka na rastline navadne melise (Melissa officinalis).
Izkazalo se je, da so visoke koncentracije težkih kovin imele blažji vpliv na sadike, ki so bile predhodno obdelane s HP. Sadike so imele boljše rastne parametre (dolžina stebla, dolžina korenin in širina listov), blažji pa so bili znaki toksičnosti selena in cinka.
Enotne razlage za učinke HP na morfologijo in fiziologijo semen še ni, saj HP zajema veliko različnih plazemskih postopkov s precej pomembnimi razlikami v operativnih parametrih, delovnem tlaku, koncentraciji reaktivnih delcev in spojin, elektronski gostoti, jakosti električnega polja itd. Prav tako pa so učinki odvisni od same strukture in sestave semena, kar se zelo razlikuje med različnimi rastlinskimi vrstami (Gómez-Ramírez in sod., 2017).
3.2 HITROST KALITVE
Ugodni učinki obdelave semen s HP so bili dokazani že na več vrstah rastlin kot so npr. pšenica, riž, ječmen, oves, soja, špinača, oljna repica, čičerika, kumara itd. Obdelava lahko bistveno izboljša kaljivost, rast in tudi donos rastlin (de Groot in sod., 2018). Te posledice lahko pripišemo različnim učinkom plazme na semena. Spremenijo se lahko fizikalne in kemijske lastnosti semenske ovojnice (poveča se hidrofilnost, prepustnost za vodo in omočljivost, povrhnjica je jedkana, površina se oksidira, na površino semen se vključi tudi več dušika), ki pozitivno vplivajo na kalitev (Adhikari in sod., 2020). Pride lahko tudi do dekontaminacije semenskih patogenov, v seme lahko prodrejo reaktivni delci in spojine, ki ob interakciji s celicami lahko stimulirajo rastne hormone, aktivirajo določene encime in uravnavajo ravni
11
demetilacije nekaterih genov (ob tem pa se ne spremeni genski material semen), kar dodatno spodbudi kalitev ter rast sadik (Pérez-Pizá in sod., 2019).
Reaktivne kisikove zvrsti (ROS) pospešujejo oksidacijo aleuronske plasti in mobilizacijo zalog hranil med kalitvijo semen. Vodikov peroksid služi vzdrževanju nizkega razmerja med abscizinsko in giberelinsko kislino, kar spodbuja aktivacijo amilaze, mobilizacijo zalog hranil in nizko proizvodnjo antioksidativnih encimov. Dušikov oksid pa uravnava proizvodnjo abscizinske kisline, fitohormona, ki zavira kalitev in spodbuja dormanco. Učinki ROS so različni glede na plazemski vir, rastlinsko vrsto, čas obdelave, dovodne pline in vsebnost vlage (Adhikari in sod., 2020).
Pérez-Pizá in sod. (2019) so primerjali, kako obdelava s HP vpliva na semena soje (od teh so bila nekatera zdrava, druga pa okužena z glivami). Z DBD plazmo so obdelali zdrava semena in semena okužena z Diaporthe caulivora, D. aspalathi, D. sojae in D. longicolla. Rezultati so pokazali, da se je izboljšala kaljivost semen, hitrost rasti se je zvišala za 10-23 % pri zdravih rastlinah. Povečala se je sveža masa in dolžina korenin rastlin, tako okuženih kot zdravih (pri zdravih je bila sprememba večja). Skupna listna površina rastlin zraslih iz zdravih in okuženih semen je bila za 2 do 5 krat večja od kontrolne. Na splošno so bili učinki izboljšanja pri okuženih semenih večji kot pri zdravih semenih. Okužene kontrolne rastline so imele znatno nižjo svojo fotosintezno aktivnost glede na zdravo kontrolo (med 2 in 5 %), kar kaže na jasen vpliv glivične okužbe na primarni metabolizem. Obdelana okužena semena so imela fotosintezno učinkovitost in vsebnost klorofila podobno zdravim kontrolam in višje od okuženih kontrol. Poleg dolžine korenin pa so vse obdelane rastline imele povečano število strokov in semen, višino rastlin in premer stebla. Tako je bil večji tudi donos soje. Študija je potrdila, da DBD plazma izboljšuje kakovost semen (kaljivost, moč in zdravje). Kaljivost, moč kalic, suhe mase sadik in velikost pridelka so se pri vseh preizkušenih obdelavah občutno povečale. Plazemska obdelava pa je rastlinam zagotavljala tudi normalno in zdravo fiziološko delovanje, saj se je zmanjšala kontaminacija s patogeni. To pa je prispevalo tudi k boljši rasti soje.
Shashikanthalu in sod. (2020) pa so z DBD plazmo obdelali semena kumine. Tudi pri tej raziskavi so opazili izboljšanje deleža kalitve in parametrov rasti (dolžina korenin, dolžina poganjkov, dolžina sadik, koncentracija klorofila, indeks odpornosti, suhe mase poganjka in korenine), vendar pa so bili rezultati različni glede na čas izpostavljenosti. Pri predolgi izpostavljenosti so bili rezultati slabši v primerjavi s kontrolo. Hitrejša kalitev pa je predvsem posledica interakcije semenskih celic s plazmo, ki pospešuje encimske aktivnosti in razgrajuje notranje hranilne snovi semen, ki predstavljajo vir energije za rast sadike. HP spodbuja aktivnost amilaze in proteaze pri presnovi topnega sladkorja in beljakovin, kar je bistvenega pomena za proces kalitve. Opazili so tudi spremembe v koncentraciji klorofila, ki je glavni fotosintezni pigment rastlin. Spremembe koncentracije klorofila vplivajo na proces fotosinteze in s tem tudi na kopičenje fotosinteznih produktov. Celotni klorofil in klorofil a sta se znatno povečala pri 3-minutnem obsevanju (za 15,5 % in 41,85 % v primerjavi s kontrolo). Medtem ko so listi rastlin, katerih semena so bila obdelana s plazmo, imeli manjše koncentracije klorofila b kot kontrola. S tem se je povečala fotosintezna učinkovitost in posledično tudi rast sadike.
12
Obdelava s HP lahko prekine dormanco semen. V času razširjanja semen so ta večinoma dormantna, da se izognejo kalitvi v neugodnih okoljskih razmerah. Mnogo dormantnim semenom pa ne uspe skaliti, kljub ugodnim pogojem. Na dormanco in kalitev poleg okoljskih dejavnikov vplivajo tudi trda semenska ovojnica, prisotnost zaviralcev kalitve, obdobje zorenja semen, nezrel embrio, neprepustnost semenske ovojnice za kisik in vodo ter hormonska neravnovesja. Za ohranjanje dormance je odgovorna abscizinska kislina, za njeno prekinitev pa giberelinska kislina (Adhikari in sod., 2020). Pri obdelavi s plazmo se namreč poveča koncentracija giberelinske in zmanjša količina abscizinske kisline, s čimer se spodbudi kalitev semen. Povečana koncentracija giberelinske kisline pa spodbuja aktivnost α-amilaz, ki razgradijo kompleksne polisaharide in tako omogočijo presnovo sladkorja, ki vzpodbudi začetek kalitve (Mildažienė in sod., 2019).
Lo Porto in sod. (2019) so izvedli študijo na divjem šparglju, za katerega je značilna nizka kaljivost semen in dolg čas kalitve. Prav zaradi teh dveh omejitvenih dejavnikov je divje šparglje zelo težko gojiti. Pri semenih divjega šparglja pa je pogosta tudi fiziološka dormanca, na katero vplivajo genetski in okoljski dejavniki. V tej raziskavi so primerjali kalitev semen:
obdelanih s plazmo (plin je bil mešanica kisika in dušika), namakanih, premazanih s polietilen glikolom (PEG) in obdelanih z giberelinsko kislino (GA3). Pri konvencionalnih metodah (namakanje, PEG in GA3) po 60 dneh še niso opazili izboljšane kaljivosti, pri namakanju se je ta povečala za 14 % po 90 dneh, GA3 ni imela vpliva na kaljivost semen, prav tako ne PEG (vrednosti so bile celo nižje v primerjavi s kontrolo). Pri semenih obdelanih s plazmo je bil delež kaljivosti za 15 % večji od kontrole po 150 dneh; za 11 % pa je bila vrednost večja od namakanih semen. Ker je čas kalitve zelo dolg, so se na površini večine semen razrastle tudi razne glive, izjema pa so bila semena obdelana s plazmo, saj ima ta tudi protimikrobno delovanje. Ti rezultati kažejo, da lahko HP močno pripomore pri težavah, ki jih predstavljajo semena z zelo dolgo dormanco.
3.3 VPLIV NA PRISOTNOST PATOGENIH MIKROORGANIZMOV
Za trajnostno pridelavo hrane je ključen tudi nadzor nad rastlinskimi boleznimi, katerih glavni povzročitelji so predvsem mikroorganizmi in zaradi katerih vsako leto pride do izgube 20-30
% pridelkov na njihov račun. Ta problem pa stopnjuje še globalno segrevanje, ker višanje temperatur in koncentracije CO2 vpliva na dovzetnost rastlin na nekatere patogene.
Najpogosteje se za uničevanje patogenov uporabljajo razna kemična sredstva, ki pa so škodljiva za okolje in lahko privedejo do odpornosti patogenov nanje. HP pa ima potencial kot metoda, s katero bi lahko učinkovito in okolju prijazno zatirali rastlinske bolezni. Pri obdelavi semen s plazmo bi tako lahko preprečili bolezni, ki se prenašajo s semeni. Veliko študij je že pokazalo, da je HP učinkovita za zmanjšanje rasti bakterij (npr. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria, Salmonella…) in gliv (Adhikari in sod., 2020).
Mráz in sod. (2014) so opazovali, kako obdelava s HP vpliva na rast 2 fitopatogenih bakterij:
Clavibacter michiganensis (Gram-pozitivna) in Erwinia amylovora (Gram-negativna). Potrdili so, da je izpostavljenost plazmi upočasnila njihovo rast in razmnoževanje.
ROS in RNS so v visokih koncentracijah toksične za bakterije, ker oksidirajo beljakovine, lipide in nukleinske kisline ter vodijo do uničenja patogenov. Učinki reaktivnih zvrsti na patogene so prikazani na sliki 4 (Adhikari in sod., 2020).
13
Natančen mehanizem inaktivacije bakterij še ni znan, saj HP povzroči več sprememb. Pride do permeabilizacije celične membrane in celične stene, kar vodi v uhajanje znotrajceličnih snovi.
Pri Gram negativnih bakterijah so spremembe celične stene večje, saj je ta tanjša v primerjavi z Gram pozitivnimi bakterijami (Gram pozitivne imajo debelejšo plast peptidoglikana). V membrani se lahko pojavijo pore, iz katerih potem lahko uhajajo ioni (npr. kalij), nukleinske kisline in beljakovine. Na DNA lahko nastanejo pirimidinski dimeri, pride pa tudi do razgradnje beljakovin, in sicer se prvi razgradijo veliki proteini (Niedźwiedź in sod., 2019).
Slika 4: Mehanizmi delovanja reaktivnih zvrsti HP pri inaktivaciji mikroorganizmov (prirejeno po Niedźwiedź in sod., 2019)
HP pa je učinkovita tudi pri inaktivaciji biofilmov. Biofilm je skupina mikroorganizmov, ki izločajo ekstracelularni matriks, s katerim so celice tudi obdane. Zanje je značilna adhezija na površine in se jih zelo težko odstrani, saj so celice zaradi matriksa bolj odporne na zunanje dejavnike, kot sta na primer temperatura in pH (Niedźwiedź in sod., 2019). Biofilmi se lahko pojavijo tudi na površini semen, še posebej pa je to problem pri pridelavi kalčkov, ki se lahko uživajo tudi surovi. Vedno bolj priljubljena postaja ekološka pridelava, pri kateri imamo na voljo zelo omejena sredstva za razkuževanje semen. Kljub predhodnemu razkuževanju pa se lahko na površini še vedno razrastejo biofilmi, saj se kalčke goji pri visoki vlažnosti in temperaturi 22 – 24°C, kar je ugodno za razrast mikroflore semena (npr. na površini semen fižola se lahko nahajajo patogeni mikroorganizmi, najpogosteje so to bakterije E. coli ali vrste iz rodu Salmonella). To pa predstavlja dejavnik tveganja za zdravje ljudi, saj lahko pride do zastrupitve s hrano (Kruk in Trzaskowska, 2021). Pri inaktivaciji biofilmov pa je potreben daljši čas obdelave kot za bakterije v planktonski obliki (Niedźwiedź in sod., 2019). To so potrdili Jahid in sod. (2014), ko so primerjali čas obdelave biofilma in planktonske oblike bakterije Aeromonas hydrophila, s katero so predhodno inokulirali solato. Število prostih živih bakterij (planktonsko stanje) se je zmanjšalo za 5 logaritemskih enot že po 15 sekundah obdelave s plazmo. Medtem ko je bil učinkovit čas obdelave za znatno zmanjšanje populacije biofilmov od ene do petih minut. Učinkovitost pa je bila odvisna tudi od temperature, večja je bila pri nižjih temperaturah (4°C, 10°C in 15°C). Pri temperaturah nad 15°C pa se je močno znižala.
14
Učinkovitost procesa je odvisna še od debeline biofilma, parametra sta v obratnem sorazmerju - večja je debelina, manjša bo učinkovitost. Vpliva pa tudi vrsta mikroorganizmov v biofilmu.
Biofilme z Gram negativnimi bakterijami se inaktivira v krajšem času kot biofilme z Gram pozitivnimi bakterijami (Niedźwiedź in sod., 2019).
Učinkovita inaktivacija spor je bila dokazana tudi pri več fitopatogenih glivah, kot so npr.
rodovi Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Phomopsis, Colletotrichum, Ascochyta, Chaetomium in Rhizoctonia (Adhikari in sod., 2020).
Reaktivne spojine imajo negativen učinek na glivne celice: raztezanje vakuol in razpad membrane, uhajanje citoplazme, liza celic, poškodujejo nukleinske kisline ter povzročijo oksidacijo beljakovin in lipidov. Dodatno lahko HP sproži tudi apoptozo ali nekrozo celic in spor. Dodano vrednost pa predstavlja inaktivacija mikotoksinov kot so aflatoksin, fumonizin, zearalenon, ohratoksin in deoksinivalenol. Mikotoksini so zelo problematični, ker so termostabilni (razgradijo se šele pri temperaturi med 237 in 306 °C). Toksičnost se najverjetneje zmanjša zaradi spremembe strukture spojin (Niedźwiedź in sod., 2019).
Protivirusni učinki plazme so bili dokazani pri človeških, živalskih in rastlinskih virusih, pa tudi pri bakteriofagih. HP lahko povzroči spremembo ali razgradnjo beljakovin, nukleinskih kislin in lipidov virusnih ovojnic. Pri bakteriofagih pa pride do poškodb kapsidnih proteinov in s tem inaktivacije virusa (Niedźwiedź in sod., 2019).
Hanbal in sod. (2018) so v raziskavi opazovali, kako obsevanje vpliva na virus tobačnega mozaika. Listi, ki so bili inokulirani s kontrolno skupino virusa (neobsevan), so razvili nekrotične lezije. V rastlinah tobaka, inokuliranih z obsevanim virusom, pa do razvoja bolezni ni prišlo. Rezultati so pokazali poškodbe virusnih delcev, ki sestavljajo plašč in fragmentacijo virusne RNA. To je povzročilo, da je virus izgubil infektivnost.
Filipić in sod. (2019) so uporabili hladno atmosfersko plazmo za inaktivacijo krompirjevega virusa Y. Gre za virus, ki se prenaša z vodo, kar pomeni da se hitro širi po zaprtih namakalnih sistemih. Povzroči lahko znatne izgube pridelka (do 80 %) in lahko okuži tudi druge pridelke kot sta paradižnik in poper. Ugotovili so, da je za uspešno inaktivacijo virusa dovolj že ena minuta obdelave vzorca vode, in sicer tako pri visoki kot tudi pri nizki koncentraciji virusa.
Glavno vlogo pri inaktivaciji pa so pripisali reaktivnim kisikovim spojinam.
Rastline na patogene reagirajo z regulacijo ekspresije odpornostnih genov. Pri okužbi se začnejo izražati geni povezani s patogenezo (geni PR). Plazemska obdelava poveča izražanje mRNA, ki kodira gene PR1a, PR1b in PR3a (za hitinazo). HP tako aktivira obrambne sisteme rastlinskih celic, saj znatno poveča ekspresijo genov PR, kar je verjetno posledica delovanja RNS in ROS (Panngom in sod., 2014).
Pomembno vlogo pri odzivu rastlin na patogene imajo ROS in RNS. Med invazijo patogena se njihova koncentracija poveča. Njihova naloga je inaktivacija patogenega organizma in aktivacija imunskega sistema rastline (začetek izražanja genov povezanih z obrambo npr.
genov PR) (Adhikari in sod., 2020). Reaktivne spojine imajo lahko koristne ali pa škodljive učinke na organizem, kar je odvisno od časa izpostavitve in samega organizma (Panngom in sod., 2014).
15
Plazemska tehnologija ima kot orodje za obvladovanje rastlinskih bolezni veliko prednosti, toda tudi nekaj slabosti. Ima manj možnosti, da povzroči odpornost patogenov, kar je glavna pomanjkljivost kemičnih sredstev. Reaktivne atomske in molekularne zvrsti, ki se generirajo v HP, so kratkožive in zato je njihov vpliv na okolje kratkotrajen (bolj okolju prijazna metoda).
Postopek je zelo učinkovit za različne patogene (glive, bakterije in viruse) in ima relativno nizko ceno. Kljub temu pa bo pred splošno uporabo potrebno rešiti kar nekaj težav. Potrebno bo optimizirati parametre HP (moč, tip plina, dolžino izpostavitve…), ki bodo dovolj učinkoviti za dekontaminacijo semen. Čas delovanja namreč ni dovolj, ker se viri in parametri plazme lahko še vedno razlikujejo. Na komponente plazme (ione, ROS, RNS, UV…) prav tako močno vpliva okolje. V prihodnosti bi se plazmo lahko uporabljalo tudi za cepljenje rastlin. S cepljenjem se aktivira imunske celice z blago izpostavljenostjo biološkim in kemičnim sredstvom proti boleznim. Rastline imajo imunski sistem, ki ga lahko aktiviramo z ROS in RNS, prisotnimi v plazmi. Te vstopijo skozi rane ali majhne odprtine, nato vstopijo v rastlinske celice. Posledica je, da se v njih zviša raven ROS in RNS, kar aktivira imunski sistem in naredi rastline bolj odporne proti boleznim (Adhikari in sod., 2020).
4 ZAKLJUČKI
Izkaže se, da ima obdelava semen s HP učinek na mnoge lastnosti semen. Posledice obdelave so najedkana semenska ovojnica, kar poveča njeno hidrofilnost in s tem tudi omočljivost semena. Posledično je izboljšana tudi imbibicija in kaljivost semen. Omočljivost še dodatno poveča delna razgradnja celuloze. Spremeni se kemijska sestava površine semen, saj pride do oksidacije zaradi izpostavljenosti reaktivnim atomskim in molekularnim zvrstem. Izboljšana je hitrost rasti, rastline imajo večjo svežo maso, daljše korenine, večje število plodov in semen, s čemur imamo večji donos. To pa pomeni, da za enako količino pridelane hrane potrebujemo manjšo pridelovalno površino. Večja je koncentracija klorofila in s tem je večja intenziteta fotosinteze, kar pozitivno vpliva na rast sadik. Obdelava s plazmo lahko tudi prekine dormanco semen, saj poveča imbibicijo in vpliva na koncentracijo hormonov, ki so odgovorni za dormanco in njeno prekinitev (abscizinska in giberelinska kislina). Spremeni se ekspresija genov, in sicer se poveča izražanje genov, ki kodirajo giberelinsko kislino ter etilen, zmanjša pa se izražanje genov za abscizinsko kislino. Poleg abscizinske in giberelinske kisline je spremenjeno izražanje tudi drugih rastlinskih hormonov: zmanjša se izražanje avksinov, poveča pa izražanje citokininov (predvsem zeatina).
Poveča se tudi ekspresija gena MAPK, genov za salicilno in jasmonsko kislino, katalazo in superoksid dimutazo ter genov PR. Pri tem ne pride do sprememb nukleotidnega zaporedja DNA, ampak do demetilacije določenih genov, kar poveča njihovo ekspresijo.
Bistveno boljša je odpornost sadik na stres, ki ga lahko povzročijo suša, slanost ali pa povečane koncentracije kovin v prsti, kar omogoča da rastline lahko uspevajo v neugodnih okoljskih pogojih. Za večino teh sprememb pa so odgovorne reaktivne atomske in molekularne zvrsti, ki vplivajo na površino semena, prodrejo pa še v notranjost.
Izboljša se aktivnost amilaz, proteaz in fitaz zaradi česa semena vsebujejo več topnih sladkorjev in beljakovin. Poleg teh encimov pa je večja tudi aktivnost antioksidativnih encimov (superoksid mutaze, peroksidaze, katalaze), ki ščitijo rastline pred oksidativnim stresom, ki ga povzročajo prosti radikali.
16
HP je lahko zelo učinkovita pri dekontaminaciji semen in tako prispeva k zmanjšanju pojava rastlinskih bolezni ter posledično povečanju pridelka. Inaktivira lahko tako viruse kot različne vrste mikroorganizmov od bakterij (tako Gram negativne kot tudi Gram pozitivne) do gliv in njihovih spor.
HP ima tako potencial kot učinkovito orodje za povečanje donosa rastlin in zatiranje rastlinskih patogenov. Ima mnogo prednosti kot so možnost za »scale up« (možna je obdelava velikega števila semen hkrati), nizki stroški, kratek čas obdelave, prav tako pa je tehnologija prijazna uporabniku (nenevarna za ravnanje) in okolju, saj so reaktivne zvrsti nestabilne, s čimer je njihov vpliv na okolje kratkotrajen.
Kljub vsem naštetim prednostim pa ima ta tehnologija tudi kar nekaj omejitev. Pri predolgi izpostavljenosti semen plazmi lahko nastane preveč razpok na semenski ovojnici, kar poslabša njihovo obstojnost. Prevelika škoda na semenih pa tako lahko celo zmanjša kaljivost in poveča stopnjo okužbe z mikroorganizmi. Prav tako lahko daljša izpostavitev povzroči genotoksične učinke (zaradi sevanja UV), še posebej pri semenih brez teste.
Glavni izziv predstavljajo raznoliki načini izpostavitve in obdelave objektov ter raznolikost plazemskih naprav. HP se lahko razlikuje tako po samem viru kot tudi po parametrih (tlak, količina reaktivnih zvrsti, elektronska gostota, električno polje, dovodni plin, čas obdelave, vsebnost vlage, napetost idr.). Učinki pa se zelo razlikujejo tudi glede na vrsto semen, saj so za različne rastlinske vrste značilne različne lastnosti semen kot so velikost, trdota, morfologija površine ipd. Na sestavo plazme vpliva še okolje - pri dekontaminaciji je to recimo sam patogen. Prav tako kljub mnogim študijam vplivov hladne plazme, njeni natančni mehanizmi delovanja še vedno niso razjasnjeni. Zato bodo potrebne še nadaljnje raziskave, da se pojasni biološki mehanizem delovanja, s čimer se bo lahko izboljšalo tudi učinkovitost. Nujna je tudi standardizacija in optimizacija procesa, da se za vsako rastlinsko vrsto določi optimalen vir plazme in čas delovanja (splošen odmerek je zaradi vpliva mnogih dejavnikov praktično nemogoče določiti). Pri tem želimo ohraniti vse pozitivne posledice tretmaja (povečana kaljivost, omočljivost, odpornost na stres idr.) in minimizirati negativne učinke (npr. nastanek pirimidinskih dimerov). Potrebne bodo še terenske študije (na polju), da se potrdi uporabnost tehnologije v praksi. Preden pa se bo tehnologijo HP uporabljalo v industriji, bo potrebno premostiti še mnoge izzive: preučiti tehnološko učinkovitost, strupenost, določiti odmerke, tehnologija mora biti odobrena s strani regulatornih organov in sprejeta tudi s strani potrošnikov.
Po mojem mnenju bo tehnologija v prihodnosti veliko pripomogla na mnogih področjih, ne le v kmetijstvu, ampak tudi v živilstvu (za dekontaminacijo, degradacijo toksinov npr.
mikotoksinov, inaktivacijo encimov), pri čiščenju vode (za degradacijo pesticidov, barvil, dekontaminacijo), v medicini (dezinfekcija ran, sterilizacija, za stimuliranje proliferacije matičnih celic, za zdravljenje tumorjev), za spreminjanje površine polimerov idr.
5 VIRI
Adhikari B., Adhikari M., Ghimire B., Park G., Choi E. H. 2019. Cold atmospheric plasma- activated water irrigation induces defense hormone and gene expression in tomato seedlings.
Scientific Reports, 9, 1, 16080, doi:10.1038/s41598-019-52646-z: 15 str.
17
Adhikari B., Adhikari M., Park G., 2020. The effects of plasma on plant growth, development, and sustainability. Applied Sciences, 10, 17, 6045, doi:10.3390/app10176045: 19 str.
Adhikari B., Pangomm K., Veerana M., Mitra S., Park G. 2020. Plant disease control by non- thermal atmospheric-pressure plasma. Frontiers in Plant Science, 11, 77,
doi:10.3389/fpls.2020.00077: 15 str.
Alves Junior C., de Oliveira Vitoriano J., da Silva D. 2016. Water uptake mechanism and germination of Erythrina velutina seeds treated with atmospheric plasma. Scientific Reports, 6, 33722, doi:10.1038/srep33722: 7 str.
Babajani A., Iranbakhsh A., Oraghi Ardebili Z. 2019. Seed priming with non-thermal plasma modified plant reactions to selenium or zinc oxide nanoparticles: cold plasma as a novel emerging tool for plant science. Plasma Chemistry and Plasma Processing, 39: 21–34 Bafoil M., Le Ru A., Merbahi N. 2019. New insights of low-temperature plasma effects on
germination of three genotypes of Arabidopsis thaliana seeds under osmotic and saline stresses. Scientific Reports, 9, 8649, doi:10.1038/s41598-019-44927-4: 10 str.
Bárdos L., Baránková H., 2008. Plasma processes at atmospheric and low pressures. Vacuum, 83, 3: 522-527
Bernhardt T., Semmler M. L., Schäfer M., Bekeschus S., Emmert S., Boeckmann L. 2019.
Plasma medicine: applications of cold atmospheric pressure plasma in dermatology.
oxidative medicine and cellular longevity. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2019, 3873928, doi:10.1155/2019/3873928: 10 str.
Bongaarts J., 2009. Human population growth and the demographic transition. Philosophical Transactions of The Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 364, 1532:
2985-2990
Bormashenko E., Grynyov R., Bormashenko Y. 2012. Cold radiofrequency plasma treatment modifies wettability and germination speed of plant seeds. Scientific Reports, 2, 741, doi:10.1038/srep00741: 8 str.
de Groot G. J. J. B., Hundt A., Murphy A. B., Bange M. P., Mai-Prochnow A. 2018. Cold plasma treatment for cotton seed germination improvement. Scientific Reports, 8, 1, 14372, doi:10.1038/s41598-018-32692-9: 10 str.
Degutytė-Fomins L., Paužaitė G., Žūkienė R., Mildažienė V., Koga K., Shiratani M. 2020.
Relationship between cold plasma treatment-induced changes in radish seed germination and phytohormone balance. The Japanese Journal of Applied Physics, 59, doi:10.7567/1347- 4065/ab656c: 24 str.
Filipić A., Primc G., Zaplotnik R., Mehle N., Gutierrez-Aguirre I., Ravnikar M., Mozetič M., Žel J., Dobnik D., 2019. Cold atmospheric plasma as a novel method for inactivation of potato virus Y in water samples. Food and Environmental Virology, 11: 220–228
18
Gómez-Ramírez A., López-Santos C., Cantos M. 2017. Surface chemistry and germination improvement of quinoa seeds subjected to plasma activation. Scientific Reports, 7, 5924, doi:10.1038/s41598-017-06164-5: 12 str.
Guo Q., Wang Y., Zhang H. 2017. Alleviation of adverse effects of drought stress on wheat seed germination using atmospheric dielectric barrier discharge plasma treatment. Scientific Reports, 7, 16680, doi:10.1038/s41598-017-16944-8: 14 str.
Hanbal S.E., Takashima K., Miyashita S. 2018. Atmospheric-pressure plasma irradiation can disrupt tobacco mosaic virus particles and RNAs to inactivate their infectivity. Archives of Virology, 163: 2835–2840
Hoffmann C., Berganza C., Zhang J. 2013. Cold atmospheric plasma: methods of production and application in dentistry and oncology. Medical Gas Research, 3, 1, 21, doi:10.1186/2045-9912-3-21: 15 str.
Holubová Ľ., Kyzek S., Ďurovcová I., Fabová J., Horváthová E., Ševčovičová A., Gálová E.
2020. Non-thermal plasma-a new green priming agent for plants?. International Journal of Molecular Sciences, 21, 24, 9466, doi:10.3390/ijms21249466: 16 str.
Iranbakhsh A., Ardebili N.O., Ardebili Z.O. 2018. Non-thermal plasma induced expression of heat shock factor A4A and improved wheat (Triticum aestivum L.) growth and resistance against salt stress. Plasma Chemistry amd Plasma Processing, 38: 29–44
Jahid I. K., Han N., Ha S. D., 2014. Inactivation kinetics of cold oxygen plasma depend on incubation conditions of Aeromonas hydrophila biofilm on lettuce. Food Research International, 55: 181-189
Kruk M., Trzaskowska M., 2021. Analysis of biofilm formation on the surface of organic mung bean seeds, sprouts and in the germination environment. Foods, 10, 3, 542, doi:10.3390/foods10030542: 20 str.
Laroussi M. 2020. Cold plasma in medicine and healthcare: the new frontier in low temperature plasma applications. Frontiers in Physics, 8, 74, doi:10.3389/fphy.2020.00074: 7 str.
Li H. P., Wang L. Y., Li G., Jin L. H., Le P-S., Zhao H. X., Xing X. H., Bao C. Y. 2011.
Manipulation of lipase activity by the helium radio-frequency, atmospheric-pressure glow discharge plasma jet. Plasma Processes and Polymers, 8, 3: 224–229
Ling L., Jiangang L., Minchong S. 2015. Cold plasma treatment enhances oilseed rape seed germination under drought stress. Scientific Reports, 5, 13033, doi: 10.1038/srep13033: 10 str.
Lo Porto C., Sergio L., Boari F., Logrieco A. F., Cantore V., 2019. Cold plasma pretreatment improves the germination of wild asparagus (Asparagus acutifolius L.) seeds.
Scientia Horticulturae, 256, 108554, doi:10.1016/j.scienta.2019.108554: 6 str.
19
Mildaziene V., Pauzaite G., Naucienė Z., Malakauskiene A., Zukiene R., Januskaitiene I., Jakstas V., Ivanauskas L., Filatova I., Lyushkevich V., 2018. Pre-sowing seed treatment with cold plasma and electromagnetic field increases secondary metabolite content in purple coneflower (Echinacea purpurea) leaves. Plasma Processes and Polymers, 15, 2, doi:10.1002/ppap.201700059: 11 str.
Mildažienė V., Aleknavičiūtė V., Žūkienė R. 2019. Treatment of common sunflower (Helianthus annus L.) seeds with radio-frequency electromagnetic field and cold plasma induces changes in seed phytohormone balance, seedling development and leaf protein expression. Scientific Reports, 9, 6437, doi:10.1038/s41598-019-42893-5: 12 str.
Mráz I., Beran P., Šerá B., Gavril B., Hnatiuc E. 2014. Effect of low-temperature plasma treatment on the growth and reproduction rate of some plant pathogenic bacteria. Journal of Plant Pathology, 96, 1: 63-67
Niedźwiedź I., Waśko A., Pawłat J., Polak-Berecka M. 2019. The state of research on antimicrobial activity of cold plasma. Polish Journal of Microbiology, 68, 2: 153–164 Panngom K., Lee S. H., Park D. H., Sim G. B., Kim Y. H., Uhm H. S., Park G., Choi E. H.
2014. Non-thermal plasma treatment diminishes fungal viability and up-regulates resistance genes in a plant host. PloS ONE, 9, 6: e99300, doi:10.1371/journal.pone.0099300: 12 str.
Pérez-Pizá M. C., Prevosto L., Grijalba P. E., Zilli C. G., Cejas E., Mancinelli B., Balestrasse K. B. 2019. Improvement of growth and yield of soybean plants through the application of non-thermal plasmas to seeds with different health status. Heliyon, 5, 4: e01495, doi:10.1016/j.heliyon.2019.e01495: 33 str.
Peťková M., Švubová R., Kyzek S., Medvecká V., Slováková Ľ., Ševčovičová A., Gálová E.
2021. The effects of cold atmospheric pressure plasma on germination parameters, enzyme activities and induction of dna damage in barley. International Journal of Molecular Sciences, 22, 6, 2833, doi:10.3390/ijms22062833: 16 str.
Rahman M. M., Sajib S. A., Rahi M. S., Tahura S., Roy N. C., Parvez S., Reza M. A., Talukder M. R., Kabir A. H. 2018. Mechanisms and signaling associated with LPDBD plasma mediated growth improvement in wheat. Scientific Reports, 8, 1, 10498, doi:10.1038/s41598-018-28960-3: 11 str.
Roos J., Hopkins R., Kvarnheden A., 2011. The impact of global warming on plant diseases and insect vectors in Sweden. European Journal of Plant Pathology, 129: 9–19
Rossati A., 2017. Global warming and its health impact. The International Journal of Occupational and Environmental Medicine, 8, 1: 7–20
Sadhu S., Thirumdas R., Deshmukh R. R., Annapure U. S. 2017. Influence of cold plasma on the enzymatic activity in germinating mung beans (Vigna radiate). LWT, 78: 97-104
20
Shapira Y., Bormashenko E., Drori E. 2019. Pre-germination plasma treatment of seeds does not alter cotyledon DNA structure, nor phenotype and phenology of tomato and pepper plants. Biochemical and Biophysical Research Communications, 519, 3: 512-517
Shashikanthalu S. P., Ramireddy L., Radhakrishnan M., 2020. Stimulation of the germination and seedling growth of Cuminum cyminum L. seeds by cold plasma. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, 18, 100259, doi:10.1016/j.jarmap.2020.100259: 8 str.
Song J-S., Kim S. B., Ryu S., Oh J., Kim D-S. 2020. Emerging plasma technology that alleviates crop stress during the early growth stages of plants: a review. Frontiers in Plant Science, 11, 988, doi:10.3389/fpls.2020.00988: 14 str.
Tendero C., Tixier C., Tristant P., Desmaison J., Leprince P. 2006. Atmospheric pressure plasmas: a review. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 61, 1: 2-30
Tong J., He R., Tang X., Li M., Wan J. 2020. Transcriptomic analysis of seed germination improvement of Andrographis paniculata responding to air plasma treatment. PloS ONE, 15, 10: e0240939, doi:10.1371/journal.pone.0240939: 16 str.
Wang X. Q., Zhou R. W., de Groot G. 2017. Spectral characteristics of cotton seeds treated by a dielectric barrier discharge plasma. Scientific Reports, 7, 5601,
doi:10.1038/s41598-017-04963-4: 9 str.
Zhang J. J., Jo J. O., Huynh D. L., Mongre R. K., Ghosh M., Singh A. K., Lee S. B., Mok Y.
S., Hyuk P., Jeong D. K. 2017. Growth-inducing effects of argon plasma on soybean sprouts via the regulation of demethylation levels of energy metabolism-related genes. Scientific Reports, 7, 41917, doi:10.1038/srep41917: 12 str.
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorici prof. dr. Katarini Vogel-Mikuš za prevzem mentorstva, vso pomoč, svetovanje in usmerjanje pri pisanju diplomske naloge. Zahvaljujem se tudi Juretu Mravljetu za pregled diplomskega dela.
Svoji družini se zahvaljujem za brezpogojno podporo tekom študija.
