UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NUŠA KRIŽOVNIK DIPLOMSKA NALOGA
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NUŠA KRIŽOVNIK
VREDNOTENJE ZDRUŽLJIVOSTI IZBRANIH RETINOIDOV IN BENZOIL PEROKSIDA V KOZMETIČNIH IZDELKIH
COMPATIBILITY EVALUATION OF SELECTED RETINOIDS AND BENZOYL PEROXIDE IN COSMETIC PRODUCTS
UNIVERSITY STUDY PROGRAMME OF COSMETOLOGY
Ljubljana, 2021
Pod mentorstvom prof. dr. Roberta Roškarja, mag. farm. in somentorstvom asist. dr. Žane Temova Rakuša, mag. farm., sem diplomsko delo izvajala na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko Fakultete za farmacijo.
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorju prof. dr. Robertu Roškarju, mag. farm. za strokovne nasvete in vso pomoč pri razvoju diplomske naloge. Posebna zahvala gre somentorici asist.
dr. Žane Temova Rakuša, mag. farm., ki me je vodila skozi delo v laboratoriju in mi je vedno svetovala ter stala ob strani v času nastajanja diplomske naloge. Zahvalila bi se tudi moji družini, še posebej staršema, ki sta me podpirala in verjela vame vsa leta študija.
IZJAVA
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno, pod vodstvom mentorja prof. dr.
Roberta Roškarja, mag farm. in somentorice asist. dr. Žane Temova Rakuše, mag. farm.
Nuša Križovnik
Komisija za zagovor:
Predsednica: izr. prof dr. Alenka Zvonar Pobirk Mentor: prof. dr. Robert Roškar
Somentorica: asist. dr. Žane Temova Rakuša Član: doc. dr. Stane Pajk
KAZALO
1 UVOD ... 1
1.1 AKNE ... 1
1.1.1 Epidemiologija ... 1
1.1.2 Patogeneza... 1
1.1.3 Kožne vzbrsti, značilne za acne vulgaris ... 2
1.1.4 Vrste aken ... 2
1.1.5 Kozmetični izdelki za nego aknaste kože in zakonodaja na področju kozmetike ... 4
1.1.6 Nega aknaste kože ... 5
1.1.7 Zdravljenje aknaste kože ... 5
1.2 RETINOIDI ... 8
1.2.1 Poimenovanje in osnove ... 8
1.2.2 Klasifikacija ... 8
1.2.3 Uporaba za zdravljenje aken ... 9
1.2.4 Stabilnost retinoidov ... 10
1.3 BENZOIL PEROKSID ... 10
1.3.1 Poimenovanje in osnove ... 10
1.3.2 Uporaba za zdravljenje aken ... 11
1.3.3 Stabilnost benzoil peroksida ... 12
1.4 ZDRUŽLJIVOST RETINOIDOV IN BENZOIL PEROKSIDA ... 12
2 NAMEN DELA ... 13
3 MATERIALI IN METODE ... 14
3.1 MATERIALI ... 14
3.1.1 Reagenti in topila ... 14
3.1.2 Standardi ... 14
3.1.3 Naprave in pribor ... 14
3.1.4 Kozmetični izdelki z retinoidi ... 15
3.2 KROMATOGRAFSKI POGOJI HPLC METOD ... 16
3.3 PRIPRAVA RAZTOPIN ... 16
3.3.1 Priprava mobilne faze ... 16
3.3.2 Priprava topila za raztapljanje in ekstracijo retinoidov ... 16
3.3.3 Priprava standardnih raztopin za vrednotenje metode... 17
3.4 STRESNI TESTI ... 17
3.5 VREDNOTENJE ANALIZNE METODE ... 18
3.5.1 Vrednotenje instrumentalne HPLC-UV metode ... 18
3.5.2 Vrednotenje analiznega postopka ... 20
3.6 PRIPRAVA VZORCEV ZA VREDNOTENJE STABILNOSTI RETINOLA OB DODATKU BENZOIL PEROKSIDA V RAZTOPINAH ... 20
3.6.1 Vrednotenje združljivosti retinola in BP v metanolnih raztopinah ... 20
3.6.2 Vrednotenje združljivosti retinola in BP v metanolnih raztopinah pri različnih temperaturah ... 21
3.6.3 Vrednotenje združljivosti retinola in BP v vodnih raztopinah ... 21
3.7 VREDNOTENJE ZDRUŽLJIVOSTI RETINOIDOV OB PRISOTNOSTI BENZOIL PEROKSIDA V KOZMETIČNIH IZDELKIH ... 22
3.7.1 Priprava vzorcev za optimizacijo ekstrakcije retinoidov iz KI... 22
3.7.2 Končni postopek ekstrakcije retinoidov iz KI ... 22
3.7.3 Izračun količine retinola v KI ... 23
3.7.4 Priprava vzorcev za vrednotenje združljivosti retinoidov in BP v izbranih KI 23 4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 25
4.1 PRILAGODITEV ANALIZNE METODE ... 25
4.2 STRESNI TESTI ... 25
4.3 VREDNOTENJE ANALIZNE METODE ... 26
4.3.1 Vrednotenje instrumentalne HPLC-UV metode ... 26
4.3.2 Vrednotenje analiznega postopka ... 28
4.4 VREDNOTENJE STABILNOSTI RETINOLA OB DODATKU BENZOIL PEROKSIDA V RAZTOPINAH ... 28
4.4.1 Vrednotenje stabilnosti retinola ob prisotnosti različnih koncentracij BP 28 4.4.2 Vpliv temperature na združljivost retinola in BP v metanolnih raztopinah 30 4.4.3 Vrednotenje združljivosti retinola in BP v vodnih raztopinah ... 31
4.5 VREDNOTENJE ZDRUŽLJIVOSTI IZBRANIH RETINOIDOV Z BENZOIL PEROKSIDOM V KOZMETIČNIH IZDELKIH ... 32
4.5.1 Optimizacija ekstrakcije retinoidov iz KI ... 33
4.5.2 Vsebnost retinola in HRP v KI pred dodatkom BP ... 34
4.5.3 Stabilnostna študija ... 34
5 SKLEP ... 39
6 LITERATURA ... 40
PRILOGE ... 43
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Pregled testiranih kozmetičnih izdelkov z retinoidi na slovenskem trgu. ... 15
Preglednica II: Kromatografski pogoji izbrane HPLC-UV metode... 16
Preglednica III: Priprava kalibracijskih in kontrolnih (označeni z modro) vzorcev retinola. ... 17
Preglednica IV: Priprava stresnih vzorcev. ... 18
Preglednica V: Priprava vzorcev za vrednotenje združljivosti retinola in BP v MeOH raztopinah. ... 21
Preglednica VI: Priprava vzorcev za vrednotenje združljivosti retinola in BP v vodnih raztopinah. ... 22
Preglednica VII: Postopek za ekstrakcijo retinoidov iz testiranih KI in volumen injiciranja vzorca.. ... 23
Preglednica VIII: Priprava KI z dodatkom BP. ... 24
Preglednica IX: Stabilnost retinola v MeOH vzorcih, izpostavljenim stresnim pogojem. ... 26
Preglednica X: Prikaz znotraj-dnevne in med-dnevne točnosti in ponovljivosti metode. ... 27
Preglednica XI: Prikaz stabilnosti kontrolnih vzorcev retinola, izražena z % vsebnosti glede na čas 0. ... 28
Preglednica XII: Prikaz uspešnosti ekstrakcije retinola iz testiranih KI. ... 28
Preglednica XIII: Prikaz ponovljivosti priprave vzorcev KI. ... 28
Preglednica XIV: Aktivne učinkovine in antioksidanti v izbranih KI. ... 33
Preglednica XVI: Vsebnost retinola in HRP v KI. ... 34
KAZALO SLIK Slika 1: Kemijska struktura retinola. ... 8
Slika 2: Kemijska struktura benzoil peroksida. ... 11
Slika 3: Linearnost metode za retinol. ... 27
Slika 4: Upad koncentracije retinola v MeOH raztopinah brez dodatka BHT pri 25 °C. ... 29
Slika 5: Upad koncentracije retinola v MeOH raztopinah z dodatkom BHT pri 25 °C. ... 30
Slika 6: Upad koncentracije retinola v MeOH raztopinah ob dodatku BP pri 5 °C... 30
Slika 7: Upad koncentracije retinola v MeOH raztopinah ob dodatku BP pri 25 °C. ... 31
Slika 8: Upad koncentracije retinola v MeOH raztopinah ob dodatku BP pri 40 °C. ... 31
Slika 9: Upad koncentracije retinola ob dodatku BP v razmerju 1:40 pri različnih temperaturah... 31
Slika 10: Upad koncentracije retinola v vodnih raztopinah z ali brez dodatka BHT pri 25 °C. ... 32
Slika 11: OR (GA) (1:40) na začetku študije (pri 25 °C). ... 35
Slika 12: OR (GA) (1:40) 4. teden študije (pri 25 °C). ... 35
Slika 13: Upad vsebnosti retinola in HRP v KI ob (1:10) ali brez (K) dodatka 10-kratne koncentracije BP pri 25 °C. ... 36
Slika 14: Upad vsebnosti retinola v vzorcih REV (0,5 %) in REV (0,2 %) z različnim dodatkom BP (razmerje R:BP) pri 25 °C. ... 37
Slika 15: Upad vsebnosti retinola in HRP v vzorcih OR (1,0 %) in OR (GA) z različnim dodatkom BP (razmerje R/HRP:BP) pri 25 °C. ... 37
Slika 16: Upad vsebnosti retinola (%) v REV (0,5 %) ob različnih dodatkih BP (razmerje R:BP) in temperaturah shranjevanja. ... 38
Slika 17: Kromatogram raztopine BHT v MeOH. ... 43
Slika 18: Kromatogram kontrolnega vzorca retinola v MeOH ob času 0. Vzorec smo pripravili v okviru stresnih testov. ... 43
Slika 19: Kromatogram stresnega vzorca retinola v MeOH z dodatkom NaOH po 24 h. ... 43
Slika 20: Kromatogram stresnega vzorca retinola v MeOH, izpostavljenega svetlobi, po 24 h. ... 44
Slika 21: Kromatogram stresnega vzorca retinola v MeOH z dodatkom H2O2 po 24 h. ... 44
Slika 22: Kromatogram stresnega vzorca retinola v MeOH, izpostavljenega 60 °C, po 24 h. ... 44
Slika 23: Kromatogram stresnega vzorca retinola v MeOH z dodatkom HCl po 24 h. ... 45
i POVZETEK
Retinoidi so pogoste sestavine izdelkov za nego in zdravljenje aken, saj učinkovito zavirajo razvoj in zmanjšujejo količino lezij. Poleg retinoidov (retinol, retinal, retinil palmitat in retinil acetat), v terapiji aken pogosteje uporabljamo topikalni benzoil peroksid (BP), ki deluje keratolitično, antibakterijsko in protivnetno. Zaradi drugačnega mehanizma delovanja bi lahko z uporabo kombinacije retinoidov in BP dosegli bolj učinkovito zdravljenje aken. Ker v literaturi nismo zasledili podatkov o njuni združljivosti, je bil poglavitni namen diplomske naloge ovrednotiti združljivosti izbranih retinoidov in BP.
Za ta namen smo uporabili predhodno razvito analizno metodo na osnovi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti. Analizno metodo smo najprej optimizirali v smeri t.i.
zelene kromatografije, jo ustrezno ovrednotili in s pomočjo stresnih testov potrdili njeno stabilnostno indikativnost. Sledil je razvoj in optimizacija priprave vzorcev za ekstrakcijo retinoidov iz štirih kozmetičnih izdelkov (KI) s kvantitativno navedeno vsebnostjo retinola ali hidroksipinakolon retinoata na ovojnini. Združljivost retinoidov in BP smo naprej vrednotili v raztopinah, nato pa v testiranih KI. Pri tem smo vrednotili vpliv dodatka različnih koncentracij BP, ki smo jih prilagodili ugotovljenim vsebnostim retinola v izdelkih in koncentracijam BP v izdelkih za terapijo aken. Ugotavljali smo tudi vpliv temperature ter dodatka antioksidanta in/ali vode na stabilnost retinoidov ob prisotnosti BP. V vseh vzorcih je prišlo do upada vsebnosti retinola. Na hitrost razgradnje retinoidov je vplivala zlasti koncentracija BP. Pri višjih koncentracijah je vsebnost retinola hitreje upadala in so bile raztopine manj stabilne. Stabilnost retinola je upočasnila nižja temperatura shranjevanja vzorcev (5 °C). Na njuno združljivost je vplival tudi medij, pri tem so bile najmanj stabilne vodne raztopine retinola brez dodatka antioksidanta butilhidroksitoluena. Z vrednotenjem njune združljivosti v KI smo prišli do podobnih zaključkov. V vseh izdelkih je vsebnost obeh retinoidov upadala, hitrejši upad smo zaznali pri večjem dodatku BP. Tudi v KI smo potrdili večji obseg razgradnje retinoidov pri višji temperaturi. Na osnovi rezultatov izvedene študije lahko povzamemo, da obravnavani retinoidi niso združljivi z BP, saj tudi najnižja preizkušena koncentracija BP povzroči njihovo nestabilnost in hitro razgradnjo.
Ključne besede: akne, benzoil peroksid, kompatibilnost, kozmetični izdelki, HPLC-UV, retinoidi, stabilnost
ii ABSTRACT
Retinoids are common ingredients in care and treatment products for acne prone skin, as they effectively inhibit the development and reduce the number of lesions. In addition to retinoids (retinol, retinal, retinyl palmitate and retinyl acetate), topical benzoyl peroxide (BP), which has keratolytic, antibacterial and anti-inflammatory effects, is more commonly used in acne therapy. Due to a different mechanism of action, using a combination of retinoid and BP could achieve a more effective acne treatment. As we did not find data on their compatibility in the available literature, the main objective of the diploma thesis was to evaluate the compatibility of selected retinoids and BP. For this purpose, we used previously developed analytical method, based on high-performance liquid chromatography. The assay method was optimized in the direction of green chromatography, evaluated, and had its stability indicative nature confirmed by means of stress tests. This was followed by the development and optimization of sample preparation for the extraction of retinoids from four cosmetic products, with a quantitatively stated content of retinol or hydroxypinacolone retinoate on the packaging. The compatibility of retinoids and BP was first evaluated in solutions and then in tested cosmetics. We evaluated the effect of BP addition in different concentrations, which were adjusted to the determined retinol contents in the cosmetic products and BP concentrations in acne treatment products. The effects of temperature and the addition of antioxidant and / or water on the stability of retinoids in the presence of BP were also evaluated. We found a decrease in retinol content in all samples. The rate of retinoid degradation was mainly influenced by BP concentration. With higher concentrations, the retinol content decreased more rapidly, and the solutions were less stable. The retinol degradation process was slowed by a lower sample storage temperature (5 °C). Their compatibility was also affected by the medium, with aqueous solutions of retinol without added antioxidant butylhydroxytoluene being the least stable. By evaluating their compatibility in cosmetic products, we came to similar conclusions. In all products, the content of both retinoids decreased, faster degradation was detected with a larger addition of BP. We also confirmed a greater extent of retinoid degradation in products at higher temperatures. Based on the obtained results, it can be concluded that the considered retinoids are not compatible with BP, as even the lowest tested concentration of BP causes their instability and rapid decay.
Keywords: acne, benzoyl peroxide, compatibility, cosmetics, HPLC-UV, retinoids, stability
iii SEZNAM OKRAJŠAV
• ACN – acetonitril
• BHA – butilhidroksianizol
• BHT – butilhidroksitoluen
• BP – benzoil peroksid
• C. acnes – Cutibacterium acnes
• FA – mravljinčna kislina
• HCl – klorovodikova kislina
• H2O2 – vodikov peroksid
• HPLC-UV – tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z UV detekcijo
• HRP – hidroksipinakolon retinoat
• MeOH – metanol
• MQ – MiliQ voda
• NaOH – natrijev hidroksid
• OR (GA) – The Ordinary Granactive Retinoid 2,0 %
• OR (1,0 %) – The Ordinary Retinol 1,0 %
• R – retinol
• REV (0,2 %) – Revolution retinol 0,2 %
• REV (0,5 %) – Revolution retinol 0,5 %
• UV – ultravijolična svetloba
• THF – tetrahidrofuran
1
1 UVOD
1.1 AKNE
1.1.1 Epidemiologija
Akne so ena najpogostejših bolezni kože, ki prizadene 50 do 95 % mladih v zahodnem svetu. Za akne je značilno, da se pojavijo predvsem v adolescenci zaradi nastanka androgenov v nadledvičnih in spolnih žlezah. Bolezen lahko nastopi že med 7. in 9. letom starosti in (večinoma) izzveni, ko se preneha rast. V nekaterih primerih se nadaljuje tudi v najstniška leta. Pomemben je vpliv dejavnikov okolja, kot sta prehrana in življenjski slog.
Zahodna dieta, za katero je značilen visok glikemični indeks, pripomore k pojavu aken (1).
Razvoj bolezni je povezan z nizko samopodobo, anksioznostjo in depresijo. Okoli 6 do 7 % pacientov z aknami razmišlja o samomoru. Ženske so bolj dovzetne za razvoj psiholoških posledic, saj je pri njih večji poudarek na videzu (2).
1.1.2 Patogeneza
Akne oz. acne vulgaris so dolgotrajna kožna bolezen, ki se pojavi zaradi zamašitve lasnih mešičkov z mrtvimi kožnimi celicami in sebumom. Klinična predstavitev obsega zaprte in/ali odprte komedone oz. nevnetne akne ter mastno kožo. Lezije se razvijejo predvsem na področju obraza, lahko pa tudi na ramenih, trupu in hrbtu. V primeru nepravilnega zdravljenja lahko preidejo v brazgotine. Te nastanejo zaradi poškodbe dermisa, kateri sledi vnetje in celjenje. Med procesom celjenja telo proizvaja kolagen, v primeru, da ga proizvede preveč, se to izrazi kot brazgotina. (2).
Patogeneza je večfaktorska in zajema štiri ključne dejavnike:
1. povečana delitev, dozorevanje in luščenje keratinocitov v lasnem mešičku ter tvorba komedona zaradi večje količine androgenih hormonov,
2. prekomerna tvorba sebuma kot rezultat povečanih lojnic zaradi večje količine androgenov,
3. naselitev in razmnoževanje bakterij v lasnem izvodilu, najpogosteje s Cutibacterium acnes (C. acnes),
4. vnetni odziv zaradi imunogenosti C. acnes (3).
Pojav aken je pogosto povezan s povečano produkcijo in delovanjem androgenih hormonov, kar vodi v nenormalno luščenje epitelija in s tem obstrukcijo mešičkov.
2
Razvijejo se prekurzorske lezije – mikrokomedoni. Ti s prostim očesom niso vidni, opazimo jih, ko pride do popolne zapore mešička in nastanka t.i. komedonov. Prekomerne količine androgenov pospešijo proces nastajanja sebuma in kopičenje le-tega v lasnih izvodilih. S povečanjem količine sebuma, ki je substrat za rast bakterij C. acnes, se te začnejo množiti. Celični receptorji, npr. TLR2 in TLR4, nato prepoznajo bakterije, kar sproži vnetni odziv, ki povzroči strukturne poškodbe komedonov in razširitev njihove vsebine v sosednji dermis. Vnetje se izrazi s pojavom papul, pustul, nodul in cist (4). Na razvoj bolezni ključno vpliva intaktnost kožne bariere oz. povrhnjice in normalno izločanje sebuma. Z leti njegova količina niha, največ se ga izloča v adolescenci in zgodnji odraslosti ter manj v otroštvu in pozni starosti. Pomanjkanje sebuma je redko (2).
1.1.3 Kožne vzbrsti, značilne za acne vulgaris
Eflorescence oz. kožne vzbrsti delimo na primarne in sekundarne. Prve nastanejo na predhodno nespremenjeni koži. Sem uvrščamo komedone, ki so posledica zamašitve izvodil lasnih mešičkov s sebumom in mrtvimi kožnimi celicami. Ob popolni zamašitvi nastanejo zaprti komedoni v obliki belih mehurčkov. Pri odprtih so izvodila lojnice prehodna in sebum v stiku z zrakom oksidira. Vidne so črne pike, ki so posledica melanina v izvodilih (5).
Med sekundarne lezije, ki se razvijejo na predhodno spremenjeni koži, prištevamo papule, pustule, nodule in ciste. So vnetne akne, ki nastopijo zaradi poškodbe stene komedona.
Papule oz. bunčice so trde vzbrsti s premerom, večjim od 10 mm. Nastanejo zaradi kopičenja mrtvih celic v plasti dermisa. Pustule so gnojni mehurčki, ki se lahko razvijejo z infekcijo papul. Za nodule je značilna tvorba vnetih tkivnih vozlov. So večje in segajo globlje kot papule. Ciste so votle vzbrsti, ki se napolnijo s tekočo ali trdo vsebino.
Nahajajo se predvsem v dermisu, segajo lahko tudi v epidermis in podkožje. Za sekundarne vzbrsti je značilna bolečina ob dotiku (5).
1.1.4 Vrste aken
Obstaja več delitev, ki temeljijo na vrsti prevladujoče vzbrsti, resnosti bolezni ali časovnem pojavu.
A. Delitev aken glede na tip eflorescence
Komedonske akne: nevnetne lezije, ki se razvijejo iz mikrokomedonov. Papule, ki so v barvi kože ali belo obarvane, imenujemo zaprti komedoni. Z nadaljnjo rastjo se razvijejo
3
odprti komedoni, za katere je značilen keratotičen čepek z visoko vsebnostjo melanina, kar mu daje črno barvo (6).
Papulopustularne akne: značilne vnetne (pustule) in ne vnetne (papule) lezije. Razvijejo se iz mikrokomeonov in so večinoma površinske, včasih sežejo tudi v globje plasti.
Sčasoma se lahko razvijejo v nodule (1).
Nodularne akne: čvrste, vnetne lezije, s premerom, večjim od 10 mm. So boleče na dotik in lahko segajo zelo globoko v dermis. Pogosto poškodujejo okoliško tkivo in sinusne vode (1).
Konglobatne akne: so redka, a huda oblika bolezni, ki prizadene predvsem odrasle moške. Lezije so prisotne na trupu, zgornjih udih in lahko segajo vse do zadnjice. V nasprotju z običajno obliko bolezni se poredko razvijejo na obrazu (1).
B. Delitev aken glede na resnost bolezni
Blaga: predvsem komedoni (zaprti in odprti) ter nekaj papul in pustul (2). Število lezij je majhno in omejeno na predel obraza (7).
Zmerna: večje število vnetnih lezij, tj. papul in pustule. Na mestu vnetja se pojavi eritem (1). Pojavijo se na obrazu in tudi na trupu (7).
Zmerna do huda: številne papule in pustule z občasnimi noduli. Najpogosteje se pojavijo na obrazu ter na področju hrbta in oprsja (2).
Huda: veliko število papul in pustul s pogostimi noduli ter cistami. Ta oblika aken pogosto vodi v nastanek brazgotin (2).
C. Delitev aken glede na čas razvoja bolezni
Neonatalne: med 0 do 6. tednom po rojstvu. Pojavljajo se eritamozne papule in pustule na obrazu, vratu in trupu. Bolezen je lahko posledica kolonizacije kvasovk vrste Malassezia in ne bakterij C. acnes, zato je ne prištevamo med “prave akne.” Večinoma je samoomejujoče stanje, z nanosom antimikotične kreme pa simptomi hitreje izginejo (8).
Infantilne: v prvih mesecih oz. prvem letu starosti. Vzrok je kombinacija povečanega izločanja sebuma, vzdraženja sebacealnih žlez z androgeni (matere ali otroka) in kolonizacije žlez s sevi Malassezie (8). Značilni so komedoni, papule, pustule, ciste in nodule, ki se razvijejo predvsem na predelu lic. Pojav infatilnih, sploh konglobatnih aken, je pogosto povezan z nastopom hujših bolezenskih stanj kasneje v adolescenci (9).
4
Akne otroške dobe: med 1. in 7. letom starosti. Je redka bolezen, ki nastane zaradi prekomerne ravni androgenih hormonov. Potrebno je odkritje vzroka hiperandrogenizma, ki je lahko: prehitra adrenarha (pazdušna poraščenost), Cushingov sindrom, kongenitalna adrenalna hiperplazija, gonodalni/adrenalni tumorji ali prezgodnja puberteta (8).
Pre-adolescentne: med 7. in 12. letom starosti. Najpogosteje se razvijejo komedoni, predvsem na področju čela in obraza. Poredko je prizadet trup. Poveča se produkcija sebuma in število pilosebacalnih enot (8).
Adolescentne: med 12. in 18. letom starosti. To je klasična oblika bolezni, za katero so značilni zaprti in odprti komedoni, kot tudi nekaj vnetnih lezij. Bolezen doseže vrhunec med 16. in 17. letom pri ženskah in med 17. in 18. letom pri moških (10).
Post-adolescentne akne: po 17. letu. Pogosteje so prizadete ženske. Lezije se razvijejo na predelu okoli ust in najpogosteje nastopijo pred menstruacijo. Vzrok bolezni so hormonska neravnovesja, razvoj C. acnes in prekomeren nanos ličil. Sem spadajo tudi konglobatne akne, ki se razvijejo po 17. letu (11).
1.1.5 Kozmetični izdelki za nego aknaste kože in zakonodaja na področju kozmetike Kozmetični izdelki (KI) so regulirani z Uredbo št. 1223/2009 o kozmetičnih izdelkih, ki je v uporabi od 11. julija 2013 in velja za vse države članice Evropske unije (12). Nanaša se zgolj na kozmetiko, ne obravnava zdravil in medicinskih ali biocidnih izdelkov. Uredba definira KI kot katero koli snov zmes, namenjeno stiku z zunanjimi deli človeškega telesa (povrhnjico, lasiščem, nohti, ustnicami in zunanjimi spolnimi organi) ali z zobmi in sluznico ustne votline zaradi izključno ali predvsem njihovega čiščenja, odišavljenja, spreminjanja njihovega videza, njihovega varovanja, ohranjanja v dobrem stanju ali korekcije telesnega vonja. KI torej niso namenjeni zdravljenju aken, se pa uporabljajo kot podporna nega kože, lahko tudi v kombinaciji z zdravili z namenom doseganja boljšega učinka ali lajšanja draženja, ki je pogosto posledica terapije z zdravili.
V kozmetičnih izdelkih za nego aknaste kože pogosto najdemo različne retinoide, najpogosteje retinol (R), retinolne estre in novejše retinoidne komplekse, ki jih Uredba o kozmetičnih izdelkih dovoljuje. Retinojska kislina in njene soli so v kozmetiki prepovedane in se nahajajo v prilogi II. Benzoil peroksid je pogosta izbira v terapiji aken, predvsem blagih in zmernih papulopustularnih. V Uredbi o kozmetičnih izdelkih je uvrščen v prilogo III med snovmi, ki se lahko uporabljajo v skladu z omejitvami in je dovoljen zgolj za poklicno uporabo v KI za nohte (12).
5
Končna koncentracija po pripravi za uporabo ne sme preseči 0,7 % (12). Na ovojnini mora biti navedeno opozorilo: “Izogib stika s kožo (Uredba (ES) št. 1223/2009, 2009, str. 105).”
Na trgu je veliko kozmetičnih izdelkov za nego kože z aknami. V diplomski nalogi smo se osredotočili na tiste, ki so dostopni na slovenskem tržišču in vsebujejo retinoide.
1.1.6 Nega aknaste kože
Posamezniki z aknami pogosto pred začetkom zdravljenja posežejo po raznih KI, najpogosteje z alfa ali beta hidroksi kislinami ali retinoidi. KI z alfa hidroksi kislinami (npr. glikolna kislina) spodbujajo luščenje povrhnjice in obnovo epidermisa preko povečanja sinteze kolagena. Beta hidroksi kisline, najpogosteje salicilna kislina (aromatska hidroksi kislina), delujejo komedolitično, kar pomeni, da spodbujajo razgradnjo komedonov in odmašitev por. KI z retinoidi pa zavirajo produkcijo sebuma in prav tako delujejo komedolitično (13). Osebam, ki so nagnjene k pojavu aken, se priporoča največ dvakrat dnevno umivanje kože z mili, namenjeni za občutljivo kožo. Uporaba pilingov ter izdelkov z adstringenti in iritanti se odsvetuje zaradi morebitnega draženja kože. Če uporaba KI za nego kože z aknami ne zadošča, je potreben posvet z zdravnikom ter pričetek terapije. Ta je najprej lokalna, potem pa lahko preide tudi v sistemsko. Možne so tudi kombinacije lokalne in sistemske terapije (14).
1.1.7 Zdravljenje aknaste kože
1.1.7.1 Najpogostejše zdravilne učinkovine A. Lokalna uporaba
Najpogosteje predpisane učinkovine za zdravljenje aknaste kože so antibiotiki (klindamicin in eritromicin), retinoidi, benzoil peroksid (BP), azelaična kislina, dapson in topikalni anti-androgeni (2). Retinoidi in BP so podrobneje opisani v nadaljevanju.
Klindamicin in eritromicin sta antibiotika, katerih tarča so kolonije C. acnes.
Najpogostejši neželeni učinki so razvoj srbečice in eritema, pekoč in oljnat občutek na koži ter luščenje kože (2).
Azelaična kislina se uporablja za zdravljenje komedonov in vnetnih aken. Mehanizem delovanja temelji na zaviranju tioredoksin reduktaznega encima C. acnes in s tem preprečevanja sinteze bakterijske DNA, ki poteka v citoplazmi. Za ustrezno delovanje mora prodreti skozi povrhnjico do sebacealnih enot in citoplazme bakterij, preko njihove
6
debele peptidoglikanske stene. Zato se pogosto kombinira s pospeševalci penetracije, keratolitiki ali eksfolianti (2). Primerna je za uporabo med nosečnostjo, saj ne predstavlja tveganja za plod (15).
Dapson, poznan pod kratico DDS (diaminodifenil sulfon), je kemoterapevtik, ki je v rabi že od 50. let prejšnjega stoletja. Dolgotrajna uporaba je posledica učinkovitega delovanja proti sevom C. acnes, ki nanj ne razvijejo odpornosti (16).
Topikalni anti-androgeni so učinkoviti pri zdravljenju bolnikov z aknami, ki imajo mastno kožo. Nanos vodi v zmanjšanje celotnega števila lezij C. acnes (2). Glavni predstavnik je spironolakton, sintetični steroid, ki deluje kot ne-selektiven antagonist mineralkortikoidnih receptorjev. Z vezavo na androgenske receptorje znotraj sebocitov preprečuje vezavo dihidrotestosterona in tako onemogoči proliferacijo sebocitov. S tem zmanjša celokupno produkcijo sebuma (17).
B. Sistemska zdravila
Ko lokalna terapija ne zadošča, se v terapiji aken uporabijo sistemska zdravila. Peroralni antibiotiki so prva izbira sistemske terapije. Delujejo protibakterijsko, tako da zmanjšujejo kolonizacijo lasnih mešičkov s C. acnes. Sistemski antibiotiki imajo tudi protivnetno in imunomodulatorno funkcijo (2). Najpogostejši peroralni antibiotiki so:
• Minociklin – ki se predpisuje za zdravljenje zmernih do hudih oblik aken (18).
• Tetraciklin – zmanjša količino kolonij C. acnes in izkazujejo protivnetni učinek.
Upočasnijo razpad retinojske kisline in encimov, delujejo antiapoptotično in antioksidativno. Regulirajo tudi celično proliferacijo (14).
• Doksiciklin – v nizkih odmerkih deluje protimikrobno in protivnetno (14). Zaradi potencialne fotosenzitivnosti je pomembna seznanitev pacienta z ustrezno nego kože.
Ta vključuje izogibanje direktni sončni svetlobi in uporabo kozmetičnih izdelkov (KI) za zaščito kože pred soncem z UV-filtri, ki zajemajo celotni spekter UVA (18).
Izotretinoin (13-cis retinojska kislina) se najpogosteje uporablja za zdravljenje cistične oblike acne vulgaris. Zmanjša produkcijo sebuma, mašenje mešičkov in proliferacijo C.
acnes (19). Zdravljenje običajno traja od 2 do 10 mesecev. Najpogostejši neželeni učinki so razvoj odpornosti na inzulin, hiperhomocisteinemija in pojav depresije. Ker je potencialno teratogen, je uporaba prepovedana nosečnicam in ženskam, ki nameravajo zanositi (2).
7
Spironolakton je antagonist aldosterona z antiandrogenim delovanjem, ki je učinkovit predvsem v zdravljenju post-adolescentnih aken (2).
Kontracepcijske tablete se lahko predpišejo kot monoterapija ali v kombinaciji z benzoil peroksidom, retinoidi ali antibiotiki (2). Zmanjšujejo ovarijsko in adrenalno produkcijo androgenov in so primerne za ženske s policističnim ovarijskim sindromom ter predmenstrualnimi pojavi/izbruhi lezij (19).
C. Fizikalno zdravljenje
Sem uvrščamo lasersko terapijo, ki je postala priljubljena v zadnjem desetletju, predvsem zaradi odsotnosti sistemskih neželenih učinkov. Uporablja se za zdravljenje zmernih in hudih oblik aken in omogoča predvsem odstranitev brazgotin. Pogosta je souporaba lokalnih in/ali sistemskih zdravil. Terapija je v primerjavi z uporabo sistemskih zdravil varnejša (2).
1.1.7.2 Potek zdravljenja aken
Evropski pododbor za akne je leta 2016 predlagal poenostavljeno klasifikacijo bolezni in pristope zdravljenja glede na vrsto pojavljajočih se vzbrsti (1).
Zaradi blažjega poteka bolezni je za zdravljenje komedonskih aken najprimernejša lokalna terapija s topikalnimi retinoidi, benzoil peroksidom ali azelaično kislino (1).
Bolnikom z blažjimi oblikami papulopustularnih aken se priporoča uporaba adapalena ali klindamicina v kombinaciji z BP. Če pacienti terapije ne tolerirajo, se predpiše monoterapija z BP, retinoidi ali azelaično kislino (1).
Za zdravljenje hudih papulopustularnih in zmernih nodularnih aken se prvenstveno priporoča monoterapija s peroralnim izotretinoinom. Kombinirane terapije adapalena s sistemskimi antibiotiki, BP ali azelaično kislino so primerne v primeru, da bolnik ne prenaša dobro izotretinoina. Za ženske je možno tudi zdravljenje s hormonskimi antiandrogeni skupaj s sistemskimi antibotiki ali topikalnimi pripravki. Terapija s sistemskimi zdravili je bolj učinkovita v primerjavi z lokalno terapijo (1).
Prva izbira terapije za hude nodularne in konglobatne akne je peroralni izotretinoin.
Primerni so tudi sistemski antibiotiki v kombinaciji z adapalenom in BP/azelaično kislino.
Za ženske je primerna terapija s hormonskimi antiandrogeni v kombinaciji s sistemskimi antibotiki ali topikalnimi pripravki (1).
8 1.2 RETINOIDI
1.2.1 Poimenovanje in osnove
Izraz retinoid se nanaša na kemijske spojine, ki so bodisi naravni derivati vitamina A, bodisi sintetično pridobljene spojine s podobno strukturo in/ali funkcijo (20). Vitamin A se v telesu ne more sintetizirati de novo, vnesti ga moramo s hrano. V rastlinah najdemo karotenoide, v hrani živalskega izvora pa retinoide. Po zaužitju, a pred absorpcijo v proksimalnem delu tankega črevesja, poteče hidroliza estrov retinola in maščobnih kislin.
Pride do sprostitve retinola, ki se nato pretvarja v metabolite, ki se med sabo razlikujejo predvsem v polarni funkcionalni skupini (hidroksilna, aldehidna ali karboksilna) (21).
R je glavna oblika vitamina A, ki kroži po telesu. Retinilni estri imajo skladiščno funkcijo v jetrih, retinojska kislina pa je glavni aktivni metabolit. Retinoidi se metabolizirajo v jetrih in se izločajo preko sistema žolčnik-ledvice (20).
1.2.2 Klasifikacija
Vitamin A je hidrofobna molekula s tremi strukturnimi domenami: cikličnim obročem, poliensko stransko verigo in polarno končno skupino. Do strukturnih sprememb lahko prihaja v vseh treh domenah, kar vodi v nastanek vrste novih spojin. Številne se uporabljajo v terapiji aken, najpogosteje izotretinoin, tretinoin, adapalen in tazoroten (20).
Slika 1 prikazuje kemijsko strukturo osnovne molekule – R.
Slika 1: Kemijska struktura retinola.
Retinoide delimo v 3 generacije, včasih govorimo tudi o četrti, kamor uvrščamo derivate piranonov (npr. trifaroten):
1. generacija: ne-aromatski retinoidi, ki se pojavljajo naravno. Zanje je značilna ciklična struktura vitamina A, s spremenjeno končno polarno in/ali stransko poliensko verigo. Glavni predstavniki so: R, retinal, tretinoin, izotretinoin in alitretinoin (20).
2. generacija: monoaromatske spojine, ki nastanejo s spreminjanjem ciklične osnove vitamina. To so predvsem etretinat, acitretin in motretinat. Zaradi drugačne strukture so bolj lipofilni kot prva generacija (20).
9
3. generacija: poliaromatske molekule, pridobljene s ciklizacijo polienske stranske verige. Glavni predstavniki so: adapalen, tazoroten in beksaroten, ki izkazujejo večjo rigidnost kot obe predhodni generaciji retinoidov (20).
1.2.3 Uporaba za zdravljenje aken
Topikalni retinoidi imajo ključno vlogo pri terapiji aken. Dokazano zmanjšujejo količino vidnih lezij ter zavirajo razvoj mikrokomedonov in novih lezij. Normalizirajo luščenje kože z zmanjšanjem proliferacije keratinocitov in promocijo njihove diferenciacije.
Zavirajo vrsto pomembnih vnetnih poti, ki se aktivirajo z razvojem bolezni (toll-like receptorji, migracija levkocitov in AP-1 pot). Tako zmanjšajo količino vnetnih citokinov ter zavirajo celično vnetje. Vplivajo na izboljšanje posledic vnetnih lezij, tj. brazgotine in (hiper)pigmentacijo (3).
Aktivna oblika vitamina A je retinojska kislina, zato je v primeru uporabe njenih derivatov za ustrezno delovanje potrebna pretvorba v smeri: retinilni ester-retinol-retinal-retinojska kislina. Aktivnost derivatov se zmanjšuje s številom korakov pretvorbe (20). Retinojska kislina se veže na receptorje znotraj keratinocitov in spodbudi celično proliferacijo, zmanjša izgubo vode, ščiti kolagen pred razpadom ter zavira aktivnost metaloproteaz, ki so odgovorne za razgradnjo zunajceličnega matriksa. Poleg tega izboljša remodeliranje retikularnih vlaken in stimulira angiogenezo v papilarnem sloju dermisa (22). Topikalni retinoidi prav tako izboljšajo penetracijo drugih učinkovin, npr. antibiotikov. Primerni so za uporabo tudi, ko vidne lezije izginejo, saj izkazujejo preventivne lastnosti (20).
Posledica zdravljenja aken z vitaminom A je lahko t. i. retinoidna reakcija, ki vodi v suho kožo s srbečico in luščenjem. Ponavadi se pojavi v prvih tednih terapije, nato se simptomi umirijo in/ali izginejo (3).
Zaradi številnih pozitivnih učinkov so pogosta sestavina tudi v KI za nego aknaste kože.
Najpogostejši derivati v KI so retinol, retinal in retinil palmitat in retinil acetat. V kozmetiki je prepovedana uporaba retinojske kisline in njenih soli, ne pa R in njegovih estrov. Uporabljajo se lahko tudi retinoidni kompleksi. Znanstveni odbor Evropske unije za varnost potrošnikov (SCCS) je označil uporabo R, retinil acetata in retinil palmitata kot varno, v koncentracijah do 0,3 % (ekvivalent R) v kremah za roke in obraz ter KI, ki se ne sperejo s telesa. V losjonih za telo je maksimalna varna vsebnost 0,05 % (ekvivalent R).
SCCS navaja, da so koncentracije R, retinil palmitata in retinil acetata v KI na Evropskem
10
trgu najpogosteje v tem koncentracijskem območju, a ne izključuje višjih vsebnosti (23).
Ob pregledu KI z retinoidi na slovenskem trgu smo našli tudi izdelke s precej višjimi navedenimi koncentracijami, vse do 5 %, kot pri izdelku The Ordinary Granactive Retinoid 5 % in Squalane.
1.2.4 Stabilnost retinoidov
Glavni izziv pri uporabi retinoidov je njihova nestabilnost, ki je najpogosteje povezana s spremembo njihove strukture in vodi v zmanjšanje ali izgubo biološke aktivnosti. Reakcije razpada so povečini omejene na območje konjugirane izoprenske stranske verige in vključujejo izomerizacijo iz trans v cis obliko, oksidacijo in fragmentacijo molekule.
Visoka vlaga in temperatura ter nizek pH zmanjšajo stabilnost R in ostalih retinoidov (24).
Na stabilnost R vplivajo različni dejavniki okolja, najbolj je občutljiv na povišano temperaturo ter izpostavitev kisiku ter svetlobi. Izdelava KI z R je otežena tudi zaradi slabe topnosti v vodi, ki je najpogosteje uporabljeno topilo. Trenutno obstajajo različni pristopi izboljšanja stabilnosti R, npr. vključitev v liposome, nanoemulzije ali trdne lipidne delce (25).
Nestabilnost je prisotna tudi v končnih KI. V študiji dolgotrajne in pospešene stabilnosti retinoidov v KI, ki je trajala mesec dni, so potrdili nestabilnost retinoidov ob izpostavitvi svetlobi ali povišani temperaturi. Manj kot tretjina KI je vsebovala več kot 80 % začetne vsebnosti retinoidov, kljub navedenemu 6 do 12 mesečnemu roku uporabe po odprtju, kar nakazuje na izredno nestabilnost in hiter razpad retinoidov. Povezave med višjo ceno ali višjo vsebnostjo retinoidov ter boljšo stabilnostjo niso ugotovili (26).
1.3 BENZOIL PEROKSID 1.3.1 Poimenovanje in osnove
BP je organski peroksid z molekulsko formulo: C14H10O4. Njegova kemijska struktura je prikazana na sliki 2. Sestoji iz dveh benzoilnih skupin, ki sta povezani preko peroksidne vezi, zato je pogosto poimenovanje tudi dibenzoil peroksid (27). Je dobro topen v organskih topilih, kot sta metanol (MeOH) in kloroform. Če ga segrejemo nad 100 °C, lahko postane eksploziven ter vnetljiv (28).
11
Slika 2: Kemijska struktura benzoil peroksida.
1.3.2 Uporaba za zdravljenje aken
BP je najpogosteje uporabljena učinkovina za zdravljenje aken z več kot 35 leti varne in učinkovite uporabe (28). Izkazuje antibakterijsko, keratolitično in protivnetno delovanje.
Olajša oz. pospeši tudi zdravljenje ran.
Zaradi izjemno lipofilne narave, ob topikalnem nanosu prehaja skozi povrhnjico in lasne mešičke. Pod vplivom bakterij, ki so prisotne na koži in v lasnih mešičkih, pretvori v benzojsko kislino in vodikov peroksid (28). Protimikrobna aktivnost je posledica oksidativnega razpada BP, pri čemer nastanejo reaktivne kisikove zvrsti, ki oksidirajo proteine v celičnih membranah bakterij (29). C. acnes, ki so najpogosteje odgovorne za razvoj aken, so zmožne izločanja polisaharidov, ki s tvorbo zaščitnega biofilma otežijo dostavo protimikrobnih učinkovin. BP ta film uspešno razgrajuje s pomočjo reaktivnih kisikovih zvrsti, zato ima tudi funkcijo olajšanja dostave topikalnih antibiotikov. C. acnes nanj še niso razvile odpornosti, kar utemelji njegovo uporabo za zdravljenje aken (28).
Na učinkovitost BP lahko vpliva dostavni sistem (vehikel). V primeru alkoholnega gela alkohol izhlapi iz površine kože in omogoči boljši kontakt BP-ja s povrhnjico ter s tem hitrejši učinek. S postopki mikronizacije, enkapsuliranja, oblaganja s trdnimi delci ali uporabo so-topila se lahko bistveno izboljša dostava na mesto delovanja (28). Stopnja penetracije je odvisna od tudi koncentracije benzoil peroksida (29).
Pri hujših oblikah bolezni monoterapija z BP ne zadošča, ampak je potrebna njegova kombinacija z drugimi učinkovinami za zdravljenje aken. Souporaba z antibiotiki ali topikalnimi retinoidi je smiselna strategija k zmanjšanju bakterijske proliferacije in vnetja (28). Razvoj iritativnega dermatitisa in pojav rdečine, luščenja ter pekočega občutka na koži so pogosti neželeni učinki pri terapiji z BP, ki po nekaj dneh uporabe povečini izginejo. Redkeje prihaja do pojava alergijskega dermatitisa (30). Draženje kože lahko proizvajalci delno preprečijo z mikroniziranjem delcev (28).
12
Na trgu obstajajo različni izdelki z BP-jem, od gelov, krem, losjonov, raztopin in aerosolov do robčkov, mask in oblog. Koncentracije učinkovine se gibljejo med 1 in 20 %, odvisno od dostavnega sistema in namena uporabe. BP se uporablja za zdravljenje aken v koncentracijah 2,5 %, 5 % ali 10 % (2).
1.3.3 Stabilnost benzoil peroksida
Problematika uporabe BP v izdelkih za zdravljenje aken je predvsem njegova stabilnost oz.
reaktivnost. Razpad BP poteče hitro zaradi nestabilne O-O vezi. Nastajajo radikali, ki vstopajo v verižne reakcije bodisi z ostalimi molekulami BP bodisi z ostalimi spojinami v izdelku. Stabilnost BP je odvisna predvsem od izbire topila in temperature. V študiji Hongo in sodelavci so potrdili stabilnost BP v acetonu, acetonitrilu (ACN) ter zmesi ACN in destilirane vode. Izpostavljenost višji temperaturi je vodila v hitrejši razpad. Ugotovili so 40 % razpad v etanolu po 8 dneh shranjevanja pri 25 °C in 82 % razpad po 10 min pri 80 °C (31). Nestabilnost je lahko prisotna tudi v kozmetičnih izdelkih, saj ti pogosto vsebujejo vodo in/ali etanol (32).
1.4 ZDRUŽLJIVOST RETINOIDOV IN BENZOIL PEROKSIDA
Združljivost retinoidov in benzoil peroksida je smiselna z vidika učinkovitosti zdravljenja aken, saj sta mehanizma delovanja različna. Peroksidi lahko v splošnem povzročijo oksidacijo in s tem upad vsebnosti večine oksidativno nestabilnih retinoidov, zato je sočasna uporaba BP in retinoidov odsvetovana. Kljub temu na trgu obstaja nekaj izdelkov, ki vsebujejo tako BP kot tudi novejše retinoide. Primer takšnega izdelka je Epiduo®Forte gel, ki vsebuje 0,3 % adapalena in 2,5 % BP ter se uporablja za lokalno zdravljenje aken.
Uporabniki ga nanesejo enkrat dnevno, priporočena je uporaba sončnih krem in izogibanje direktni svetlobi (33).
Retinoidi in BP so na splošno nezdružljivi, vendar so različni retinoidi različno občutljivi na BP. To so dokazali v študiji Martin in sodelavci, kjer so primerjali stabilnost adapalena in tretionina ob dodatku BP. V študiji so potrdili boljšo stabilnost adapalena ob dodatku BP in izpostavljenosti svetlobi v primerjavi s tretinoinom. V 24 h se je koncentracija adapalena zmanjšala za 20 %, medtem ko se je koncentracija tretinoina po 2 h zmanjšala za več kot 50 %, po 24 h pa za 95 % (34).
13
2 NAMEN DELA
Namen diplomskega dela bo ovrednotiti združljivost izbranih retinoidov (R in HRP) z BP, ki se prav tako kot retinoidi pogosto uporablja v terapiji aken. Sočasna uporaba retinoidov in BP je smotrna s kliničnega stališča, saj njihovo delovanje v terapiji aken temelji na drugačnih mehanizmih. Pri tem pa je vprašljiva njihova združljivost s stališča stabilnosti, ki v literaturi še ni bila opisana, in jo je treba eksperimentalno preveriti.
Za namen vrednotenja stabilnosti izbranih retinoidov bomo uporabili predhodno razvito metodo HPLC-UV, ki jo bomo najprej prilagodili in nato ustrezno ovrednotili po smernicah za validacijo analiznih metod. Preverili bomo parametre linearnosti, ponovljivosti, točnosti in stabilnosti kontrolnih vzorcev. Stabilnostno indikativnost metode bomo vrednotili na osnovi stresnih vzorcev.
Proučevanje stabilnosti retinoidov bomo začeli v raztopinah. S pomočjo stresnih testov bomo pridobili vpogled v razgradnje procese R in med testiranimi dejavniki (temperatura, svetloba, dodatek vode, klorovodikove kisline, natrijevega hidroksida in vodikovega peroksida) identificirali ključne za nestabilnost R. V nadaljevanju bomo ovrednotili združljivost R in BP v raztopinah pod vplivom različnih dejavnikov (različnih koncentracij BP, različnih temperatur, medija ali dodatka antioksidanta).
Vrednotenje združljivosti retinoidov in BP bomo prenesli tudi na komercialno dostopne kozmetične izdelke z retinoidi, ki jim bomo dodali različne koncentracije BP glede na predhodno določeno vsebnost retinoidov. Za te namene bomo tudi razvili postopek za ekstrakcijo retinoidov iz kozmetičnih izdelkov, ki ga bomo ustrezno ovrednotili (ponovljivost priprave vzorcev in izkoristek ekstrakcije). Združljivost retinoidov in BP v kozmetičnih izdelkih bomo vrednotili pri sobni in povišani temperaturi (40 °C) znotraj enega meseca.
14
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI 3.1.1 Reagenti in topila
• Acetonitril (ACN): C2H3N, M = 41,05 g/mol, Chromasolv Plus, ≥99 % (Honeywell, Francija)
• Butilhidroksitoluen (BHT): C15H240, M = 220,35 g/mol, ≥99 % (Sigma-Aldrich, Nemčija)
• Klorovodikova kislina (HCl): HCl, M = 36,46 g/mol, Titrisol® za pripravo 1 M raztopine (Merck, Nemčija)
• Metanol (MeOH): CH4O, M = 32,04 g/mol, Chromasolv, ≥99 % (Honeywell, Francija)
• MiliQ voda (MQ): H2O, M = 18,02 g/mol (Fakulteta za farmacijo, Slovenija)
• Mravljinčna kislina (FA): CH2O2, M = 46,03 g/mol, 98 - 100 % (Merck, Nemčija)
• Natrijev hidroksid (NaOH): NaOH, M = 40,00 g/mol, Titrisol® za pripravo 1 M raztopine (Merck, Nemčija)
• Prečiščena voda (PV): H2O, M = 18,02 g/mol (Fakulteta za farmacijo, Slovenija)
• Tetrahidrofuran (THF): C4H8O, M = 72,11 g/mol, Chromasolv Plus, ≥99 % (Honeywell, Nemčija)
• Vodikov peroksid (H2O2): H2O2, 30 %, M = 34,01 g/mol (Sigma-Aldrich, ZDA) 3.1.2 Standardi
• Benzoil peroksid (BP): C14H10O4, 75 %, M = 242,23 g/mol (Carbosynth, Velika Britanija)
• Retinol (R): C20H30O, ≥99 %, M = 286,45 g/mol (Sigma-Aldrich, Švica) 3.1.3 Naprave in pribor
• Analitska tehnica Excellence Plus (Mettler Toledo, Švica)
• Avtomatske pipete 20-200 µL, 100-1000 µL (Eppendorf, Nemčija)
• Centrifuga Centric 400R (Tehnica, Slovenija)
• Filtri Minisart® RC, premer por: 0,45 µm (Sartorious, Nemčija)
• Hladilnik (Bosch, Nemčija)
• Hladilnik (Gorenje, Slovenija)
• HPLC sistem, Agilent 1100/1200 Series, (Agilent Technologies ZDA):
15
○ Avtomatski vzorčevalnik
○ Kvarterna črpalka
○ Variabilni UV-VIS detektor
○ Termostat za kolono
○ ChemStation programska oprema
○ Predkolona Luna C18 4 × 3 mm (Phenomenex, ZDA)
○ Kolona Kinetex XB-C18: 100 × 4,6 mm, 2,6 µm (Phenomenex, ZDA)
• Klimatska komora VC 4034 (Vötsch Industrietechnik, Nemčija)
• Kolona Luna C18 150 × 4,6 mm, 3 µm (Phenomenex, ZDA)
• Polnilne pipete 5-25 mL (Kefo, Slovenija)
• Printer P25 (Mettler Toledo, Švica)
• Sistem za pripravo Milli-Q® vode A10 Advantage (Millipore, ZDA)
• Steklovina: čaše, bučke, merilni valji, tehtalni čolnički, viale, lijaki, zamaški
• Stresalnik Vibromix 10 (Tehnica, Slovenija)
• Termostat VC 4034 (Vötsch, Nemčija)
• Ultrazvočna kadička Bandelin Sonorex (Bandelin, Nemčija)
• Vodna kopel WB 13 (Kambič Anton, Slovenija)
• Ostali inventar: spatule, centrifugirke, brizge, igle, kapalke, stojala, rokavice 3.1.4 Kozmetični izdelki z retinoidi
Za namen študije smo izbrali 4 KI z retinoidi (Preglednica I), ki jih najdemo na slovenskem trgu. Trije izdelki so bili serumi z R, četrti izdelek (mleko za obraz) pa poleg R navaja tudi HRP. Izdelek REV (0,5 %) smo kupili na novo, ostali KI so bili pridobljeni za namene prejšnjega raziskovalnega dela v Laboratoriju za stabilnost.
Preglednica I: Pregled testiranih kozmetičnih izdelkov z retinoidi na slovenskem trgu.
Ime kozmetičnega izdelka
Okrajšava imena
Vrsta KI
Navedena oblika vitamina A
Navedena vsebnost vitamina A
Cena KI (za 30 mL)
Dodatek BHT Revolution (0.2 %
Retinol) – Fine Line Correcting Serum
REV
(0,2 %) serum R 0,2 % R 9,0 € DA
Revolution (0.5 % Retinol) – With Rosehip Seed Oil
REV
(0,5 %) serum R 0,5 % R 10,99 € DA
16 The Ordinary (Retinol
1 % in Squalane)
OR
(1,0 %) serum R 1 % R 8,50 € DA
The Ordinary (Granactive Retinoid
2 % Emulsion)
OR (GA)
mleko za obraz
HRP in R 2 % HRP 12,00 € NE
3.2 KROMATOGRAFSKI POGOJI HPLC METOD
Za vrednotenje vsebnosti obravnavanih retinoidov smo uporabili sistem na osnovi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti z UV detekcijo (HPLC-UV). Končni kromatografski pogoji so zbrani v preglednici II.
Preglednica II: Kromatografski pogoji izbrane HPLC-UV metode.
Kolona Kinetex XB-C18, 100 × 4,6 mm, 2,6 µm
Pretok 1 mL/min
Volumen injiciranja 5-20 µL Temperatura kolone 40 °C Valovna dolžina detekcije 325 nm
Čas analize 8 min (R) ali 30 min (HRP)
Mobilna faza 25 % A (0,05 % FA), 75 % C (ACN) Retencijski čas • 6,9 min (R)
• 26,0 min (HRP)
3.3 PRIPRAVA RAZTOPIN 3.3.1 Priprava mobilne faze
Mobilna faza (MF) je bila sestavljena iz 25 % faze A in 75 % faze C. MF A je predstavljala 0,05 % FA, ki smo jo pripravili tako, da smo 500 µL FA prenesli v 1L bučko in do oznake dopolnili z MQ. MF C je bil ACN. Pred uporabo smo mobilni fazi ročno premešali in razplinili s soniciranjem za 10 min.
3.3.2 Priprava topila za raztapljanje in ekstracijo retinoidov
V 500 mL bučko smo zatehtali 75 mg BHT in do oznake dopolnili z MeOH. Raztopino smo nato sonicirali 10 min v ultrazvočni kadički in jo uporabili kot topilo za raztapljanje R ter pri ekstrakciji retinoidov iz KI.
17
3.3.3 Priprava standardnih raztopin za vrednotenje metode
Za pripravo kalibracijskih vzorcev smo natehtali 5 mg R, ga prenesli v 50 mL bučko in do oznake dopolnili s topilom, pripravljenim po postopku 3.3.2. To osnovno raztopino (A1), s koncentracijo 100 mg/L, smo 10-krat redčili z enakim topilom do koncentracije 10 mg/L in tako pridobili vmesno raztopino (A2). Za pripravo standardnih raztopin s koncentracijami, ki so navedene v preglednici III, smo osnovne raztopine ustrezno redčili s topilom za raztapljanje. Volumen injiciranja je bil 5 µL.
Preglednica III: Priprava kalibracijskih in kontrolnih (označeni z modro) vzorcev retinola.
c (mg/L) 100 80 75 50 40 25 10 8 5 1
VA1 (µL) 1000 800 750 500 400 250
VA2 (µL) 1000 800 500 100
Vtopilo (µL) 0 200 250 500 600 750 0 200 500 900
Kontrolne vzorce (QC) smo pripravili po enakem postopku kot kalibracijske vzorce (preglednica III – modra barva). Vsak vzorec smo pripravili v 3 paralelkah. Kontrolne vzorce z visoko koncentracijo (80 mg/L), srednjo koncentracijo (40 mg/L) in nizko koncentracijo (8 mg/L) smo uporabili za vrednotenje točnosti in ponovljivosti metode ter stabilnost kontrolnih vzorcev.
3.4 STRESNI TESTI
Za namen stresne študije smo pripravili raztopino R v MeOH s koncentracijo 1000 mg/L, jo sonicirali 10 min ter po 1000 µL prenesli v štiri 5 mL bučke. V tri bučke smo dodali 500 µL 1 M NaOH, 1 M HCl ali 3 % H2O2 in do oznak dopolnili s prečiščeno vodo (PV). V četrto bučko smo dodali samo PV.
Iz prvih treh bučk (z NaOH, HCl in H2O2) smo prenesli po 1 mL raztopine v 3 viale. Med posameznimi meritvami smo viale shranili na sobni temperaturi (25 °C), zaščitene pred svetlobo. Iz bučke, ki je vsebovala R v PV, smo prenesli po 1 mL raztopine v 5 vial (R v topilu (RT)). 2 viali smo izpostavili sončni svetlobi (25 °C), 2 povišani temperaturi (60 °C, termostat), eno pa smo shranili v predalniku, zaščiteno pred svetlobo (25 °C). Zadnja je služila kot kontrola. Tako pripravljene vzorce smo analizirali ob času 0, 24 h in 48 h. Pred analizo vzorcev z dodatkom NaOH smo jih ustrezno nevtralizirali, tako da smo v viale dodali 100 µL 1 M HCl in vsebino premešali. Za vzorce s HCl pa smo za nevtralizacijo uporabili dodatek 100 µL 1 M NaOH. Vsebino vial s H2O2 smo direktno analizirali.
18
Izvedbo stresne študije smo še enkrat ponovili, le da smo zamenjali topilo - PV z MeOH.
Priprava vzorcev za stresne teste je prikazana v preglednici IV.
Preglednica IV: Priprava stresnih vzorcev.
VOLUMNI (µL)
STRESNI POGOJI
Kislina (HCl) Baza (NaOH) Oksidant (H2O2) Retinol v topilu (RT)
Retinola 1000 1000 1000 1000
HCl (1 M) 500
NaOH (1 M) 500
H2O2 (3 %) 500
VOLUMNI (µL) TOPILO
Topilo* 3500 3500 3500 4000
* V prvem poskusu PV, v drugem pa MeOH.
3.5 VREDNOTENJE ANALIZNE METODE
3.5.1 Vrednotenje instrumentalne HPLC-UV metode
Izbrano metodo HPLC-UV smo vrednotili v skladu s smernico ICH (International Council on Harmonisation) Q2(R1) (35). Preverili smo parametre selektivnosti, linearnosti, točnosti, ponovljivosti in stabilnosti kontrolnih vzorcev. Vzorce standardnih raztopin R za vrednotenje metode smo pripravili po postopku, navedenem v poglavju 3.3.3.
3.5.1.1 Selektivnost
Selektivnost metode je sposobnost razlikovanja med posameznimi analiti v istem vzorcu.
Preverjali smo jo z uporabo standardnih raztopin R (100 mg/L) in benzoil peroksida (88 mg/L) in uporabljenih topil: MeOH, MeOH z dodanim BHT (postopek 3.3.2) in MQ vodi.
Opazovali smo, ali se kromatografski vrh R loči od vrha topila ter ali pri 325 nm zaznamo tudi BP. Pozorni smo bili na morebitne interference v topilih, ki bi se eluirale ob enakem retencijskem času kot R. Selektivnost smo dodatno vrednotili tudi v vzorcih, izpostavljenim stresnim pogojem. Preverjali smo ločbo kromatografskega vrha R od vrhov njegovih razgradnih produktov v raztopinah, nato pa še v izdelkih, kjer smo bili pozorni tudi na potencialne interference ostalih sestavin KI.
3.5.1.2 Linearnost
Linearnost je sposobnost (v danem razponu) pridobitve rezultatov, ki so premosorazmerni koncentraciji analita v vzorcu. Rezultate uporabimo za izdelavo regresijske funkcije ter
19
izračun korelacijskega faktorja, naklona funkcije in presečišča na ordinati. Za potrditev linearnosti je potrebnih minimalno 5 različnih koncentracij (35).
Linearnost smo vrednotili s kalibracijskimi vzorci v koncentracijskem območju 1 mg/L do 100 mg/L R, ki smo jih pripravili po postopku v poglavju 3.3.3. Rezultate smo podali v obliki umeritvene krivulje in korelacijskega koeficienta. Zastavljena meja sprejemljivosti je bila R2>0,999.
3.5.1.3 Točnost
Točnost analizne metode izraža odstopanje izmerjenih vrednosti od pravih oz. referenčnih vrednosti (35). Za izračun in vrednotenje točnosti smo uporabili kontrolne vzorce na treh koncentracijskih nivojih (nizko, srednje in visoko) znotraj območja linearnosti. Vzorce smo pripravili po postopku, navedenem v poglavju 3.3.3, s koncentracijami R 8, 40 in 80 mg/L.
Iz odziva analitov (površine pod kromatografskimi vrhovi) in umeritvene krivulje smo izračunali izmerjena koncentracijo v vzorcih. Dejansko koncentracijo smo pridobili iz zatehte in redčitev. Točnost smo izračunali po enačbi:
Točnost (%) = cizmerjena / cdejanska * 100 %
Vrednotili smo znotraj dnevno in med-dnevno točnost. Za mejo sprejemljivosti smo zastavili interval 100 ± 5 %.
3.5.1.4 Ponovljivost
Ponovljivost nam pove, kako se serije meritev enakega vzorca med seboj razlikujejo.
Vrednotimo jo z uporabo:
• minimalno 9 točk, ki pokrivajo dani interval (tj. 3 koncentracije/3 ponovitve) ali
• minimalno 6 točk, pri 100 % testni koncentraciji (35).
Ponovljivost smo vrednotili glede na odzive kontrolnih vzorcev treh koncentracijskih nivojev (8 mg/L, 40 mg/L in 80 mg/L), pripravljenih po postopku 3.3.3 v treh paralelkah.
Iz odziva smo izračunali koncentracijo v vzorcu. Nato smo izračunali še povprečje in relativni standardni odklon (RSD), mejo sprejemljivosti smo postavili na ± 5 %.
20 3.5.1.5 Stabilnost kontrolnih vzorcev
Vrednotili smo jo z analizo kontrolnih vzorcev (poglavje 3.3.3.) ob času 0, ter po 6, 12 in 24 h. Stabilnost smo izračunali kot razmerje koncentracije po določenem času in koncentracije ob času 0 in rezultat pomnožili s sto. Kot mejo sprejemljivosti smo zastavili interval 100 ± 5 %.
3.5.2 Vrednotenje analiznega postopka 3.5.2.1 Izkoristek
Za pridobitev podatka o učinkovitosti ekstrakcije smo pripravili vzorce vseh štirih KI po postopku, opisanem v poglavju 3.7.2. Za vsak izdelek smo naredili 2 raztopini vzorcev:
eno brez in eno z dodatkom standarda R (100 mg/L), vsako v treh paralelkah. Volumen dodanega standarda smo prilagodili glede na vsebnost R v KI. Ločeno smo pripravili in analizirali raztopino standarda R. Kot topilo smo uporabljali MeOH z dodatkom BHT, pripravljen po postopku v poglavju 3.3.2. Izkoristek smo izračunali po enačbi 1. Za uspešnost ekstrakcije smo si postavili interval 100 ± 10 %.
Enačba 1: Izkoristek (%) = (cvz + st. – cvz) / cst. * 100
cvz. + st. = izmerjena koncentracija R v KI z dodatkom standarda cvz. = izmerjena koncentracija R v KI
cst. = dodana koncentracija R
3.5.2.2 Ponovljivost priprave vzorcev
Za vrednotenje ponovljivosti priprave vzorcev smo vse testirane KI pripravili v treh paralelkah po postopku 3.7.2. Iz izmerjenih koncentracij smo izračunali RSD. Meja sprejemljivosti je bil RSD ≤ 5 %.
3.6 PRIPRAVA VZORCEV ZA VREDNOTENJE STABILNOSTI RETINOLA OB DODATKU BENZOIL PEROKSIDA V RAZTOPINAH
3.6.1 Vrednotenje združljivosti retinola in BP v metanolnih raztopinah
Za vrednotenje stabilnosti R ob prisotnosti BP v raztopinah smo najprej pripravili topilo po postopku 3.3.2. Nato smo pripravili osnovno (1100 mg/L) in vmesno (55 mg/L) raztopino BP ter osnovno raztopino R (250 mg/L) v topilu za raztapljanje. Raztopine smo sonicirali 10 min v ultrazvočni kadički in jih uporabili za pripravo 5 raztopin z različnimi kombinacijami R in BP, vsako v 3 paralelkah. Priprava je prikazana v preglednici V.
21
Med posameznimi meritvami smo vzorce shranjevali 10 dni pri 25 °C. Za kontrolni vzorec smo uporabili osnovno raztopino R (250 mg/L), ki smo jo 10-krat redčili s topilom za raztapljanje.
Preglednica V: Priprava vzorcev za vrednotenje združljivosti retinola in BP v MeOH raztopinah.
Razmerje R: BP Vor. R (µL) Vor. BP (µL) Vvm. BP (µL) Vtopila (µL)
1:0 100 900
1:0,1 100 45 855
1:1 100 450 450
1:10 100 225 675
1:40 100 900
R = retinol; or. R = osnovna raztopina retinola (250 mg/L); or. BP = osnovna raztopina BP (1100 mg/L); vm.
BP = vmesna raztopina BP (55 mg/L). Topilo je MeOH z BHT (150 mg/L).
3.6.2 Vrednotenje združljivosti retinola in BP v metanolnih raztopinah pri različnih temperaturah
Za vrednotenje vpliva temperature na stabilnost R ob dodatku BP v raztopinah smo pripravili osnovno raztopino R v MeOH s koncentracijo 250 mg/L. Stabilnost R smo vrednotili ob prisotnosti 4 različnih koncentracij BP. Vzorce smo pripravili na enak način, kot je navedeno v preglednici V, le da smo kot topilo uporabili MeOH brez dodatka BHT.
Vzorce smo pripravili v treh paralelkah. 10-kratna redčitev osnovne raztopine R (250 mg/L) je služila kot kontrola. Vsebino vial smo analizirali takoj po pripravi, nato smo jih med posameznimi meritvami shranili pri treh različnih temperaturah: 5 °C (hladilnik), 25
°C (termostat avtomatskega vzorčevalnika HPLC) in 40 °C (klimatska komora). Študijo smo izvajali 28 dni.
3.6.3 Vrednotenje združljivosti retinola in BP v vodnih raztopinah
Za vrednotenje združljivosti R in BP v vodnih raztopinah smo pripravili osnovni raztopini R s koncentracijo 500 mg/L v MeOH (ORA1) ter v MeOH z dodatkom BHT (150 mg/L) (ORA2). Nato smo osnovno raztopino BP v MeOH, s koncentracijo 20000 mg/L, redčili z MeOH do vmesnih raztopin s koncentracijami: 5000 mg/L, 500 mg/L in 50 mg/L. Po soniciranju smo 50 µL vsake raztopine BP prenesli v viale, jim dodali 50 µL ORA1 in do 1 mL dopolnili z MQ. Poskus smo še enkrat ponovili, le da smo ORA1 nadomestili z ORA2. Raztopini ORA1 in ORA2 brez BP, ki smo jih dopolnili z MQ, smo uporabili kot kontroli.
Podroben postopek priprave raztopin z različnimi razmerji R in BP je prikazan v preglednici VI. Med meritvami, ki so trajale 21 dni, smo vzorce shranjevali pri 25 °C.
22
Preglednica VI: Priprava vzorcev za vrednotenje združljivosti retinola in BP v vodnih raztopinah.
Razmerje R: BP Vor. R (µL) VMQ (µL) VMeOH/BP (µL)
1:0 50 ORA1
ali 50 ORA2
900
50 MeOH
1:0,1 50 BP (50 mg/L)
1:1 50 BP (500 mg/L)
1:10 50 BP (5000 mg/L)
1:40 50 BP (20000 mg/L)
R = retinol;or. R = osnovna raztopina retinola (500 mg/L).
3.7 VREDNOTENJE ZDRUŽLJIVOSTI RETINOIDOV OB PRISOTNOSTI BENZOIL PEROKSIDA V KOZMETIČNIH IZDELKIH
3.7.1 Priprava vzorcev za optimizacijo ekstrakcije retinoidov iz KI
Optimizacijo ekstrakcijskega postopka smo začeli s testiranjem vpliva uporabe različnih topil na ekstrakcijo retinoidov iz KI. Pri tem smo 100 µL izdelka REV (0,2 %) raztopili s 25 mL različnih topil: MeOH, ACN, njunih različnih zmesi ACN+MeOH (1:1; 3:1 in 1:3) in ACN+THF (1:1). Optimizacijo smo nadaljevali na KI OR (1,0 %), tako da smo 100 µL KI raztopili v 25 mL topil: MeOH in ACN+THF (1:1). Vse vzorce smo premešali z vibracijskim mešalom (2 min) ter sonicirali v ultrazvočni kadički (10 min). Nato smo jih analizirali z uporabo HPLC-UV sistema.
Preverjali smo tudi vpliv soniciranja na optimizacijo ekstrakcije. Raztopili smo 100 µL REV (0,5 %) in 100 µL REV (0,2 %) v 25 mL MeOH, z dodatkom BHT (150 mg/L).
Pripravili smo 6 paralelk za vsak KI. Vse vzorce smo premešali z vibracijskim mešalom (2 min). Po 3 paralelke za vsak KI smo analizirali, ostale 3 pa pred analizo dodatno sonicirali (10 min). Nazadnje smo preverili, ali se OR (GA) ustrezno raztaplja v MeOH. 200 µL OR (GA) smo prenesli v 25 mL bučko in do oznake dopolnili z MeOH. Nato smo raztopino premešali z vibracijskim mešalom (2 min), centrifugirali (5000 obratov/min, 25 °C, 5 min) ter filtrirali (filtri Minisart® RC, velikost por: 45 µm).
3.7.2 Končni postopek ekstrakcije retinoidov iz KI
Ustrezne volumne posameznega KI smo prenesli v bučke, ki smo jih do oznake dopolnili z MeOH z 150 mg/L BHT (preglednica VII). Bučke smo premešali z vibracijskim mešalom (2 min) in sonicirali (10 min). OR (GA) smo 5 min centrifugirali pri 5000 obratih/min in 25 °C, nato še filtrirali (filtri Minisart® RC, velikost por: 45 µm). Ostale vzorce smo direktno analizirali. Za vsak KI smo pripravili vzorce v 3 paralelkah.
