UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Sergeja ŠETINA
CELIČNE LINIJE S PREUREJENIM GENOMOM KOT MODEL ZA PREUČEVANJE BOLEZNI
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Sergeja ŠETINA
CELIČNE LINIJE S PREUREJENIM GENOMOM KOT MODEL ZA PREUČEVANJE BOLEZNI
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
GENETICALLY EDITED CELL LINES FOR DISEASE MODELLING
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Jerneja Ogorevca.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum predstavitve: 9. 7. 2021
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 602.69:602.9:611.018:606:61(043.2)
KG biotehnologija, celični modeli, genski inženiring, precizna medicina AV ŠETINA, Sergeja
SA OGOREVC, Jernej (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN CELIČNE LINIJE S PREUREJENIM GENOMOM KOT MODEL ZA
PREUČEVANJE BOLEZNI
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 22 str., 3 pregl., 4 sl., 75 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Za zdravljenje bolezni je ključno razumevanje procesov, ki vodijo v njihov nastanek.
Preučevanje molekularnih mehanizmov bolezni pogosto poteka na celičnih linijah. Z reprogramiranjem somatskih celic lahko vzpostavimo linije induciranih pluripotentnih matičnih celic, ki izvirajo iz pacientov s kandidatno mutacijo za določeno bolezen. Ker različna genetska ozadja pacientov pogosto otežujejo primerjavo celičnih linij, lahko s pomočjo orodij za preurejanje genoma vzpostavimo izogene celične linije, ki se med seboj razlikujejo le v kandidatni mutaciji. Zaradi različnih genotipov, imajo lahko zdravila na bolnike različne učinke, zato so celične linije, vzpostavljene iz tkiva pacientov, uporabne tudi za testiranje zdravil na bolniku lastnih celicah, s čimer lahko ugotovimo, katero zdravilo je za posameznike najbolj primerno.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 602.69:602.9:611.018:606:61(043.2)
CX biotechnology, cellular models, genetic engineering, precision medicine AU ŠETINA, Sergeja
AA OGOREVC, Jernej (mentor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI GENETICALLY EDITED CELL LINES FOR DISEASE MODELLING DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)
NO VI, 22 p., 3 tab., 4 fig., 75 ref.
LA sl AL sl/en
AB Understanding molecular processes, causing diseases, is crucial for treatment development. Various cell lines have often been used to study disease mechanisms. By reprogramming the somatic cells, we can establish induced pluripotent stem cell lines, which contain patients' candidate mutation(s) for the specific disease. Different genetic backgrounds of patients often interfere with understanding specific genotype-fenotype relationship. Therefore, it is often helpful, by the use of genome editing technology, to establish isogenic cell lines that differ only in candidate mutation. Due to the different genotypes of patients, drugs often show individual-specific effects. Drug testing on patient-specific cell lines enables selection of drugs which are the most appropriate for a particular patient.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VI
KAZALO SLIK VI
1 UVOD 1
2 METODE PREUREJANJA GENOMOV 2
2.1 NUKLEAZE CINKOVIH PRSTOV (ZFN) 3
2.2 TRANSKRIPCIJSKE AKTIVATORJU PODOBNE EFEKTORSKE NUKLEAZE
(TALEN) 3
2.3 CRISPR/Cas9 4
3 MODELIRANJE BOLEZNI 5
3.1 EMBRIONALNE MATIČNE CELICE 6
3.2 INDUCIRANE PLURIPOTENTNE MATIČNE CELICE 6
3.3 DIFERENCIACIJA PSC V ŽELENI CELIČNI TIP 7
3.4 IZOGENE CELIČNE LINIJE 9
4 PRIMERI CELIČNIH MODELOV S PREUREJENIM GENOMOM 10
4.1 PARKINSONOVA BOLEZEN 10
4.2 CISTIČNA FIBROZA 11
4.3 LESCH-NYHANOV SINDROM 12
4.4 DRUGE BOLEZNI 12
5 PRECIZNA MEDICINA 13
5.1 TESTIRANJE ZDRAVIL 14
6 ZAKLJUČEK 15
7 VIRI 16
ZAHVALA
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Kandidatni geni, povezani s Parkinsonovo boleznijo 10 Preglednica 2: PSC in orodja za preurejanje genoma za izdelavo modelov
človeških bolezni 13
Preglednica 3: Prednosti in slabosti različnih vrst človeških celic za testiranje
zdravil 15
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Delovanje ZFN, TALEN in CRISPR/Cas9 3
Slika 2: Primer reprogramiranja in diferenciacije somatskih celic v različne
celične tipe, ki jih lahko uporabimo za preučevanje bolezni 7
Slika 3: Uporaba izogenih celičnih linij 9
Slika 4: Razlike med posamezniki v najbolj primernem odmerku zdravila 13
1 UVOD
Modeliranje bolezni je pomembno za razumevanje molekularnih mehanizmov, ki vodijo v nastanek in razvoj bolezni, ter je ključno za razvoj novih terapij. Pogosto se za preučevanje človeških bolezni uporablja živalske modele, ki omogočajo preučevanje bolezni in vivo (Sterneckert in sod., 2014). Študije na živalskih modelih, kot so npr. miši, so smiselne zaradi precejšnje evolucijske ohranjenosti sesalskih genomov, posebno v zaporedjih, ki kodirajo proteine (Guénet, 2005). Ker je v času od zadnjega skupnega prednika v zaporedjih DNA med živalskimi vrstami in ljudmi nastalo veliko razlik, ni presenetljivo, da med vrstami obstajajo razlike, zaradi katerih živalski modeli niso vselej optimalni za preučevanje človeških bolezni, saj v njih ni vedno mogoče vzpostaviti človeškega fenotipa ali pa so fenotipi zaradi anatomskih in fizioloških razlik med vrstama preveč različni. Poleg tega, so lahko vzrok za bolezni tudi mutacije v nekodirajočih regijah, ki so med vrstami precej slabše ohranjene, kar otežuje prepoznavo in primerjavo ortolognih regij (Bassett, 2017). Eden od načinov za premostitev tovrstnih omejitev je uporaba celičnih kultur, ki jih vzpostavimo iz tkiva pacientov. Uporaba celičnih kultur ni etično sporna in omogoča večje število ponovitev poskusov, izvedenih v kontroliranih pogojih, brez zapletenih fizioloških interakcij med različnimi celičnimi tipi, ki potekajo v živem organizmu in otežujejo analizo delovanja posameznega celičnega tipa (Murphy, 1991).
Seveda pa ima tudi uporaba celičnih kultur določene omejitve in pomanjkljivosti. Kot omenjeno, in vitro modeli predstavljajo le približek stanja in vivo in ne omogočajo simulacije kompleksnih medceličnih interakcij in okolja v tkivu ter sistemskih učinkov. Poleg tega so primarne celične kulture pogosto zahtevne za gojenje, imajo kratko življenjsko dobo in so sestavljene iz heterogenih celičnih populacij, kar otežuje njihovo analizo. Za preučevanje bolezni uporabljamo tudi trajne celične linije, ki vsebujejo genske mutacije, zaradi katerih niso vedno ustrezen fiziološki model bolezni. Uporabo embrionalnih matičnih celic za preučevanje bolezni nam omejujejo tehnični in etični razlogi (Bassett, 2017). Izvirajo namreč iz človeških zarodkov, poleg tega pa pogosto ne kažejo enakega bolezenskega fenotipa kot somatske celice (Sterneckert in sod., 2014).
Razvoj celičnih modelov je pospešilo odkritje reprogramiranih somatskih celic, kar je omogočilo vzpostavitev linij pluripotentnih matičnih celic iz somatskih celic posameznika (iPSC) (Takahashi in Yamanaka, 2006). S pomočjo celičnih linij, ki izvirajo iz pacientov z monogenskimi ali poligenskimi boleznimi, lahko pripravimo celične modele bolezni na personalizirani ravni, kar prispeva k razumevanju molekularne in celične patogeneze posameznika. Možnost vzpostavitve iPSC posameznega pacienta omogoča uporabo visoko zmogljivih pregledovalnih metod za testiranje zdravil in testiranje učinkov zdravila na ravni celic posameznega pacienta (Bassett, 2017). Veliko zdravil je namreč učinkovitih le pri določenih bolnikih, pri mnogih pa se lahko pojavijo škodljivi stranski učinki, kar lahko pripišemo predvsem razlikam v genotipu (različnim genetskim ozadjem). S testiranjem
2
zdravil na bolnikovih celicah lahko tako ugotovimo, katera zdravila so za posameznika najbolj primerna (Gorshkov in sod., 2019).
Številne mutacije imajo le zmerne do majhne učinke na metabolizem celic, zaradi česar moramo za potrditev povezave med mutacijo in fenotipom med seboj primerjati veliko različnih celičnih linij bolnih in zdravih oseb. S pomočjo orodij za preurejanje genoma lahko pripravimo izogene celične linije, ki se razlikujejo le v določeni kandidatni mutaciji, kar nam omogoča zaznavo fenotipov, ki bi jih sicer lahko zakrivala različna genetska ozadja darovalcev celic (Bassett, 2017).
2 METODE PREUREJANJA GENOMOV
Raznolike tehnologije za preurejanje genomov omogočajo hitre spremembe genomov različnih celičnih tipov in organizmov. Med glavna orodja preurejanja genomov spadajo nukleaze cinkovih prstov (ZFN), transkripcijske aktivatorju podobne efektorske nukleaze (TALEN) in sistem CRISPR/Cas9. Za njih je značilno, da v DNA zaporedje uvedejo dvojni prelom verige DNA (DSB), kar aktivira popravljalne sisteme v celicah, ki prelom ob prisotnosti matrice običajno popravijo z mehanizmom homologne rekombinacije (HDR – angl. homology directed repair) ali nehomolognega spajanja koncev (NHEJ – angl. non- homologous end joining), pri čimer se v zaporedju običajno zgodijo insercije ali delecije (Gaj in sod., 2016). Pri celicah v G1 fazi celičnega cikla je najbolj pogost NHEJ. Homologna rekombinacija je bolj običajna pri celicah s podvojeno DNA, saj je kot matrica na voljo sestrska kromatida (Chapman in sod., 2012). Mutacije, ki so posledica NHEJ, so zaželene, če je naš namen narediti gen nefunkcionalen (izničenje gena). Pri celičnih terapijah so naključne insercije in delecije nezaželene, saj želimo endogeni gen specifično spremeniti – napraviti funkcionalen. V primeru celičnih terapij je zato uporabnejši pristop spreminjanja genoma, ki temelji na mehanizmu homologne rekombinacije (Hockemeyer in Jaenisch, 2017).
Glavno težavo pri postopkih preurejanja genoma predstavljajo izven-tarčni učinki (angl. off- target effects), ki se pojavijo, če nukleaza nenačrtovano reže genom na mestu z zaporedji podobnimi tarčnemu, kar lahko vodi do mutacije v naključnih genih (Yee, 2016).
Slika 1: Delovanje ZFN, TALEN in CRISPR/Cas9 (prirejeno po Musunuru, 2013)
2.1 NUKLEAZE CINKOVIH PRSTOV (ZFN)
Proteini, ki vsebujejo cinkove prste, so v genomih evkariontov dokaj pogosti, saj jih lahko najdemo v živalih, rastlinah in glivah. Pri prokariontih so ti motivi redki (Wolfe in sod., 2000). Vezava cinkovega iona na proteine ustvari strukturne domene, imenovane cinkovi prsti, ki jih lahko povežemo skupaj v peptid, ustvarjen za vezavo na določeno mesto v zaporedju DNA. Vsak cinkov prst interagira s tripletom nukleotidov v DNA, kar prispeva k afiniteti in specifičnosti vezave. Nukleaze cinkovih prstov ali ZFN so sestavljene iz FokI endonukleaze, ki nespecifično reže DNA, in po meri ustvarjenih proteinov cinkovih prstov, ki glede na njihovo zaporedje omogočajo specifično vezavo na DNA (Kim in sod., 1996). ZFN so ponavadi sestavljene iz treh ali štirih domen cinkovih prstov, od katerih vsebuje vsak okoli trideset aminokislinskih ostankov (Pavletich in Pabo, 1991).
Širšo uporabo ZFN omejuje težavna izgradnja cinkovih prstov, ki poleg tega vseh DNA tripletov, še posebej 5'-CNN-3' in 5'-TNN-3', ne prepoznavajo učinkovito. Posledica tega je manjša tarčna fleksibilnost, ki je sicer značilna za novejše metode preurejanja genoma (Gaj in sod., 2016).
2.2 TRANSKRIPCIJSKE AKTIVATORJU PODOBNE EFEKTORSKE NUKLEAZE (TALEN)
Transkripcijske aktivatorju podobne efektorske nukleaze so ena od alternativ ZFN za povzročitev dvojnega preloma in preurejanje genoma. Podobno kot ZFN, je tudi TALEN sestavljen iz nespecifične FokI nukleaze, spojene s po meri izdelano DNA vezavno domeno iz dobro ohranjenih ponovitev, ki izvirajo iz proteinov, imenovanih transkripcijskemu
4
aktivatorju podobni efektorji (TALE) (Joung in Sander, 2013). TALE v citoplazmo rastlinskih celic izločajo bakterije iz rodu Xanthomonas, ki so sicer patogeni poljščin, kot so riž, paprika in paradižnik. DNA vezavno domeno sestavlja od dvanajst do dvajset monomerov, od katerih vsak veže en nukleotid v tarčnem zaporedju. Monomeri vsebujejo tandemske ponovitve štiriintridesetih aminokislinskih ostankov, od katerih sta dva, na mestih dvanajst in trinajst, visoko variabilna in odgovorna za prepoznavo specifičnega nukleotida (RVD – angl. repeat variable residue). Edina omejitev pri izbiri tarčnega mesta je, da na njegovem 5' koncu potrebujemo timin. Prvi aminokislinski ostanek v RVD stabilizira prostorsko konformacijo, drugi pa interagira z nukleotidom (Nemudryi in sod., 2014). Različne kombinacije RVD prepoznavajo različne nukleotide: kombinacija histidina in aspartata (HD) prepoznava citidin, asparagin ali izolevcin z glicinom (NG, IG) prepoznava timin, asparagin z izolevcinom (NI) pa adenin. RDV dveh asparaginov (NN) prepoznava adenin in gvanin, za katerega ima tudi večjo preferenco. Asparagin s serinom (NS) prepozna vse nukleotide (Boch in sod., 2009).
TALEN je mogoče zasnovati in izgraditi hitreje kot ZFN, poleg tega pa je metoda, zaradi večje specifičnosti, tudi manj toksična za celice (Mussolino in sod., 2014). Kljub temu, da ima TALEN svoje prednosti, med katere spada visoka specifičnost tarčnega delovanja, uporabo te metode vedno bolj nadomešča sistem CRISPR/Cas9 (Werner Sunderland in Peggs, 2018).
2.3 CRISPR/Cas9
Sistemi CRISPR/Cas so del imunskega sistema večine arhej in bakterij za obrambo pred virusi (bakteriofagi) in plazmidi (Barrangou in sod., 2007). Lokusi CRISPR so zgrajeni iz več ponovitev, dolgih od 23 do 47 baznih parov, prekinjenih z variabilnimi zaporedji – vmesniki, ki so dolgi od 21 do 72 baznih parov in predstavljajo integrirane odseke DNA zajetih virusov in plazmidov. Na istem lokusu se nahajajo geni cas, ki kodirajo veliko in heterogeno družino proteinov z različnimi domenami, tudi nukleaznimi (Horvath in Barrangou, 2010). Za imunski odziv proti virusom, se morajo integrirani vmesniki najprej prepisati v kratka zaporedja crRNA, se povezati s tracrRNA (trans-activating crRNA), hibrid crRNA/tracrRNA pa se nato veže na Cas9 endonukleazo. Ta kompleks se lahko veže na tuje nukleinske kisline, ki vsebujejo specifična zaporedja, imenovana PAM (angl. protospacer adjacent motif). Na ta način se bakterije zavarujejo pred delovanjem endonukleaz na lastno DNA. Glede na komplementarnost med 5' delom crRNA in tarčno verigo se vez stabilizira, kar omogoči endonukleazno delovanje Cas9 (Gaj in sod., 2016).
Sistem CRISPR/Cas9 je poceni, učinkovit in dokaj preprost za uporabo, omogoča pa tudi urejanje genoma na več različnih lokusih hkrati (Werner Sunderland in Peggs, 2018). Za uporabo v genskem inženiringu je bil sistem modificiran, in sicer sta bili crRNA in tracrRNA molekuli umetno spojeni v eno samo RNA molekulo – sgRNA (single guide RNA) (Jinek in sod., 2012), kar je uporabo sistema dodatno poenostavilo. Poleg mesta komplementarnega
sgRNA na tarčni molekuli DNA pri uporabi sistema CRISPR/Cas9 potrebujemo tudi specifično zaporedje NGG (PAM), ki predstavlja vezavno mesto za Cas9. Ob zadostnem ujemanju 5' konca sgRNA in tarčnega zaporedja encim Cas9 prereže DNA tri bazne pare navzgor od mesta PAM (Gaj in sod., 2016).
Sistem CRISPR/Cas9 lahko v celico vnesemo z virusnimi vektorji, kot so z adenovirusi povezani virusi (AAV), lentivirusi in adenovirusi. Adenovirusni vektorji se ne integrirajo v genom gostitelja, vendar je njihova izdelava delovno zahtevna, kar omejuje njihovo uporabo.
Enako velja tudi za AAV, njihova prednost pa je, da so manj imunogeni. Izdelava lentivirusnih vektorjev, ki so bolj učinkoviti, je lažja, vendar se ti integrirajo v genom. Vnos sistema CRISPR/Cas9 v celice je mogoč tudi z različnimi fizičnimi in kemijskimi metodami, kot so mikroinjiciranje, elektroporacija in lipofekcija (Yip, 2020). Zaradi določene tolerance na neujemanje baz med sgRNA in tarčnim mestom DNA so možni izven-tarčni učinki (Fu in sod., 2013), vendar obstaja veliko načinov, s katerimi lahko izboljšamo specifičnost njegovega delovanja (Tycko in sod., 2016).
3 MODELIRANJE BOLEZNI
Poznavanje bioloških procesov, ki so ključni za razvoj bolezni pri človeku, je izjemno pomembno za preprečevanje in zdravljenje bolezni. Molekularne osnove mnogih bolezni lahko zožimo na določen genski lokus, kar nam omogoča študije specifičnih genotipov v različnih eksperimentalnih pogojih. Za preučevanje bolezenskih mehanizmov in vivo lahko uporabljamo živalske modele, kot so miši, podgane in nečloveški primati, saj so zaporedja v sesalskih genomih dokaj dobro ohranjena. Kljub visoki stopnji homologij v genetskih zaporedjih in fizioloških mehanizmih so med vrstami določene razlike, ki lahko onemogočajo vzpostavitev človeškega fenotipa bolezni. To je razlog, da se pogosto poslužujemo raziskav na ljudeh, ki pa so skoraj vedno omejene na študije in vitro. Gojenje celic, ki izvirajo iz pacientov, je izrednega pomena za preučevanje bolezni na molekularni in celični ravni, kot tudi za razvoj novih terapij. Pluripotentne matične celice (PSC) imajo zmožnost neskončnega obnavljanja in diferenciacije v katerokoli tkivo, kar omogoča študije povezav med fenotipom in genotipom na različnih celičnih tipih in v različnih stopnjah diferenciacije (Avior in sod., 2016). Glede na način pridobivanja lahko PSC delimo na embrionalne matične celice (ESC), ki jih pridobimo iz zarodkov, in inducirane pluripotentne matične celice (iPSC), ki jih pridobimo iz tkiva odraslih organizmov.
Za preučevanje bolezni na celičnih linijah je idealno, če je bolezen močno odvisna od genotipa in kaže visoko penetranco. Relacija med genotipom in fenotipom je zlasti lahko prepoznavna v primeru monogenskih bolezni in je pogosto zaznavna tudi v ustreznem diferenciranem celičnem tipu v celični kulturi (npr. celice pljučnega epitelija z mutacijo za cistično fibrozo kažejo del fenotipskih značilnosti tudi in vitro). Težje je preučevati in z
6
gensko terapijo zdraviti poligenske bolezni in bolezni, na katere v večji meri delujejo dejavniki okolja (Musunuru, 2013).
3.1 EMBRIONALNE MATIČNE CELICE
Človeške embrionalne matične celice izvirajo iz zarodkov pred vgnezditvijo. Lahko jih izoliramo iz morule, cele blastociste ali znotrajcelične mase (ICM). Z začetkom predimplantacijske genske diagnostike (PGD) je postala mogoča vzpostavitev ES celičnih linij z genetskimi napakami (Verlinsky in sod., 2005). PGD se uporablja za testiranje zarodkov staršev z določeno boleznijo, ki ima dobro opisane genetske vzroke, ali prenašalcev.
Za vzpostavitev celičnih linij s specifičnimi mutacijami smo odvisni od dostopa do zarodkov, ki so bili preverjeni s PGD, in od privolitve staršev. Poleg tega pri ESC povezava med genotipom in fenotipom ni nujno zelo očitna, ker se fenotip pogosto razvije šele v diferenciranih celicah, poleg tega pa je penetranca lahko raznolika zaradi specifičnih genetskih ozadij in okolja. Za modeliranje bolezni v ESC, pridobljenih iz zdravih posameznikov, je potrebno v celicah z genetsko manipulacijo inducirati specifične mutacije, značilne za to bolezen. Poleg tega je uporaba ESC zaradi etičnih zadržkov, povezanih z njihovim izvorom, v nekaterih državah prepovedana (Sterneckert in sod., 2014).
Vsaj delu opisanih težav se lahko izognemo tako, da vzpostavimo linijo induciranih pluripotentnih matičnih celic, ki izvirajo iz bolnika in že vsebujejo kandidatne mutacije.
3.2 INDUCIRANE PLURIPOTENTNE MATIČNE CELICE
Inducirane pluripotentne matične celice pridobimo z reprogramiranjem somatskih celic tako, da v njih izrazimo določen set transkripcijskih dejavnikov, ki jih vnesemo v celice. Takahashi in sodelavci (2007) so z vnosom štirih dejavnikov (Oct3/4, Sox2, Klf4 in c-Myc) v fibroblaste uspeli le-te reprogramirati v pluripotentno stanje in pridobiti t. i. inducirane pluripotentne matične celice – iPSC. Te celice so v več vidikih podobne ESC, med drugim v morfologiji, proliferaciji, izraženih genih, telomerazni aktivnosti, in vitro diferenciaciji in formaciji teratomov (Takahashi in sod., 2007). Učinkovitost reprogramiranja je različna za različne celične tipe. Poznamo več tehnik za indukcijo iPSC. Klasični načini vključujejo vnos s pomočjo virusne transdukcije, medtem ko neintegrirajoči vektorji lahko reprogramirajo celice brez integracije transgenov v genom gostitelja, s čimer se izognemo tveganju za nastanek insercijske mutageneze. Ena od najbolj učinkovitih in tudi varnih strategij za reprogramiranje brez integracije je vnos mRNA ali miRNA, kar odpravi potrebo po uporabi virusov in DNA (Silva in sod., 2015).
3.3 DIFERENCIACIJA PSC V ŽELENI CELIČNI TIP
Smer diferenciacije PSC je odvisna od vrste bolezni in njenega poteka. Mnogo bolezenskih fenotipov se izrazi le v diferenciranih celicah in ne v pluripotentnih celicah, zato lahko koristne informacije o patogenezi bolezni pridobimo le iz celic, ki so se diferencirale v celični tip, vpleten v patogenezo bolezni (Saha in Jaenisch, 2009). Popularna metoda za diferenciacijo celic je dodatek rastnih dejavnikov v diferenciacijsko gojišče. Ti posnemajo zgodnjo stopnjo embrionalnega razvoja v ektoderm, mezoderm ali endoderm. Po uspešni indukciji zarodne plasti lahko rastni dejavniki in signalne molekule v kombinaciji z majhnimi molekulami usmerijo celico na želeno diferenciacijsko pot. Ob uporabi rastnih dejavnikov rekombinantnega izvora lahko ostanki bakterijskih ali sesalskih celic, v katerih so narejeni rekombinantni proteini, kontaminirajo gojišče. Poleg tega so rekombinantni rastni dejavniki izjemno dragi, zato se za diferenciacijo celic v večjem merilu poslužujemo tudi drugih metod (Cohen in Melton, 2011). Celice lahko diferenciramo tudi izključno z uporabo majhnih molekul (kemijskih spojin), ki so za razliko od proteinskih dejavnikov cenejše, stabilnejše in manj imunogene (Frank-Kamenetsky in sod., 2002). Diferenciacijo pluripotentnih celic pa lahko vodimo tudi z vnosom DNA ali mRNA molekul, ki kodirajo transkripcijske dejavnike (Goparaju in sod., 2017).
Slika 2: Primer reprogramiranja in diferenciacije somatskih celic v različne celične tipe, ki jih lahko uporabimo za preučevanje bolezni (prirejeno po Hockemeyer in Jaenisch, 2017)
8
Čeprav se iPSC lahko diferencirajo v določen celični tip, lahko diferencirane celice tudi po daljšem obdobju še vedno izražajo gene, ki so značilni za začetne stopnje razvoja, kar je posledica nepopolne diferenciacije, ali pa izražajo gene, značilne za donorske celice, kar je posledica nepopolnega reprogramiranja. V celicah se namreč lahko ohranijo metilacijski vzorci DNA, značilni za njihovo izvorno tkivo, zato se celice lažje diferencirajo v sorodne celične tipe in težje v drugačne. Tak epigenetski spomin donorskega tkiva lahko izbrišemo z optimizacijo diferenciacije ali z obdelavo celic s snovmi, ki modificirajo kromatin (Kim in sod., 2010).
Za študij nekaterih bolezni, ki se pojavijo v odrasli dobi, kot sta npr. Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen, je potrebno celice umetno postarati. To storimo tako, da jih izpostavimo oksidativnem stresu ali dodamo snovi, ki sprožijo agregacijo proteinov in nevrodegeneracijo (Sterneckert in sod., 2014). Ena od takih snovi je progerin, ki skrajša telomere celic in posledično vodi v celično senescenco (Miller in sod., 2013). Strategije za induciranje staranja bi lahko v prihodnosti s pomočjo orodij za preurejanje genoma vključevale tudi manipulacijo značilnih celičnih in molekulskih poti staranja. Harel in sodelavci (2015) so s sistemom CRISPR/Cas manipulirali gene, povezane s staranjem, v kratkoživeči ribici Nothobranchius furzeri, ki živi v presihajočih ribnikih v Afriki, in spremljali vpliv na senescenco. Ustvarili so vretenčarski model z zmanjšanim izražanjem telomeraze, kar posnema več značilnosti človeških bolezni, ki se pokažejo kasneje v življenju.
S tem so pokazali, da je preurejanje genoma uporabno tudi za preučevanje genov, ki so vpleteni v človeško staranje in bolezni, ki so s tem povezane (Harel in sod., 2015).
Med reprogramiranjem ali med vzdrževanjem celične kulture lahko prihaja do genetskih in epigenetskih sprememb v celicah, kar lahko vpliva na njihov razvojni potencial in uporabo (Gore in sod., 2011; Ma in sod., 2014). Okoljski dejavniki, kot so toksične kovine, pesticidi, življenjski stil in prehranske navade, vplivajo na epigenom in povečujejo tveganje za nastanek določenih sporadičnih bolezni. Proces reprogramiranja celic lahko izbriše določene epigenetske modifikacije, ki jih je povzročilo okolje in so povezane z bolezenskim fenotipom, zato je študij bolezni, povezanih z epigenetskimi vzroki pri uporabi iPSC močno otežen (Saha in Jaenisch, 2009). Genetsko in epigenetsko variabilnost lahko zmanjšamo s pravilno izbiro vira celic, protokola za reprogramiranje in kultivacijskih pogojev. Celice, ki izvirajo iz mladostnikov, imajo manj variacij v epigenomu, kot tiste iz odraslih oseb. Uporaba neintegrirajočih metod za reprogramiranje zmanjša tveganje za reaktivacijo transgena in insercijsko mutagenezo. Pasažiranje lahko zmanjša določene variacije v številu kopij (CNV – angl. copy number variations) in odpravlja »somatski spomin« celic, vendar moramo biti pazljivi, saj se celice z določenimi spremembami lahko delijo hitreje od ostalih in v celični kulturi prevladajo, zato moramo variacije odkrivati in jih kontrolirati, kar storimo s kariotipizacijo in analizo izražanja označevalcev pluripotentnosti. Celice, namenjene za terapevtske aplikacije, je potrebno preučiti in opisati bolj podrobno, npr. s sekvenciranjem genoma, analizo ekspresije in analizo DNA ter histonskih modifikacij (Liang in Zhang, 2013).
3.4 IZOGENE CELIČNE LINIJE
Za vzpostavitev splošnega modela bolezni primerjamo več celičnih linij, ki izvirajo iz istega pacienta in še drugih bolnih posameznikov, da zagotovimo, da določena opažanja niso specifična za posamezno celično linijo ali pacienta (Saha in Jaenisch, 2009). Posamezne ESC in iPSC linije imajo lahko zelo variabilne biološke značilnosti zaradi razlik v genotipu, postopkih pridobivanja celic in, v primeru iPSC, genetskih in epigenetskih sprememb, ki jih lahko povzroči reprogramiranje (Soldner in sod., 2011). Vse to oteži njihovo medsebojno primerjavo, zato se za modeliranje bolezni pogosto poslužujemo uporabe izogenih celičnih linij. Izogene celične linije se med sabo razlikujejo le v kandidatni mutaciji za določeno bolezen, kar olajša odkrivanje vzročne povezave med genotipom in fenotipom. Poleg tega zmanjšamo tudi vpliv dejavnikov, ki vplivajo na diferenciacijski potencial PSC linij, kot so epigenetsko stanje, starost in spol (Musunuru, 2013). Izogene celične linije so zelo pomembne za študij sporadičnih bolezni, ki jih povzročajo dejavniki okolja v kombinaciji z velikim število alelov, ki se nahajajo predvsem v regulatornih regijah in imajo relativno majhen vpliv na fenotip (Hockemeyer in Jaenisch, 2017).
Slika 3: Uporaba izogenih celičnih linij (prirejeno po Bassett, 2017)
Celične modele bolezni lahko z uporabo orodij za preurejanje genoma pripravimo na dva različna načina. Pri prvem pridobimo PSC, ki izvirajo iz celic bolnika, in popravimo
10
kandidatni alel za bolezen. Tako vidimo, ali je genetska sprememba vplivala na bolezenski fenotip, ne izvemo pa, če je dejansko povzročila bolezen. Celične linije, ki izhajajo iz pacienta, se lahko obnašajo nekoliko drugače kot zdrave in jih je zato v nekaterih primerih težje vzdrževati v kulturi in genetsko manipulirati. Pri drugem načinu vzamemo PSC linijo zdravega človeka in uvedemo kandidatno mutacijo. Tako lahko določimo, če je uvedena genetska sprememba dovolj, da povzroči bolezenski fenotip na celični ravni, vendar pa v primeru, da sprememb v molekularnem ali celičnem fenotipu na ravni celične kulture ne zaznamo, ne moremo zaključiti, da ta alel dejansko ne prispeva k bolezni in vivo. Ti dve strategiji sta med seboj komplementarni in lahko priskrbita informacije o potencialnih epistatskih interakcijah z drugimi aleli v specifičnem genetskem ozadju. Pri celičnih linijah, pridobljenih iz zdravih donorjev, lahko direktno primerjamo različne genetske preureditve za določeno bolezen (Bassett, 2017). Vendar pa vedno obstaja nevarnost, da bo postopek preurejanja genoma v celične linije vnesel izven-tarčne spremembe, zato je nerealno pričakovati, da bi lahko pridobili 100% izogene celične linije (Musunuru, 2013).
4 PRIMERI CELIČNIH MODELOV S PREUREJENIM GENOMOM 4.1 PARKINSONOVA BOLEZEN
Patološka značilnost Parkinsonove bolezni je propadanje dopaminergičnih nevronov v temni snovi (lat. substantia nigra) možganov in nabiranje mutiranega α-sinukleina, ki se nahaja v skupkih, imenovanih Lewyjeva telesca. Ob postavitvi diagnoze je običajno velik del nevronov že propadel, nevrodegeneracija pa je razširjena na ostale regije centralnega živčnega sistema.
Med simptome spada tresavica, togost, upočasnjeno gibanje in motnje ravnotežja. Bolezen zdravimo z nadomestkom dopamina, vendar njenega napredovanja ne moremo ustaviti.
Dejavniki tveganja za razvoj bolezni so starost, spol, nekateri okoljski dejavniki in družinska zgodovina bolezni (Balestrino in Schapira, 2020). Leta 1997 so Polymeropoulos in sodelavci prvi povezali Parkinsonovo bolezen z mutacijo gena SCNA (A53T), ki povzroči spremembo aminokisline v α-sinukleinu (Polymeropoulos in sod., 1997).
Preglednica 1: Kandidatni geni, povezani s Parkinsonovo boleznijo (prirejeno po Balestrino in Schapira, 2020)
Gen Protein Dedovanje Funkcija Frekvenca
pojavljanja pri PB SNCA α-sinuklein avtosomno dominantno tvori Lewyjeva
telesca
<1%
PRKN parkin avtosomno recesivno ubikvitin ligaza 1-5%
PINK1 s PTEN inducirana putativna kinaza 1
avtosomno recesivno mitohondrijska kinaza
2-5%
DJ-1 protein DJ-1 avtosomno recesivno senzor
oksidativnega stresa 1%
LRRK2 z levcinkimi ponovitvami bogata kinaza 2
avtosomno dominantno kinaza, več funkcij 1-5%
Živalski modeli za Parkinsonovo bolezen le delno prikažejo njeno patologijo (Dawson in sod., 2010). Mutacije v genih, povezanih s Parkinsonovo boleznijo, kažejo komaj zaznavne spremembe v fenotipu, zato je Soldner s sodelavci (2011) razvil genetsko definiran in vitro človeški model Parkinsonove bolezni. Z uporabo ZFN so ustvarili izogene celične linije, in sicer na dva načina. Najprej so v ESC divjega tipa (zdrav genotip) v gen za α-sinuklein vnesli mutacijo A53T. Od 336 klonov so trije imeli pravilno modifikacijo tarčnega lokusa. Potem so v iPSC bolnika, ki je imel isto mutacijo (α-sinuklein, A53T), mutacijo popravili. Celice so diferencirali v dopaminergične nevrone in potrdili izražanje mutiranega α-sinukleina v nevronih, ki so izhajali iz ESC, ter normalnega α-sinukleina v nevronih, ki so izhajali iz iPSC.
Izven-tarčnih učinkov na preučevanih lokusih niso našli, je pa med kultivacijo ESC prišlo do nekaj sprememb v številu kopij genov (CNV). Zmožnost popravljanja mutacij, ki povzročijo bolezen, predstavlja napredek na področju osnovnih biomedicinskih raziskav, saj bi nam to pomagalo pojasniti mehanizem bolezni (Soldner in sod., 2011).
Reinhardt in sodelavci (2013) so pridobili iPSC bolnikov z najbolj pogosto mutacijo gena LRRK2 (G2019S) in s pomočjo ZNF in Cre/LoxP sistema to mutacijo tudi popravili. LRRK2 kodira serinsko/treoninsko kinazo, ki aktivira ERK signalno pot, kar stimulira transkripcijo gena SCNA (Carballo-Carbajal in sod., 2010). V iPSC zdravega donorja so tarčno vstavili mutacijo LRRK2 G2019S in pokazali, da je to dovolj za nastanek bolezenskega fenotipa v diferenciranih celicah. Mutirani nevroni so v primerjavi s celicami divjega tipa kazali večjo občutljivost na oksidativni stres, manjšo rast izrastkov in večji delež apoptoze. Uspelo jim je tudi identificirati gene (CPNE8, MAP7, CADPS2, UHRF2), ki se jim je zaradi mutacije spremenilo izražanje, in do takrat niso bili povezani s Parkinsonovo boleznijo (Reinhardt in sod., 2013). Slabost Cre/LoxP sistema je sicer, da v bližini tarčnega mesta ostane 34 bp dolgo LoxP zaporedje. Qing in sodelavci (2017) so s sistemom CRISPR/Cas in PiggyBac transpozoni uspeli v zdrave celice uvesti enako mutacijo (LRRK2 G2019S) in ustvariti izogeno celično linijo, ki v genomu nima uvedenih nobenih dodatnih zaporedij (Qing in sod., 2017).
4.2 CISTIČNA FIBROZA
Cistična fibroza je avtosomna recesivna motnja, pri kateri se nenormalno viskozni izločki nabirajo v dihalnih poteh in kanalih trebušne slinavke. Te blokade vodijo v vnetje, poškodbe tkiva in propad obeh organskih sistemov. Prizadeti so tudi ostali organski sistemi, ki vsebujejo epitelne celice, kot so znojnice, prebavni trakt itd. Izguba eksokrine funkcije trebušne slinavke vodi v podhranjenost in, za večino oseb, ki niso zdravljene, smrt že v prvem desetletju življenja. Razlog za bolezen je mutacija gena CFTR, ki kodira kloridni kanalček in je reguliran s cikličnim AMP (Cutting, 2015). Obstaja približno 2000 različic gena, fenotip pacientov pa je pogosto posledica kombinacije dveh ali več mutacij Vsa genetska variabilnost v CFTR ni povezana s cistično fibrozo, številne mutacije pa so zelo redke in še niso bile preučene (Bareil in Bergougnoux, 2020). Najbolj pogosta znana mutacija CFTR, ki povzroči
12
zaplete, je F508del (Kerem in sod., 1989). To je delecija treh nukleotidov, ki spremeni triplet kodonov in vpliva na strukturo mRNA ter zmanjša učinkovitost translacije (Lazrak in sod., 2013). Poleg tega je nastali protein nepravilno zvit, zaradi česar se ga večina kasneje razgradi (Cheng in sod., 1990).
Crane in sodelavci (2015) so popravili F508del mutacijo v iPSC z uporabo ZNF in Cre/Lox.
Popravljene in diferencirane epitelne celice so imele normalno delujoč kloridni kanalček, vendar pa je v genomu ostalo LoxP zaporedje (Crane in sod., 2015). Preurejanje gena brez dodatnih sledov je uspelo Firthu in sodelavcem (2015), z uporabo CRISPR/Cas in selekcijskega označevalca, obdanega s PiggyBac transpozonskim zaporedjem (Firth in sod., 2015). Suzuki in sodelavci (2016) so se ustvarjanja izogene celične linije lotili s TALEN in brez selekcijskega označevalca, ki bi lahko ostal v zaporedju. Celice s popravljeno mutacijo F508del so imele normalen fenotip, torej delujoč kloridni kanalček (Suzuki in sod., 2016).
4.3 LESCH-NYHANOV SINDROM
Lesch-Nyhanov sindrom (LNS) je genetska motnja, ki jo povzročijo mutacije HPRT1, ki se nahaja na X kromosomu in kodira encim v purinskem metabolizmu, imenovan hipoksantin- gvanin-fosforibozil-transferaza (HGPRT). Mutacije so lahko razporejene po celotnem genu in so različnih vrst – drugačnosmiselne (missense) in nesmiselne (nonsense) mutacije, delecije, insercije, duplikacije itd. Za lažjo različico bolezni je značilna prekomerna produkcija sečne kisline, pri težjih oblikah pa ima bolnik še različne stopnje nevroloških in vedenjskih motenj (Fu in sod., 2014). Trenutno še ni sprejete hipoteze, ki bi pojasnjevala nevrovedenjske simptome LNS. Tudi ni nobenega učinkovitega zdravljenja, čeprav je bil vzrok bolezni (okvara encima HGRPT) odkrit že približno 50 let nazaj (Seegmiller in sod., 1967).
Frank in sodelavci (2013) so z orodjem TALEN uvedli kandidatne mutacije v drugi ekson gena HPRT1 v človeških ESC. Pri tem je bila pomembna uporaba dveh selekcijskih označevalcev, saj je bila stopnja mutacij zelo majhna. Pridobili so 5 klonov, od tega tri homozigotne in dva heterozigotna za inducirano mutacijo. Po diferenciaciji v nevrone centralnega in perifernega živčnega sistema so ti kazali fenotip LNS, torej je bila dolžina nevritov krajša. S tem so dokazali, da kandidatne mutacije dejansko vplivajo na fenotip, povezan z boleznijo, ki je zaznaven tudi v celični kulturi (Frank in sod., 2013).
4.4 DRUGE BOLEZNI
Poleg prej opisanih primerov, so bile metode za preurejanje genoma uporabljene tudi za izdelavo celičnih modelov drugih bolezni. Nekateri od njih so predstavljeni v preglednici številka dva.
Preglednica 2: PSC in orodja za preurejanje genoma za izdelavo modelov človeških bolezni (prirejeno po Martín in sod., 2016)
Bolezen Gen Orodje za preurejanje
genoma
PSC Referenca
Hemofilija A F8 TALEN iPSC (Park in sod., 2014)
Fragilni X sindrom FMR1 CRISPR/Cas iPSC in ESC (Park in sod., 2015)
AIDS CCR5 ZFN ESC (Lei in sod., 2011)
Barthov sindrom TAZ CRISPR/Cas iPSC (Wang in sod., 2014)
Wiskott‐Aldrichov sindrom
WAS ZFN ESC (Toscano in sod., 2016)
Epilepsija SCN1A CRISPR/Cas, TALEN iPSC (Liu in sod., 2016)
Avtizem KCTD13 TALEN ESC (Martinez in sod., 2015)
5 PRECIZNA MEDICINA
Celične modele bolezni lahko poleg preučevanja bolezni uporabljamo tudi za odkrivanje novih tarč v razvoju zdravil in testiranje zdravil (Sterneckert in sod., 2014). Mnogo pacientov se na zdravila ne odzove oziroma jim lahko celo škodujejo (Spear in sod., 2001). Ta problem naslavlja t. i. precizna medicina, ki ugotavlja, ali je za nekega pacienta določeno zdravilo primerno, ter kolikšna doza tega zdravila je zanj najbolj ustrezna. Za uporabo precizne medicine je pomembno razumevanje vzrokov za variabilnost v odzivu na zdravilo, med katere spadajo: fenotip in genotip bolezni, fenotip in genotip bolnika, njegov življenjski slog, okolje in zavezanost k zdravljenju, formulacija in način vnosa zdravila (Peck, 2018). Genetske razlike med pacienti vključujejo škodljive mutacije in različno raven izražanja proteinov (proti katerim so običajno usmerjena zdravila), potrebnih za njihov metabolizem. Testiranje različnih zdravil in njihovih koncentracij na bolnikovih celičnih vzorcih nam pomaga ugotoviti, katero zdravilo in v kakšni količini je pri posamezniku najbolj učinkovito (Gorshkov in sod., 2019).
Slika 4: Razlike med posamezniki v najbolj primernem odmerku zdravila (prirejeno po Peck, 2018)
14 5.1 TESTIRANJE ZDRAVIL
Pred varno uporabo zdravil na ljudeh mora biti njihov učinek ustrezno ocenjen, tovrstne raziskave pa so zelo drage. Cena razvoja zdravil stalno narašča in lahko presega več milijard dolarjev. Od vseh zdravil, ki začnejo klinična preizkušanja, jih le okoli deset odstotkov pride na trg (DiMasi in sod., 2016). Velik del testiranj zdravil prekinejo zaradi njihove premajhne učinkovitosti ali toksičnosti (predvsem kardio- in hepatotoksičnosti). Za testiranje toksičnosti se pogosto uporablja živali, v katerih ne moremo vedno vzpostaviti človeških fizioloških razmer. Včasih zdravila, ki dokazano prinašajo koristi v živalskih modelih, pri ljudeh niso nujno tako učinkovita. Poleg tega je lahko snov strupena le za določeno vrsto, ne pa za ostale (Singh in sod., 2015). Uporaba živali v testiranjih je tudi etično sporna, teste je težko avtomatizirati, njihovo vzdrževanje pa je dražje v primerjavi s celičnimi kulturami. Zato so celični modeli uporabni tudi za testiranje zdravil.
Najpogosteje uporabljene celične linije za testiranje toksičnosti so rakavega izvora, ki so po mnogih pasažah dobro prilagojene na in vitro pogoje. Nesmrtnost jim zagotavljajo številne kromosomske in genetske spremembe, zaradi katerih niso vselej optimalen model obnašanja normalnih celic. Boljši model so primarne celične kulture somatskih celic, ki pa so običajno precej variabilne in heterogene ter uspevajo le omejeno količino pasaž, zato je pri njih za testiranje toksičnosti težko pridobiti konsistentne in ponovljive rezultate (Gunaseeli in sod., 2010). Človeške iPSC lahko povečajo učinkovitost in znižajo ceno razvoja zdravil. Prednost iPSC je, da lahko ustvarimo knjižnico celičnih linij, ki predstavljajo širok spekter genetskih in epigenetskih variacij v populaciji. Ker lahko trajno rastejo v kulturi, nam po diferenciaciji zagotavljajo neomejen vir željenih specializiranih celic (Chun in sod., 2011). Uporaba iPSC modelov bolezni bi lahko pomagala obdržati določena zdravila na trgu, saj se lahko zaradi toksičnih stranskih učinkov pri le določenih pacientih zdravilo odstrani s trga, čeprav je za druge paciente učinkovito. Z uporabo diferenciranih celic bolnika, kot so npr. kardiomiociti, bi lahko testirali kardiotoksičnost zdravila, še preden bi ga ponudili pacientu. Če bi in vitro opazili toksičnost, pacient ne bi prejel tega zdravila, bi pa zdravilo ostalo na voljo drugim pacientom, pri katerih nima toksičnih učinkov in je učinkovito (Sterneckert in sod., 2014).
Glavne prednosti in slabosti različnih celičnih tipov celičnih linij so predstavljene v Preglednici tri.
Testiranje učinkovitosti zdravil temelji na tarčah, ki naj bi bile pomembne za mehanizem bolezni. Z modeli, ki izvirajo iz bolnikovih iPSC, lahko in vitro vzpostavimo fenotip in patologijo bolezni. Pri tem so pomembne kontrolne skupine, ki jih ustvarimo s pomočjo orodij za preurejanje genoma tako, da popravimo mutantni alel v bolnikovih iPSC. Rezultate testiranj potrdimo s primerjavo zdravih, bolnikovih in popravljenih iPSC (Shi in sod., 2017).
Preglednica 3: Prednosti in slabosti različnih vrst človeških celic za testiranje zdravil (prirejeno po Ebert in Svendsen, 2010)
Tip celic Prednosti Slabosti
Nesmrtne celične linije
Poceni rast in vzdrževanje Ni pomembnih vidikov nativne funkcije Homogena populacija celic Ne predstavljajo vseh celičnih tipov Primarne celične
linije
Popolnoma diferencirane Težko dostopne za vse celične tipe Dober približek nativne funkcije Potrebujejo svežo pripravo
Ponovljivost
ESC in iPCS Velika količina Draga rast in vzdrževanje
Vir vseh celičnih tipov Časovno zamudno, da pridobimo vse celične tipe
Možnost pridobitve popolnoma diferenciranih celic
Težje dobimo čiste celične populacije Dober približek nativne funkcije Etično sporno pridobivanje (ESC)
Za številne študije in aplikacije potrebujemo velike količine celic z veliko čistostjo. Pri čiščenju lahko uporabimo različne tehnike. Doi in sodelavci (2014) so iz iPSC diferencirali dopaminergične nevrone, ki bi jih lahko uporabljali za zdravljenje Parkinsonove bolezni. S pomočjo celičnega ločevalnika so izolirali diferencirane celice, ki so na površini izražale označevalec CORIN, saj bi prisotnost nediferenciranih celic lahko sprožile nastanek tumorjev (Doi in sod., 2014). Izolacija specifičnih celičnih tipov s pomočjo antigenov na površini celic je pogosto uporabljena metoda za čiščenje, vendar mnogo tipov celic, tudi npr. kardiomiociti, nima znanih specifičnih površinskih označevalcev, na podlagi katerih bi lahko izvedli učinkovito identifikacijo in ločevanje celic. Miki in sodelavci (2015) so izdelali sintetično mRNA, ki kodira fluorescentni protein, označen z zaporedji, ki bi jih prepoznavala miRNA, izražena v celicah, ki nas zanimajo. S to metodo lahko obogatimo različne celične tipe, ki izvirajo iz PSC, kot so kardiomiociti, endotelne celice, hepatociti in β-celice trebušne slinavke (Miki in sod., 2015).
6 ZAKLJUČEK
Napredek v tehnologiji sekvenciranja DNA nam omogoča prepoznavo številnih kandidatnih mutacij, odgovornih za nastanek bolezni, zato je pomembno, da vzpostavimo preproste in robustne celične modele bolezni, ki bi omogočali razumevanje njihove funkcije. Pogost model za človeške bolezni so iPSC, ki izvirajo iz somatskih celic, in jih reprogramiramo v želeni celični tip. Njihova uporaba ni etično sporna, kot to velja za ESC. Vnos transgenov za reprogramiranje predstavlja tveganje za nenamerno insercijsko mutagenezo, ki bi lahko spremenila lastnosti celic, vendar obstajajo tudi učinkovite metode, pri katerih tega tveganja ni. S primerjavo celičnih linij, ki izvirajo iz različnih bolnikov z določeno boleznijo, lahko preučujemo povezavo med genotipom in fenotipom. Z orodji za preurejanje genomov lahko v take celične linije uvedemo kandidatno mutacijo ali kandidatno mutacijo popravimo ter ustvarimo izogene celične linije, ki se med seboj razlikujejo le v kandidatni mutaciji. To
16
celic. Pri vseh tehnikah za preurejanje genoma lahko sicer prihaja do izven-tarčnega delovanja, vendar obstajajo različne metode, ki povečajo njihovo specifičnost. Tako spremenjene celice lahko služijo tudi drugim namenom, kot je testiranje toksičnosti in učinkovitosti zdravil (tudi na personalizirani ravni), ter tako povečajo učinkovitost in zmanjšajo ceno njihove produkcije.
Tudi v prihodnosti modeliranja bolezni bodo celične linije igrale pomembno vlogo, saj imamo poleg vse globljega razumevanja celic v celični kulturi, na voljo tudi nove tehnologije, kot je sistem CRISPR/Cas9, s pomočjo katerega lahko spreminjamo genom celic po lastnih željah.
V zadnjih letih iz PSC izdelujejo tudi 3D strukture, imenovane organoidi, ki bi lahko v večji meri posnemali komunikacijo med celicami v in vivo okolju.
7 VIRI
Avior Y., Sagi I., Benvenisty N. 2016. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 17, 3: 170–182
Balestrino R., Schapira A. H. V. 2020. Parkinson disease. European Journal of Neurology, 27, 1: 27–42
Bareil C., Bergougnoux A. 2020. CFTR gene variants, epidemiology and molecular pathology. Archives de Pediatrie, 27: eS8–eS12, doi: 10.1016/S0929-693X(20)30044-0: 5 str.
Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richardss M., Boyaval P., Moineau S., Romero D. A., Horvath P. 2007. CRISPR provides against viruses in prokaryotes. Science, 315, 5819:
1709–1712
Bassett A. R. 2017. Editing the genome of hiPSC with CRISPR/Cas9: disease models.
Mammalian Genome, 28, 7–8: 348–364
Boch J., Scholze H., Schornack S., Landgraf A., Hahn S., Kay S., Lahaye T., Nickstadt A., Bonas U. 2009. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.
Science, 326, 5959: 1509–1512
Carballo-Carbajal I., Weber-Endress S., Rovelli G., Chan D., Wolozin B., Klein C. L., Patenge N., Gasser T., Kahle P. J. 2010. Leucine-rich repeat kinase 2 induces α-synuclein expression via the extracellular signal-regulated kinase pathway. Cellular Signalling, 22, 5:
821–827
Chapman J. R., Taylor M. R. G., Boulton S. J. 2012. Playing the end game: DNA double- strand break repair pathway choice. Molecular Cell, 47, 4: 497–510
Cheng S. H., Gregory R. J., Marshall J., Paul S., Souza D. W., White G. A., O’Riordan C. R., Smith A. E. 1990. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell, 63, 4: 827–834
Chun Y. S., Byun K., Lee B. 2011. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine:
current progress and future perspectives. Anatomy & Cell Biology, 44, 4: 245–255
Cohen D. E., Melton D. 2011. Turning straw into gold: directing cell fate for regenerative
medicine. Nature Reviews Genetics, 12, 4: 243–252
Crane A. M., Kramer P., Bui J. H., Chung W. J., Li X. S., Gonzalez-Garay M. L., Hawkins F., Liao W., Mora D., Choi S., Wang J., Sun H. C., Paschon D. E., Guschin D. Y., Gregory P.
D., Kotton D. N., Holmes M. C., Sorscher E. J., Davis B. R. 2015. Targeted correction and restored function of the CFTR gene in cystic fibrosis induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports, 4, 4: 569–577
Cutting G. R. 2015. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics, 16, 1: 45–56
Dawson T. M., Ko H. S., Dawson V. L. 2010. Genetic animal models of parkinson’s disease.
Neuron, 66, 5: 646–661
DiMasi J. A., Grabowski H. G., Hansen R. W. 2016. Innovation in the pharmaceutical industry: new estimates of R&D costs. Journal of Health Economics, 47: 20–33
Doi D., Samata B., Katsukawa M., Kikuchi T., Morizane A., Ono Y., Sekiguchi K., Nakagawa M., Parmar M., Takahashi J. 2014. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports, 2, 3: 337–350
Ebert A. D., Svendsen C. N. 2010. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery, 9, 5: 367–372
Firth A. L., Menon T., Parker G. S., Qualls S. J., Lewis B. M., Ke E., Dargitz C. T., Wright R., Khanna A., Gage F. H., Verma I. M. 2015. Functional gene correction for cystic fibrosis in lung epithelial cells generated from patient iPSCs. Cell Reports, 12, 9: 1385–
1390
Frank-Kamenetsky M., Zhang X. M., Bottega S., Guicherit O., Wichterle H., Dudek H., Bumcrot D., Wang F. Y., Jones S., Shulok J., Rubin L. L., Porter J. A. 2002. Small- molecule modulators of Hedgehog signaling: identification and characterization of smoothened agonists and antagonists. Journal of Biology, 1, 2: 10, doi: 10.1186/1475- 4924-1-10: 19 str.
Frank S., Skryabin B. V., Greber B. 2013. A modified TALEN-based system for robust generation of knock-out human pluripotent stem cell lines and disease models. BMC Genomics, 14, 1: 773–781
Fu R., Ceballos-Picot L., Rosa J., Larovere L.E., Yamada Y., Nguyen K. V., Hegde M., Visser J.E., Schretlen D.J., Nyhan W.L., Puig J.G., O’Neill P.J., Jinnah H.A. 2014.
Genotype-phenotype correlations in neurogenetics: Lesch-Nyhan disease as a model disorder. Brain, 137, 5: 1282–1303
Fu Y., Foden J. A., Khayter C., Maeder M. L., Reyon D., Joung J. K., Sander J. D. 2013.
High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.
Nature Biotechnology, 31, 9: 822–826
Gaj T., Sirk S. J., Shui S. L., Liu J. 2016. Genome-editing technologies: principles and applications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 8, 12: a023754, doi:
10.1101/cshperspect.a023754: 21 str.
Goparaju S. K., Kohda K., Ibata K., Soma A., Nakatake Y., Akiyama T., Wakabayashi S., Matsushita M., Sakota M., Kimura H., Yuzaki M., Ko S. B. H., Ko M. S. H. 2017. Rapid
18
differentiation of human pluripotent stem cells into functional neurons by mRNAs encoding transcription factors. Scientific Reports, 7, 1: 42367, doi: 10.1038/srep42367: 12 str.
Gore A., Li Z., Fung H.-L., Young J. E., Agarwal S., Antosiewicz-Bourget J., Canto I., Giorgetti A., Israel M. A., Kiskinis E., Lee J.-H., Loh Y.-H., Manos P. D., Montserrat N., Panopoulos A. D., Ruiz S., Wilbert M. L., Yu J., Kirkness E. F., Izpisua Belmonte J. C., Rossi D. J., Thomson J. A., Eggan K., Daley G. Q., Goldstein L. S. B., Zhang K. 2011.
Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature, 471, 7336: 63–
67
Gorshkov K., Chen C. Z., Marshall R. E., Mihatov N., Choi Y., Nguyen D. T., Southall N., Chen K. G., Park J. K., Zheng W. 2019. Advancing precision medicine with personalized drug screening. Drug Discovery Today, 24, 1: 272–278
Guénet J. L. 2005. The mouse genome. Genome Research, 15, 12: 1729–1740
Gunaseeli I., Doss M. X., Antzelevitch C., Hescheler J., Sachinidis A. 2010. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current Medicinal Chemistry, 17, 8: 759–766
Harel I., Benayoun B. A., Machado B., Singh P. P., Hu C. K., Pech M. F., Valenzano D. R., Zhang E., Sharp S. C., Artandi S. E., Brunet A. 2015. A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate. Cell, 160, 5: 1013–1026
Hockemeyer D., Jaenisch R. 2017. Induced pluripotent stem cells meet genome editing. Cell Stem Cell, 18, 5: 573–586
Horvath P., Barrangou R. 2010. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea.
Science, 327, 5962: 167–170
Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. 2012. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.
Science, 337, 6096: 816–821
Joung J. K., Sander J. D. 2013. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 14, 1: 49–55
Kerem B., Rommens J. M., Buchanan J. A., Merkiewiez D., Cox T. K., Chakravarti A., Buchwald M., Tsui L. 1989. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.
Science, 245, 4922: 1073–1080
Kim K., Doi A., Wen B., Ng K., Zhao R., Cahan P., Kim J., Aryee M., Ji H., Ehrlich L., Yabuuchi A., Takeuchi A., Cunniff K., Hongguang H., Mckinney-Freeman S., Naveiras O., Yoon T., Irizarry R., Jung N., Seita J., Hanna J., Murakami P., Jaenisch R., Weissleder R., Orkin S., Weissman I., Feinberg A., Daley G. 2010. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature, 467, 7313: 285–290
Kim Y. G., Cha J., Chandrasegaran S. 1996. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 3: 1156–1160
Lazrak A., Fu L., Bali V., Bartoszewski R., Rab A., Havasi V., Keiles S., Kappes J., Kumar R., Lefkowitz E., Sorscher E. J., Matalon S., Collawn J. F., Bebok Z. 2013. The silent codon change I507-ATC→ATT contributes to the severity of the AF508 CFTR channel
dysfunction. FASEB Journal, 27, 11: 4630–4645
Lei Y., Lee C. L., Joo K. I, Zarzar J., Liu Y., Dai B., Fox V., Wang P. 2011. Gene editing of human embryonic stem cells via an engineered baculoviral vector carrying zinc-finger nucleases. Molecular Therapy, 19, 5: 942–950
Liang G., Zhang Y. 2013. Genetic and epigenetic variations in iPSCs: potential causes and implications for application. Cell Stem Cell, 13, 2: 149–159
Liu J., Gao C., Chen W., Ma W., Li X., Shi Y., Zhang H., Zhang L., Long Y., Xu H., Guo X., Deng S., Yan X., Yu D., Pan G., Chen Y., Lai L., Liao W., Li Z. 2016. CRISPR/Cas9 facilitates investigation of neural circuit disease using human iPSCs: mechanism of epilepsy caused by an SCN1A loss-of-function mutation. Translational Psychiatry, 6, 1:
e703, doi: 10.1038/tp.2015.203: 9 str.
Ma H., Morey R., O’Neil R. C., He Y., Daughtry B., Schultz M. D., Hariharan M., Nery J. R., Castanon R., Sabatini K., Thiagarajan R. D., Tachibana M., Kang E., Tippner-Hedges R., Ahmed R., Gutierrez N. M., Van Dyken C., Polat A., Sugawara A., Sparman M., Gokhale S., Amato P., Wolf D. P., Ecker J. R., Laurent L. C., Mitalipov S. 2014. Abnormalities in human pluripotent cells due to reprogramming mechanisms. Nature, 511, 7508: 177–183 Martín F., Sánchez-Gilabert A., Tristán-Manzano M., Benabdellah K. 2016. Stem cells for
modeling human disease. V: Pluripotent stem cells - from the bench to the clinic. Minoru Tomizawa (ur.). Rijeka, IntechOpen: 257-272
Martinez R. A., Stein J. L., Krostag A. R. F., Nelson A. M., Marken J. S., Menon V., May R.
C., Yao Z., Kaykas A., Geschwind D. H., Grimley J. S. 2015. Genome engineering of isogenic human ES cells to model autism disorders. Nucleic Acids Research, 43, 10: e65, doi: 10.1093/nar/gkv164: 9str.
Miki K., Endo K., Takahashi S., Funakoshi S., Takei I., Katayama S., Toyoda T., Kotaka M., Takaki T., Umeda M., Okubo C., Nishikawa M., Oishi A., Narita M., Miyashita I., Asano K., Hayashi K., Osafune K., Yamanaka S., Saito H., Yoshida Y. 2015. Efficient detection and purification of cell populations using synthetic microRNA switches. Cell Stem Cell, 16, 6: 699–711
Miller J. D., Ganat Y. M., Kishinevsky S., Bowman R. L., Liu B., Tu E. Y., Mandal P. K., Vera E., Shim J. W., Kriks S., Taldone T., Fusaki N., Tomishima M. J., Krainc D., Milner T. A., Rossi D. J., Studer L. 2013. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell, 13, 6: 691–705
Murphy H. C. 1991. The use of whole animals versus isolated organs or cell culture in research. Transactions of the Nebraska Academy of Sciences and Affiliated Societies, 18:
105–108
Mussolino C., Alzubi J., Fine E. J., Morbitzer R., Cradick T. J., Lahaye T., Bao G., Cathomen T. 2014. TALENs facilitate targeted genome editing in human cells with high specificity and low cytotoxicity. Nucleic Acids Research, 42, 10: 6762–6773
Musunuru K. 2013. Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models. Disease Models & Mechanisms, 6, 4: 896–904
Nemudryi A. A., Valetdinova K. R., Medvedev S. P. Zakian S. M. 2014. TALEN and CRISPR/Cas genome editing systems: tools of discovery. Acta Naturae, 6, 3: 19–40
20
Park C. Y., Halevy T., Lee D. R., Sung J. J., Lee J. S., Yanuka O., Benvenisty N., Kim D. W.
2015. Reversion of FMR1 methylation and silencing by editing the triplet repeats in fragile X iPSC-derived neurons. Cell Reports, 13, 2: 234–241
Park C. Y., Kim J., Kweon J., Son J. S., Lee J. S., Yoo J. E., Cho S. R., Kim J. H., Kim J. S., Kim D. W. 2014. Targeted inversion and reversion of the blood coagulation factor 8 gene in human iPS cells using TALENs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111, 25: 9253–9258
Pavletich N. P., Pabo C. O. 1991. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268- DNA complex at 2.1 A. Science, 252, 5007: 809–817
Peck R. W. 2018. Precision medicine is not just genomics: the right dose for every patient.
Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 58, 1: 105–122
Polymeropoulos M. H., Lavedan C., Leroy E., Ide S. E., Dehejia A., Dutra A., Pike B., Root H., Rubenstein J., Boyer R., Stenroos E. S., Chandrasekharappa S., Athanassiadou A., Papapetropoulos T., Johnson W. G., Lazzarini A. M., Duvoisin R. C., Di Iorio G., Golbe L.
I., Nussbaum R. L. 1997. Mutation in the α-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science, 276, 5321: 2045–2047
Qing X., Walter J., Jarazo J., Arias-Fuenzalida J., Hillje A.L., Schwamborn J.C. 2017.
CRISPR/Cas9 and piggyBac-mediated footprint-free LRRK2-G2019S knock-in reveals neuronal complexity phenotypes and α-synuclein modulation in dopaminergic neurons.
Stem Cell Research, 24: 44–50
Reinhardt P., Schmid B., Burbulla L. F., Schöndorf D. C., Wagner L., Glatza M., Höing S., Hargus G., Heck S. A., Dhingra A., Wu G., Müller S., Brockmann K., Kluba T., Maisel M., Krüger R., Berg D., Tsytsyura Y., Thiel C. S., Psathaki O. E., Klingauf J., Kuhlmann T., Klewin M., Müller H., Gasser T., Schöler H. R., Sterneckert J. 2013. Genetic correction of a lrrk2 mutation in human iPSCs links parkinsonian neurodegeneration to ERK- dependent changes in gene expression. Cell Stem Cell, 12, 3: 354–367
Saha K., Jaenisch R. 2009. Technical challenges in using human induced pluripotent stem cells to model disease. Cell Stem Cell, 5, 6: 584–595
Seegmiller J. E., Rosenbloom F. M., Kelley W. N. 1967. Enzyme defect associated with a sex-linked human neurological disorder and excessive purine. American Association for the Advancement of Science, 155, 3770: 1682–1684
Shi Y., Inoue H., Wu J. C., Yamanaka S. 2017. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery, 16, 2: 115–130
Silva M., Daheron L., Hurley H., Bure K., Barker R., Carr A. J., Williams D., Kim H. W., French A., Coffey P. J., Cooper-White J. J., Reeve B., Rao M., Snyder E. Y., Ng K. S., Mead B. E., Smith J. A., Karp J. M., Brindley D. A., Wall I. 2015. Generating iPSCs:
translating cell reprogramming science into scalable and robust biomanufacturing strategies. Cell Stem Cell, 16, 1: 13–17
Singh V. K., Kalsan M., Kumar N., Saini A., Chandra R. 2015. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.
Frontiers in Cell and Developmental Biology, 3: 2, doi:10.3389/fcell.2015.00002: 18 str.
Soldner F., Laganière J., Cheng A. W., Hockemeyer D., Gao Q., Alagappan R., Khurana V., Golbe L. I., Myers R. H., Lindquist S., Zhang L., Guschin D., Fong L. K., Vu B. J., Meng
X., Urnov F. D., Rebar E. J., Gregory P. D., Zhang H. S., Jaenisch R. 2011. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset parkinson point mutations. Cell, 146, 2: 318–331
Spear B. B., Heath-Chiozzi M., Huff J. 2001. Clinical application of pharmacogenetics.
Trends in Molecular Medicine, 7, 5: 201–204
Sterneckert J. L., Reinhardt P., Schöler H. R. 2014. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews Genetics, 15, 9: 625–639
Suzuki S., Sargent R. G., Illek B., Fischer H., Esmaeili-Shandiz A., Yezzi M. J., Lee A., Yang Y., Kim S., Renz P., Qi Z., Yu J., Muench M. O., Beyer A. I., Guimarães A. O., Ye L., Chang J., Fine E. J., Cradick T. J., Bao G., Rahdar M., Porteus M. H., Shuto T., Kai H., Kan Y. W., Gruenert D. C. 2016. TALENs facilitate single-step seamless SDF correction of F508del CFTR in airway epithelial submucosal gland cell-derived CF-iPSCs. Molecular Therapy - Nucleic Acids, 5, 1: e273, doi: 10.1038/mtna.2015.43: 10 str.
Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. 2007.
Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 131, 5: 861–872
Takahashi K., Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126, 4: 663–676
Toscano M. G., Muñoz P., Sánchez-Gilabert A., Cobo M., Benabdellah K., Anderson P., Ramos-Mejía V., Real P. J., Neth O., Molinos-Quintana A., Gregory P. D., Holmes M. C., Martin F. 2016. Absence of WASp enhances hematopoietic and megakaryocytic differentiation in a human embryonic stem cell model. Molecular Therapy, 24, 2: 342–353 Tycko J., Myer V. E., Hsu P. D. 2016. Methods for optimizing CRISPR-Cas9 genome editing
specificity. Molecular Cell, 63, 3: 355–370
Verlinsky Y., Strelchenko N., Kukharenko V., Rechitsky S., Verlinsky O., Galat V., Kuliev A. 2005. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online, 10, 1: 105–110
Wang G., McCain M. L., Yang L., He A., Pasqualini F. S., Agarwal A., Yuan H., Jiang D., Zhang D., Zangi L., Geva J., Roberts A. E., Ma Q., Ding J., Chen J., Wang D. Z., Li K., Wang J., Wanders R. J. A., Kulik W., Vaz F. M., Laflamme M. A., Murry C. E., Chien K.
R., Kelley R. I., Church G. M., Parker K. K., Pu W. T. 2014. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine, 20, 6: 616–623
Werner Sunderland M., Peggs K. S. 2018. Successful translation and future prospects of TALEN editing for leukemia patients. Expert Opinion on Biological Therapy, 18, 7: 725–
726
Wolfe S. A., Nekludova L., Pabo C. O. 2000. DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 29: 183–212
Yee J. K. 2016. Off-target effects of engineered nucleases. The FEBS Journal, 283, 17: 3239–
3248
Yip B. H. 2020. Recent advances in CRISPR/Cas9 delivery strategies. Biomolecules, 10, 6:
839, doi: 10.3390/biom10060839: 16 str.
22 ZAHVALA
Zahvaljujem se doc. dr. Jerneju Ogorevcu za prevzem mentorstva in pomoč pri izdelavi diplomskega dela.
Hvala tudi vsem domačim, ki so mi omogočili študij in me vedno podpirali.
