FAKULTETA ZA FARMACIJO
ANA ZAGORC
VREDNOTENJE METABOLIZMA IN PERMEABILNOSTI PARABENOV V IZBRANIH CELIČNIH LINIJAH IN VITRO
METABOLISM AND PERMEABILITY EVALUATION OF PARABENS IN SELECTED CELL LINES IN VITRO
DIPLOMSKA NALOGA
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA
Diplomsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom izr. prof. dr.
Simona Žaklja, mag. farm.
Zahvala
Zahvaljujem se mentorju izr. prof. dr. Simonu Žaklju, mag. farm. za vse nasvete, pomoč, ažurnost in vodenje. Zahvala gre tudi Nevenki Lilik, dipl. ing. kem. tehn. za vso pomoč v laboratoriju in dobro voljo. Nazadnje se zahvaljujem prijateljem, LC-MS ekipi in družini za moralno podporo tekom študija in izdelave diplomske naloge.
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom izr. prof. dr.
Simona Žaklja, mag. farm.
Ana Zagorc
Ljubljana, 2021
Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Alenka Zvonar Pobirk, mag. farm.
Član diplomske komisije: doc. dr. Anja Pišlar, mag. farm.
VSEBINA
KAZALO VSEBINE
KAZALO
1 UVOD ... 10
1.1 PERMEABILNOST ... 10
1.2 METODE ZA DOLOČANJE PERMEABILNOSTI ... 10
1.3 METABOLIZEM ... 12
1.4 CELIČNE LINIJE ... 14
1.4.1 Caco-2 celice ... 14
1.4.2 HepG2 celice ... 15
1.4.3 Keratinociti – celična linija NCTC2544, ICLC ... 15
1.5 MODELNE SPOJINE ... 16
1.5.1 Metilparaben ... 16
1.5.2 Etilparaben ... 17
1.5.3 Propilparaben ... 17
1.5.4 Para-hidroksibenzojska kislina ... 17
2 NAMEN DELA ... 18
3 MATERIALI IN METODE ... 19
3.1 SPOJINE ... 19
3.2 APARATURE IN LABORATORIJSKI PRIBOR ... 20
3.3 MEDIJI ZA GOJENJE CELIC ... 20
3.3.1 Medij za gojenje Caco-2 celic ... 20
3.3.2 Medij za gojenje HepG2 celic ... 21
3.3.3 Medij za gojenje celične linije NCTC2544 ... 21
3.4 PRIPRAVA REAGENTOV IN RAZTOPIN ... 21
3.4.1 Ringerjev pufer ... 21
3.4.2 PBS ... 22
3.4.3 1% HCOOH v acetonitrilu... 22
3.4.4 Metilparaben ... 22
3.4.5 Etilparaben ... 22
3.4.6 Propilparaben ... 22
3.4.7 Para-hidroksibenzojska kislina ... 23
3.4.8 Akceptorske raztopine za poskus na Caco-2 celicah ... 23
3.4.9 Donorske raztopine za poskus na Caco-2 celicah ... 23
3.4.10 Priprava standardnih raztopin atenolola in metoprolola ... 24
3.4.11 Priprava raztopin za poskus na HepG2 celicah in celični liniji NCTC2544 ... 24
3.5 POSTOPKI IN METODE ... 25
3.5.1 Gojenje celičnih linij ... 25
3.5.2 Razvoj analizne metode ... 26
3.5.3 Eksperimentalno delo ... 27
4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 31
4.1 Ustreznost celičnih linij ... 31
4.2 Analizna metoda ... 31
4.3 Določanje permeabilnosti in metabolizma parabenov skozi Caco-2 celice... 33
4.3.1 Metilparaben ... 33
4.3.2 Etilparaben ... 36
4.3.3 Propilparaben ... 38
4.3.4 Para-hidroksibenzojska kislina ... 39
4.3.5 Primerjava permeabilnosti preiskovanih spojin ... 39
4.4 Določanje metabolizma parabenov pri HepG2 celicah in na celični liniji NCTC2544 42 5 SKLEP ... 46
6 LITERATURA ... 47
KAZALO SLIK
Slika 1: Stolpični diagram povprečnih vrednosti Papp (nm/s) ± SD v smeri prehoda Ap-BL in BL-Ap
metilparabena (MP) pripravljenem v Ringerjevem pufru (R) in mediju. ... 33
Slika 2: Množina (mol) metilparabena (MP), ki je prešla skozi plast Caco-2 celic iz različnih donorskih raztopin in smeri prehoda (kvadrat – povprečje množin, ko je bila donorska raztopina MP pripravljena v Ringerjevem pufru v Ap-BL smeri ± SD; trikotnik - povprečje množin vzorcev donorske raztopine MP v Ringerjevem pufru v BL-Ap smeri ± SD; kara - povprečje množin vzorcev donorske raztopine MP v mediju v Ap-BL smeri ± SD) v odvisnosti od časa. ... 35
Slika 3: Povprečne množine (mol) vseh parabenov in p-HBK ± SD, ki so prešle skozi plast Caco-2 celic v Ap- BL smeri (kvadrat – propilparaben (PP), krog – etilparaben (EP), trikotnik – metilparaben (MP) pripravljen v pufru, kara – para-hidroksibenzojska kislina (p-HBK), ko je bila samostojno pripravljena kot donorska raztopina) v odvisnosti od časa. ... 37
Slika 4: Množina (mol) etilparabena (krog) v Ringerjevem pufru in p-HBK (para-hidroksibenzojska kislina) (kvadrat), ko je bil na donorsko stran dodan le etilparaben ± SD v odvisnosti od časa. ... 38
Slika 5: Primerjava naraščanja množine (mol) propilparabena (PP) (kara), ki je prešel skozi plast celic Caco-2 in p-HBK (para-hidroksibenzojska kislina) (trikotnik), ko je le-ta nastala kot metabolit propilparbena med difuzijo skozi plast Caco-2 celic. ... 39
Slika 6: Modri stolpci prikazujejo permeabilnost (nm/s) parabenov (MP – metilparaben, EP – etilparaben, PP – propilparaben) in p-HBK ± SD v absorptivni smeri (Ap-BL); zeleni stolpci pa prikazujejo
permeabilnost p-HBK (nm/s), ki nastane ob metabolizmu parabenov. ... 40
Slika 7: Primerjava permeabilnosti (nm/s) med parabeni (MP – metilparaben, EP – etilparaben, PP – propilparaben) ter p-HBK (para-hidroksibenzojska kislina) in standardoma – atenololom in metoprololom ± SD. ... 41
Slika 8: Deleži metabolizma parabenov (metilparaben – MP, etilparaben – EP, propilparaben – PP) in p- HBK (para-hidroksibenzojska kislina) po eni uri na keratinocitna celična linija (modri stolpci) in HepG2 celicah (oranžni stolpci) ± SD. ... 43
Slika 9: Obseg metabolizma posameznih parabenov (metilparaben – MP, etilparaben – EP, propilparaben – PP) in p-HBK (para-hidroksibenzojska kislina) v keratinocitih (modri stolpci) in v HepG2 celicah (oranžni stolpci) ± SD po 24 urni inkubaciji. ... 44
Slika 10: Delež pretvorbe parabenov (MP – metilparaben, EP – etilparaben, PP – propilparaben) v p-HBK (para- hidroksibenzojska kislina) ± SD po 24 urah; modri stolpci – keratinocitna celična linija, oranžni stolpci – HepG2 celice... 45
KAZALO ENAČB
Enačba 1: Formula za izračun števila celic v vdolbinah. ... 25
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Shematski prikaz priprave kalibracijskih raztopin v Ringerjevem pufru za izdelavo umeritvene premice za vse preiskovane spojine (metilparaben, etilparaben, propilparaben in p-HBK). ... 29 Preglednica II: Nastavitev gradientne metode HPLC, ki s časom spreminja delež mobilnih faz do končnih pogojev. ... 32
POVZETEK
Parabeni so konzervansi, ki se uporabljajo v kozmetičnih, prehranskih in farmacevtskih izdelkih. Kemijsko so alkil estri para-hidroksibenzojske kisline. Poznamo več vrst parabenov pod različnimi imeni, kot taki se naprimer najpogosteje uporabljajo metilparaben (E218), etilparaben (E214), propilparaben (E216) itn. Zanimali so nas kratkoverižni parabeni, saj imajo ti večjo sposobnost penetracije skozi kožo kot dolgoverižni. Ker sta običajni poti vnosa parabenov v organizem skozi prebavila in skozi kožo, smo za raziskovanje vstopa parabenov izbrali celične linije Caco-2, HepG2 in NCTC2544. Glavna presnovna pot, ki omejuje biološko uporabnost parabenov, je metabolizem do para- hidroksibenzojske kisline. Zato smo v vseh celičnih linijah preverili zmožnost zaznavanja in kvantitativne opredelitve te pretvorbe. S Caco-2 celicami smo določili tudi permeabilnostne lastnosti parabenov in para-hidroksibenzojske kisline.
Za sočasno detekcijo različnih spojin v vzorcih smo uporabili HPLC (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti) sistem in razvili metodo, ki je dovolj selektivna in občutljiva. Primerna je morala biti za sočasno določanje vseh načrtovanih preiskovanih spojin v dovolj kratkem času, da je omogočala analizo velikega števila vzorcev pridobljenega v poskusih.
Opazovali smo kako temeljito se parabeni metabolizirajo in opazili velik del pretvorbe preiskovanih spojin v metabolit že medtem, ko so parabeni prehajali sluznico.
Ključne besede: metabolizem, permeabilnost, parabeni, celične linije
ABSTRACT
Parabens are perservatives used in cosmetics, food and pharmaceuticals. Chemically they are alkyl esters of hydroxybenzoic acid. There are several different types of parabens, under different names, in our thesis we have chosen methylparaben (E218), ethylparaben (E214) and propylparaben (E216). We were interested in short-chain parabens, due to their higher ability to penetrate the skin compared to long-chain parabens. Most important pathways for parabens into organism are through the dygestive system and skin. Therefore we selected Caco-2, HepG2 and NCTC2544 cell lines to measure metabolism and permeability.
An HPLC (High Performance Liquid Chromatography) system was used for simultaneous detection of different compounds in samples. A sufficiently selective and sensitive metod was developed for this purpose.
The main metabolic pathway, restricting biological use of parabens, is the metabolism to para-hydroxybenzoic acid. Therefore, the ability to detect and quantify this conversion was tested in all cell lines. With theuse of Caco-2 cells the permeability properties of parabens and para-hydroxybenzoic acid were determined.
In this thesis, we observed how parabens are being transformed into metabolite, which is para-hydroxybenzoic acid, and came to conclusion that they are quick to enter membrane but as soon as they come into contact with membrane big flux of metabolite was noticed.
Key words: metabolism, permeability, parabens, cell lines
SEZNAM OKRAJŠAV
ACN = acetonitril ATP = adenozin trifosfat
BCS = Biofarmacevtski klasifikacijski sistem (Biopharmaceutics Classification System) BeP = benzilparaben
BP = butilparaben CYP = citokrom EP = etilparaben EtOH = etanol
hCE1 = karboksilesteraza 1, tudi CES1 hCE2 = karboksilesteraza 2, tudi CES2
HPLC = tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC (High Performace Liquid Chromatography)
MP = metilparaben
OECD = Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (Organisation for Economic Co-operation and Development)
p-HBK = para-hidroksibenzojska kislina
PP = propilparaben
Papp = permeabilnostni koeficient PBS = fosfatni pufer s soljo
RSD = relativni standardni odklon
SCCP = Znanstveni odbor za potrošniške izdelke (Scientific Committee on Consumer Products)
SD = standardna deviacija
1 UVOD
1.1 PERMEABILNOST
Pojem permeabilnosti Slovar slovenskega knjižnega jezika [1] opredeli kot »sposobnost omogočanja prehoda, zlasti tekočinam; prepustnost«. V kontekstu biologije se ta pojem navezuje na lastnost biološke bariere v okviru (one)omogočanja prehoda spojine skozi biološko bariero.
Celična permeabilnost je odvisna od membrane, za katero je značilna selektivna prepustnost, kar pomeni, da skozi fosfolipidni dvosloj prehajajo majhne molekule in večje nepolarne molekule, topne v lipidih [2]. Nepropustnost velja za anorganske ione in večje organske spojine [3, 4]. Celična permeabilnost obsega dve vrsti transporta, ki se razlikujeta po smeri in viru energije. Pasivni transport pomeni, da transport poteka s področja z višjo koncentracijo na področje z nižjo koncentracijo tj. v nasprotni smeri koncentracijskega gradienta, ki predstavlja tudi vir energije za ta transport. Proces pasivne difuzije poteka, dokler niso molekule topljenca enakomerno razporejene med dvema raztopinama, ki ju ločuje difuzijska bariera. Aktivni transport je prenos topljenca v smeri koncentracijskega gradienta, se pravi iz manjše v večjo koncentracijo, pri temu pa se uporablja energija v obliki ATP (adenozin trifosfat) ali pa se kot vir energije porablja koncentracijski gradient katere druge snovi [2, 3, 4].
1.2 METODE ZA DOLOČANJE PERMEABILNOSTI
Metode za določanje permeabilnosti skozi kožo delimo v dve kategoriji: in vitro in in vivo.
In vivo metode se izvajajo na živih subjektih, kot so človeški prostovoljci in živali, predvsem glodavci. OECD (Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj) podaja načela in vivo testiranj na podganah. Pri njih naj se uporabi površina v velikosti 10 cm2, to se določi z napravo, ki naj bo nameščena na tej površini. Testiranje se izvaja določeno časovno obdobje,
v tem času vsaka testirana podgana biva v svoji individualni kletki, kjer je omogočeno tudi zbiranje njenih izločkov. Po končanem testiranju se nanesen preparat odstrani z uporabo ustrezne metode čiščenja, testne živali so nato usmrčene, če se organi in tkiva uporabijo za nadaljne analize. Zbrani podatki o izvedenem testiranju omogočajo izračun kožne absorpcije testirane snovi, ki je lahko podana kot absorbirana količina na določeno časovno enoto ali kot povprečna absorpcija na površino kože, na osnovi vsebnosti v izločkih pa se lahko izračuna izločanje in metabolizem [5].
Prednost v uporabi metod iz te kategorije predstavlja uporaba fiziološko in metabolično intaktnih sistemov – študije se izvajajo na živalih, običajno glodavcih in na ljudeh prostovoljcih. Po drugi strani pa imajo in vivo metode več slabosti. Izvajanje testiranja na živih subjektih je lahko etično sporno, zahteva visoke finančne vložke, raziskave pa so lahko dolgotrajne. Hkrati lahko pride do večje variacije rezultatov, saj se lahko subjekti razlikujejo glede demografskih spremenljivk (starost, spol, rasa), glede splošnega zdravja, med samimi subjekti pa živali izkazujejo drugačne lastnosti v permeabilnosti kože in imajo drugačno sistemsko dispozicijo kot ljudje. Zaradi nevedenih pomanjkljivosti se in vivo metode za določanje permeabilnosti skozi kožo uporabljajo le, kadar ne obstajajo ustrezne alternative in so tako te nujno potrebne, oziroma kadar so bile predhodno že opravljene vse smiselne raziskave na in vitro modelih [6, 7].
In vitro metode za določanje permeabilnosti se opravijo zunaj živega organizma. Uporaba teh metod je široko razširjena, predvsem zaradi neinvazivnosti ter možnosti hitrega pridobivanja rezultatov in enostavne izvedbe [8]. Uporaba teh metod je možna tako na
»neživi« človeški kot živalski koži, hkrati pa lahko poleg permeabilnosti preučujemo tudi metabolizem, v tem primeru mora koža biti viabilna [9].
Pomemben dejavnik v okviru permeabilnosti je tudi topnost, ki je nujen predpogoj za absorpcijo zdravilne učinkovine oz. katerekoli snovi. Pomen raztapljanja vnesene spojine na njeno biološko uporabnost so proučevali predvsem na primeru peroralno apliciranih zdravil, kjer je bila tudi naprej potrjena korelacija med in vitro sproščanjem in in vivo biološko uporabnostjo vnesene učinkovine [10]. Amidon in sodelavci [10] so s pomočjo živalskega
modela potrdili tudi korelacijo med absorpcijo učinkovine in permeabilnostjo črevesne membrane. Na podlagi nadaljnjega raziskovanja te korelacije za peroralno aplicirane zdravilne učinkovine so slednje danes razvščene v sistem imenovan Biofarmacevtski klasifikacijski sistem (BCS). Glede na BCS smernice zdravilne učinkovine razvrščamo v štiri razrede, glede na njihovo topnost in permeabilnost [10, 11]:
- razred I: visoka topnost – visoka permeabilnost – visok obseg presnove, - razred II: nizka topnost – visoka permeabilnost – visoka stopnja presnove, - razred III: visoka topnost – nizka permeabilnost – slaba presnova,
- razred IV: nizka topnost – nizka permeabilnost – slaba presnova.
Visoka stopnja permeabilnosti je po prvotnih smernicah v primeru peroralne aplikacije pomenila, da se absorbira več kot 90 % odmerka zdravilne učinkovine, medtem ko je visoka topnost definirana kot raztopitev najvišjega odmerka zdravila v pH območju 1-7,5 v 250 ml vodnega medija [12].
1.3 METABOLIZEM
Po absorbciji se parabeni v telesu s pomočjo esteraz hidrolizirajo, metaboliti pa se ne zadržujejo v telesu, temveč se izločijo z urinom. Primarni in iz vidika obsega najpomembnejši metabolit parabenov je para-hidroksibenzojska kislina (p-HBK).
Metabolizem parabenov v človeškem telesu se razlikuje glede na način absorpcije. V primeru uporabe kozmetičnih izdelkov se parabeni absorbirajo dermalno. Parabeni prodrejo skozi plasti povrhnjice v usnjico, kjer se lahko tudi metabolizirajo pred absorpcijo v sistemski krvni obtok. V primeru spremljanja metabolizma po dermalni absorpciji z metodami in vivo zelo težko ločimo med metabolizmom v jetrih in metabolizmom v koži [13, 14]. Za vrednotenje slednjih dveh so tako primernejše in vitro metode, ki temeljijo na uporabi celičnih frakcij (mikrosomi, živalska koža, donorska koža). Pri analizi metabolizma je pomembna tudi hitrost difuzije (ang. flux) in s tem penetracije parabenov v in skozi kožo [15]. Prva faza metabolizma je ponavadi hidroliza parabenov, sledi lahko še konjugacija z
glukuronidom, sulfatom ali glicinom. Za izvedbo slednje ni potrebna predhodna hidroliza.
Namen konjugacije je povečanje hidrofilnosti snovi, da bi se ta lažje izločila iz telesa.
Glukuronidacija je katalizirana z encimi UDP-glukuronoziltransferaze, ki omogočajo vezavo glukuronske kisline na nukleofilno skupino parabena oziroma na para- hidroksibenzojske kisline. Posledica je nastanek hidrofilnih molekul – β-glukuronidov, za katere je značilno izločanje z urinom in žolčem [16].
Značilnosti metabolizma parabenov opredeljene in opisane v okviru in vitro metod skozi kožo so naslednje :
- odvisen je od načina izpostavitve (tj. per os ali dermalno), metabolizem se odvija hitro in v velikem obsegu [17],
- človeška koža ima vsaj 4 različne karboksilesteraze, ki lahko cepijo parabene [18], - dolžina alkilne verige parabena in vrste stranske skupine določa hitrost hidrolize.
hCE1 (karboksilesteraza 1, tudi CES1) ima večjo afiniteto do metilparabena in etilparabena in prevladuje v jetrih, hCE2 (karboksilesteraza 2, tudi CES2) do propilparabena, butilparabena in benzilparabena in prevladuje v koži ter tankem črevesu [16, 19],
- metabolizem parabenov v večji meri poteka v jetrnih celičnih linijah in vitro kot v kožnih [16].
Parabene človek lahko vnese v telo tudi s hrano in farmacevtskimi izdelki (v katerih jih uporabljamo kot konzervanse); v tem primeru se slednji absorbirajo po drugih poteh in posledično sta tudi njihova absorpcija in metabolizem drugačna kot v primeru dermalne absorpcije. Poleg slednje lahko absorpcija parabenov poteka tudi po peroralnem, rektalnem ali vaginalnem vnosu oz. po administraciji v obliki injekcije (intravensko, intramuskularno, subkutano) [20]. Za takšne načine absorpcije veljajo naslednje značilnosti [16, 21, 22]:
- sistemska absorpcija parabenov po teh poteh aplikacije je veliko večja kot v primeru dermalne aplikacije,
- po intravenski aplikaciji se serumske koncentracije izhodne spojine zelo hitro znižajo in ostanejo nizke,
- peroralna aplikacija omogoča dobro absorpcijo parabenov iz gastrointestinalnega trakta,
- ne glede na pot aplikacije parabenov je za njih značilen hiter metabolizem in visoka stopnja metabolizma,
- predsistemski metabolizem v jetrih in črevesju vpliva na sistemsko koncentracijo izhodne spojine,
- izločanje parabenov večinoma poteka z urinom, kjer se približno 80% odmerka izloči v prvih 24h urah, manjši delež se izloči z blatom in žolčem,
- parabeni se ne kopičijo v telesu.
1.4 CELIČNE LINIJE 1.4.1 Caco-2 celice
Caco-2 celična linija je bila pridobljena v 70. letih z namenom preučevanja rakavih mehanizmov in citostatičnih terapij, saj je to tumorska celična linija, pridobljena iz heterogenega epitelija kolorektalnega adenomarcinoma [23]. Caco-2 celice predstavljajo epitelijske rakave celice debelega črevesa. Uporabljajo se kot in vitro model za vrednotenje črevesne absorpcije pri človeku. Z njimi je možno podati oceno sposobnosti kemičnih snovi, da preidejo črevesno absorpcijsko bariero, ter tudi preučevati transportne mehanizme [24, 25]. Prednost te linije celic je tudi spontana diferenciacija v celice enoslojnega epitelija, ki imajo lastnosti, tipične tudi za enterocite in se nahajajo v tankem črevesu. Caco-2 celice lahko opišemo kot heterogene, imajo podobne lastnosti kot enterociti tankega črevesa, saj se v kulturi, ko dosežejo konfluenco, polarizirajo in pridobijo značilno apikalno krtačno obrobo (ang. BRUSH BORDER), obenem pa izvajajo nekatere encimske aktivnosti, ki so značilne za enterocite. Med te aktivnosti štejemo laktazno, aminopeptidazno N, saharazo-izomaltazno in dipeptidilpeptidazno IV [26].
Te celice se za namen permeabilnostnih meritev goji na prepustnih filtrskih vložkih, da bi izboljšali morfološko in funkcionalno diferenciacijo, hkrati pa omogočili polarizacijo celic in posnemali barierno vlogo enterocitov v črevesu [26]. Vrednosti permeabilnosti,
pridobljene s tem modelom, na nelinearen način korelirajo s podatki o obsegu absorpcije, ki jih pridobimo z in vivo metodami v primeru testiranja zdravil. To je tudi razlog, da pomen tega modela za merjenje permeabilnosti pridobiva na veljavi in se dandanes lahko uporablja tudi kot presejalno orodje pri odkrivanju in preučevanju lastnosti zdravilnih učinkovin za napovedovanje permeabilnosti zdravilnih učinkovin skozi črevo [25].
1.4.2 HepG2 celice
Celične linije hepatoma, med katere spadajo tudi jetrne HepG2 celice, v in vitro študijah nadomeščajo človeške hepatocite in so primerne za raziskovanje metabolizma zdravil in hepatotoksičnosti. So netumorogene celice, ki imajo visoko stopnjo proliferacije, hkrati pa je njihova in vitro morfologija podobna kot in vivo [27]. Ena izmed slabosti teh celic z vidika raziskav jetrnega metabolizma je, da imajo nizke ravni bazalne ekspresije CYP (citokroma), vendar v primeru CYP1A2 in CYP3A4 izkazujejo podobno induciranost kot človeški hepatociti [28]. Za njih je značilno, da imajo funkcijo izločanja velikih plazemskih proteinov in metabolno aktivnost z metabolnimi encimi I. Faze, kot so citokromi CYP1A1, CYP1A2, CYP2B, CYP2E1, in II. Faze, kot so glutation-S-transferaza, sulfotransferaza, N- acetiltransferaza, glukuronosiltransferaza. [29].
1.4.3 Keratinociti – celična linija NCTC2544, ICLC
NCTC 2544 predstavlja človeško celično linijo keratinocitov, ki je podobna epiteliju kože.
Nastala je na podlagi enojnega klona epidermalne celice, pridobljene od zdravega moškega bele rase. Za te celice je značilna nesmrtnost, vendar po drugi strani nimajo transformiranega fenotipa. Rast poteka enoslojno. Uporabne so, ker ne sintetizirajo odvečnega keratina in jih posledično lahko uporabimo kot model za nediferencirane keratinocite bazalne plasti povrhnjice kože [30].
1.5 MODELNE SPOJINE
Parabeni spadajo v skupino 4-hidroksibenzoatnih estrov in jih opišemo kot protimikrobne substance, ki so široko uporabljane v kozmetiki, zdravilih in hrani kot konzervansi. So naravna sestavina nekaterega sadja in zelenjave (borovnice, kumare, čebula), v čisti obliki pa so na voljo kot prašek in nimajo vonja ali okusa. Protimikrobni učinek parabenov se kaže v zaviranju transporta skozi membrane in zaviranju procesov v mitohondrijih bakterij in gliv [31]. Parabeni imajo možnost hitre absorpcije, hidrolize, konjugacije in eliminacije v primeru peroralnega vnosa, metabolični procesi le teh pa se v večini odvijajo v jetrih in ledvicah. V primeru dermalnega nanosa je absorpcija parabenov le delna [32]. Najpogosteje uporabljen je metilparaben, ki pa ima tudi največjo permeabilnost skozi kožo, kar mu omogočata krajša alkilna veriga in manjša lipofilnost. Za ta paraben je znano, da se celo v predhodno zamrznjeni koži hidrolizira v p-HBK. Znanstveni odbor za potrošniške izdelke (SCCP) predpisuje dovoljeno koncentracijo metilparabena in etilparabena v kozmetičnih izdelkih, ki je do 0,4 % kot posamezen ester, za mešanico parabenov pa je meja do 0,8 %.
Maksimalna možna koncentracija za propilparaben in butilparaben je posamezno ali v kombinaciji 0,14 % [33, 34, 35]. V številnih in vitro študijah so ugotovili, da se parabeni lahko vežejo na estrogene receptorje zaradi svoje lipofilnosti, zato jih označujejo za estrogene motilce. Estrogeno delovanje parabenov narašča z dolžino in razvejanostjo stranske akilne verige [36]. Darbre in sod. so v študiji leta 2004 poročali o povezavi med parabeni in rakom na dojki [37]. Znanstveniki (SCCP) so prišli do skupnih zaključkov, da ni nobenega zanesljivega dokaza za tveganje za razvoj raka dojk ob uporabi kozmetičnih izdelkov konzerviranih s parabeni [38].
1.5.1 Metilparaben
Sinteza metilparabena (MP) poteka s kondenzacijo karboksi skupine 4-hidroksibenzojske kisline z metanolom. Njegova molekulska masa znaša 152,15 g/mol, topnost v vodi je 2500 mg/L, topnost v olivnem olju pa 29000 mg/L. Prav tako ima kristalno obliko, je brez barve in vonja. V naravi ga najdemo v borovnicah. Deluje protimikrobno in protiglivično v živilih in kozmetičnih izdelkih [39].
1.5.2 Etilparaben
Etilparaben (EP) nastane skozi formalno kondenzacijo karboksi skupine 4- hidroksibenzojske kisline z etanolom. Je v kristalni obliki, nima vonja in barve, pogosto ga najdemo v obliki belega kristalnega prahu. Njegova molekulska masa je 166,18 g/mol, njegova topnost v vodi je 885 mg/L in v olju 30000 mg/L. Uporablja se kot konzervans hrane in protiglivično sredstvo [40].
1.5.3 Propilparaben
Molekulska masa propilparabena (PP) znaša 180,20 g/mol, ima topnost v vodi 500 mg/L, v olivnem olju pa je ta 52000 mg/L. Najdemo ga v obliki kristaliničnega belega praška. Je brez vonja ali pa je njegov vonj šibek. Eden od njegovih značilnosti je, da je brez okusa, vendar povzroči otrplost jezika [41]. Kot konzervans je pogost v kozmetičnih izdelkih, ki vsebujejo vodno fazo, se pravi kremah, losjonih, izdelkih za tuširanje in umivanje las. Njegova uporaba je pogosta tudi v živilih. Tako kot ostali parabeni, ima protiglivično in protimikrobno vlogo.
Zaradi tega se pogosto uporablja skupaj z metilparabenom, saj skupaj delujeta sinergistično [41, 42].
1.5.4 Para-hidroksibenzojska kislina
Para-hidroksibenzojska kislina (p-HBK) je monohidroksibenzojska kislina, ki ima vlogo rastlinskega metabolita in metabolita alg, prav tako pa je glavni metabolit parabenov. Ima molekulsko maso 138,12 g/mol, topnost v vodi je 11,9 g/L, obstaja v obliki kristalnega praška bele barve. Je sredstvo za izboljšanje okusa, uporablja se tudi pri izdelavi sintetičnih drog, zdravil, barvil in mehčal. Vnos v organizem peroralno s prehrano je precej pogost in običajen, prav tako skozi kožo po nanosu kozmetičnih izdelkov. Prisotna je v nekaterem sadju in zelenjavi, kot na primer borovnice, jagode, olive in korenje [43, 44, 45].
2 NAMEN DELA
Glavni namen diplomske naloge je preučiti, kako se metabolizem in permeabilnost parabenov v in vitro pogojih izrazita na treh različnih celičnih linijah povezanih z običajnimi potmi vnosa parabenov v organizem. Sposobnost za metabolizem parabenov bomo preučevali na jetrnih celicah HepG2 ter na celicah epidermisa imenovanih keratinociti.
Permeabilnost in metabolizem parabenov sočasno pa bomo opazovali skozi monosloj Caco- 2 celic.
Naš cilj je ovrednotiti sposobnost izbranih parabenov za difuzijo in aktivni transport skozi Caco-2 celice in v izbranih celičnih linijah določiti obseg njihovega metabolizma v para- hidroksibenzojsko kislino, ki predstavlja njihov glavni metabolit. Izbrani parabeni so metilparaben, etilparaben in propilparaben. O pridobljenih rezultatih bomo razpravljali v kontekstu znanih dejstev o absorpciji in metabolizmu parabenov po dermalni in po peroralni aplikaciji pri človeku. Prav tako bomo skušali ugotoviti, ali je transformacija parabenov v para-hidroksibenzojsko kislino merljiva v zastavljenih in vitro pogojih.
Za določitev parabenov in para-hidroksibenzojske kisline v pridobljenih vzorcih bomo razvili HPLC (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti) metodo in na instrumentu za tekočinsko kromatografijo izvedli vse meritve. Tako bomo dobili podatke za nadaljnjo obdelavo.
3 MATERIALI IN METODE
3.1 SPOJINE
Metilparaben, Sigma Aldrich, Nemčija
Etilparaben, Sigma Aldrich, Nemčija
Propilparaben, Sigma Aldrich, Nemčija
Para-hidroksibenzojska kislina, Sigma Aldrich, Nemčija
Amoniak, NH3 25%, Sigma Aldrich, Nemčija
Etanol, 96 %, Sigma Aldrich, Nemčija
MilliQ prečiščena voda
Fosforjeva (V) kislina, Merck KgaA, Nemčija
Acetonitril, Sigma Aldrich, Nemčija
Natrijev hidrogen karbonat, Merck KgaA, Nemčija
Natrijev dihidrogen fosfat monohidrat, Merck KgaA, Nemčija
Natrijev klorid, Merck KgaA, Nemčija
Kalijev klorid, Merck KgaA, Nemčija
Kalcijev klorid dihidrat, Merck KgaA, Nemčija
Magnezijev klorid heksahidrat, Merck KgaA, Nemčija
Dinatrijev hidrogenfosfat dihidrat, Merck KgaA, Nemčija
Dinatrijev hidrogenfosfat, Merck KgaA, Nemčija
Kalijev dihidrogen fosfat, Merck KgaA, Nemčija
Klorovodikova kislina, HCl, Sigma Aldrich, Nemčija
Atenolol, Sigma Aldrich, Nemčija
Metoprolol, Sigma Aldrich, Nemčija
Rhodamin12, Sigma Aldrich, Nemčija
Glukoza, Sigma Aldrich, Nemčija
Tripsin, Sigma Aldrich, Nemčija
Barvilo tripan blue, Gibco, Merck KgaA, Nemčija
Manitol, Sigma Aldrich, Nemčija
Mravljična kislina, HCOOH¸ Sigma Aldrich, Nemčija 3.2 APARATURE IN LABORATORIJSKI PRIBOR
Avtomatska pipeta Eppendorf Research 1000
pH meter: pH 330i, WTW, Nemčija
Sonis 4, Iskra pio d. o. o., Slovenija
Tehtnica XP 205, Mettler Toledo, Švica
Q-pod: MilliQ, Merck KgaA, Nemčija
Inkubator
Centrifugirka
Termoblok
Mikrobiološki laboratorij komora
Mikroskop
Agilent Chemstation, Agilent Technologies, Nemčija
Agilent 1100 Series (razplinjevalec, binarna črpalka, termostatirani avtomatski vzorčevalnik za mikrotitrske plošče, termostat za kolono, UV-VIS detektor z nizom diod), Agilent Technologies, Nemčija
Mikrotitrska plošča s 96 vdolbinicami, Agilent Techologies
Mikrotitrska plošča z 12 vdolbinicami, Agilent Techologies
Magnetno mešalo IKA RET control/t
Kolona: Xterra MS C18, 4,6 × 100mm; 3,5um 3.3 MEDIJI ZA GOJENJE CELIC
3.3.1 Medij za gojenje Caco-2 celic
(ATCC HTB-37), ATCC ZDA: DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium – low glucose (Sigma Aldrich, Nemčija) z dodatki:
- 20 % (v/v) fetalni goveji serum (Gibco – Invitrogen, ZDA/ Life Technologies corporation, ZDA)
- 1 % 2mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, Nemčija)
- 1 % antibiotik (penicillin in streptomicin) (Sigma-Aldrich, Nemčija) 3.3.2 Medij za gojenje HepG2 celic
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium – low glucose (Sigma Aldrich, Nemčija) z dodatki:
- 10 % (v/v) fetalni goveji serum (Gibco – Invitrogen, ZDA/ Life Technologies corporation, ZDA)
- 1 % 2mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, Nemčija)
- 1 % antibiotik (penicillin in streptomicin) (Sigma-Aldrich, Nemčija) 3.3.3 Medij za gojenje celične linije NCTC2544
MEM (Minimum essential medium) (Sigma-Aldrich, Nemčija) z dodatki:
- 10 % (v/v) fetalni goveji serum (Gibco – Invitrogen, ZDA/ Life Technologies corporation, ZDA)
- 1 % neesencialne aminokisline (Sigma-Aldrich, Nemčija) - 1 % 2mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, Nemčija)
- 1 % antibiotik (penicillin in streptomicin) in antimikotik (amfotericin B) (Sigma- Aldrich, Nemčija)
3.4 PRIPRAVA REAGENTOV IN RAZTOPIN 3.4.1 Ringerjev pufer
Za pripravo Ringerjevega pufra smo najprej 1000 mL merilno bučko napolnili s približno 800 mL prečiščene vode in nato ob stalnem mešanju dodajali reagente v naslednjem zaporedju: 2,1 g NaHCO3; 0,055 g NaH2PO4 x H2O; 6,541 g NaCl; 0,373 g KCl; 0,176 g CaCl2 x 2H20; 0,244 g MgCl2 x 6H2O in 0,2845 g Na2HPO4 x 2H20. Ko so se vsi reagenti
raztopili, smo dopolnili s prečiščeno vodo do oznake in dobro premešali. Tako pripravljeno raztopino smo hranili v hladilniku do začetka poskusa.
3.4.2 PBS
Za pripravo PBS (fosfatni pufer s soljo) smo uporabili 8 g NaCl; 0,2 g KCl; 1,44 g Na2HPO4
in 0,24 g KH2PO4. Vse skupaj smo kvantitavno prenesli v 1000 mL merilno bučko in s prečiščeno vodo dopolnili do oznake. Nato smo umerili pH s HCl oz. z NaOH na vrednost 7,4. Tako pripravljen pufer smo hranili v hladilniku do začetka poskusa.
3.4.3 1% HCOOH v acetonitrilu
V 100 mL merilno bučko smo dodali nekaj acetonitrila in odpipetirali 1,0 mL HCOOH. Z acetonitrilom smo dopolnili do oznake in premešali. Raztopino smo hranili v zamrzovalniku.
3.4.4 Metilparaben
Metilparaben (MP) je topen tako v lipofilnih kot hidrofilnih topilih. Mi smo ga raztopili v 96 % etanolu zaradi povečane topnosti v založni raztopini. Tako smo 3,34 mg raztopili v 1097 µL 96 % etanola, da smo dobili koncentracijo 20-mM. Naprej smo založno raztopino redčili v enem koraku do koncentracije 200-µM z Ringerjevim pufrom.
3.4.5 Etilparaben
Za pripravo založne raztopine etilparabena (EP) smo natehtali 3,91 mg spojine in ga raztopili v 1176 µL 96 % etanola. Naprej smo to raztopino redčili do končne koncentracije 200-µM v Ringerjevem pufru v enem koraku.
3.4.6 Propilparaben
Za pripravo založne raztopine propilparabena (PP) smo zatehtali 3,69 mg spojine, raztopili v 1024 µL 96 % etanola in redčili v Ringerjevem pufru v enem koraku do koncentracije 200- µM.
3.4.7 Para-hidroksibenzojska kislina
Zatehtali smo 2,98 mg para- hidroksibenzojske kisline (p-HBK) in raztopili v 1078 µL 96
% etanola. Nato smo redčili do končne koncentracije 200-µM v Ringerjevem pufru v enem koraku.
3.4.8 Akceptorske raztopine za poskus na Caco-2 celicah 3.4.8.1 Manitolna raztopina
Natehtali smo 2,85 g manitola v 25 mL merilno bučko in s prečiščeno vodo dopolnili do oznake. Dobili smo osnovno raztopino manitola s koncentracijo 625-mM. Kot apikalno akceptorsko raztopino smo potrebovali 10-mM manitol, zato smo odpipetirali 800 µL osnovne raztopine v 50 mL merilno bučko in do oznake dopolnili z Ringerjevim pufrom.
3.4.8.2 Glukozna raztopina
Natehtali smo 2,815 g glukoze v 25 mL merilno bučko in s prečiščeno vodo dopolnili do oznake. Dobili smo osnovno raztopino glukoze s koncentracijo 625-mM. Kot bazolateralno akceptorsko raztopino smo potrebovali 10-mM glukozo, zato smo odpipetirali 800 µL osnovne raztopine v 50 mL merilno bučko in do oznake dopolnili z Ringerjevim pufrom.
3.4.9 Donorske raztopine za poskus na Caco-2 celicah 3.4.9.1 Donorske raztopine v Ringerjevem pufru
Za pripravo apikalne donorske raztopine v Ap-BL (apikalno-bazolateralno) smo v 5 mL merilno bučko odpipetirali 50 µL založne raztopine MP s koncentracijo 20-mM, dodali 80 µL 10-mM manitolne raztopine in do oznake dopolnili z Ringerjevim pufrom, da smo dobili 200-µM metilparaben. Po enakem postopku smo pripravili donorske raztopine z EP, PP in p-HBK.
Za pripravo donorske raztopine za meritve v BL-Ap (bazolaterlano-apikalno) smeri, smo v 10 mL merilno bučko odpipetirali 100 µL založne raztopine MP s koncentracijo 20-mM, dodali 160 µL 10-mM glukozne raztopine in do oznake dopolnili z Ringerjevim pufrom, da smo dobili 200-µM metilparaben.
3.4.9.2 Donorska raztopina metilparabena v mediju za gojenje Caco-2 celic
Za pripravo donorske raztopine Ap-BL smo v 5 mL merilno bučko odpipetirali 50 µL založne raztopine MP s koncentracijo 20-mM in do oznake dopolnili z medijem, v katerem se goji Caco-2 celice (v nadaljevanju medij). Končna koncentracija MP je 200-µM.
3.4.10 Priprava standardnih raztopin atenolola in metoprolola
Kot standardni učinkovini s srednjo in visoko permeabilnostjo smo uporabili atenolol in metoprolol, ki se ju pogosto uporablja v ta namen. Obseg absorpcije teh spojin poznamo, zato lahko predvidimo obseg absorpcije preiskovanim spojinam s primerjavo njihove in vitro permeabilnosti. Rhodamin123 je barvilo in je služil kot označevalec za transport s prenašalci Pgp (P-glikoprotein).
Kot donorsko raztopino iz apikalne v bazolateralno stran (Ap-BL), ki je absorptivna smer, smo v 5 mL merilni bučki zmešali 100 µL 200-µM atenolola, 50 µL 100-µM metoprolola, 50 µL 20-µM Rhodamin123 in 80-µL 10-mM manitolne raztopine. Do oznake smo dopolnili z Ringerjevim pufrom. Za donorsko raztopino iz bazolateralne v apikalno stran (BL-Ap), ki je eliminatorna smer, pa smo v 5 mL merilni bučki zmešali 100 µL 200-µM atenolola, 50 µL 100-µM metoprolola, 50 µL 20-µM Rhodamin123 in 80 µL 10-mM glukozne raztopine.
Do oznake smo dopolnili z Ringerjevim pufrom.
3.4.11 Priprava raztopin za poskus na HepG2 celicah in celični liniji NCTC2544 Kot inkubacijsko raztopino smo pripravili 10-mM PBS z glukozo. Iz osnovne 625-mM raztopine glukoze (glej točko 3.4.8.2.) smo odpipetirali 800 µL in raztopili v 50 mL PBS.
Nato smo v 10 mL merilno bučko iz založnih raztopin parabenov s koncentracijo 20-mM odpipetirali 100 µL in raztopili v 10-mM PBS z glukozo. Po tem principu smo pripravili ločeno raztopino za vsak paraben in p-HBK. Končna koncentracija posamičnega parabena v raztopini je bila 200-µM.
3.5 POSTOPKI IN METODE 3.5.1 Gojenje celičnih linij
Gojenje vseh treh vrst celic je zelo podobno, razlike so pri centrifugiranju. Celice smo gojili v celičnem laboratoriju pod aseptičnimi pogoji. Hranilni medij, ki je enak mediju za gojenje celičnih linij (glej točke 3.3.1, 3.3.2, 3.3.3), smo pred vsako uporabo segreli na 37 °C.
Globoko zamrznjene celice (-80 °C) smo hitro odtalili, dodali 10 mL hranilnega medija in premešali. Suspenzijo smo centrifugirali ter nato odstranili supernatant. Celice smo s pomočjo avtomatske pipete resuspendirali v 1 mL medija.
Potek štetja celic:
V mikroepruveti smo zmešali 40 μL barvila tripan blue in 10 μL suspenzije celic. Na hemacitometer smo prenesli 10 μL ter prešteli celice v vseh štirih kvadrantih. Nato smo s pomočjo enačbe 1 izračunali št. celic v vdolbinicah.
Enačba 1: Formula za izračun števila celic v vdolbinah.
Pripravili smo 12 – 15 mL suspenzije z gostoto cca. 105 celic/mL ter jo prenesli v posodo za gojenje (75 cm2) ter hranili v inkubatorju (37 °C, 5 % CO2, 95 % vlažnost). Pri Caco-2 celicah in celični liniji NCTC2544 smo medij zamenjali po 24 urah, nato pa vsak drugi dan.
Pri HepG2 celicah medija nismo menjavali, ampak smo celice subkultivirali dvakrat tedensko.
Ko so celice prerasle približno 90 % površine, smo izvedli tripsinizacijo. Najprej smo odstranili hranilni medij, celice dvakrat sprali s 5 mL PBS ter dodali 3 mL tripsina. Z rahlim stresanjem smo pospešili, da so se celice odlepile od podlage. Dodali smo 10 mL medija in celice prenesli v centrifugirko. Caco-2 celice smo centrifugirali 8 min pri 800 RPM, HepG2 5 min pri 1200 RPM, keratinocitne celice pa 5 min pri 1300 RPM. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant, celice resuspendirali, jih prešteli ter nadaljevali z gojenjem oz. pričeli s poskusom.
3.5.2 Razvoj analizne metode
Preden smo se lotili eksperimenta na celičnih linijah, smo morali razviti analizno metodo za HPLC, saj smo z njo analizirali vzorce in detektirali posamezne spojine v njih. Cilj je vseskozi bil razviti metodo, ki bo hitra, enostavna, bo imela dovolj dobro občutljivost in bo primerna za detekcijo vseh preiskovanih spojin naenkrat. Za separacijo smo uporabili kolono Xterra MS C18, 4,6 x 100 mm; 3,5 µm delci. Temperatura kolone je bila 50 °C, pretok mobilne faze pa je bil 1,5 mL/min. Mobilna faza je bila sestavljena iz amonijevega fosfata in acetonitrila. Na začetku smo za mobilno fazo uporabili pH 3,0. Zaradi popačenih in razširjenih vrhov smo prilagodili pH na 2,5 in kromatogrami so bili ustreznejši. Metoda je gradientna in traja 8 minut. Ob času 0 smo delež mobilne faze B nastavili na 10 %, linearno je do 8 min dosegel 45 %. Injicirali smo 50 µL vzorca in opazili dobro občutljivost, zato volumna nismo povečevali. Znan nam je maksimum absorpcije preiskovanih spojin in je zato bila valovna dolžina 256 nm. Za dodatno identifikacijo vrhov je bilo območje snemanja UV spektra nastavljeno od 190 do 400 nm.
Vsaki posamezni spojini smo z gradientno metodo določili retencijski čas, s pomočjo katerega smo potem lahko ob UV spektru prepoznali spojino na kromatogramu. Retencija
p-HBK kot prve eluirane je pri približno 1,9 min, metilparaben se eluira pri 4,2 min, etilparaben pri 5,6 min in propilparaben pri 7. minuti.
3.5.3 Eksperimentalno delo
3.5.3.1 Potek izvedbe poskusa na Caco-2 celicah
Na 24 Transwell filtrskih membran smo nasadili Caco-2 celice in jih kasneje prenesli v dve mikrotitrski plošči z 12 vdolbinami. Pred začetkom poskusa smo nastavili grelni blok na 37
°C in vklopili dotok karbogena (95 % O2 in 5 % CO2)iz jeklenke. Ves čas poskusa smo vzdrževali temperaturo 37 °C. Medij smo s filtrov, na katerih so bile nasajene celice, odstranili in jih sprali z Ringerjevim pufrom. Pred odstranitvijo pa smo pomerili transepitelijsko električno upornost (TEER) plasti celic. Vsaka vdolbinica s celicami je vsebovala donorsko in akceptorsko raztopino. Donorske raztopine v Ap-BL smeri smo nanesli na apikalno stran, ki je zgoraj. Ta volumen je bil 500 µL. Na bazolateralno stran smo vnesli 1500 µL akceptorske 10-mM glukoze v Ringerjevem pufru, v primeru medija pa le svež medij za gojenje celičnih kultur. V primeru donorskih raztopin v BL-Ap smeri je bila le-ta nanešena na bazolateralno stran, ki je spodaj, volumen pa je bil 1500 µL. Na apikalno stran smo vnesli 500 µL 10-mM manitola.
Akceptorske raztopine smo vzorčili na 20 minut, vzorčenj pa je bilo šest. Volumen vzorčenja iz apikalne strani je bil 100 µL, iz bazolateralne pa 300 µL. Po vsakem vzorčenju smo enak volumen odvzete raztopine tudi vrnili. Vzorce smo shranjevali na mikrotitrsko ploščo in jih kasneje pomerili na sistemu.
Izjema so bili vzorci v mediju, ki jih je bilo potrebno pred injiciranjem na HPLC oboriti zaradi nevarnosti zamašitve kolone s proteini, ki jih medij vsebuje. To smo storili tako, da smo 300 µL vzorca v 1,5 mL mikrocentrifugirkah dodali trikratni prebitek ledeno-mrzle raztopine 1 % HCOOH v ACN in vzorec takoj s pipeto v nastavku turbulentno premešali.
Do začetka centrifugiranja smo jih hranili v zamrzovalniku pri -20°C. Nato smo centrifugo ohladili na 4 °C in na HPLC ploščo odpipetirali 250 µL prečiščene vode z namenom redčenja in zmanjšanja deleža acetonitrila. Potem smo vzorce v mikrocentrifugirkah centrifugirali 10
minut pri 15000 obratih/minuto in na ploščo k 250 µL prečiščene vode odpipetirali 50 µL supernatanta. Vzorci so bili pripravljeni na HPLC meritev.
3.5.3.2 Potek izvedbe poskusa na HepG2 celicah in celični liniji NCTC2544
Posamezno skupino celic smo nasadili na mikrotitrsko ploščo s 96 vdolbinami in keratinocitne celice do poskusa gojili dva dni, HepG2 celice pa tri dni. NCTC2544 celicam smo po 24 urah zamenjali medij. Pred začetkom poskusa smo nastavili termoblok na temperaturo 37 °C in vklopili dotok karbogena iz jeklenke. Ves čas poskusa smo mikrotitrsko ploščo segrevali v termobloku. Raztopine za meritve smo pred nanosom na ploščo segreli v kadički. Poskus smo zastavili tako, da smo izločili vdolbine ob robu plošče, ker izkušnje v laboratorijih kažejo, da rob ni vedno povsem primerljiv s sredino. V 8 vdolbin smo na celice nanesli le po 300 µL 10-mM glukoze v PBS brez dodanih parabenov za kontrolo, 12 vdolbin smo uporabili za meritev števila celic pred in po poskusu, v ostale vdolbine pa smo odpipetirali 300 µL raztopin s parabeni. Tako smo dobili več paralelk za primerjavo. Inkubacija je trajala 24 ur.
Vzorčenje smo izvedli po eni uri ob vzpostavitvi stabilnih pogojev poskusa, drugo vzorčenje pa po 24 urah. Odpipetirali smo 100 µL vzorca, ter ravno toliko začetne raztopine tudi vrnili, da je bil celokupni volumen nespremenjen.
Po končani inkubaciji smo ponovno izvedli vzorčenje. Tokrat smo odpipetirali 300 µL vzorca in prenesli na ploščo za HPLC. Nato smo vzorce pomerili s tekočinsko kromatografijo.
3.5.3.3 Izdelava umeritvenih premic
Za Caco-2 celice smo izdelali dve umeritveni premici – eno z Ringerjevim pufrom za vzorce pripravljene v le-tem in drugo z medijem za gojenje Caco-2 celic za vzorce pripravljene v mediju. Raztopine smo pripravljali v epicah. Za umeritveno premico v Ringerjevem pufru smo uporabili donorske raztopine parabenov v BL-Ap smeri s koncentracijo 200-µM.
Združili smo 200 µL te raztopine in dodali 800 µL Ringerjevega pufra. Sledeči koraki so prikazani v Preglednici I.
Preglednica I: Shematski prikaz priprave kalibracijskih raztopin v Ringerjevem pufru za izdelavo umeritvene premice za vse preiskovane spojine (metilparaben, etilparaben, propilparaben in p-HBK).
Kalibracijske raztopine (kal. r.)
Redčene razt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Donorska razt. (µL) 200
Kal. r. 1 (µL) 500 200 100
Kal. r. 4 (µL) 500 200 100
Kal. r. 7 (µL) 500 200 100
Ringerjev pufer (µL) 800 500 800 900 500 800 900 500 800 900
Faktor redčenja 5 10 25 50 100 250 500 1000 2500 5000
Za umeritveno premico za metilparaben v mediju smo uporabili donorsko raztopino metilparabena v mediju v Ap-BL smeri s koncentracijo 200-µM in jo pripravili po shemi, ki je opisana zgoraj (Preglednica I). Ker medij vsebuje proteine, kar ni optimalno za kolono na HPLC sistemu, smo raztopine z medijem oborili. To smo storili z 1 % HCOOH v acetonitrilu. Za natančen postopek glej točko 3.5.3.1.
Vzorce s HepG2 in NCTC2544 celicami (keratinociti) smo vrednotili na kalibracijsko premico, kjer smo v epici združili po 25 µL založne raztopine s koncentracijo 20-mM vsakega parabena in p-HBK ter dodali 900 µL PBS z glukozo. Nadaljnja shema redčitev je prikazana v Preglednici I, faktorji redčenja pa si sledijo v korakih od 40x do 40.000x redčitve.
Nato smo iz epic na mikrotitrsko ploščo prenesli po 250 µL redčenih raztopin. Na HPLC sistemu smo jih vzorčili v vrstnem redu od najbolj redčenih do najmanj redčenih, da bi preprečili navzkrižno kontaminacijo.
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 Ustreznost celičnih linij
Da bi preverili, ali plast celic ohrani integriteto do konca poskusa, smo Caco-2 celicam pred začetkom in po koncu poskusa (ob 120. minuti) pomerili transepitelijsko električno upornost (TEER) in ugotovili, da se vrednost bistveno ne spreminja (cca. 300 ×cm2).
Na podlagi tega smo sklepali, da so bile celice ustrezno vitalne in povezane v sloj, ki je imel lastnosti epitelijske bariere.
Pred poskusom na HepG2 celicah in celični liniji NTCTC2544 smo prešteli celice v 6 vdolbinah, pri čemer smo jim prej dodali tripsin, da so se odlepile (postopek je podrobneje opisan v poglavju 3.5.1.). Suspenzijo s celicami smo prenesli na hemocitometer, kjer smo nato celice pod mikroskopom prešteli in določili, da je v povprečju v vsaki vdolbinici pred poskusom bilo približno 53 000 celic, po poskusu pa približno 205 000 celic. Malo verjetno je, da se je med poskusom število celic dejansko toliko povečalo. Morda je bila tripsinizacija za odlepljanje po inkubaciji v pufru učinkovitejša kot po inkubaciji v mediju (glej točko 3.5.1) in smo tudi zato določili toliko več celic, še vedno pa rezultat predstavlja pozitivno presenečenje. S tem smo dokazali, da pogoji poskusa ne le, da ne pobijajo celic, ampak morda celo omogočajo nadaljnjo proliferacijo. Zato smo ocenili, da sta celični liniji primerni za nadaljnjo raziskavo, protokol poskusa pa je iz vidika vitalnosti celic ustrezen.
4.2 Analizna metoda
Cilj naše naloge je bil razviti analizno gradientno metodo, ki bo ustrezala vsem preiskovanim spojinam (p-HBK in parabenom). Zaradi predvidenega velikega števila vzorcev smo želeli, da se preiskovane spojine eluirajo v kratkem času in imajo zadovoljiv odziv ter s tem občutljivost metode. Za separacijo smo uporabili kolono Xterra MS C18, 4,6 x 100 mm; 3,5 µm delci. Temperatura kolone med analiziranjem je bila 50 °C, pretok mobilne faze 1,5 mL/min, volumen injiciranja pa 50 µL pri vzorcih
na Caco-2 celicah in 5 µL pri vzorcih na celični liniji NCTC2544 in HepG2 celicah. Za mobilno fazo A smo uporabili amonijev fosfat s pH 2,5, mobilna faza B pa je bil acetonitril. Delež acetonitrila se je s časom spreminjal, kot kaže Preglednica II.
Preglednica II: Nastavitev gradientne metode HPLC, ki s časom spreminja delež mobilnih faz do končnih pogojev.
Čas (min) Mobilna faza A (%) Mobilna faza B (%)
0 90 10
8 55 45
Valovno dolžino detektorja smo nastavili na 256 nm, ki ustreza absorbcijskemu maksimumu preiskovanih spojin. Spremljali smo tudi UV spektre vrhov za identifikacijo. Območje meritev UV spektrov je bilo med 190 - 400 nm.
Vse vzorce smo pripravili v štirih paralelkah, pri čemer je bila ponovljivost znotraj teh paralelk dobra (RSD < 15 %). Prav tako smo pripravili umeritveno premico za vse štiri analite, pri čemer je bil R2 > 0,99.
4.3 Določanje permeabilnosti in metabolizma parabenov skozi Caco-2 celice 4.3.1 Metilparaben
Razmerje med permeabilnostjo metilparabena v Ap-BL in BL-Ap smeri difuzije v Ringerjevem pufru je pokazalo, da je prisoten aktiven proces transporta v eliminatorni smeri skozi plast Caco-2 celic. To potrjuje efluksno razmerje, torej razmerje med Papp v eliminatorni smeri in Papp v absortivni smeri, ki je visoko in znaša 2,7.
Navidezni permeabilnostni koeficienti izraženi kot aritmetična sredina ± standardni odkloni, prikazani tudi na sliki 1, so bili v Ringerjevem pufru v absorptivni smeri (to je Ap-BL) 14,9
± 2,2 nm/s, v eliminatorni smeri (to je BL-Ap) pa 40,0 ± 5,5 nm/s. V mediju za rast celičnih linij DMEM je v Ap-BL smeri navidezni permeabilnostni koeficient znašal 38,1 ± 4,5 nm/s.
Slika 1: Stolpični diagram povprečnih vrednosti Papp (nm/s) ± SD v smeri prehoda Ap-BL in BL-Ap metilparabena (MP) pripravljenem v Ringerjevem pufru (R) in mediju.
Uporaba medija za gojenje celičnih linij kot osnova za donorske in akceptorske raztopine se je prav tako izkazala kot dejavnik, ki vpliva na navidezne permeabilnostne koeficiente, kar razločimo iz slike 1. Po drugi strani predpostavljamo, da je visoka vrednost Papp v absorptivni smeri (vzorci pripravljeni v mediju), lahko deloma tudi posledica motnje, ki bi jo lahko povzročila priprava vzorcev z obarjanjem proteinov (glej poglavje 3.5.3.1). Pri tem
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0
Ap-BL (R) BL-Ap (R) Ap-BL (medij)
Papp (nm/s)
postopku namreč dodamo vzorcem trikratni volumen acetonitrila, sicer jih redčimo do deleža acetonitrila, ki ustreza začetnim pogojem gradientne metode (10 % acetonitrila), kar pa pri visokih volumnih injiciranja, ki smo jih bili primorani uporabiti (50 µL), lahko povzroči precejšnjo nezanesljivost HPLC tehnike z UV detekcijo. Ker se je uporaba Ringerjevega pufra izkazala za povsem ustrezno tudi pri meritvah metabolizma do p-HBK (sledi v nadaljevanju; slike 4, 5 in 6), lahko sklepamo, da medij za poskus na celičnih linijah ni potreben, oz. celo zmanjša zanesljivost poskusa.
Množina preiskovane spojine metilparabena (prikazana kot povprečje ± standardni odklon) ki je v posamezni časovni točki prešla skozi plast celic Caco-2, je prikazana na sliki 2.
Vsebnost metilparabena je bila v vseh akceptorskih raztopinah (metilparaben v Ringerjevem pufru v Ap-BL smeri, metilparaben v Ringerjevem pufru v BL-Ap smeri in metilparaben v mediju v Ap-BL smeri) že po prvem vzorčenju (ob 20. minuti) precej visoka glede na kasnejše meritve. Kasneje, ko je množina naraščala linearno, pa krivulja ni več bila strma, kar lahko pomeni, da je do zadnjega vzorčenja potekla pretvorba velikega deleža metilparabena do p-HBK. Tako smo v vzorcih kvantificirali tudi preiskovani metabolit p- HBK, ki je verjetno posledica metabolizma in etilparaben, slednji je verjetno posledica neželene kontaminacije donorske ali pa akceptorske raztopine že med samo izvedbo poskusa v laboratoriju.
Slika 2: Množina (mol) metilparabena (MP), ki je prešla skozi plast Caco-2 celic iz različnih donorskih raztopin in smeri prehoda (kvadrat – povprečje množin, ko je bila donorska raztopina MP pripravljena v Ringerjevem pufru v Ap-BL smeri ± SD; trikotnik - povprečje množin vzorcev donorske raztopine MP v Ringerjevem pufru v BL-Ap smeri ± SD; kara - povprečje množin vzorcev donorske raztopine MP v mediju v Ap-BL smeri ± SD) v odvisnosti od časa.
Ko smo permeabilnosti primerjali s standardoma atenololom in metoprololom, smo opazili, da so vrednosti permeabilnostnega koeficienta metilparabena nižje od atenolola, a v primerljivem velikostnem razredu. Na osnovi tega sklepamo, da metilparaben ni visoko permeabilna spojina.
Delež metabolizma metilparabena do p-HBK je bil med vsemi proučevanimi parabeni največji. Začetna koncentracija metilparabena je bila 200-µM, ob času 120 minut (zadnja točka vzorčenja) pa metilparabena v donorski raztopini praktično nismo več zaznali, zato sklepamo, da se je večina parabena metabolizirala v p-HBK. Iz tega lahko razložimo tudi popačeno (nelinearno) krivuljo na sliki 2. Na mestu, kjer naklon krivulji več strmo ne narašča (pri 40. minuti vzorčenja), sklepamo, da je že bil dosežen visok delež pretvorbe parabena v p-HBK. Rezultati so pričakovani in tudi podprti z literaturnim virom – hiter metabolizem metilparabena v p-HBK je bil opisan v znanstvenem članku Lester in sod [46].
0,00E+00 2,00E-09 4,00E-09 6,00E-09 8,00E-09 1,00E-08 1,20E-08 1,40E-08 1,60E-08 1,80E-08
0 20 40 60 80 100 120 140
n (mol)
t (min)
4.3.2 Etilparaben
Na sliki 3 vidimo, da je pojav hitrega porasta vsebnosti parabenov v akceptorskih raztopinah na začetku vzorčenja, opazen tudi pri etilparabenu. Morda bi bilo v prihodnje smiselno na začetku poskusa izvajati vzorčenje v krajših časovnih intervalih z namenom boljšega razumevanja in razlage hitrega porasta koncentracije v prvih 20 minutah eksperimenta. Bi pa za to potrebovali sistem za robotsko vzorčenje med inkubacijo namenjeno meritvam permeabilnosti. Če bi bilo možno izmeriti permeabilnostni koeficient že v kratkem času do prvega vzorčenja, bi bil precej višji od tega, ki smo ga določili za celoten poskus, pri čemer smo lahko določili le naklon premice množina v odvisnosti od časa za linearni del od 40. do 120. minute poskusa. Zgolj na osnovi rezulatov prikazanih na sliki 3 še ne moremo opredeliti, kje točno prihaja do pretvorbe parabena v p-HBK. Možna je pretvorba še pred prehodom skozi apikalno membrano celic, v citosolu, ali celo šele po difuziji skozi bazolateralno membrano. Ker je etilparaben ester, načeloma lahko pride do hidrolize estrske vezi že v raztopini brez prisotnosti esteraz. Slednje je sicer manj verjetno glede na to, da je pH v območju fiziološkega (pH = 7,2), vemo pa, da so parabeni kot zanesljivi konzervansi v farmacevtskih in kozmetičnih izdelkih več let stabilni tudi v nevtralnih vodnih raztopinah.
Slika 3 prikazuje povprečno množino ± SD vseh treh parabenov in p-HBK, ki difundirajo skozi plast Caco-2 celic v absorptivni smeri (Ap-BL) v odvisnosti od časa.
Slika 3: Povprečne množine (mol) vseh parabenov in p-HBK ± SD, ki so prešle skozi plast Caco-2 celic v Ap- BL smeri (kvadrat – propilparaben (PP), krog – etilparaben (EP), trikotnik – metilparaben (MP) pripravljen v pufru, kara – para-hidroksibenzojska kislina (p-HBK), ko je bila samostojno pripravljena kot donorska raztopina) v odvisnosti od časa.
Sočasno z difuzijo poteka tudi njegov metabolizem in morda vezava na tkivo, zato koncentracija preiskovane spojine tekom poskusa pada. Na kromatogramih vzorcev z etilparabenom, odvzetih iz akceptorske strani, smo določili tudi znatno količino p-HBK (slika 4). Delež etilparabena v akceptorskih vzorcih je podobno kot pri metilparabenu na koncu minimalen, zato vemo, da je potekla pretvorba parabena v p-HBK.
0,00E+00 5,00E-09 1,00E-08 1,50E-08 2,00E-08
0 20 40 60 80 100 120 140
n (mol)
t (min)
Slika 4: Množina (mol) etilparabena (krog) v Ringerjevem pufru in p-HBK (para-hidroksibenzojska kislina) (kvadrat), ko je bil na donorsko stran dodan le etilparaben ± SD v odvisnosti od časa.
4.3.3 Propilparaben
Permeabilnost propilparabena je na koncu poskusa višja v primerjavi z metilparabenom ali etilparabenom. Pri tej spojini tudi opazimo visoko koncentracijo v prvi točki vzorčenja (tj.
ob 20. minuti). Za izračun permeabilnostnega koeficienta smo zato uporabili linearni del krivulje (od 2. točke vzorčenja dalje), kar je kasneje predstavljeno na sliki 6. Vrednosti množin propilparabena so prikazane na sliki 5. Iz nje je razvidno, da je od začetka do konca poskusa naraščanje množine p-HBK, ki je nastala kot metabolit v vzorcih le s propilparabenom v začetni donorski raztopini, veliko hitrejše od čistega propilparabena, kar nam pove, da se je propilparaben porabljal, p-HBK pa je nastajala kot metabolit tega parabena.
0,00E+00 5,00E-09 1,00E-08 1,50E-08 2,00E-08 2,50E-08 3,00E-08 3,50E-08 4,00E-08 4,50E-08
20 40 60 80 100 120
n (mol)
t (min)
Slika 5: Primerjava naraščanja množine (mol) propilparabena (PP) (kara), ki je prešel skozi plast celic Caco- 2 in p-HBK (para-hidroksibenzojska kislina) (trikotnik), ko je le-ta nastala kot metabolit propilparbena med difuzijo skozi plast Caco-2 celic.
Podobno kot pri kromatogramih vzorcev z metilparabenom smo tudi pri vzrocih s propilparabenom detektirali vrhove etilparabena, ki so najverjetneje posledica kontaminacije vzorcev med samo izvedbo poskusa in znatno količino p-HBK. Primerjavo v množini med p-HBK in propilparabena prikazuje slika 5. Slednja potrjuje obsežen metabolizem propilparabena, ki ustvarja p-HBK na akceptorski strani.
4.3.4 Para-hidroksibenzojska kislina
p-HBK je hidrofilna molekula, zato težje preide skozi membrano. Zaradi visoke sposobnosti parabenov za prehod skozi celično membrano pa lahko po transformaciji parabenov do metabolita p-HBK znotraj Caco-2 celic zaznamo na akceptorski (bazolateralni) strani večje kopičenje p-HBK. Z ločenim poskusom smo dokazali, da je sama p-HBK nizko permeabilna, kar prikazujejo slike 3, 6 in 7.
4.3.5 Primerjava permeabilnosti preiskovanih spojin
Če povzamemo permeabilnost vseh treh parabenov, lahko potrdimo načelo, da je permeabilnost povezana z lipofilnostjo in molekulsko maso. V primeru parabenov se permeabilnost namreč povečuje z lipofilnostjo in je pričakovano največja pri propilparabenu.
0,00E+00 5,00E-09 1,00E-08 1,50E-08 2,00E-08 2,50E-08 3,00E-08
0 20 40 60 80 100 120 140
n (mol)
t (min)
Lipofilnost je namreč povezana z boljšim vstopanjem v plast Caco-2 celic. Do enakih zaključkov so prišli tudi znanstveniki skupine Caon in sod., ki so preučevali permeabilnost parabenov skozi kožo prašičjega ušesa [47]. Vrednosti Papp za same parabene v naših poskusih izgledajo nizke, kar bi pomenilo, da že sama permeabilnost lahko predstavlja oviro za prehod parabenov v organizem. Na sliki 6 smo permeabilnostnim koeficientom parabenov dodali še hipotetične permeabilnostne koeficiente p-HBK (zeleni stolpci), kot bi jih lahko izračunali tudi za delež parabenov, ki se med prehodom skozi sluznico presnovijo do p- HBK. Tako smo ugotovili, da je nekoliko več p-HBK nastalo pri prehodu metilparabena in etilparabena skozi plast celic kot pri prehodu propilparabena, kar je lahko razlika v hitrosti pretvarjanja v p-HBK. Višjo določeno permeabilnost propilparabena tako lahko delno razložimo tudi z možnostjo, da se le-ta počasneje pretvarja v p-HBK in ga zato več v nespremenjeni obliki preide skozi bariero.
Slika 6: Modri stolpci prikazujejo permeabilnost (nm/s) parabenov (MP – metilparaben, EP – etilparaben, PP – propilparaben) in p-HBK ± SD v absorptivni smeri (Ap-BL); zeleni stolpci pa prikazujejo permeabilnost p- HBK (nm/s), ki nastane ob metabolizmu parabenov.
Naše meritve kažejo, da so preiskovani parabeni po permeabilnosti primerljivi z atenololom, ki je standard za nizko permeabilne spojine in jih zato uvrstimo med le-te. Poleg tega so njihove permeabilnosti očitno nižje od permeabilnosti metoprolola, ki je modelna spojina za
0 50 100 150 200 250 300 350
MP Ap-BL (R) EP Ap-BL (R) PP Ap-BL (R) MP Ap-BL (medij) pHBK Ap-BL (R)
Papp (nm/s)
opredelitev visoke permeabilnosti. Prikaz primerjave permeabilnosti parabenov z atenololom prikazuje slika 7, dodan je tudi metoprolol.
Slika 7: Primerjava permeabilnosti (nm/s) med parabeni (MP – metilparaben, EP – etilparaben, PP – propilparaben) ter p-HBK (para-hidroksibenzojska kislina) in standardoma – atenololom in metoprololom ± SD.
Predvsem izstopa ugotovitev, da so parabeni, če seštejemo njihove permeabilnosti (tj.
množine spojin zaznanih v nespremenjeni obliki, in v obliki njihovega glavnega metabolita p-HBK) z vidika prehoda apikalne membrane Caco-2 celic pravzaprav visoko permeabilne spojine. Podobno so ugotovili tudi Caon in sod. [47], ki so proučevali njihovo prehajanje skozi kožo prašičjega uhlja. Navidezni permeabilnostni koeficient izračunamo iz donorske koncentracije (mol/L) in hitrosti pretoka [nmol/(h × cm2)]. Ugotovili smo, da je splošno paraben tisti, ki hitro vstopa v sluznico, v kateri se v velikem obsegu metabolizira.
Posledično iz sluznice celic v akceptorsko raztopino difundira predvsem p-HBK, ki je sicer dokazano nizko permeabilna spojina (slike 3, 6 in 7). To pomeni, da med prehajanjem sluznice prihaja do zelo obsežne transformacije parabenov v ta metabolit.
0 50 100 150 200 250 300
MP Ap-BL (R)
MP BL-Ap (R)
EP PP pHBK atenolol metoprolol
Papp (nm/s)
