FENOLNE SPOJINE IN ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL RDEČIH VIN

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Neža HREN

FENOLNE SPOJINE IN ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL RDEČIH VIN

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij – 1. stopnja živilstvo in prehrana

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Neža HREN

FENOLNE SPOJINE IN ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL RDEČIH VIN

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij – 1. stopnja Živilstvo in prehrana

PHENOLIC COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT POTENTIAL OF RED WINE

B. SC. THESIS

Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition

Ljubljana, 2021

(3)

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana. Delo je bilo opravljeno v laboratoriju Katedre za tehnologije rastlinskih živil in vino na Oddelku za živilstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani in na Kmetijsko gozdarskem zavodu Nova Gorica.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr. Tatjano Košmerl in za recenzenta prof. dr. Blaža Cigića.

Mentorica: prof. dr. Tatjana KOŠMERL

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Recenzent: prof. dr. Blaž CIGIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik:

Mentorica:

Recenzent:

Datum zagovora:

Neža Hren

(4)

Hren N. Fenolne spojine in antioksidativni potencial rdečih vin.

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 663.25:547.56:577.1(043)=163.6

KG vino, rdeče vino, fenolne spojine, flavonoidi, tanini, barva, antioksidativni potencial AV HREN, Neža

SA KOŠMERL, Tatjana (mentorica), CIGIĆ, Blaž (recenzent) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021

IN FENOLNE SPOJINE IN ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL RDEČIH VIN TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP X, 20 str., 1 pregl., 13 sl., 8 pril., 18 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Fenolne spojine pomembno vplivajo na specifične lastnosti posameznih vin (barva, okus in telo), še posebej pri rdečih vinih. Poleg tega vina ščitijo pred oksidativnim stresom, zaradi svojih sposobnosti vezanja prostih radikalov, kelacije kovinskih ionov in vezave beljakovin. V raziskavo smo vključili vzorce rdečega vina sort merlot, modra frankinja in cabernet sauvignon, letnika 2018, pridelane v različnih vinorodnih okoliših Slovenije. Opravili smo analize vsebnosti skupnih fenolnih snovi, intenzitete barve, tona barve, deleža rdečega pigmenta, deleža barve pri posameznih valovnih dolžinah in antioksidativnega potenciala vina (AOP). Dodatno so bile opravljene še meritve kemijskih parametrov z aparaturo WineScan. Rezultati so pokazali razlike med vsebnostjo skupnih fenolnih snovi glede na posamezne sorte vina (1258-2798 mg GAE/L). Pokazala se je močna povezava med antioksidativnim potencialom in skupnimi fenolnimi spojinami (R² = 0,9376), prav tako je bilo moč opaziti povezavo med vsebnostjo alkohola in skupnimi fenolnimi spojinami (R² = 0,6615), ter intenziteto barve in skupnimi fenolnimi spojinami (R² = 0,8508). Ostali barvni parametri so se spreminjali med različnimi sortami vina, glede na vsebnost posameznih fenolnih spojin, ki dajejo vinu različne odtenke.

(5)

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 663.25:547.56:577.1(043)=163.6

CX wine, red wine, phenolic compounds, flavonoids, tannins, colour, antioxidant potential AU HREN, Neža

AA KOŠMERL, Tatjana (supervisor), CIGIĆ, Blaž (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology

PY 2021

TI PHENOLIC COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT POTENTIAL OF RED WINE DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO X, 20 p.,1 tab., 13 fig., 8 ann., 18 ref.

LA sl AL sl/en

AB Phenolic compounds importantly affect specific properties of wine (colour, taste and body), especially red wine. They also protect wine from oxidative stress, due to their ability to bind free radicals, proteins and metal ions chelation. In the research, we used samples of red wine of the varieties Merlot, Blue Franconian and Cabernet Sauvignon, year 2018, produced in different wine-growing regions of Slovenia. We performed analyses of the content of total phenolic compounds, colour intensity and hue, colour structure (contribution of the individual components to the overall colour in percentages) and antioxidant potential (AOP). Additionally, measurements of chemical parameters were performed with WineScan. Results showed differences between wine varieties in the content of total phenolic substances (1258-2798 mg GAE/L). A strong correlation between antioxidant potential and total phenolic compounds was shown (R²

= 0,9376), as well as an association between alcohol content and total phenolic compounds (R² = 0,6615), colour intensity and total phenolic compounds (R² = 0,8508).

Other colour parameters varied between different varieties of wine, depending on the content of individual phenolic compounds that give the wine different shades.

(6)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ...III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VII KAZALO PRILOG ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... IX

1 UVOD ... 1

1.1 CILJ DELA ... 1

1.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 1

2 PREGLED OBJAV ... 2

2.1 FENOLNE SPOJINE ... 2

2.1.1 Flavonoidi ... 2

2.1.1.1 Antocianini ... 3

2.1.1.2 Flavonoli ... 4

2.1.1.3 Flavan-3-oli ... 5

2.1.2 Neflavonoidi ... 5

2.1.2.1 Stilbeni ... 5

2.1.2.2 Fenolne kisline ... 6

2.1.2.2.1 Hidroksicimetne kisline ... 6

2.1.2.2.2 Hidroksibenzojske kisline ... 7

2.1.3 Tanini ... 7

2.1.3.1 Kondenzirani tanini ... 8

2.1.3.2 Hidrolizabilni tanini ... 8

2.2 ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL FENOLNIH SPOJIN ... 8

3 MATERIAL IN METODE ... 10

3.1 DOLOČANJE SKUPNIH FENOLNIH SPOJIN V VINU PO SINGLETONU IN ROSSIJU ... 10

3.2 DOLOČANJE BARVE ... 10

3.3 DOLOČANJE ANTIOKSIDATIVNEGA POTENCIALA ... 11

4 REZULTATI Z RAZPRAVO ... 13

4.1 REZULTATI OSNOVNE KEMIJSKE ANALIZE ... 13

(7)

4.2 REZULTATI DOLOČANJA SKUPNIH FENOLNIH SNOVI V VINU PO

SINGLETONU IN ROSSIJU ... 13

4.3 REZULTATI DOLOČANJA BARVE ... 14

4.3.1 Intenziteta barve ... 14

4.3.2 Ton barve ... 15

4.3.3 Delež rdeče barve (prosti in vezani antocianini) v posameznih vzorcih vina 15 4.3.4 Delež rdeče barve pri posameznih valovnih dolžinah ... 15

4.4 REZULTATI DOLOČANJA ANTIOKSIDATIVNEGA POTENCIALA ... 16

5 SKLEPI ... 17

6 POVZETEK ... 18

7 VIRI ... 19 ZAHVALA

PRILOGE

(8)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 VII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Rezultati osnovne kemijske analize vzorcev vina ... 13

KAZALO SLIK Slika 1: Sinteza fenolov (Fliamini in sod., 2013) ... 2

Slika 2: Osnovna kemijska struktura flavonoidov (Horendo-Ortega in sod., 2020) ... 3

Slika 3: Struktura antocianinov (Horendo-Ortega in sod., 2020) ... 3

Slika 4: Struktura flavonolov (Horendo-Ortega in sod., 2020) ... 4

Slika 5: Struktura flavan-3-olov (Horendo-Ortega in sod., 2020) ... 5

Slika 6: Struktura fenolnih kislin (Horendo-Ortega in sod., 2020) ... 6

Slika 7: Struktura procianidinov (Horendo-Ortega in sod., 2020) ... 8

Slika 8: Reakcija radikala DPPH s fenolnimi spojinami (Teixeira in sod., 2013) ... 9

Slika 9: Vsebnost skupnih fenolnih snovi v posameznih vzorcih vina ... 14

Slika 10: Odvisnost skupnih fenolnih spojin od alkohola ... 14

Slika 11: Ton barve pri posameznih vzorcih vina ... 15

Slika 12: Odvisnost deleža rdeče barve pri 520 nm od deleža rdeče barve v obliki flavilijevega kationa ... 16

Slika 13: Odvisnost antioksidativnega potenciala od skupnih fenolnih spojin ... 16

(9)

KAZALO PRILOG

Priloga A: Umeritvena krivulja za določanje skupnih fenolnih spojin Priloga B: Intenziteta barve v posameznih vzorcih vina

Priloga C: Odvisnost intenzitete barve od skupnih fenolnih spojin Priloga D: Odvisnost tona barve od skupnih fenolnih snovi

Priloga E: Odvisnost tona barve (brez meritve, ki odstopa) od skupnih fenolnih snovi

Priloga F: Delež rdeče barve (prosti in vezani antocianini v obliki flavilijevga kationa; %) v posameznih vzorcih vina

Priloga G: Delež rdeče barve pri posamezni valovni dolžini pri posameznih vzorcih vina Priloga H: Antioksidativni potencial (AOP, mmol/L) posameznih vzorcev vina

(10)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 IX

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI A420 absorbanca pri valovni dolžini 420 nm

A520 absorbanca pri valovni dolžini 520 nm A620 absorbanca pri valovni dolžini 620 nm AOP antioksidativni potencial

Aslepi vz. absorbanca slepega vzorca

Astand. absorbanca standarda

dA420 delež rdeče barve pri valovni dolžini 420 nm dA520 delež rdeče barve pri valovni dolžini 520 nm dA620 delež rdeče barve pri valovni dolžini 420 nm

dAF delež rdeče barve (prostih in vezanih antocianinov v obliki flavilijevega kationa)

DPPH• 2,2-difenil-1-pikril-hidrazil

I intenziteta barve

l dolžina optične poti v kiveti

n_DPPH₂ število molov reducirane oblike DPPH -OH hidroksilna skupina

R razredčitev

UV-VIS ultravijolična vidna spektrofotometrija Vreak. zmesi volumen reakcijske zmesi

Vvzorca volumen vzorca

x̅ povprečje treh izmerjenih absorbanc vzorca

ΔA razlika absorbanc

εDPPH molarni ekstinkcijski koeficient radikala DPPH•

(11)

1 UVOD

Vino je kompleksna mešanica več sto spojin, ki skupaj pripomorejo k temu, da dobimo kakovosten pridelek. Nekatere izmed teh spojin so prisotne v zelo majhnih koncentracijah, a zato niso nič manj pomembne. Ena izmed najpomembnejših skupin, ki se nahajajo v vinu, so fenolne spojine, ki predstavljajo manj kot en odstotek celote, vendar pa so ključnega pomena za oblikovanje značilnih lastnosti posameznih sort vina in tako omogočajo pridelavo pestrega nabora vin.

Fenolne spojine so široka skupina naravnih bioaktivnih snovi, ki se med seboj močno razlikujejo po strukturi in kompleksnosti. Izraza »polifenoli« ali »fenoli« opisujeta skupino sekundarnih metabolitov z eno ali več hidroksilnih skupin, vezanih na benzenov obroč in jih glede na razlike v sestavi delimo v številne podskupine (Horendo-Ortega in sod., 2020).

Številne raziskave so pokazale povezavo med antioksidativnim potencialom (AOP) in vsebnostjo fenolnih spojin. Njihovo antioksidativno aktivnost povezujemo s številom hidroksilnih skupin; več kot jih je, večji je AOP.

1.1 CILJ DELA

Namen diplomskega dela je bil kvantitativno določiti vsebnost fenolnih spojin v rdečih vinih istega letnika, poleg tega pa teoretično razdeliti fenolne spojine in raziskati kakšne so njihove lastnosti. Nadalje smo želeli ugotoviti, kako se spreminja antioksidativni potencial glede na različne vsebnosti skupnih fenolnih spojin in določiti vlogo fenolnih spojin na barvo končnega pridelka.

1.2 DELOVNE HIPOTEZE

H1: Antioksidativni potencial rdečih vin istega letnika je proporcionalen z vsebnostjo fenolnih spojin.

H2: Vina z višjim deležem alkohola vsebujejo več fenolnih spojin.

(12)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021 2

2 PREGLED OBJAV 2.1 FENOLNE SPOJINE

Delimo jih na flavonoide in ne-flavonoide. Flavonoidi imajo tri obroče; v to skupino uvrščamo antocianine, flavonole in flavan-3-ole ter njihove derivate. Ne-flavonoidov je največ v grozdnem mesu in jih najdemo tako v belem kot rdečem vinu (Angelosante, 2020). Vse komponente so lahko prisotne v prostih ali konjugiranih oblikah, ki se razlikujejo v stopnji hidroksilacije in substituciji hidroksilnih skupin (metilacija, glikozilacija, aciliranje). Med seboj lahko tvorijo komplekse (kondenzirani tanini, kompleksi med antocianini in tanini…), vse to omogoča pestro sestavo fenolnih spojin v grozdju (Horendo-Ortega in sod., 2020). Na sestavo fenolov vplivajo sorta vinske trte, okoljski dejavniki in način pridelave (Flamini in sod., 2013).

V rdečem vinu se nahaja nekje med 1-4 g/L fenolnih spojin (v belih vinih le 10 % od te vrednosti) (Angelosante, 2020). Te snovi pomembno pripomorejo k senzoričnim lastnostim vina, kot so na primer barva, okus, občutek v ustih, trpkost in grenkoba. Prav tako lahko fermentacijo, zorenje in staranje izvajamo v lesenih sodih, kjer pride do ekstrakcije številnih snovi lesa (največ elagotaninov) (Horendo-Ortega in sod., 2020). Fenolne spojine najpogosteje nastajajo iz aminokisline fenilalanin (slika 1). Sintetizira se v šikimatni poti, kar povezuje metabolizem ogljikovih hidratov z biosintezo aromatskih aminokislin in sekundarnih metabolitov (Flamini in sod., 2013). V fenilpropanoidni poti deaminira in nastane kalkon, ki je prekurzor za flavonoidno pot, kjer se sintetizirajo antocianini in proantocianidini (Nel, 2018).

Slika 1: Sinteza fenolov (Fliamini in sod., 2013)

2.1.1 Flavonoidi

Osnovna struktura flavonoidov je sestavljena iz 15 ogljikov (C6-C3-C6), razdeljenih na dva benzenova obroča, A in B, ki ju povezuje heterociklični obroč C (slika 2). Glede na oksidacijsko

(13)

stanje obroča C se spojine deli v antocianine, flavan-3-ole in flavonole (Horendo-Ortega in sod., 2020).

Slika 2: Osnovna kemijska struktura flavonoidov (Horendo-Ortega in sod., 2020)

2.1.1.1 Antocianini

Antocianini so snovi, zaradi katerih sta grozdje in vino rdeče barve, vplivajo na organoleptične lastnosti vina, imajo antioksidativne in protimikrobne lastnosti ter pozitivno delujejo na srčno- žilni sistem. Na vsebnost antocianinov najpomembneje vplivajo okoljski dejavniki, medtem ko je njihova sestava bolj povezana s sorto vinske trte. V rastlinskem tkivu ščitijo pred sončno svetlobo, UV žarki, patogenimi organizmi, oksidativnimi poškodbami, prostimi radikali, prav tako pa privabljajo živali, pomembne pri razmnoževanju (Flamini in sod., 2013). V rastlinah se začnejo akumulirati med začetkom zorenja grozdja (ang. veraison), najdemo jih v vakuolah epidermalnih celic jagodne kožice. V grozdju žlahtne vinske trte Vitis vinifera je pet najpomembnejših antocianinov (slika 3): delfinin-3-O-glukozid, cianidin-3-O-glukozid, petunidin-3-O-glukozid, peonidin-3-O-glukozid, malvidin-3-O-glukozid (Nel, 2018).

Slika 3: Struktura antocianinov (Horendo-Ortega in sod., 2020)

He in sodelavci so prikazali tudi vsebnost pelargonidin-3-O-glukozida v kožicah grozdnih jagod pri sortah cabernet sauvignon in modri pinot (He in sod., 2010). Monoglukozidi teh antocianinov so lahko acetilirani z aromatskimi kislinami (p-kumarna in kavna kislina) in alifatskimi kislinami (ocetna, jabolčna in jantarna kislina) tako, da se tvori 15 različnih antocianinov (Nel, 2018). Barva antocianinov se spreminja s strukturo. Tisti, ki imajo na obroču dva substituenta, imajo oranžen ton barve, tisti ki imajo tri substituente pa so rdečkasto vijolične barve.Na barvo vpliva tudi prisotnost metoksi skupin v B obroču: večje kot je njihovo število, več je vijoličnih tonov (Escribano-Bailón in sod., 2019). Pomembno vlogo pri stabilizaciji in

(14)

intenziteti barve imajo dimeri antocianinov (dimer dveh malvidin-3-O-glukozidov, dimer malvidin-3-O-glukozida in peonidin-3-O-glukozida). Za vina cabernet sauvignon, merlot, syrah in tempranillo je značilen velik delež oblik malvidina, medtem ko je v nebbiolu (italijanska sorta) peonidin-3-O-glukozid najbolj razširjen antocianin. Druge sorte, kot so na primer modri pinot, rdeči chardonnay in roza sultana (beli rdeče obarvani mutanti), ne morejo sintetizirati acetiliranih antocianinov. Tako lahko profil antocianov v grozdju uporabljamo kot orodje za preverjanje pristnosti sortnih vin (Horendo-Ortega in sod., 2020).

Pri pH vina so antocianini vključeni v številne reakcije, odvisno od pH vina pa jih najdemo v štirih različnih oblikah: flavilijev kation, kinoidalna baza, karbinolna baza in kalkon. Pri nizkih vrednostih pH je najpomembnejši rdeči flavilijev kation, z višanjem vrednosti pH se vključuje v reakcijo hidracije in tvori se brezbarvna karbinolna baza, ta pa se z tavtomerno izomeracijo pretvori v rumeni kalkon. Pri vrednostih pH blizu 7 v nevodnem mediju, je najpomembnejša oblika vijolična kinoidalna baza. Glede na pogoje v vinu bi morala biti večina antocianinov v brezbarvni obliki, vendar pa določeni mehanizmi pripomorejo k stabilizaciji obarvanih oblik.

Zaradi kopigmentacije se obarvane oblike antocianinov stabilizirajo, tako deluje kot glavni mehanizem za stabilizacijo barve v rastlinah in v rdečem vinu. Vodi v karakteristične spremembe v absorpcijskem spektru, poveča se absorbanca v vidnem spektru. V mladem vinu bi lahko kopigmentaciji pripisali skoraj 50 % barve, vendar pa se v procesu staranja ta delež zmanjša (vključevanje v kemijske interakcije) (Escribano-Bailón in sod., 2019).

2.1.1.2 Flavonoli

Flavonoli imajo dvojno vez med C2 in C3 in hidroksilno skupino na C3. Običajno so bele do rumene barve, pomembno prispevajo k stabilizaciji barve mladih vin s procesom kopigmentacije z antocianini in imajo vlogo pri zaznavi trpkosti in grenkobe (Horendo-Ortega in sod., 2020). Ena izmed funkcij flavonolov je tudi zaščita vina pred svetlobo (Flamini in sod., 2013).

Slika 4: Struktura flavonolov (Horendo-Ortega in sod., 2020)

Nahajajo se v kožicah grozdnih jagod v 3-O-glukozidnih oblikah. Glavni flavonoli v rdečem grozdju so dihidroksilirani kvercetin-3-O-glukozid in kvercetin-3-O-glukuronid ter trihidroksilirani miricetin-3-O-glukozid. Poleg tega so bile identificirane tudi druge spojine (slika 4), kot so kamferol, metilirani izoramnetin, laricitrin in siringetin 3-O-glukozidi. V grozdju cabernet sauvignon se v manjših količinah nahajajo kamferol in laricitrin-3-O-

(15)

galaktozidi, kamferol-3-O-glukuronid ter celo kvercetin in siringetin-3-O-(6″-acetil)-glukozid.

Poročali so tudi o vsebnosti laricitrin-3-O-galaktozida in siringetin-3-O-galaktozida v rdečem vinu. V sortah belega grozdja za razliko od rdečega ni prisotnih miricetina, laricitrina in siringetina (Horendo-Ortega in sod., 2020).

2.1.1.3 Flavan-3-oli

Flavan-3-oli so monomerni flavonoidi sestavljeni iz benzoprianske strukturne enote (obroča A in C) in benzenovega obroča (slika 5). Dva kiralna centra (C2 in C3) omogočata štiri različne konfiguracije za posamezni monomer. Molekule se med seboj povezujejo v dimere, oligomere (3-10 monomernih enot) in polimere (več kot 10 monomernih enot). Vse bolj kompleksne strukture uvrščamo med kondenzirane tanine. Če jih tvorita (+)-katehin, (-)-epikatehin in njuni estri z galno kislino, se imenujejo procianidini, če pa jih sestavljata (+)-galokatehin, (-)- epigalokatehin in njuni galoderivati, se uporablja izraz prodelfinidini (Horendo-Ortega in sod., 2020).

Slika 5: Struktura flavan-3-olov (Horendo-Ortega in sod., 2020)

Struktura flavan-3-olov omogoča relativno preprosto oksidacijo in odstranjevanje prostih radikalov. Prisotnost galoilnih skupin, število in položaj hidroksilnih skupin naj bi povečali aktivnost, metoksilacija in glikozilacija položaja 3 pa zavirata aktivnost, poleg tega (-)- epikatehin lažje oksidira kot (+)-katehin. Flavan-3-oli imajo antioksidativne lastnosti, ki jih omogoča več mehanizmov (odstranjevanje prostih radikalov, kelacija prehodnih kovin, vpliv na delovanje encimov). Konfiguracija flavan-3-olov omogoča enostavno sproščanje elektronov med proste radikale. S sproščanjem elektronov se radikalni značaj reaktivnih snovi prenese na njih. Flavan-3-oli in njihovi mikrobni presnovki fenolne kisline se pogosto štejejo za boljše antioksidante od vitaminov C in E, saj je nastali radikal na splošno bolj stabilen in manj škodljiv kot začetne radikalne vrste (Aron in Kennedy, 2008).

2.1.2 Neflavonoidi

2.1.2.1 Stilbeni

Stilbeni so fitoaleksini, prisotni v grozdnih jagodah in so povezani s pozitivnimi učinki v vinu (Flamini in sod., 2013). Sestavljeni so iz dveh aromatskih obročev, povezanih z etilenskim

(16)

mostičkom, skupaj tvorijo C6-C2-C6 strukturo. Benzenovi strukturni obroči so običajno substituirani z različnimi skupinami, kot so na primer hidroksilne, metilne, metoksilne ali fenilne skupine. Monomerne enote se med seboj lahko povezujejo in tako tvorijo bolj kompleksne stilbene. V grozdnih jagodah jih največ najdemo v grozdnih kožicah, v sledeh so prisotni tudi v pečkah (Horendo-Ortega in sod., 2020).

Resveratrol je stilben, ki ga povezujemo z antikancerogenim, antioksidativnim, protivnetnim delovanjem, prav tako pa naj bi ščitil srčno-žilni sistem (Flamini in sod., 2013). V grozdju se nahaja v različnih oblikah, kot so na primer cis- in trans- izomeri, pa tudi glukozidi obeh izomer (cis-resveratrol v grozdju ni prisoten, se pa nahaja v vinu). Izomerizacijo molekule povzroča svetloba (Waterhouse, 2002). Dimeri in oligomeri resveratrola so prav tako prisotni v grozdju, ki se tvorijo kot aktivna obramba pred zunanjimi nevarnostmi ali pa jih producirajo ekstracelularni encimi, sproščeni iz patogenih mikroorganizmov, kot način za odstranitev toksičnih komponent (Flamini in sod., 2013). Drugi pomembni stilbeni so še piceid, astringin v manjših količinah so prisotni tudi drugi manjši monomeri, kot sta pterostilben in izorapontigenin (Horendo-Ortega in sod., 2020).

2.1.2.2 Fenolne kisline

Fenolne kisline delimo v dve skupini: hidroksicimetne kisline in hidroksibenzojske kisline (slika 6). Najdemo jih v kožicah, mesu in pečkah grozdnih jagod. Na njihovo vsebnost vpliva sorta in poreklo (Horendo-Ortega in sod., 2020).

Slika 6: Struktura fenolnih kislin (Horendo-Ortega in sod., 2020)

2.1.2.2.1 Hidroksicimetne kisline

V največjih količinah se nahajajo v kožici grozdnih jagod (Horendo-Ortega in sod., 2020).

Pomembna skupina fenolov, predvsem imajo večjo vlogo v belem vinu. So prvi, ki v vinu oksidirajo in tako povzročajo porjavenje. Pogoste oblike, ki se pojavljajo v vinih so: p-kumarna kislina, kavna kislina, ferulna kislina in sinapinska kislina (Waterhouse, 2002). Kavna in p- kumarna kislina sta lahko zaestreni z glukozo antocianinskih monoglukozidov, ki tvorijo njune acilirane derivate (Horendo-Ortega in sod., 2020). Hidroksicimetne kisline so v grozdju

(17)

zaestrene z vinsko kislino, skupaj tvorijo kaftrno, p-kutarno ali fertarno kislino (iz kavne, p- kumarne in ferulne kisline). Največ je kaftarne kisline, medtem ko je drugih precej manj.

Količinsko razmerje se ohranja tudi v vinu. Hidroksicimetne kisline deloma prispevajo tudi k čutnem zaznavanju trpkosti in grenkobe (Waterhouse, 2002).

Naravno prisotni estri so občutljivi na hidrolizo, ki poteče v vodni raztopini vina, kot produkti se sproščajo preproste hidroksicimetne kisline, ki jih lahko zaznamo v nekaj tednov staremu vinu. Te proste kisline deloma reagirajo z etanolom v vinu in tvorijo nove estre (potek reakcije je odvisen od pH) (Waterhouse, 2002).

2.1.2.2.2 Hidroksibenzojske kisline

Mednje uvrščamo galno kislino, vanilinsko kislino in siringinsko kislino, v manjših količinah pa so prisotne tudi protokatehujska kislina in p-hidroksibenzojske kisline (Horendo-Ortega in sod., 2020). Najdemo jih predvsem v mladih vinih. V rdečem vinu se nahajajo v koncentracijah do 70 mg/L, medtem ko jih je v belem okoli 10 mg/L (Waterhouse, 2002). Glavni predstavnik je galna kislina, ki nastane iz hidrolize galatnih estrov taninov, po nekaj mesecih od začetka pridelave vina. Galna kislina je stabilna med staranjem vina (Waterhouse, 2002). Je prekurzor za vse hidrolizabilne tanine (Horendo-Ortega in sod., 2020).

2.1.3 Tanini

Trpkost vina lahko pripišemo taninom, na katero vplivata količina in sestava. So polimeri manjših fenolov imenovanih flavan-3-oli. Flavan-3-oli (vključno s katehinom) so vir grenkobe in se nahajajo predvsem v pečkah (med procesom pridelave poskušamo omejiti ekstrakcijo).

Imajo negativni naboj in se vežejo s pozitivno nabitimi molekulami (Angelosante, 2020).

Beljakovine v slini reagirajo s tanini in tako povzročijo nastanek netopne oborine (suh občutek v ustih) (Ma in sod., 2014).

Struktura taninov vplivata na njihovo trpkost, prav tako na zaznavo taninov vplivajo različni dejavniki, kot sta alkohol (zmanjša zaznavo trpkosti) in kisline (povečajo zaznavo trpkosti) (Angelosante, 2020). Trpkost taninov se zmanjša med zorenjem vina, saj prihaja do sprememb v stopnji polimerizacije, kar zmehča tanine in tako tudi njihovo zaznavo. Občutek trpkosti in grenkobo pogosto zaznavamo skupaj, vendar pa se v nasprotju z trpkostjo grenkoba z molekulsko maso zmanjšuje. To je razvidno iz taninov kožice in pečk, saj je stopnja polimerizacije v pečkah manjša, kar se pozna na večji grenkobi taninov iz pečk (Ma in sod., 2014). Tanini iz kožic so bolj zaželeni od tistih iz pečk. Delimo jih v dve skupini, kondenzirani in hidrolizabilni tanini. Kondenzirani tanini se imenujejo tudi proantocianidini in se v vinu nahajajo v največji količini od vseh fenolov (25-50 % vseh fenolov; 0,3-2,0 g/L), medtem ko je hidrolizabilnih antocianinov v rdečem vinu redko več kot 20 mg/L, večinoma v vino pridejo iz lesa med zorenjem vina (Angelosante, 2020).

(18)

2.1.3.1 Kondenzirani tanini

Kondenzirani tanini se nahajajo v vseh rastlinah. Njihov neprijetni okus odvrača živali in insekte, ki predstavljajo nevarnost rastlini. Najdemo jih v kožici, pečkah in pecljevini, količina se razlikuje glede na sorte (predvsem tanini v pečkah) in okoljske dejavnike (Angelosante, 2020). Količina, struktura (slika 7) in stopnja polimerizacije so odvisne od lokacije v grozdnem tkivu. Stopnja polimerizacije je pomembna lastnost strukture proantocianidinov. Delimo jih na dimere, trimere, oligomere in polimere. Največ jih je v pečkah, precej pa tudi v pecljevini in jagodnih kožicah, medtem ko jih je v grozdnem mesu malo (največ v vinih sort barvaric, t.i.

teinturier). V pečkah so oligomeri in polimeri sestavljeni iz monomernih enot flavan-3-olov, (+)-katehinov, (-)-epikatehinov in (-)-epikatehin galatov, povezanih z C4-C8 in/ali C4-C6 vezmi.

V kožicah, pecljevini in mesu najdemo tudi (-)-epigalokatehin, (+)-galokatehin in (-)- epigalokatehin galat (lahko prisotni tudi galokatehini in prodelfinidini). V grozdju se v večini nahajajo v obliki polimerov (60-80 %) (Jordão in Ricardo-da-Silva, 2019).

Slika 7: Struktura procianidinov (Horendo-Ortega in sod., 2020)

2.1.3.2 Hidrolizabilni tanini

So polimeri ne-flavonoidnih spojin. V grozdju teh komponent ni, a s staranjem v lesenih sodih ali z uporabo lesenih nadomestkov migrirajo v vino. Iz novih lesenih sodov se ekstrarhira bistveno več hidrolizabilnih taninov kot iz starejših (nov sod prispeva dvakrat več taninov kot eno leto star sod) (Angelosante, 2020). Delimo jih na galotanine, iz katerih med hidrolizo dobimo sladkorje in galno kislino, ter elagotanine, iz katerih med hidrolizo poleg sladkorjev nastane elagična kislina (Smeriglio in sod., 2017).

2.2 ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL FENOLNIH SPOJIN

V vinih so fenolne spojine glavne reducirajoče snovi. V raziskavah so se pokazale povezave med antioksidativnim potencialom in vsebnostjo fenolnih komponent, vino z višjo vsebnostjo fenolnih komponent je imelo višji AOP. Rezultati so pokazali tudi, da ima rdeče vino bistveno

(19)

večji AOP od belega, prav tako imajo nekatera starejša vina višji AOP od mlajših. Pozitivne vplive fenolnih spojin pripisujejo prav AOP (Košmerl in Cigić, 2008).

Antioksidativna aktivnost fenolnih komponent je povezana z njihovo kemijsko strukturo, saj imajo spojine z velikim številom hidroksilnih skupin višjo antioksidativno aktivnost. To pomeni, da na AOP ne vpliva le vsebnost fenolnih spojin, ampak tudi njihova sestava oz.

struktura. Najpomembneje k anitoksidativnim lastnostim vina prispeva flavan-3-olna frakcija, bistveno manj pa antocianini. Antioksidativna aktivnost se razlikuje med monomernimi in polimernimi molekulami, mogoče je tudi sinergistično ali antagonistično delovanje med različnimi skupinami fenolov (Banc in sod., 2020). Mehanizmov delovanja fenolnih spojin je več. Hidroksilne skupine fenolih spojin so dobri donorji vodika, tako antioksidanti reagirajo z reaktivnim kisikom in dušikom v reakciji terminacije, ki prekine cikel nastajanja novih radikalov. Po poteku reakcije z reaktivnimi snovmi nastane antioksidativni radikal, ki je bistveno bolj stabilen od začetnega. Antoksidativna aktivnost se fenolnim spojinam pripisuje tudi zaradi sposobnosti kelacije kovinskih ionov, ki sodelujejo pri nastajanju novih radikalov, prav tako pogosto vstopajo v interakcije z beljakovinami. Na ta način zavirajo nekatere encime, ki sodelujejo pri tvorbi radikalov (Pereira in sod., 2009).

Ena izmed metod, ki se uporablja za določanje AOP se uporablja metoda z radikalom DPPH.

DPPH• reagira z različnimi antioksidanti v različnih molarnih razmerjih (snovi z več hidroksilnimi skupinami na (1,2-) pozicijah v aromatičnih obročih vežejo več DPPH• (Košmerl in Cigić, 2008).

Slika 8: Reakcija radikala DPPH s fenolnimi spojinami (Teixeira in sod., 2013)

Reakcija z radikalom DPPH poteka različno hitro – askorbinska kislina reagira že v nekaj sekundah, medtem ko reakcija pri nekaterih antioksidantih poteka več ur (Košmerl in Cigić, 2008).

(20)

3 MATERIAL IN METODE

V okviru eksperimentalnega dela smo uporabili po dva vzorca vina sort merlot, modra frankinja in cabernet sauvignon letnika 2018, pridelana v različnih vinorodnih pokrajinah Slovenije.

Vzorčenje smo opravili v paralelkah. Del analiz smo opravili v laboratoriju za tehnologijo vina na Biotehniški fakulteti v Ljubljani (antioksidativni potencial, skupne fenolne snovi, intenziteta barve, ton barve, delež rdeče barve – prosti in vezani antocianini v obliki flavilijevega kationa, delež rdeče barve pri posamezni valovni dolžini). Dodatne kemijske analize vina so bile opravljene v Novi Gorici s pomočjo aparature WineScan.

3.1 DOLOČANJE SKUPNIH FENOLNIH SPOJIN V VINU PO SINGLETONU IN ROSSIJU

Vsebnost skupnih fenolov v vinu smo določali s spektrofotometrično metodo po Singletonu in Rossiju. Njihovo vrednost podajamo kot mg galne kisline/L. Za določanje koncentracije skupnih fenolnih snovi smo vzorcu vina dodali Folin-Ciocaulteujev, ki ima sposobnost oksidacije fenolnih snovi v alkalni raztopini (dodatek Na2CO3). Ob poteku reakcije se raztopina obarva modro. Absorbanco raztopine merimo pri 765 nm. Za določanje koncentracije skupnih fenolov smo pripravili šest standardnih raztopin galne kisline, jim izmerili absobanco pri 765 nm in na podlagi teh meritev narisali umeritveno krivuljo (priloga A) (Košmerl in Kač, 2010).

Laboratorijski pripomočki:

 100 mL merilne bučke,

 pipete,

 puhalka z deionizirano vodo,

 10 mm kvarčne kivete,

 UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu, model UV-160A).

Reagenti:

 osnovna raztopina galne kisline (500 mg galne kisline, 10 mL absolutnega etanola, deionizirana voda),

 Folin-Ciocalteujev reagent (redčitev z deionizirano vodo v razmerju 1:2),

 20 % raztopina natrijevega karbonata,

 deionizirana voda.

3.2 DOLOČANJE BARVE

Vzorce rdečih vin smo pred meritvami primerno razredčili (razmerje 1:10) s pufrno raztopino, za katero je pomembno, da je njena vrednost pH čim bližja vrednostim pH naših vzorcev. Po razredčitvi smo izmerili absorbanco pri valovnih dolžinah 420 nm, 520 nm in 620 nm.

(21)

Intenziteto barve (I) predstavlja vsota vseh absorbanc, odtenek barve (ton) pa določa razmerje absorbanc pri 420 nm in 520 nm (Košmerl in Kač, 2010).

 20 mL epruvete,

 pipete,

 pH meter (Mettler Toledo, model DL50 Graphix),

 10 mm kvarčne kivete,

Reagenti:

 pufer z vrednostjo pH 3,5.

Računi (Košmerl in Kač, 2010):

I = (A ₄₂₀+ A ₅₂₀+ A ₆₂₀) …(1)

ton = ^A⁴²⁰

A ₅₂₀ …(2)

dA_F (%) = (A ₅₂₀−^(A⁴²⁰^+A⁶²⁰⁾

2 ) ⋅ ¹

A 520⋅ 100 …(3)

dA₄₂₀ (%) = (^A⁴²⁰

I ) ⋅ 100 …(4)

dA₅₂₀ (%) = (^A⁵²⁰

I ) ⋅ 100 …(5)

dA₆₂₀ (%) = (^A⁶²⁰

I ) ⋅ 100 …(6)

Legenda:

A420…absorbanca pri valovni dolžini 420 nm, A520…absorbanca pri valovni dolžini 520 nm, A620…absorbanca pri valovni dolžini 620 nm, dA420…delež rdeče barve pri valovni dolžini 420 nm, dA520…delež rdeče barve pri valovni dolžini 520 nm, dA620…delež rdeče barve pri valovni dolžini 420 nm, dAF…delež rdeče barve (prostih in vezanih antocianinov v obliki flavilijevega kationa), I…intenziteta barve, l…dolžina optične poti v kiveti

3.3 DOLOČANJE ANTIOKSIDATIVNEGA POTENCIALA

Za določanje antioksidativnega potenciala smo uporabili spektroskopsko metodo z radikalom DPPH•, pri kateri pride do reakcije med DPPH• in donorjem vodika, med katere spadajo tudi fenolne spojine. Pri reakciji nastaja DPPH2, zaradi katerega pride do spremembe barve iz vijolične v rumeno in posledično tudi zmanjšanja absorbance pri 517 nm (pri tej valovni dolžini ne absorbira) (Zorenč in Košmerl, 2020).

DPPH• + fenoli  DPPH2 …(7)

(22)

 Eppendorf centrifugirke,

 pipete,

 10 mm plastične kivete,

Reagenti:

 raztopina DPPH (v 100 mL merilno bučko odpipetiramo 4 mg DPPH•, raztopimo v 10 mL metanola in z metanolom redčimo, vse dokler raztopine ne doseže absorbance približno 1,0 pri valovni dolžini 517 nm),

 metanol,

 deionizirana voda.

Računi (Zorenč in Košmerl, 2020):

ΔA = A_stand − (x̅ + A_{slepi vz.}) …(8)

n_DPPH₂ (mol) = ^ΔA

ε_DPPH ( ^L

mol⋅cm)⋅l (cm) ⋅ vreak. zmesi (L) …(9)

AOP (mol/L) = ⁿ^DPPH2^(mol)

V_vzorca(μL) ⋅ R ⋅ 10⁻⁶(^μL

L) …(10)

Legenda:

Aslepi vz.…absorbanca slepega vzorca, Astand.…absorbanca standarda, n_DPPH₂…število molov reducirane oblike DPPH, R…razredčitev, Vreak. zmesi…volumen reakcijske zmesi, Vvzorca…volumen vzorca, x̅…povprečje treh izmerjenih absorbanc vzorca, ΔA…razlika absorbanc, εDPPH… molarni ekstinkcijski koeficient radikala DPPH•

(23)

4 REZULTATI Z RAZPRAVO

4.1 REZULTATI OSNOVNE KEMIJSKE ANALIZE

Vzorca številka 1 in 2 predstavljata vino sorte merlot, vzorca 3 in 4 vino sorte modra frankinja in vzorca 5 in 6 vino sorte cabernet sauvignon (preglednica 1). Vzorci 1, 2, 5 in 6 so bili pridelani v vinorodni deželi Primorska, vzorec 3 v vinorodni deželi Podravje in vzorec 4 v vinorodni deželi Posavje, vsi so bili pridelani leta 2018. Analize so pokazale, da imajo vzorci vina med 1,82 g/L in 3,86 g/L reducirajočih sladkorjev, kar pomeni, da jih uvrščamo med suha vina. Alkoholna stopnja vzorcev se je gibala med 11,88 vol. % in 13,68 vol. %. Vzorca vina sorte modra frankinja sta vsebovala nekaj manj alkohola od vzorcev vin merlot in cabernet sauvignon.

Preglednica 1: Rezultati osnovne kemijske analize vzorcev vina

Vzorec Sorta Vinorodna dežela Vinorodni okoliš

Relativna

gostota Alkohol Reducirajoči sladkorji (vol. %) (g/L) 1 merlot vinorodna dežela

Primorska Slovenska

Istra 0,9937 13,41 3,86

2 merlot vinorodna dežela

Primorska Vipavska

dolina 0,9945 13,51 3,40

3 modra

frankinja

vinorodna dežela Podravje

Štajerska Slovenija

0,9937 11,88 2,81

4 modra

frankinja

vinorodna dežela Posavje

Dolenjska 0,9945 12,76 3,83

5 cabernet

sauvignon vinorodna dežela

Primorska Goriška

Brda 0,9962 13,23 3,65

6 cabernet

sauvignon vinorodna dežela

Primorska Goriška

Brda 0,9941 13,68 1,82

4.2 REZULTATI DOLOČANJA SKUPNIH FENOLNIH SNOVI V VINU PO SINGLETONU IN ROSSIJU

Rezultati določanja skupnih fenolnih snovi kažejo na razlike med sortami, kot tudi med posameznimi vzorci znotraj sorte, kar je razvidno na sliki 9. Največ skupnih fenolnih snovi smo izmerili v vzorcu številka 2, in sicer 2798 mg GAE/L, najmanj pa v vzorcu številka 3, v katerem smo namerili 1258 mg GAE/L. Razvidno je, da ima najmanj skupnih fenolnih snovi vino sorte modra frankinja (1378 ± 163 GAE/L), bistveno več pa jih ima vino sorte cabernet sauvignon (2258 ± 218 GAE/L), kar lahko pripisujemo sortnim značilnostim. Pri vzorcih vina sorte merlot (2178 ± 578 GAE/L) je prišlo do precejšne razlike, kar bi lahko pripisali različni fenolni zrelosti grozdja ob trgatvi in v manjšem obsegu tudi različnemu vinogradniškem okolišu.

(24)

Slika 9: Vsebnost skupnih fenolnih snovi v posameznih vzorcih vina

Na sliki 10 je prikazana zveza med koncentracijo skupnih fenolnih spojin in alkoholno stopnjo vina. Med parametroma je vidna pozitivna linearna zveza (R² = 0,6615), ki sicer ni zelo tesna, a vseeno bi lahko rekli, da povezava med parametroma obstaja. Vina z višjo alkoholno stopnjo imajo namreč večjo koncentracijo skupnih fenolnih snovi. To povezavo bi lahko razložili z daljšo alkoholno fermentacijo, s katero dosežemo višjo alkoholno stopnjo, ob tem se zaradi daljšega stika iz grozdnega materiala ekstrahira več fenolnih spojin. Poleg tega alkohol deluje kot ekstrakcijsko topilo, zato je ob večji koncentraciji možna obsežnejša ekstrakcija.

Slika 10: Odvisnost skupnih fenolnih spojin od alkohola

4.3 REZULTATI DOLOČANJA BARVE

4.3.1 Intenziteta barve

Priloga B prikazuje intenziteto barve različnih vzorcev, ki se nahaja v obsegu med 5,31 in 12,05.

Ta je sorazmerna z meritvami vsebnosti skupnih fenolnih spojin (R² = 0,8508), tako da je

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

1 2 3 4 5 6

skupne fenolne spojine (mg GAE/L)

številka vzorca

y = 715,95x - 7415,9 R² = 0,6615

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

11,5 12,0 12,5 13,0 13,5 14,0

alkohol (vol. %)

(25)

intenziteta barve najšibkejša pri vzorcih vina sorte modra frankinja (5,7 ± 0,4), medtem ko imata sorti merlot (10,5 ± 1,5) in cabernet sauvignon (9,5 ± 0,5) večjo intenziteto barve vina.

Zveza med intenziteto barve in vsebnostjo skupnih fenolnih spojin je predstavljena v prilogi C.

4.3.2 Ton barve

Ton barve prikazuje razvoj barve proti oranžnim odtenkom. Mlada vina imajo vrednosti med 0,5 in 0,7. Vrednost s staranjem vina narašča do vrednosti 1,2 oz. 1,3 (Babincev in sod., 2016).

Slika 11 prikazuje ton barve za posamezne vzorce. Vrednosti se gibljejo med 0,794 in 0,903.

Višje vrednosti kažejo na več oranžnih odtenkov v vinu, ki so lahko znak oksidiranega vina.

Zveza med tonom barve in vsebnostjo skupnih fenolih spojin (prilogi D in E) je zelo slaba, če upoštevamo vse meritve (R² = 0,00007). Če ne upoštevamo meritve, ki odstopa (vzorec 3) se ta povezava precej okrepi (R² = 0,5816), vendar je še vedno precej slabša od povezave med intenziteto barve in vsebnostjo skupnih fenolnih spojin.

Slika 11: Ton barve pri posameznih vzorcih vina

4.3.3 Delež rdeče barve (prosti in vezani antocianini) v posameznih vzorcih vina

Priloga F prikazuje delež rdeče barve v obliki flavilijevega kationa, tj. vsebnost prostih in vezanih antocianinov v posameznih vinih. Vrednosti se gibljejo med 42,4 % in 49,1 %. Največja je razlika med vzorcema vina sorte modra frankinja, medtem ko je razlika pri drugih vzorcih manjša. Mogoče je opaziti povezavo med tonom barve in deležem rdeče barve, saj imajo vina z večjimi vrednostmi pri tonu barve nižji delež rdeče barve.

4.3.4 Delež rdeče barve pri posameznih valovnih dolžinah

Merite barve pri 420 nm predstavljajo rumenkaste odtenke v vinu, pri 520 nm rdečkaste odtenke in pri 620 nm vijolične odtenke. Če pride do večjih odstopanj pri deležu barve pri 420 nm, to

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00

1 2 3 4 5 6

ton barve

številka vzorca

(26)

kaže na oksidirano vino. Med posameznimi sortami ni bilo vidnih večjih razlik v posameznih deležih barve (priloga G), prihaja do manjših razlik, ki bi jih lahko pripisali različnim postopkom pridelave, pogojem, koncentraciji SO2 in razmerju med antocianini in tanini. Barva pri valovni dolžini 420 nm predstavlja med 39,4 % in 41,9 %, barva pri 520 nm predstavlja med 46,5 % in 49,5 %, barva pri 620 nm, ki prispeva najmanjši delež k celotni barvi, pa predstavlja med 11,2 % in 12,4 %. Slika 12 prikazuje povezavo med deležem rdeče barve pri 520 nm in deležem rdeče barve v obliki flavilijevega kationa, ki je zelo tesna (R² = 0,9996).

Slika 12: Odvisnost deleža rdeče barve pri 520 nm od deleža rdeče barve v obliki flavilijevega kationa

4.4 REZULTATI DOLOČANJA ANTIOKSIDATIVNEGA POTENCIALA

Največji antioksidativni potencial ima vzorec številka 6 (cabernet sauvignon), ki ima vrednost 19,9 mmol/L, medtem ko ima najmanjši AOP vzorec številka 3 (modra frankinja), in sicer 8,4 mmol/L (priloga G). Na sliki 13 je predstavljena zveza med koncentracijo skupnih fenolnih spojin in AOP. Zveza je premosorazmerna (R² = 0,9376). Tako lahko potrdimo, da obstaja tesna povezava med parametroma.

Slika 13: Odvisnost antioksidativnega potenciala od skupnih fenolnih spojin y = 0,4471x + 27,525

R² = 0,9996

46 46,5 47 47,5 48 48,5 49 49,5 50

42 43 44 45 46 47 48 49 50

dA520(%)

dA_F(%)

y = 0,0075x - 0,3836 R² = 0,9376

0 5 10 15 20 25

1000 1500 2000 2500 3000

antioksidativni potencial (mmol/L)

(27)

5 SKLEPI

Na podlagi dobljenih rezultatov lahko povzamemo naslednje sklepe:

 Vzorci so vsebovali med 2798 mg GAE/L in 1258 mg GAE/L, med sortami sta vzorca modre frankinje (1378 ± 163 GAE/L) vsebovala manj skupnih fenolnih spojin, v primerjavi z vzorci vina sort merlot (2178 ± 578 GAE/L) in cabernet sauvignon (2258 ± 218 GAE/L).

Pri vzorcih sorte merlot smo opazili velike razlike, kar smo pripisali razlikam zaradi lege in različni fenolni zrelosti grozdja.

 Intenzivnost barve in vsebnost skupnih fenolnih spojin sta sorazmerno povezani.

 Pri tonu barve je do odstopanj prišlo pri vzorcih vina sorte modra frankinja, vrednosti so bile med 0,794 in 0,903, pri čemer so višje vrednosti kazale na več oranžnih odtenkov v vinu.

 Pri deležih rdeče barve pri različnih valovnih dolžinah med vzorci ni prihajalo do večjih razlik. Pri 420 nm so se vrednosti gibale med 39,4 % in 41,9 %, pri 520 nm med 46,5 % in 49,5 % in pri 620 nm med 11,2 % in 12,4 %.

 Opaziti je mogoče povezavo med tonom barve in deležem rdeče barve v obliki flavilijevega kationa. Vzorci z višjo vrednostjo pri tonu barve imajo manjši delež rdeče barve.

 Antioksidativni potencial vina se je gibal med 8,4 mmol/L in 19,9 mmol/L.

 Hipoteza 1 je potrjena, saj se je pokazala močna sorazmerna povezava med vsebnostjo skupnih fenolnih snovi in antioksidativnim potencialom vina.

 Obstaja sorazmerna povezava (R² = 0,6615) med vsebnostjo alkohola in skupnih fenolnih snovi v vzorcih vina, s tem smo potrdili hipotezo 2.

(28)

6 POVZETEK

Namen diplomske naloge je bil teoretično raziskati fenolne spojine v rdečih vinih, njihove vplive na lastnosti vina, kot sta barva in okus. Poleg tega nas je zanimal tudi mehanizem antioksidativnega učinkovanja fenolnih spojin v vinih. Analize o vsebnosti skupnih fenolnih spojin, intenziteti barve, tonu barve, deležu rdečega pigmenta, deležu rdeče barve pri posameznih valovnih dolžinah in antioksidativnem potencialu vina smo izvedli praktično, ter poskušali obrazložiti razloge za dobljene meritve.

Fenolne spojne delimo na flavonoide (antocianini, flavonoli in flavan-3-oli) in ne-flavonoide (stilbeni in fenolne kisline). Njihova sinteza najpogosteje poteka prek aminokisline fenilalanin.

Antocianini so snovi zaradi katerih sta grozdje in vino rdeče barve, vplivajo na organoleptične lastnosti vina. Flavonoli so bele do rumene barve, pomembno prispevajo k stabilizaciji barve mladih vin s procesom kopigmentacije z antocianini in imajo vlogo pri zaznavi trpkosti in grenkobe. Flavan-3-oli so monomerni falvonoidi z antioksidativnimi lastnostmi, ki jih omogoča več mehanizmov (odstranjevanje prostih radikalov, kelacija prehodnih kovin, vpliv na delovanje encimov).

Stilbeni so prisotni v grozdnih jagodah in jih povezujemo s pozitivnimi učinki v vinu, glavni stilben je resvratrol. Fenolne kisline se delijo v dve podskupini, in sicer hidroksicimetne kisline (p-kumarna kislina, kavna kislina, ferulna kislina in sinapinska kislina) ter hidroksibenzojske kisline (galna kislina, vanilinska kislina in siringinska kislina), najdemo jih v celotni grozdni jagodi.

Zaznavanje trpkosti in grenkobe v vinu povezujemo z vsebnostjo taninov, z večanjem molekulske mase trpkost narašča, grenkoba pa se zmanjšuje. Tanine razdelimo na dve skupini;

kondenziranih taninov je v vinu od vseh skupin fenolov največ, medtem ko je hidrolizabilnih taniniov manj (v vino pridejo iz lesa med zorenjem vina).

Fenolne spojine z večjim številom hidroksilnih skupin imajo višjo antioksidativno aktivnost, saj je –OH skupina dober donor vodika, tako reagira s reaktivnimi kisikovimi in dušikovimi spojinami v reakciji terminacije. Druga dva mehanizma, ki pripomoreta k antioksidativni aktivnosti, sta sposobnost kelacije kovinskih ionov in pa pogosto vstopanje fenolnih spojin v interakcije z beljakovinami (zaviranje encimov, ki imajo vlogo pri tvorbi radikalov).

Opravili smo analize šestih vzorcev rdečih vin, pridelanih različnih vinorodnih deželah Slovenije, leta 2018, sort merlot, modra frankinja in cabernet sauvignon. Potrdili smo hipotezi o povezavah med vsebnostjo skupnih fenolnih spojin in AOP, ter vsebnostjo alkohola in skupih fenolnih spojin. Pri analizah skupnih fenolnih spojin je prišlo tako do razlik med sortami, kot tudi znotraj ene sorte. Te meritve so bile v linearni povezavi z meritvijo intenzitete barve (R² = 0,8508) in določitvijo AOP (R² = 0,9376). Pri ostalih meritvah barvnih parametrov je prišlo do manjših odstopanj med posameznimi vzorci, zaradi razlik v sestavi fenolnih spojin, ki dajejo vinu različne lastnosti.

(29)

7 VIRI

Angelosante J. 2020. A guide to wine phenolics. Petaluma, GuildSomm, Inc.: 12 str.

https://www.guildsomm.com/public_content/features/articles/b/jennifer- angelosante/posts/phenolics (10. maj. 2021)

Aron P.M., Kennedy J.A. 2008. Flavan‐3‐ols: Nature, occurrence and biological activity.

Molecular Nutrition & Food Research, 52, 1: 79-104.

Babincev L.M., Gurešić D.M., Simonović R.M. 2016. Spectrophotometric characterization of red wine color from the vineyard region of Metohia. Journal of Agricultural Sciences, 61, 3: 281-290.

Banc R., Loghin F., Miere D., Ranga F., Socaciu C. 2020. Phenolic composition and antioxidant activity of red, rosé and white wines originating from Romanian grape cultivars. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 48, 2: 716-734.

Escribano-Bailón M.T., Rivas-Gonzalo J.C., García-Estévez I. 2019. Wine color evolution and stability. V: Red wine technology. Morata A. (ur.). London, Academic Press: 195-205 Flamini R., Mattivi F., Rosso M.D., Arapitsas P., Bavaresco L. 2013. Advanced knowledge of

three important classes of grape phenolics: anthocyanins, stilbenes and flavonols.

International Journal of Molecular Sciences, 14, 10: 19651-19669.

He F., He J.J., Pan Q.H., Duan C.Q. 2010. Mass‐spectrometry evidence confirming the presence of pelargonidin‐3‐O‐glucoside in the berry skins of Cabernet Sauvignon and Pinot Noir (Vitis vinifera L.). Australian Journal of Grape and Wine Research, 16, 3: 464-468.

Hornedo-Ortega R., González-Centeno M.R., Chira K., Jourdes M., Teissedre P.L. 2020.

Phenolic compounds of grapes and wines: key compounds and implications in sensory perception. V: Chemistry and biochemistry of winemaking, wine stabilization and aging.

Cosme F., Nunes F.M., Filipe-Ribeiro L. (ur.) London, IntechOpen, doi:

10.5772/intechopen.93127: 26 str.

Jordão A.M., Ricardo-da-Silva J.M. 2019. Evolution of proanthocyanidins during grape maturation, winemaking, and aging process of red wines. V: Red wine technology. Morata A. (ur.). London, Academic Press: 177-193

Košmerl T., Cigić B. 2008. Antioxidant potential and phenolic composition of white and red wines. Le Bulletin de l'OIV: Revue Technique Internationale, 81, 926/928: 251-259 Košmerl T., Kač M. 2010. Kemijske analize in postopki čiščenja vina: laboratorijske vaje pri

izbirnem predmetu Vinarstvo. Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 37-45

Ma W., Guo A., Zhang Y., Wang H., Liu Y., Li H. 2014. A review on astringency and bitterness perception of tannins in wine. Trends in Food Science & Technology, 40, 1: 6-19.

Nel A.P. 2018. Tannins and anthocyanins: From their origin to wine analysis: A review. South African Journal of Enology and Viticulture, 39, 1: 1-20.

(30)

Pereira D.M., Valentão P., Pereira J.A., Andrade P.B. 2009. Phenolics: From chemistry to biology. Molecules, 14, 6: 2202-2211

Smeriglio A., Barreca D., Bellocco E., Trombetta D. 2017. Proanthocyanidins and hydrolysable tannins: occurrence, dietary intake and pharmacological effects. British Journal of Pharmacology, 174, 11: 1244-1262.

Teixeira J., Gaspar A., Garrido E. M., Garrido J., Borges, F. 2013. Hydroxycinnamic acid antioxidants: an electrochemical overview. BioMed Research International, 2013: ID 251754, doi: 10.1155/2013/251754: 12 str.

Waterhouse A. L. 2002. Wine phenolics. Annals of the New York Academy of Sciences, 957, 1: 21-36

Zorenč Z., Košmerl T. 2020. Tehnologija vina: interno študijsko gradivo laboratorijskih vaj za študente pri predmetu Tehnologija vina. Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo.

Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 6-9

(31)

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorici prof. dr. Tatjani Košmerl za vodenje, spodbudo, vso pomoč in nasvete pri pisanju dela, za potrpežljivost in vedno hitro odzivnost.

Zahvala tudi recenzentu prof. dr. Blažu Cigiću za trud vložen v strokoven in temeljit pregled diplomske naloge.

Tehniški sodelavki Zdenki Zupančič se zahvaljujem za pomoč pri praktični izvedbi diplomskega dela.

Na koncu se zahvaljujem svoji družini in prijateljem za podporo, potrpežljivost in pomoč pri vseh letih študija.

(32)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021

PRILOGE

Priloga A: Umeritvena krivulja za določanje skupnih fenolnih spojin

Priloga B: Intenziteta barve v posameznih vzorcih vina

Priloga C: Odvisnost intenzitete barve od skupnih fenolnih spojin y = 0,001x + 0,0095

R² = 0,9998

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

0 100 200 300 400 500 600

absorbanca (= 765 nm)

koncentracija (mg galne kisline/L)

0 2 4 6 8 10 12 14

1 2 3 4 5 6

intenziteta barve

številka vzorca

y = 0,0039x + 1,0131 R² = 0,8508

0 2 4 6 8 10 12 14

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

intenziteta barve

(33)

Priloga D: Odvisnost tona barve od skupnih fenolnih snovi

Priloga E: Odvisnost tona barve (brez meritve, ki odstopa) od skupnih fenolnih snovi

Priloga F: Delež rdeče barve (prosti in vezani antocianini v obliki flavilijevga kationa; %) v posameznih vzorcih vina

y = 5E-07x + 0,8463 R² = 7E-05 0,78

0,8 0,82 0,84 0,86 0,88 0,9 0,92

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

ton barve

y = 4E-05x + 0,746 R² = 0,5816

0,79 0,8 0,81 0,82 0,83 0,84 0,85 0,86 0,87 0,88

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

ton barve

35 37 39 41 43 45 47 49 51

1 2 3 4 5 6

dAF(%)

številka vzorca

(34)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2021

Priloga G: Delež rdeče barve pri posamezni valovni dolžini pri posameznih vzorcih vina

Priloga H: Antioksidativni potencial (AOP, mmol/L) posameznih vzorcev vina 0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3 4 5 6

delež (%)

številka vzorca

rdeča barva pri 420 nm rdeča barva pri 520 nm rdeča barva pri 620 nm

0 5 10 15 20 25

1 2 3 4 5 6

AOP (mmol/L)

številka vzorca