BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Tina TERBUC
VPLIV RAZLIČNIH POSTOPKOV OBDELAVE CVETNEGA PRAHU OSMUKANCA NA
ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo
Ljubljana, 2022
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Tina TERBUC
VPLIV RAZLIČNIH POSTOPKOV OBDELAVE CVETNEGA PRAHU OSMUKANCA NA ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo
EFFECT OF DIFFERENT TREATMENTS ON ANTIOXIDANT POTENTIAL OF BEE POLLEN
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Food Science and Technology
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Živilstvo. Delo je bilo opravljeno na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani, Oddelek za živilstvo, Katedra za biokemijo in kemijo živil.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala prof. dr.
Heleno Abramovič in za recenzentko prof. dr. Tatjano Košmerl.
Mentorica: prof. dr. Helena ABRAMOVIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Recenzentka: prof. dr. Tatjana KOŠMERL
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Neža ČADEŽ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Član: prof. dr. Helena ABRAMOVIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Član: prof. dr. Tatjana KOŠMERL
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum zagovora:
Tina Terbuc
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 638.178.2:66.094.3.097.8:547.56(043)=163.6
KG cvetni prah, osmukanec, fenolne spojine, antioksidativni potencial, toplotna obdelava, sušenje, skladiščenje
AV TERBUC, Tina, dipl. inž. živ. in preh. (UN)
SA ABRAMOVIČ, Helena (mentorica), KOŠMERL, Tatjana (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2022
IN VPLIV RAZLIČNIH POSTOPKOV OBDELAVE CVETNEGA PRAHU
OSMUKANCA NA ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo) OP XI, 72 str., 7 pregl., 28 sl., 81 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V okviru magistrskega dela smo določali vsebnost skupnih fenolnih spojin, skupnih flavonoidov, posameznih skupin flavonoidov in antioksidativni potencial (AOP) cvetnega prahu osmukanca. Zanimal nas je vpliv skladiščenja, toplotne obdelave in načina sušenja cvetnega prahu ter vpliv skladiščenja etanolnih izvlečkov cvetnega prahu na omenjene parametre. Vsebnost fenolnih spojin smo določili spektrofotometrično z uporabo Folin-Ciocalteu reagenta; v svežem cvetnem prahu, ki je bil zbran leta 2019, smo določili med 5,7 in 12,4 mg galne kisline/g suhe snovi.
AOP smo določili z metodo lovljenja radikala DPPH• in O2• ter ugotovili, da preiskovani cvetni prah vsebuje dobre lovilce omenjenih radikalov. Dveletno skladiščenje cvetnega prahu (zamrznjenega pri –18 °C in posušenega pri sobni temperaturi) ne vpliva na zmanjšanje vsebnosti fenolnih spojin, vpliva pa na zmanjšanje AOP med skladiščenjem zamrznjenega cvetnega prahu. Toplotna obdelava vpliva na spremembe v vsebnosti skupnih fenolnih spojin pri nekaterih režimih obdelave. Daljši čas toplotne obdelave vpliva na zmanjšanje vsebnosti skupnih flavonoidov. Liofilizacija ne vpliva na zmanjšanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin, skupnih flavonoidov in AOP. Skladiščenje izvlečkov cvetnega prahu na svetlobi pri sobni temperaturi (tri mesece) vpliva na zmanjšanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin pri večini izvlečkov. Skladiščenje izvlečkov cvetnega prahu v hladilniku (4 8 °C; tri mesece) pri večini izvlečkov ne vpliva na zmanjšanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 638.178.2:66.094.3.097.8:547.56(043)=163.6
CX bee pollen, phenolic compounds, antioxidative potential, heat treatment, drying, storage
AU TERBUC, Tina
AA ABRAMOVIČ, Helena (supervisor), KOŠMERL, Tatjana (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2022
TI EFFECT OF DIFFERENT TREATMENTS ON ANTIOXIDANT POTENTIAL OF BEE POLLEN
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Food Science and Technology) NO XI, 72 p., 7 tab., 28 fig., 81 ref.
LA sl Al sl/en
AB The aim of this thesis was to determine total phenolic and flavonoid content, content of flavonoid subgroups, and antioxidative potential (AOP) of bee pollen. We investigated the influence of storage, heat treatment, and drying method of bee pollen, and the influence of storing bee pollen ethanolic extracts on mentioned parameters. The total phenolic content was determined spectrophotometrically using Folin-Ciocalteu reagent; between 5.7 and 12.4 mg gallic acid/g dry matter was determined in fresh bee pollen, collected in year 2019. AOP was determined by the DPPH• and O2• radical scavenging method and it was found that the investigated bee pollen contains good scavengers of these radicals. Two-year storage of bee pollen (frozen –18 °C and dried at room temperature) does not decrease total phenolic content, but it does decrease AOP of frozen bee pollen. Heat treatment affects the total phenolic content of bee pollen in some treatment regimes. Prolonged heat treatment has the effect of reducing total flavonoid content. Lyophilisation does not decrease the total phenolic content, total flavonoid content and AOP. Storing bee pollen extracts in light at room temperature for three months decreases total phenolic content in most of the extracts. Storing bee pollen extracts in a refrigerator (4 8 °C) for three months does not decrease the total phenolic content in most of the extracts.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VIII KAZALO SLIK ... IX OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... XII
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN DELA ... 1
1.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 2
2.1 CVETNI PRAH ... 2
2.1.1 Zbiranje cvetnega prahu ... 2
2.1.2 Sestava cvetnega prahu ... 3
2.1.3 Obdelava cvetnega prahu ... 5
2.1.3.1 Sušenje na soncu ... 5
2.1.3.2 Sušenje z vročim zrakom/konvekcijsko sušenje ... 5
2.1.3.3 Liofilizacija ... 6
2.1.3.4 Sušenje v vakuumu ... 6
2.1.3.5 Sušenje z mikrovalovi ... 7
2.2 FENOLNE SPOJINE ... 7
2.2.1 Flavonoidi ... 8
2.2.2 Fenolne kisline in druge fenolne spojine ... 9
2.3 OKSIDATIVNI STRES IN ROS ... 10
2.4 ANTIOKSIDATI IN AOP ... 11
3 MATERIAL IN METODE ... 14
3.1 MATERIAL IN OPIS POSTOPKA ... 14
3.1.1 Vzorci cvetnega prahu ... 14
3.1.2 Kemikalije in reagenti ... 16
3.1.3 Naprave in pribor ... 16
3.2 METODE ... 17
3.2.1 Določanje deleža vode v vzorcih cvetnega prahu ... 17
3.2.2 Vpliv temperature in časa toplotne obdelave cvetnega prahu ... 18
3.2.3 Vpliv liofilizacije kot načina sušenja cvetnega prahu ... 18
3.2.4 Ekstrakcija ... 19
3.2.5 Skladiščenje izvlečkov ... 19
3.2.6 Določanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin ... 20
3.2.7 Določanje vsebnosti skupnih flavonoidov in posameznih skupin flavonoidov ... 22
3.2.7.1 Določanje vsebnosti skupnih flavonoidov ... 22
3.2.7.2 Določanje vsebnosti skupnih flavonov in flavonolov ... 26
3.2.7.3 Določanje vsebnosti skupnih flavanonov in dihidroflavonolov ... 28
3.2.8 Določanje sposobnosti lovljenja radikala DPPH• ... 31
3.2.9 Določanje sposobnosti lovljenja radikala O2• ... 32
3.3 STATISTIČNA ANALIZA ... 34
4 REZULTATI Z RAZPRAVO ... 35
4.1 VSEBNOST SKUPNIH FENOLIH SPOJIN, FLAVONOIDOV IN AOP V SVEŽEM CVETNEM PRAHU OSMUKANCU... 35
4.1.1 Vsebnost skupnih fenolnih spojin v svežem cvetnem prahu ... 35
4.1.2 Vsebnost skupnih flavonoidov in posameznih skupin flavonoidov v svežem cvetnem prahu ... 37
4.1.3 Sposobnost lovljenja radikala DPPH• ... 40
4.1.4 Sposobnost lovljenja radikala O2• ... 42
4.2 VPLIV DVELETNEGA SKLADIŠČENJA CVETNEGA PRAHU OSMUKANCA NA VSEBNOST SKUPNIH FENOLNIH SPOJIN IN AOP ... 44
4.2.1 Vpliv dveletnega skladiščenja posušenega cvetnega prahu na vsebnost skupnih fenolnih spojin in AOP ... 44
4.2.2 Vpliv dveletnega skladiščenja zamrznjenega cvetnega prahu na vsebnost skupnih fenolnih spojin in AOP ... 47
4.3 VPLIV TEMPERATURE IN ČASA TOPLOTNE OBDELAVE CVETNEGA PRAHU NA VSEBNOST SKUPNIH FENOLNIH SPOJIN IN FLAVONOIDOV ... 49
4.4 VPLIV LIOFILIZACIJE CVETNEGA PRAHU OSMUKANCA NA VSEBNOST SKUPNIH FENOLNIH SPOJIN, FLAVONOIDOV IN AOP ... 52
4.4.1 Vpliv liofilizacije cvetnega prahu na vsebnost skupnih fenolnih spojin . 52
4.4.2 Vpliv liofilizacije cvetnega prahu na vsebnost skupnih flavonoidov ... 54
4.4.3 Vpliv liofilizacije cvetnega prahu na AOP ... 55
4.5 VPLIV SKLADIŠČENJA IZVLEČKOV CVETNEGA PRAHU OSMUKANCA NA VSEBNOST SKUPNIH FENOLNIH SPOJIN ... 57
5 SKLEPI ... 60
6 POVZETEK ... 62
7 VIRI ... 65 ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Opis vzorcev cvetnega prahu osmukanca, ki smo jih prejeli iz ČZS ... 14 Preglednica 2: Način obdelave vzorcev cvetnega prahu osmukanca ... 18 Preglednica 3: Masna koncentracija galne kisline (γ) v reakcijski zmesi in povprečne
vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 765 nm ... 20 Preglednica 4: Masna koncentracija rutina v reakcijski zmesi (γ) in povprečne
vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 510 nm ... 24 Preglednica 5: Masna koncentracija kvercetina v reakcijski zmesi (γ) in povprečne
vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 425 nm ... 26 Preglednica 6: Masna koncentracija naringenina v reakcijski zmesi (γ) in povprečne
vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 486 nm ... 29
KAZALO SLIK
Slika 1: Zbiralni proces zbiranja cvetnega prahu osmukanca (Thakur in Nanda, 2020)... 3
Slika 2: Klasifikacija in kemijska struktura nekaterih polifenolnih spojin (Aylanc in sod., 2021) ... 8
Slika 3: Svež cvetni prah osmukanec pred in po drobljenju v keramičnem terilniku ... 15
Slika 4: Eksikator z vzorci cvetnega prahu osmukanca ... 18
Slika 5: Liofilizator ... 19
Slika 6: Umeritvena krivulja I z galno kislino ... 21
Slika 7: Umeritvena krivulja II z galno kislino ... 21
Slika 8: Umeritvena krivulja I z rutinom ... 24
Slika 9: Umeritvena krivulja II z rutinom ... 24
Slika 10: Umeritvena krivulja s kvercetinom ... 27
Slika 11: Umeritvena krivulja z naringeninom ... 29
Slika 12: Vsebnost skupnih fenolnih spojin v svežem cvetnem prahu osmukancu; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 36
Slika 13: Vsebnost skupnih flavonoidov v svežem cvetnem prahu osmukancu; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 38
Slika 14: Vsebnost skupnih flavonov in flavonolov v svežem cvetnem prahu osmukancu; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 39
Slika 15: Vsebnost skupnih flavanonov in dihidroflavonolov v svežem cvetnem prahu osmukancu; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 40
Slika 16: Sposobnost lovljenja radikala DPPH• svežega cvetnega prahu osmukanca; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 41
Slika 17: Sposobnost lovljenja radikala O2• (KSA) in sposobnost lovljenja radikala DPPH• (wulovljenega DPPH•) svežega cvetnega prahu osmukanca; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 43 Slika 18: Primerjava vsebnosti skupnih fenolnih spojin v posušenem neskladiščenem
cvetnem prahu (Angelova, 2018) in posušenem cvetnem prahu skladiščenem dve leti pri sobni temperaturi v temi (D35, K35, H35 - cvetni prah posušen pri 35 °C/72 h, neskladiščen; D35S, K35S, H35S - cvetni prah posušen pri 35 °C/72 h, skladiščen; D40, K40 - cvetni prah posušen pri 40 °C/24 h, neskladiščen; D40S,
K40S - cvetni prah posušen pri 40 °C/24 h, skladiščen); različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 45 Slika 19: Primerjava sposobnosti lovljenja radikala DPPH• neskladiščenega sušenega
cvetnega prahu in sušenega cvetnega prahu skladiščenega dve leti pri sobni temperaturi v temi (D35, K35, H35 - cvetni prah posušen pri 35 °C/72 h, neskladiščen; D35S, K35S, H35S - cvetni prah posušen pri 35 °C/72 h, skladiščen;
D40, K40 - cvetni prah posušen pri 40 °C/24 h, neskladiščen; D40S, K40S - cvetni prah posušen pri 40 °C/24 h, skladiščen); različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 46 Slika 20: Primerjava vsebnosti skupnih fenolnih spojin v zamrznjenem
neskladiščenem cvetnem prahu (Angelova, 2018) in cvetnem prahu zamrznjenem skladiščenem dve leti (DZ, KZ, HZ - zamrznjen neskladiščen cvetni prah; DZS, KZS, HZS - zamrznjen skladiščen cvetni prah); različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 47 Slika 21: Primerjava sposobnosti lovljenja radikala DPPH• zamrznjenega
neskladiščenega cvetnega prahu (Angelova, 2018) in cvetnega prahu zamrznjenega skladiščenega dve leti (DZ, KZ, HZ - zamrznjen neskladiščen cvetni prah; DZS, KZS, HZS - zamrznjen skladiščen cvetni prah); različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 48 Slika 22: Vsebnost skupnih fenolnih spojin v cvetnem prahu osmukancu, ki je toplotno
obdelan pri različnih pogojih; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 49 Slika 23: Vsebnost skupnih flavonoidov v cvetnem prahu osmukancu, ki je toplotno
obdelan pri različnih pogojih; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 51 Slika 24: Vsebnost skupnih fenolnih spojin v cvetnem prahu osmukancu, sušenem z
liofilizacijo in z vročim zrakom; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 53 Slika 25: Vsebnost skupnih flavonoidov v cvetnem prahu osmukancu sušenem z
liofilizacijo in z vročim zrakom; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 54 Slika 26: Sposobnost lovljenja radikala DPPH• cvetnega prahu osmukanca sušenega z
liofilizacijo in z vročim zrakom; različne nadpisane črke pomenijo statistično značilno razliko znotraj posameznega vzorca (P<0,05) ... 56 Slika 27: Vsebnost skupnih fenolnih spojin v svežih in skladiščenih izvlečkih cvetnega
prahu letnik 2019; različne nadpisane črke znotraj posameznega vzorca pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 57
Slika 28: Vsebnost skupnih fenolnih spojin v svežih in skladiščenih izvlečkih cvetnega prahu letnik 2017; različne nadpisane črke znotraj posameznega vzorca pomenijo statistično značilno razliko (P<0,05) ... 57
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
A absorbanca
AOP antioksidativni potencial ČZS Čebelarska zveza Slovenije DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazil DPPH• 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
EC50 koncentracija fenolnih spojin, ki za 50 % zmanjša začetno vsebnost DPPH∙
FC Folin-Ciocalteu reagent GA galna kislina
KA katehin KV kvercetin
LDL lipoproteini nizke gostote (angl. low density lipoprotein) NA naringenin
NADH nikotinamid adenin dinukleotid PMS fenazin metasulfat
ROS reaktivne kisikove zvrsti (angl. reactive oxygen species) RU rutin
s.s. suha snov
sd standardna deviacija γ masna koncentracija
1 UVOD
Cvetni prah osmukanec se zbira s pomočjo smukalnikov (Kurinčič Tomšič in sod., 2008).
Ima visok bioaktivni potencial, katerega lahko v večji meri pripišemo visoki koncentraciji esencialnih aminokislin, antioksidantov (zelo pomembne so fenolne spojine), vitaminov, mineralov in drugi spojin. Zaradi protivnetnih, antibiotičnih, antialergenih, antioksidativnih in drugih pozitivnih vplivov, ki jih ima cvetni prah osmukanec na človekovo zdravje, pa ima pomembno vlogo v prehrani in pridobiva tudi veliko pozornosti kot funkcionalno živilo (Panche in sod., 2016).
Cvetni prah osmukanec vsebuje relativno velik delež vode (med 20 in 30 g/100 g), kar vpliva na manjšo stabilnost med shranjevanjem. Zato je potrebno cvetni prah osmukanec pred skladiščenjem obdelati z ustreznimi postopki oziroma ga skladiščiti pri ustreznih pogojih, ki zagotavljajo ustrezno senzorično in mikrobiološko kakovost cvetnega prahu osmukanca tudi ob koncu shranjevanja (Barajas in sod., 2012).
Sušenje je ena pomembnejših metod konzerviranja živil. Kljub temu, da je tradicionalno sušenje na soncu ena cenejših metod sušenja, pa lahko pride med takšnim sušenjem do kontaminacije cvetnega prahu z mikroorganizmi in do kontaminacije zaradi insektov in ptic.
Pride lahko do izgub in pojava neprijetnih vonjev. Zato so za obdelavo cvetnega prahu osmukanca z namenom podaljšanja obstojnosti in ohranjanja kakovosti primernejše druge metode sušenja, kot so sušenje s konvekcijskimi pečmi, vakuumsko sušenje, liofilizacija, modernejše metode sušenja z mikrovalovi in podobno (Kayacan in sod., 2018; Zuluaga- Domínguez in sod., 2018; De-Melo in sod., 2016; Castagna in sod., 2020).
Vendar pa lahko sušenje oziroma drugi postopki obdelave in skladiščenje cvetnega prahu osmukanca vplivajo na zmanjšanje vsebnosti fenolnih spojin in antioksidativnega potenciala (AOP), kar vpliva na zmanjšano prehransko vrednost.
1.1 NAMEN DELA
Namen dela je bil cvetnemu prahu osmukancu, obdelanemu oziroma skladiščenemu pri različnih pogojih, določiti vsebnost fenolnih spojin in AOP in tako določiti, kateri izmed postopkov je najprimernejši za ohranitev ustreznih oz. želenih karakteristik cvetnega prahu.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Predvidevamo, da postopki obdelave in skladiščenja cvetnega prahu osmukanca vplivajo na vsebnost fenolnih spojin in AOP.
Predvidevamo, da sušenje z zamrzovanjem povzroči manjše spremembe vsebnosti fenolnih spojin in AOP cvetnega prahu osmukanca kot konvekcijsko sušenje.
2 PREGLED OBJAV
2.1 CVETNI PRAH
Cvetni prah oz. pelod nastaja v prašnikih semenskih rastlin. Z izrazom cvetni prah pa poimenujemo tudi čebelji pridelek - to je pelod, ki se oprime dlačic na telesu čebele in je obogaten s čebeljo slino (encimi), nektarjem ali manjšo količino medu, pri čemer se oblikujejo drobne grudice (Almeida-Muradian in sod., 2005). Je proizvod, katerega se uporablja zaradi njegovih hranilnih lastnosti, fizioloških lastnosti in ugodnega učinka na zdravje ljudi. Sestavljen je iz beljakovin, sladkorjev, vlaknin, mineralnih snovi, fenolnih spojin, vitaminov in ga čebele uporabljajo kot vir hranil v vseh fazah razvoja (Campos in sod., 2008). Vsebuje esencialna hranila, ki jih potrebuje človeško telo. Ima veliko terapevtskih učinkov, kot so antioksidativno, protivnetno in protikancerogeno delovanje.
Deluje pozitivno na celjenje ran, na delovanje imunskega sistema in zaščitno za jetra (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016).
Cvetni prah vsebuje veliko spojin, ki so pomembne za normalen in zdrav razvoj organizma, za kar se lahko uporablja kot prehransko dopolnilo (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016).
Ker vsebuje vse esencialne aminokisline, ki jih potrebuje človeško telo, se ga označuje kot
‘popolno živilo’ (Pascoal in sod., 2014).
2.1.1 Zbiranje cvetnega prahu
Čebelja kolonija lahko zbere med 50 in 250 g cvetnega prahu dnevno (Komosinska-Vassev in sod., 2015). Za pridobivanje cvetnega prahu se v glavnem uporabljata dva načina:
smukanje (osmukanec) in izkopavanje (izkopanec). Prvi način zbiranja je pogostejši, poteka pa tako, da so na panj ali v notranjosti panja nameščeni smukalniki (posebne mreže), ki s čebeljih nožic osmukajo cvetni prah, ta pa se zbira v posodi za zbiranje (pod mrežami).
Drugi, redkeje uporabljen način, je zbiranje cvetnega prahu z izkopavanjem iz satja, kjer je cvetni prah že fermentiral in je obogaten z izločki čebeljih žlez (Denisow in Denisow- Pietrzyk, 2016; Kurinčič Tomšič in sod., 2008).
Slika 1: Zbiralni proces zbiranja cvetnega prahu osmukanca (Thakur in Nanda, 2020)
Hranilna vrednost in drugi parametri kakovosti cvetnega prahu se začnejo hitro po zbiranju slabšati, zato je potrebno cvetni prah pravilno shraniti in čimprej porabiti, ali pa za zagotavljanje obstojnosti ustrezno posušiti in tako zmanjšati možnost za kvar (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016; Kieliszek in sod., 2018).
2.1.2 Sestava cvetnega prahu
Cvetni prah sestavljajo beljakovine (10 – 40 %), reducirajoči in nereducirajoči sladkorji (13 - 55 %), maščobe (1 - 13 %), vlaknine (0,3 – 20 %), esencialne aminokisline, minerali, bioaktivne spojine, kot so vitamini, encimi in fenolne spojine (3 – 8 %). Deleži predstavljajo masni delež v suhi snovi (w/w) (Campos in sod., 2008).
Svež cvetni prah vsebuje 20 – 30 g vode na 100 g cvetnega prahu in je posledično zelo dovzeten za mikrobno rast, zato ga je potrebno hraniti v hladilniku (5 – 10 °C). Priporočljivo je, da se za zagotavljanje boljše obstojnosti vsebnost vlage zmanjša na 5 – 8 %, takšen izdelek pa je mogoče hraniti na sobni temperaturi (Almeida-Muradian in sod., 2005; Barajas in sod., 2012).
Ogljikovi hidrati predstavljajo največji sestavni del cvetnega prahu. Na vsebnost lahko v veliki meri vplivata čebelji nektar in med, ki sama vsebujeta velike količine le teh in prideta v stik s cvetnim prahom med zbiranjem in v panju. Vsebnost pa je odvisna tudi od botaničnega izvora rastlin in nekaterih drugih dejavnikov. Cvetni prah sestavljajo monosaharidi, kot sta fruktoza in glukoza ter disaharidi, kot so saharoza, maltoza in drugi.
Poleg polisaharidov, kot je škrob, je v cvetnem prahu prisoten tudi sporopolenin (Thakur in Nanda, 2020). To je glavni sestavni del trdne zunanje stene pelodnega zrna, notranjo steno pa sestavljata celuloza in pektin (Xu in sod., 2009).
Beljakovine predstavljajo za ogljikovimi hidrati drugi največji sestavni del cvetnega prahu.
Kot so ugotovili Campos in sod. (2008) med pregledom literature, vsebuje cvetni prah med 10 in 40 % beljakovin, odvisno od botaničnega izvora in drugih dejavnikov. Cvetni prah v glavnem vsebuje vezane aminokisline. Le 1/10 skupnih beljakovin predstavljajo proste aminokisline, njihova vsebnost pa je prav tako odvisna od botaničnega izvora, obdelave in skladiščnih pogojev (Campos in sod., 2008; Domínguez-Valhondo in sod., 2011). Ena izmed glavnih aminokislin v cvetnem prahu je glutaminska kislina, pomembni pa naj bi bili tudi prolin in asparaginska kislina. Cvetni prah prav tako vsebuje visok nivo esencialnih aminokislin, kar mu viša hranilno vrednost. Glede na raziskave naj bi se med esencialnimi aminokislinami v cvetnem prahu v največjih koncentracijah pojavljali aminokislini levcin in lizin, ter tudi triptofan in nekatere druge aminokisline oz. njihovi prekurzorji (Yang in sod., 2013).
Campos in sod. (2008) navajajo vsebnost maščob v cvetnem prahu med 1 in 13 % na suho snov. Vendar pa so v okviru kasnejših raziskav v cvetnem prahu določili tudi vrednosti, ki so segale kar do 24 % (Odoux in sod., 2012). Prehranska vlaknina ima v cvetnem prahu predstavnike, kot so sporopolenin, celuloza, hemiceluloza, pektin, kaloza in lignin. Pepel predstavlja od 2,5 – 6,5 % cvetnega prahu. V njem se nahajajo kalcij, baker, krom, železo, kalij, magnezij, mangan, natrij, fosfor, cink in drugi (Thakur in Nanda, 2020).
Cvetni prah vsebuje tudi nezanemarljivo količino vitaminov. Chantarudee in sod. (2012) so v tajskem cvetnem prahu določili vsebnosti vitaminov, kot so tiamin (B1; 0,20 mg/100 g), riboflavin (B2; 0,50 mg/100 g), niacin (B3; 7,03 mg/100 g), pantonenska kislina (B5; 0,39 mg/100 g), kobalamin (B12; 1,87 μg/100 g), biotin (B7; 56,69 μg/100 g), folna kislina (B9;
54,70 μg/100 g), α-tokoferol (vitamin E; 6,21 mg/100 g) in β-karoten (provitamin A; 1530 μg/100 g).
V sodobnih časih ljudje, ki smo ozaveščeni o zdravju, radi posegamo po izdelkih z večjo hranilno vrednostjo in na tak način dopolnjujemo sodobno prehrano, ki je velikokrat nasičena s procesiranimi, visoko kaloričnimi izdelki z relativno nizko hranilno vrednostjo.
Za prehrano ljudi je pomembno, da zraven energijskih potreb zadovolji tudi potrebe po esencialnih hranilih, kar je ključno za fizični in mentalni razvoj ter zdravje (Kieliszek in sod., 2018). Zaradi svoje sestave se lahko cvetni prah uporablja kot prehransko dopolnilo in tako pomembno prispeva k dnevnemu vnosu hranil. To mu omogočata predvsem visoka vsebnost beljakovin, esencialnih aminokislin in vlaknin, saj bi bilo mogoče z vnosom 50 g cvetnega prahu v veliki meri zadovoljevati potrebe po opisanih hranilih. Z uživanjem cvetnega prahu je mogoče tudi prispevati k zadovoljevanju potreb po nekaterih esencialnih vitaminih in mineralih. Vnos cvetnega prahu je mogoče olajšati z dodajanjem le tega v običajna živila, ki jih uživamo - v mleko, smutije, jogurt, kruh, kekse, sokove in podobno (Thakur in Nanda, 2020). Vseeno pa je potrebno omeniti, da je vnos večjih količin cvetnega prahu (50 g)
dnevno precej težko izvedljiv in se priporoča zaužitje 15 g (1 žlica) cvetnega prahu dnevno (Kurinčič Tomšič in sod., 2008).
Ne glede na vse pozitivne sestavine in učinke cvetnega prahu pa je pomembno pozornost polagati tudi potencialnim negativnim učinkom uživanja cvetnega prahu, do katerih bi lahko prišlo zaradi kontaminacije cvetnega prahu z mikotoksini, pesticidi in toksičnimi kovinami ali pa zaradi alergijskih reakcij na cvetni prah (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016).
2.1.3 Obdelava cvetnega prahu
Raziskave navajajo, da je za boljšo absorpcijo v človeškem telesu cvetni prah potrebno mehansko obdelati (mletje). Pelodno zrno namreč obdaja toga in trdna zunanja plast, ki naj bi vplivala na zmanjšano uspešnost absorpcije hranilnih snovi (Choi in sod., 2016). Zraven tega, je cvetni prah zaradi visoke vsebnosti vode (20 – 30 g/100 g) zelo dovzeten za mikrobno rast in delovanje encimov. Iz tega razloga ga je potrebno hraniti pri nizkih temperaturah ali pa za zagotavljanje boljše obstojnosti primerno obdelati. Sušenje cvetnega prahu pa lahko vpliva na kakovost cvetnega prahu. Lahko namreč povzroči zmanjšanje vsebnosti določenih bioaktivnih komponent ali vpliva na druge kemijske parametre. Zato iščejo raziskovalci načine sušenja oziroma obdelave cvetnega prahu, ki bi najmanj ogrozila sestavo cvetnega prahu, hkrati pa zagotovila mikrobiološko in senzorično stabilen produkt.
V nadaljevanju podajamo nekaj izsledkov raziskav, kjer so izvedli različne načine sušenja cvetnega prahu.
2.1.3.1 Sušenje na soncu
Sušenje na soncu je tradicionalna metoda odstranjevanja vode iz cvetnega prahu, ki pa ima zaradi svoje narave določene negativne lastnosti, kot so dolgi čas sušenja, tveganje mikrobne kontaminacije, visoka dovzetnost za kontaminacijo z insekti in različnimi tujki, zahteva po veliki površini namenjeni sušenju in težek nadzor pogojev sušenja. V nasprotju s sušenjem na soncu omogočijo sušenje z vročim zrakom oz. konvekcijsko sušenje in tudi ostale modernejše metode krajši čas sušenja, imajo manjše tveganje za mikrobno kontaminacijo, omogočijo boljše higienske pogoje in lažjo ter učinkovitejšo kontrolo pogojev sušenja (Isik in sod., 2018).
2.1.3.2 Sušenje z vročim zrakom/konvekcijsko sušenje
Sušenje z vročim zrakom ima lahko negativne posledice na kakovost cvetnega prahu.
Številne študije svetujejo, da se cvetni prah suši na nižjih temperaturah, za preprečitev razgradnje termolabilnih komponent, kot so nekateri vitamini, karotenoidi, fenolne spojine in druge sestavine (Dias in sod., 2016; Barajas in sod., 2012; Almeida-Muradian in sod., 2005; Domínguez-Valhando in sod., 2011). Song in sod. (2019) so v svoji raziskavi
ugotovili, da sušenje cvetnega prahu z vročim zrakom vpliva na zmanjšanje AOP, ki se zmanjšuje z daljšim časom in višjo temperaturo sušenja.
Po drugi strani pa za učinkovitejšo odstranitev vode in preprečevanje rasti mikroorganizmov nekateri avtorji celo svetujejo, da se cvetni prah suši pri temperaturi višji od 40 °C (Zuluaga- Domínguez in sod., 2018). Zuluaga-Domínguez in sod. (2018) so za sušene vzorce cvetnega prahu določili celo večje vsebnosti skupnih fenolnih spojin in AOP v primerjavi s svežimi.
Predvidevajo, da je to posledica sproščanja fenolnih spojin in drugih spojin z antioksidativnim delovanjem iz zunanje plasti pelodnih zrn, kar pa naj bi omogočilo ravno sušenje.
Pri iskanju optimalne temperature sušenja je potrebno poiskati ravnotežje med minimalno izgubo hranilnih snovi in bioaktivnih spojin ter uspešnim omejevanjem mikrobiološkega kvara.
2.1.3.3 Liofilizacija
Liofilizacija ali sušenje z zamrzovanjem je široko uporabljena metoda sušenja. Uporablja se za sušenje izdelkov, ki so občutljivi na segrevanje oziroma na višje temperature sušenja, kot so na primer izdelki, občutljivi na oksidacijo. Proces temelji na zamrzovanju vzorca in nato dodajanju zadostne količine toplote, ki pri znižanem tlaku privede do sublimacije vode, to je direktnega prehoda iz trdnega v plinasto agregatno stanje (Bhatta in sod., 2020).
V procesu liofilizacije so ključne tri faze. Prva faza je zamrzovanje vzorca, kar običajno poteka pri temperaturah med –50 in –80 °C. Temu sledi primarno sušenje. V komori se zniža tlak in vzpostavi delni vakuum ter počasi dvigne temperatura, kar povzroči sublimacijo vode iz vzorca. V tej fazi se iz vzorca v glavnem odstrani le prosta voda. Sledi ji sekundarno sušenje, kjer se temperatura še nekoliko dvigne ali dodatno zniža tlak in tako iz vzorca odstrani še vezano vodo (Bhatta in sod., 2020).
Večina rezultatov raziskav kaže na to, da liofilizacija cvetnega prahu vpliva na večje vsebnosti skupnih fenolnih spojin, skupnih flavonoidov in AOP v primerjavi s sušenjem cvetnega prahu z vročim zrakom (Kanar in Mazi, 2019; Dias in sod., 2016; Keskin in Özkök., 2020), vseeno pa rezultati nekaterih raziskav temu nasprotujejo (Cinkmanis in sod., 2017).
2.1.3.4 Sušenje v vakuumu
Sušenje v vakuumu je pogosto uporabljena metoda, ki se uporablja za produkte, občutljive na toploto, saj višje temperature vplivajo na kakovost teh produktov (barva, struktura, hranilna vrednost). Krajši čas sušenja, nižje temperature in odsotnost kisika lahko
omogočijo, da ima končni izdelek boljše karakteristike in večjo hranilno vrednost (Kayacan in sod., 2018).
Raziskave kažejo, da lahko sušenje v vakuumu (določeni režimi) vpliva tako, da so določene lastnosti cvetnega prahu boljše (večja vsebnost skupnih fenolnih spojin) v primerjavi s sušenjem z vročim zrakom. Po mnenju nekaterih avtorjev pa so najverjetneje druge metode (mikrovalovi, liofilizacija) primernejše (Kayacan in sod., 2018; Kanar in Mazi, 2019).
2.1.3.5 Sušenje z mikrovalovi
Določene raziskave, kjer so za način sušenja cvetnega prahu izbrali sušenje z mikrovalovi, so pokazale zelo dobre rezultate. Ugotovili so, da sušenje z mikrovalovi v večini primerov vpliva na večje vsebnosti skupnih fenolnih spojin v primerjavi s sušenjem z vročim zrakom (Kanar in Mazi, 2019). V nekaterih primerih pa so vsebnosti lahko celo večje od svežih vzorcev cvetnega prahu (Castagna in sod., 2020). Za sušenje cvetnega prahu se lahko uporablja tudi različne kombinirane tehnike, kot je na primer sušenje v vakuumu z mikrovalovi (Kanar in Mazi, 2019).
2.2 FENOLNE SPOJINE
Fenolne spojine so sekundarni metaboliti rastlin in so zelo razširjene, trenutno je identificiranih več kot 8000 fenolnih spojin. Rastline uporabljajo fenolne spojine v različne namene, kot so rast in razvoj, zaščita rastline pred zunanjimi dejavniki, kot barvne pigmente, aromatične spojine in drugo (Samanta in sod., 2011; Panche in sod., 2016). Prehranski vir fenolnih spojin predstavljajo sadje, zelenjava, kakav, nekatere pijače, kot so kava, čaj, pivo in podobno (Shahidi in Ambigaipalan, 2015). Kemijska struktura fenolnih spojin vključuje aromatski obroč (enega ali več) z eno ali več hidroksilnimi skupinami. So različnih struktur, od tistih z nizko molekulsko maso do kompleksnejših, z visoko molekulsko maso. Kot je prikazano na sliki 2, jih lahko razdelimo v flavonoide, fenolne kisline in druge fenolne spojine, kot so stilbeni (resveratrol) in lignani (Aylanc in sod., 2021).
Slika 2: Klasifikacija in kemijska struktura nekaterih polifenolnih spojin (Aylanc in sod., 2021)
2.2.1 Flavonoidi
Flavonoidi spadajo v skupino fenolnih spojin z nizko molekulsko maso in so široko razširjeni v kraljestvu rastlin. Imajo številne pozitivne biokemijske in antioksidativne učinke, povezane s preprečevanjem različnih bolezni, kot so rak, Alzheimerjeva bolezen, ateroskleroza in podobno. Povezuje se jih s številnimi pozitivnimi učinki na zdravje ljudi, zato so nepogrešljiva komponenta v številnih nutracevtskih, farmacevtskih, medicinskih in kozmetičnih izdelkih. Temu naj bi bilo tako zaradi njihovih antioksidativnih, protivnetnih, antimutagenih in protikancerogenih lastnosti. Prav tako so znani po svoji funkciji inhibicije številnih encimov, kot so ksantin oksidaza, ciklooksigenaza in lipoksigenaza (Vaya in sod., 2003; Panche in sod., 2016).
Flavonoide je mogoče razdeliti v podskupine: flavone, flavonole, flavanone, antocianidine, flavanole (katehin), halkone, izoflavone in neoflavonoide (Kocot in sod., 2018).
Skoraj vse skupine flavonoidov imajo sposobnost antioksidativnega delovanja. Glede na raziskave naj bi bili pri zaščiti telesa pred reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) med bolj močnimi flavoni in katehini. Celice v telesu so v neprestani nevarnosti pred prostimi radikali oz. ROS, ki se tvorijo ob celičnem dihanju ali zaradi različnih zunanjih dejavnikov (Panche in sod., 2016). Mehanizmi in zaporedje dogodkov, po katerih se prosti radikali vključujejo v celične funkcije, še ni popolnoma razumljeno. Med pomembnejše reakcije naj bi spadala lipidna peroksidacija, ki poškoduje lipidno membrano. Poškodbe vodijo v spremembo osmotskega tlaka in posledično do celične smrti. Za zaščito pred ROS so živi organizmi
razvili številne mehanizme (endogena antioksidativna zaščita telesa), vendar pa zvišana proizvodnja ROS med poškodbami vodi do porabe oziroma izčrpanja teh endogenih lovilcev (Sharma, 2014).
Flavonoidi lahko preprečijo poškodbe, ki jih povzročajo prosti radikali na več različnih načinov, eden od teh je direktno lovljenje prostih radikalov. Flavonoidi reagirajo s prostimi radikali, ti pa s tem postanejo manj reaktivni (Hanasaki in sod, 1994). Hanasaki in sod.
(1994) so ugotovili, da imajo flavonoidi, kot sta epikatehin in rutin, močno antiradikalsko učinkovitost in da je le-ta verjetno posledica inhibitorne aktivnosti na encim ksantin oksidaza. Vaya in sod. (2003) so poročali, da lahko flavonoidi z lovljenjem prostih radikalov preprečijo oksidacijo lipoproteinov nizke gostote, to je delcev LDL (low density lipoprotein;
in vitro). Zaščitili naj bi delce LDL in imeli tako preventivno vlogo pri aterosklerozi.
Mnoge študije kažejo na negativno povezavo med incidenco srčno-žilnih bolezni in kapi ter vnosom flavonoidov, predvsem kvercetina, s prehrano (Hertog in sod., 1993).
In vitro študije so pokazale, da imajo številni flavonoidi sposobnost inhibicije acetilholin esteraze (AChE) in butirilholinesteraze (BChE). Acetilholinesteraza je glavni encim v centralnem živčnem sistemu. Inhibicija le-tega vodi do povišanja nivojev acetilholina, kar je ena od terapij oziroma načinov simptomatskega blaženja pri Alzheimerjevi bolezni (Khan in sod., 2009; Imran in sod., 2020).
Kot že prej omenjeno, so flavonoidi glavna skupina fenolnih spojin v cvetnem prahu.
Prevladujoča podskupina so flavonoli, predvsem derivati kamferola, kvercetina, izoramnetina in miricetina. Pogosto so prisotni tudi flavoni, predvsem derivati apigenina in luteolina (Anjos in sod., 2019; Kostić in sod., 2019).
Flavonoidi cvetnega prahu imajo različne farmakološke in medicinske vloge, kot so antioksidativna aktivnost, aktivacija encimov, ekspresija genov, hormonska regulacija, protimikrobno delovanje, protikancerogeno in protidiabetično delovanje (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016; Kieliszek in sod., 2018), vendar je njihova učinkovitost v preprečevanju bolezni močno odvisna od stopnje biološke dostopnosti in asimilacije prebavnega sistema ljudi (Crozier in sod., 2010).
2.2.2 Fenolne kisline in druge fenolne spojine
Glavne neflavonoidne spojine, ki so pomembne v prehrani ljudi, so fenolne kisline. Le-te lahko v grobem razdelimo v dva tipa – derivate benzojske in derivate cimetne kisline. Med hidroksibenzojskimi kislinami je pomembnejša galna kislina. V hrani se v večjih količinah nahaja v rdečem vinu in zelenem čaju. Najbolj pogoste hidroksicimetne kisline so p- kumarna, kavna, ferulna in sinapinska kislina. Pojavljajo se kot konjugati z vinsko in kina
kislino (klorogenske kisline). Manj pogosto se v hrani nahajajo derivati fenilvalerianske kisline, fenilmlečne kisline in fenilpropionske kisline. Te spojine so metaboliti črevesne mikrobiote številnih prehranskih polifenolov in se zlahka absorbirajo. Zato bi lahko igrali pomembno vlogo pri nekaterih bioloških učinkih, povezanih s polifenolnimi spojinami bogato dieto (Crozier in sod., 2009).
Med neflavonoidne fenolne spojine spadajo tudi stilbeni, predstavnik katerih je resveratrol.
Nahaja se predvsem v rdečem vinu, arašidih, v manjših količinah pa tudi v jagodičevju in nekaterih drugih živilih (Crozier in sod., 2009).
Pomembnejše fenolne kisline v cvetnem prahu so galna kislina, vanilinska kislina, protokatehujska kislina, kavna kislina, fenetilni ester kavne kisline in druge (Thakur in Nanda, 2020).
2.3 OKSIDATIVNI STRES IN ROS
Oksidativni stres je definiran kot neravnovesje med proizvodnjo in akumulacijo ROS. Je posledica neravnovesja med njihovo proizvodnjo in odstranjevanjem s strani antioksidativnih molekul v celicah in tkivih. Številne študije nakazujejo, da lahko oksidativni stres privede do različnih bolezni, kot so visok krvni tlak, kardiomiopatija, gastrointestinalne motnje, cerebralna ali srčna ishemija, ateroskleroza ali rak (Pizzino in sod., 2017).
ROS se tvorijo med številnimi oksidativnimi procesi, vključno z aerobnim metabolizmom, metabolizmom arahidonske kisline, aktivnostjo NADPH oksidaz, ksantin oksidaz in drugimi fiziološkimi ali patološkimi pogoji (Cho in sod., 2011).
Med ROS uvrščamo proste radikale, kot so (Rao in sod., 2011):
superoksidni anionski radikal (O2•),
hidroksilni radikal (•OH),
peroksilni radikal (RO2•),
alkoksilni radikal (RO•),
hidroperoksilni radikal (HOO•) in neradikalne molekule, kot so:
vodikov peroksid (H2O2)
hipoklorna kislina (HOCl),
ozon (O3),
singletni kisik (1O2),
peroksinitrit (ONOO-).
Do oksidativnega stresa pride zaradi zmanjšanja bioloških sistemov za razstrupitev oziroma deaktivacijo teh reaktivnih zvrsti (Pizzino in sod., 2017).
Superoksidni anionski radikal nastane s pomočjo delovanja NADPH oksidaze, ksantin oksidaze in peroksidaze. Pomembno vlogo ima pri iniciaciji oksidacijskih reakcij, povezanih s staranjem (Valko in sod., 2007). Vključen je v reakcije, v katerih se tvorijo druge ROS, kot so vodikov peroksid, hidroksilni radikal, peroksinitrit, hipoklorna kislina in singletni kislik.
Vključuje se v reakcije s kovinskimi ioni, kar privede do tvorbe vodikovega peroksida. V reakcijah med vodikovim peroksidom z železovimi in bakrovimi ioni (Fe2+ in Cu+) nastane hidroksilni radikal (Fentonova reakcija), ki je najbolj reaktiven prosti radikal in vivo.
Hidroksilni radikal lahko nastane tudi z direktno reakcijo med superoksidnim anionskim radikalom in vodikovim peroksidom, vendar je reakcija hitrejša ob prisotnosti kovinskih ionov. Nastale reaktivne kisikove spojine inicirajo oksidativne poškodbe DNK, maščob in beljakovin (Pizzino in sod., 2017).
Prosti radikali so zvrsti z nesparjenim elektronom v orbitali, kar jih dela nestabilne in zelo reaktivne. Za zagotovitev stabilnosti prejmejo elektron drugih spojin v okolju, zaradi česar postanejo prizadete spojine same prosti radikali. Nastale spojine tako inicirajo reakcije, ki vodijo v poškodbe celic (Rao in sod, 2011).
Presežek ROS oziroma prostih radikalov v telesu (posledica oksidativnega stresa) reagira oz. “napade” vitalne celične komponente, kot so koencimi, nevrotransmiterji in makromolekule (nukleinske kisline, beljakovine, maščobe in ogljikovi hidrati). Pri tem jih poškoduje, kar lahko privede do celične smrti. Mitohondrijska DNK je dovzetna za napade ROS. Poškodbe mitohondrijske DNK lahko privedejo do mutacij v genomih, kar lahko vodi v razvoj različnih bolezni in poveča resnost obstoječih bolezni (Campos in sod., 2003; Guo in sod., 2013).
Celični sistem za lovljenje prostih radikalov, katerega sestavni del so antioksidativni encimi, nevtralizira proste radikale in tako prepreči poškodbe. Ker pa imajo celice v telesu omejeno kapaciteto za lovljenje prostih radikalov (Campos in sod., 2003; Guo in sod., 2013), je pomembno, da se primanjkljaj nadoknadi z vključevanjem eksogenih antioksidantov v telo preko prehrane in se tako poveča zaščita telesa.
2.4 ANTIOKSIDATI IN AOP
Antioksidanti preprečijo oksidativne poškodbe na različne načine: z odstranitvijo kovinskih ionov, s preprečevanjem tvorbe aktivnih spojin, s pretvorbami in deaktivacijo ROS oz.
prostih radikalov ali z deaktivacijo prooksidativnih encimov. Pri tem gre za prekinjanje verižnih reakcij in popravljanje poškodb celic, ki nastanejo zaradi delovanja prostih radikalov (Rao in sod., 2011; Aguilar in sod., 2016). Glede na njihovo aktivnost se delijo na
dva tipa, encimske in neencimske. Deli pa se jih tudi glede na izvor, na endogene, katere proizvede telo in eksogene, katere v telo vnašamo s prehrano (Rao in sod., 2011).
Endogeni antioksidanti vključujejo encimske antioksidante, kot so superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza, tioredoksin reduktaza, peroksiredoksin, glutation-s- transferaza, glutation reduktaza in neencimske antioksidante, kot so albumin, bilirubin, glutation, sečna kislina, melatonin, poliamin in beljakovine, ki vežejo kovinske ione (ceruloplazmin, transferin). Eksogene antioksidante je v telo mogoče dobiti s prehrano.
Čeprav je najboljše v telo dobiti antioksidante s prehrano, bogato s sadjem, zelenjavo in drugimi bogatimi živili, pa je vedno bolj popularno vključevanje prehranskih dopolnil, ki te vsebujejo (Aguilar in sod., 2016; Rao in sod., 2011).
Čebelji cvetni prah velja za potencialni naravni vir antioksidantov zaradi visoke antioksidativne aktivnosti njegovih učinkovin/sestavin, zlasti fenolnih spojin in karotenoidov. Fenolne spojine preprečujejo poškodbe DNK in tkivne poškodbe, povezane z oksidativnim stresom, ki bi nastale zaradi različnih dejavnikov (Kocot in sod., 2018; Panche in sod., 2016). Lahko imajo učinek na AOP, izražanje genov, encime za metabolizem drog, imajo fitoestrogeni potencial in kažejo zaščitne učinke proti okoljskemu onesnaževalu dioksinu (Šarić in sod., 2009). Delujejo kot antioksidanti z direktno pretvorbo prostih radikalov, z interakcijo z encimi ali z vezavo kovinskih ionov v komplekse. Pretvorba (oz.
deaktivacija, stabilizacija) prostih radikalov je posledica oddaje elektrona prostemu radikalu (Fatrcova-Šramkova in sod., 2016).
Antioksidativna aktivnost cvetnega prahu je v glavnem povezana z vsebnostjo fenolnih kislin (galna, vanilinska, protokatehujska, kavna, fenetilni ester kavne kisline), flavonoidov (kvercetin, rutin, pinocembrin, apigenin, krizin, galangin, kamferol, izoramnetin) in drugih spojin, kot so karotenoidi, vitamin C in vitamin E (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016;
Bonvehi in sod., 2001). Te spojine vplivajo na izgled, barvo in okus cvetnega prahu (Zuluaga in sod., 2015).
Karotenoidi so naravno prisotni pigmenti, odgovorni za rumeno, oranžno in rdečo barvo v rastlinah, algah in fotosintetizirajočih bakterijah. Proste radikale lovijo na različne načine, kot so prenos elektronov in reakcije adicije in eliminacije vodika (Mãrgãoan in sod., 2014;
Fatrcova-Šramkova in sod., 2016).
Antioksidativna aktivnost cvetnega prahu je odvisna od njegove kemijske sestave, ki lahko variira zaradi različnih dejavnikov, kot so botanični izvor, geografski izvor, vremenske razmere, sezona in entomološki izvor. Na kemijsko sestavo lahko vplivajo tudi čebelarji med čiščenjem, dehidracijo, pakiranjem in drugimi postopki obdelave cvetnega prahu, z namenom podaljšanja obstojnosti in odstranitve tujkov (Campos in sod., 2008; Almeida- Muradian in sod., 2005).
Raziskave so pokazale, da imajo sestavine cvetnega prahu sposobnost lovljenja prostih radikalov in zavirajoč učinek na lipidno peroksidacijo. Številne metode za ocenjevanje AOP cvetnega prahu temeljijo ravno na mehanizmih oziroma sistemih antioksidativne zaščite, kot je odstranjevanje ali inhibicija prostih radikalov ali kelacija kovinskih ionov (Aličić in sod., 2014; Leja in sod., 2007). Ker je AOP cvetnega prahu odvisen od njegove sestave, pa raziskave cvetnega prahu različnega geografskega in botaničnega izvora velikokrat dajejo precej različne rezultate vrednosti AOP. Rezultati se velikokrat razlikujejo tudi glede na uporabljeno metodo določanja (Kocot in sod., 2018; Leja in sod., 2007; Saral in sod., 2019).
3 MATERIAL IN METODE
3.1 MATERIAL IN OPIS POSTOPKA 3.1.1 Vzorci cvetnega prahu
V raziskavi smo uporabili cvetni prah osmukanec (svež, posušen/skladiščen, zamrznjen/
skladiščen), ki smo ga dobili iz Čebelarske zveze Slovenije (ČZS) in je bil zbran na različnih geografskih območjih po Sloveniji. Svež cvetni prah so zbrali spomladi leta 2019 in leta 2020. Vzorce posušenega/skladiščenega cvetnega prahu so zbrali leta 2017, posušili pri 35 °C/72 h ali pri 40 °C/24 h ter dve leti hranili pri sobni temperaturi v temi.
Zamrznjen/skladiščen cvetni prah so zbrali leta 2017 in hranili dve leti v zamrzovalniku pri –18 °C. Podrobneje vzorce opisuje preglednica 1.
Preglednica 1: Opis vzorcev cvetnega prahu osmukanca, ki smo jih prejeli iz ČZS
Št. Oznaka vzorca Opis vzorca Čas zbiranja (leto, obdobje), geografsko območje
1 CP7 svež 2019, pomlad, osrednja Slovenija
2 CP8 svež 2019, pomlad, Gorenjska
3 CP9 svež 2019, pomlad, Gorenjska
4 CP10 svež 2019, pomlad, Zasavje
5 CP11 svež 2019, pomlad, jugovzhodna Slovenija
6 CP12 svež 2019, pomlad, Primorska
7 CPA svež 2020
8 CPB svež 2020
9 CPC svež 2020
10 D40S posušen pri 40 °C, skladiščen 2017 11 K40S posušen pri 40 °C, skladiščen 2017 12 D35S posušen pri 35 °C, skladiščen 2017 13 K35S posušen pri 35 °C, skladiščen 2017 14 H35S posušen pri 35 °C, skladiščen 2017
15 DZS zamrznjen skladiščen 2017
16 KZS zamrznjen skladiščen 2017
17 HZS zamrznjen skladiščen 2017
Slika 3: Svež cvetni prah osmukanec pred in po drobljenju v keramičnem terilniku
Cvetni prah smo zdrobili v keramičnem terilniku. Na sliki 3 lahko vidimo svež cvetni prah osmukanec pred (je v obliki majhnih grudic) in po drobljenju v keramičnem terilniku.
Iz vseh vzorcev cvetnega prahu smo pripravili izvlečke in določili vsebnost skupnih fenolnih spojin, skupnih in posameznih skupin flavonoidov ter AOP.
Vzorce D40S, K40S, D35S, K35S, H35S, DZS, KZS in HZS smo analizirali z namenom preveriti vpliv dveletnega skladiščenja cvetnega prahu (posušenega pri sobni temperaturi oz.
zamrznjenega pri –18 °C) na omenjene parametre.
Vpliv temperature in časa toplotne obdelave cvetnega prahu na omenjene parametre smo opravili na vzorcih CP8, CP10 in CP11.
Vpliv liofilizacije kot načina sušenja cvetnega prahu in primerjavo s sušenjem v konvekcijskem sušilniku na omenjene parametre smo opravili na vzorcih CPA, CPB in CPC.
Izvlečke, ki smo jih pripravili iz cvetnega prahu, smo skladiščili pri različnih pogojih in določili vpliv pogojev skladiščenja izvlečkov na vsebnost skupnih fenolnih spojin.
3.1.2 Kemikalije in reagenti
Za analize smo uporabili naslednje kemikalije:
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH•) reagent (Sigma, Nemčija)
2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH) reagent (97%, Aldrich, Avstrija)
aluminijev triklorid (AlCl3) (Sigma, Nemčija)
etanol (96 %, Honeywell Riedel-de Haën, Nemčija)
fenazin metasulfat (PMS) (Sigma, Nemčija)
Folin-Ciocalteu reagent (Sigma, Švica)
galna kislina (monohidrat; C7H6O5·H2O) (Sigma, Nemčija)
kalijev dihidrogenfosfat (KH2PO4) (Merck, Nemčija)
kalijev hidroksid (KOH) (Sigma, Švica)
kvercetin (Sigma, Nemčija)
metanol (Merck, Nemčija)
naringenin (Sigma, Nemčija)
natrijev hidrogen fosfat (Na2HPO4) (Merck, Nemčija)
natrijev hidroksid (NaOH) (Merck, Nemčija)
natrijev karbonat (Na2CO3) (Merck, Nemčija)
natrijev nitrit (NaNO2) (Alkaloid, Makedonija)
nikotinamid adenin dinukleotid (NADH) (Sigma, Nemčija)
nitrotetrazol modro (NBT) (Sigma, Švica)
rutin (trihidrat; C27H30O16·3H2O) (Sigma, Nemčija)
žveplova (VI) kislina (95-97 %, Merck, Nemčija) 3.1.3 Naprave in pribor
Za analizo smo uporabili naslednje naprave in pribor:
Naprave:
analitska tehtnica (Mettler Toledo AT201, Švica)
avtomatske pipete (Eppendorf, Nemčija)
centrifuga (Tehtnica Centric200, Slovenija)
centrifuga (Tehtnica Centric322A, Slovenija)
hladilnik
konvekcijski sušilnik (Memmert VO400, Nemčija)
liofilizator (CHRIST Alpha 1-2 LD plus, Nemčija)
magnetno mešalo (IKA RCT basic, Nemčija)
pH meter
stresalnik (Tehtnica VIBROMIX 314 EVT, Slovenija)
tehtnica (Mettler Toledo PB3002-5, Švica)
termoblok (Starlab, Švica)
ultrazvočna vodna kopel (Kambič WB-30 STE, Slovenija)
ultrazvočna vodna kopel (Omnilab, Nemčija)
UV-VIS spektrofotometer (Hewlett – Packard 8453, ZDA)
vrtinčnik
zamrzovalnik Pribor:
aluminijasta folija
čaše
epice (Eppendorf, Nemčija)
filter papir (Sartorius 389, z velikostjo por 125 mm)
lij
merilni valj
nastavki za pipete (Eppendorf, Nemčija)
plastična ladjica za tehtanje
plastične centrifugirke (Eppendorf, Nemčija)
plastične epruvete z navojem
plastične kivete (Brand, Nemčija)
puhalka
reagenčne steklenice
steklena palčka
steklene epruvete
štoparica
žlička za tehtanje 3.2 METODE
Vse postopke obdelave in analize smo izvajali v treh paralelkah.
3.2.1 Določanje deleža vode v vzorcih cvetnega prahu
Delež vode v vzorcih smo določali s sušenjem cvetnega prahu osmukanca do konstantne mase. Natehtali smo po 2,5 g cvetnega prahu osmukanca (na 0,001 g natančno) v steklene tehtiče in cvetni prah sušili pri 105 °C 3 h. Nato smo vzorce postavili v eksikator in hladili 30 – 45 min. Tehtiče z vzorci smo stehtali in jih ponovno postavili na 105 °C za 3 h. Postopek smo ponavljali do konstante mase. Slika 4 prikazuje eksikator z vzorci.
Slika 4: Eksikator z vzorci cvetnega prahu osmukanca
3.2.2 Vpliv temperature in časa toplotne obdelave cvetnega prahu
Uporabili smo vzorce cvetnega prahu z oznako CP8, CP10 in CP11. Zatehtali smo po 1,5 g cvetnega prahu v plastične epruvete z navojem in jih postavili v konvekcijski sušilnik pri temperaturi in za čas toplotne obdelave, kot opisuje preglednica 2. Ekstrakcijo smo izvedli največ dva dni po obdelavi.
Preglednica 2: Način obdelave vzorcev cvetnega prahu osmukanca Oznaka vzorca Način obdelave
CP8 40 °C/ 24 h, 50 °C/ 6 h, 50 °C/24 h, 70 °C/6 h in 70 °C/24 h CP10 40 °C/ 24 h, 50 °C/ 6 h, 50 °C/24 h, 70 °C/6 h in 70 °C/24 h CP11 40 °C/ 24 h, 50 °C/ 6 h, 50 °C/24 h, 70 °C/6 h in 70 °C/24 h
3.2.3 Vpliv liofilizacije kot načina sušenja cvetnega prahu
Uporabili smo vzorce cvetnega prahu z oznako CPA, CPB in CPC. Za sušenje v liofilizatorju (slika 5) smo zatehtali po 2,0 g cvetnega prahu in vzorce predhodno zamrznili pri –80 °C.
Nato smo jih postavili v liofilizator (temperatura = –50 °C, tlak < 0,1 mbar) za 22 h (do konstantnega tlaka). Liofilizacija vzorcev je potekala v liofilizatorju, ki je prikazan na sliki 5.
Za primerjavo smo izvedli še sušenje v konvekcijskem sušilniku, pri čemer smo zatehtali po 2,0 g cvetnega prahu in ga sušili pri 60 °C 24 h.
Slika 5: Liofilizator
3.2.4 Ekstrakcija
Za ekstrakcijo smo uporabili 96 % etanol. V epruvete z navojem (15 mL) smo natehtali po 3 g predhodno temperiranih vzorcev cvetnega prahu in dodali po 9 mL etanola (96 %).
Vsebino epruvet smo dobro ročno premešali. Epruvete z navojem smo postavili na stresalnik in prekrili z aluminijevo folijo. Sledilo je stresanje na stresalniku s 175 obr/min. Na vsakih 30 min smo vzorce dobro ročno premešali in postavili nazaj na stresalnik. Po 2 h stresanja smo postavili vzorce za 30 min v ultrazvočno kopel. Nato smo postavili vzorce nazaj na stresalnik za 3 h in jih ročno premešali na vsako uro. Po končani ekstrakciji smo vzorce filtrirali in filtrat centrifugirali 10 min na 4000 obratih/min. Supernatant smo odlili v nove epruvete z navojem in izvlečke shranili v hladilniku do analiz.
3.2.5 Skladiščenje izvlečkov
Vpliv skladiščenja izvlečkov cvetnega prahu osmukanca na vsebnost skupnih fenolnih spojin smo ugotavljali pri šestih izvlečkih svežega cvetnega prahu (CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP12) in pri šestih izvlečkih skladiščenega cvetnega prahu (D35S, K35S, H35S, DZS, KZS, HZS).
Po ekstrakciji cvetnega prahu smo izvlečke prelili v 2 mL epice, zamašili in prekrili s parafilmom. Epice z izvlečki smo postavili: a) na sobno temperaturo/svetloba, b) na sobno temperaturo/tema in c) v hladilnik (4 °C) za tri mesece. Po preteku treh mesecev smo v izvlečkih določali vsebnost skupnih fenolnih spojin.
3.2.6 Določanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin
Vsebnost skupnih fenolnih spojin smo določali z metodo Folin-Ciocalteu (Gutfinger, 1981).
Fenolne spojine v izvlečkih reagirajo s kompleksom fosfomolibden/fosfovolfram Folin- Ciocalteu reagenta in tvorijo modro obarvan kompleks, ki ga je mogoče kvantificirati s spektrofotometrijo.
Priprava reagentov:
Folin-Ciocalteujev reagent smo pripravili tako, da smo ga razredčili z bidestilirano vodo v volumskem razmerju 1 : 2 (Folin-Ciocalteujev reagent : bidestilirana voda).
Za pripravo 20 % (w/v) raztopine Na2CO3 smo natehtali 20 g Na2CO3 v 100 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.
Za pripravo umeritvene krivulje smo uporabili raztopino galne kisline s koncentracijo 100 mg/L. Na stekleno ladjico smo zatehtali 22,12 mg monohidrata galne kisline, kvantitativno prenesli v 200 mL bučko in do oznake dopolnili z bidestilirano vodo. V epicah smo pripravili različne razredčitve izhodne raztopine z bidestilirano vodo. Vse razredčitve so bile pripravljene v treh ponovitvah. V epice smo k ustrezno razredčeni raztopini galne kisline dodali 0,125 mL pripravljenega Folin-Ciocalteujevega reagenta in začeli meriti čas.
Po 5 min smo dodali 0,125 mL 20 % raztopine Na2CO3 in dopolnili z bidestilirano vodo do 1 mL. Nato smo vzorce centrifugirali 10 min na 13000 obr/min. Po 40 min od dodatka Folin- Ciocalteujevega reagenta smo pomerili absorbanco pri valovni dolžini 765 nm (A765) proti slepemu vzorcu (96 % etanol).
Umeritveno krivuljo z galno kislino, ki prikazuje A765 v odvisnosti od koncentracije galne kisline (γ) v reakcijski zmesi, smo pripravljali dvakrat, saj smo analize opravljali z večjim časovnim zamikom. Vrednosti A765I v preglednici 3 in na sliki 6 prikazujejo podatke za umeritveno krivuljo I, ki smo jo uporabili pri poglavjih 4.1, 4.2, 4.3 in 4.5. Vrednosti A765II v preglednici 3 in na sliki 7 prikazujejo podatke za umeritveno krivuljo II, ki smo jo uporabili pri poglavju 4.4.
Preglednica 3: Masna koncentracija galne kisline (γ) v reakcijski zmesi in povprečne vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 765 nm
γ (mg/L)
A765I ± sd A765II ± sd
2 0,2457 ± 0,040 0,2383 ± 0,001 4 0,4554 ± 0,001 0,4553 ± 0,003 6 0,6692 ± 0,014 0,6533 ± 0,004 8 0,8385 ± 0,001 0,8385 ± 0,001 10 1,0088 ± 0,002 1,0100 ± 0,003
Z linearno regresijo smo določili smerna koeficienta (k) premic. Vrednost k premice na sliki 6 je 0,1051 (R2 = 0,9919), vrednost k premice na sliki 7 je 0,1047 (R2 = 0,9942).
Slika 6: Umeritvena krivulja I z galno kislino
Slika 7: Umeritvena krivulja II z galno kislino
Za določitev vsebnosti skupnih fenolnih spojin smo temperirali izvlečke in pripravili ustrezne razredčitve v 96 % etanolu. V epice smo odpipetirali 0,200 mL ustrezno razredčenega izvlečka in nadaljevali s postopkom za določanje skupnih fenolnih spojin.
Vsebnost skupnih fenolnih spojin v cvetnem prahu smo izrazili v ekvivalentih galne kisline kot mg galne kisline na gram suhe snovi (mg GA/gs.s.). Do vrednosti smo prišli s pomočjo naslednjih zvez. Najprej smo iz A765 in smernega koeficienta premice izračunali masno koncentracijo fenolnih spojin v reakcijski zmesi:
γreakc.zmesi =A765
k ...(1)
γreakc.zmesi – masna koncentracija fenolnih spojin v reakcijski zmesi (mg/L) A765 – absorbanca pri valovni dolžini 765 nm
k – smerni koeficient premice
Nato smo izračunali masno koncentracijo fenolnih spojin v razredčenem izvlečku:
γrazred.izvleč.= γreakc.zmesi · Vreakc.zmesi
Vrazred.izvleč.
...(2)
γrazred.izvleč. – masna koncentracija fenolnih spojin v razredčenem izvlečku (mg/L) Vreakc.zmesi – volumen reakcijske zmesi (1,0 mL)
Vrazred.izvleč. – volumen razredčenega izvlečka (0,2 mL)
Iz masne koncentracije v razredčenem izvlečku in razredčitvenega faktorja smo izračunali masno koncentracijo fenolnih spojin v izvlečku in z upoštevanjem volumna celotnega izvlečka maso fenolnih spojin v izvlečku:
mv celot.izvleč. = γizvleč.· Vcelot.izvleč. ...(3)
γizvleč. – masna koncentracija fenolnih spojin v izvlečku (mg/L) mv celot.izvleč. – masa fenolnih spojin v celotnem izvlečku
Vcelot.izvleč. – volumen celotnega izvlečka pri ekstrakciji
Masa fenolnih spojin v celotnem izvlečku je enaka masi fenolnih spojin v zatehti cvetnega prahu osmukanca, zato smo maso fenolnih spojin na g cvetnega prahu izračunali iz naslednje zveze:
mna g cvetnega prahu= mv celot.izvleč.
mcv.prahu ...(4)
mna g cvetnega prahu – masa fenolnih spojin na g cvetnega prahu (mg/g) mcv.prahu – masa cvetnega prahu (g)
Nato smo s pomočjo podatka o vsebnosti vode v vzorcih cvetnega prahu izračunali maso fenolnih spojin na gram suhe snovi in jo izrazili kot ekvivalent galne kisline v mg GA/gs.s.. 3.2.7 Določanje vsebnosti skupnih flavonoidov in posameznih skupin flavonoidov 3.2.7.1 Določanje vsebnosti skupnih flavonoidov
Vsebnost skupnih flavonoidov je mogoče določati spektrofotometrično z uporabo AlCl3. Ta metoda temelji na reakciji aluminijevih ionov s flavonoidi v bazičnih pogojih. Produkti
reakcije so rdeče obarvani aluminijevo-flavonoidni kelatni kompleksi (Pękal in Pyrzynska, 2014).
Priprava reagentov:
Za pripravo 5 % (w/v) raztopine NaNO2 smo 2,50 g NaNO2 raztopili v majhnem volumnu bidestilirane vode (približno 30 mL) v čaši na magnetnem mešalu, kvantitativno prenesli v 50 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.
Za pripravo 5 % (w/v) raztopine AlCl3 smo natehtali 2,50 g AlCl3 v čašo in počasi dodajali bidestilirano vodo (približno 20 mL, v digestoriju). Nato smo raztopino kvantitativno prenesli v 50 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.
Za pripravo raztopine NaOH (1 mol/L) smo natehtali 10 g NaOH v čašo, raztopili na magnetnem mešalu, kvantitativno prelili v 250 mL bučko ter dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.
Za pripravo umeritvene krivulje za določanje vsebnosti skupnih flavonoidov smo uporabili rutin. Pripravili smo dve umeritveni krivulji, saj smo določene analize izvajali z večjim časovnim zamikom.
Prvo umeritveno krivuljo z rutinom smo pripravili z uporabo izhodne raztopine rutina s koncentracijo 0,5 mg/mL. Na ladjico smo zatehtali 5,44 mg trihidrata rutina, ga kvantitativno prenesli v 10 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom. Za drugo umeritveno krivuljo smo pripravili izhodno raztopino rutina s koncentracijo 0,96 mg/mL. Na ladjico smo zatehtali 10,45 mg trihidrata rutina, ga kvantitativno prenesli v 10 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom. Nato smo odpipetirali različne volumne izhodne raztopine in dodali 96 % etanol do skupnega volumna 0,250 mL. K 0,250 mL ustrezno razredčene raztopine rutina smo dodali 1,25 mL bidestilirane vode in 0,075 mL raztopine NaNO2 ter pustili, da reagira 5 min. Nato smo dodali 0,15 mL raztopine AlCl3. Po 6 min od dodatka zadnjega reagenta (raztopina AlCl3) smo dodali 0,5 mL raztopine NaOH in 0,775 mL bidestilirane vode (do skupnega volumna 3 mL). Po dodatku vsakega reagenta smo vzorce dobro premešali na vrtinčniku. Po 30 min od dodatka zadnjega reagenta (raztopina NaOH) smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 510 nm (A510). Slepi vzorec smo pripravili na enak način, le namesto raztopine rutina smo uporabili etanol (96 %).
Masne koncentracije rutina v reakcijski zmesi in izmerjene A510 so prikazane v preglednici 4.
Preglednica 4: Masna koncentracija rutina v reakcijski zmesi (γ) in povprečne vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 510 nm
γ (mg/L) A510I ± sd A510II ± sd 8,3 0,0977 ± 0,002 0,0992 ± 0,003 16,7 0,2047 ± 0,011 0,2011 ± 0,002 25,0 0,2983 ± 0,005 0,3060 ± 0,007 33,3 0,3997 ± 0,009 0,4167 ± 0,005 41,7 0,5146 ± 0,005 0,5279 ± 0,006
48,0 - 0,5882 ± 0,007
64,0 - 0,7793 ± 0,016
80,0 - 0,9787 ± 0,018
Slika 8 prikazuje graf A510I v odvisnosti od koncentracije rutina v reakcijski zmesi. Z linearno regresijo smo določili k premice, ki je 0,0122 (R2 = 0,9993).
Slika 8: Umeritvena krivulja I z rutinom
Slika 9 prikazuje graf A510II v odvisnosti od koncentracije rutina v reakcijski zmesi. Z linearno regresijo smo določili k premice, ki je 0,0123 (R2 = 0,9995).
Slika 9: Umeritvena krivulja II z rutinom
Za določanje vsebnosti skupnih flavonoidov smo k določenemu volumnu odpipetiranega izvlečka dodali 96 % etanol do skupnega volumna 0,250 mL. Postopek smo nadaljevali po metodi, kot je opisano pri pripravi umeritvene krivulje.
Vsebnost skupnih flavonoidov v cvetnem prahu smo izrazili v ekvivalentih rutina kot mg rutina na gram suhe snovi (mg RU/gs.s.). Do vrednosti smo prišli s pomočjo naslednjih zvez.
Najprej smo iz absorbance in smernega koeficienta premice izračunali masno koncentracijo skupnih flavonoidov v reakcijski zmesi:
γreakc.zmesi =A510
k ...(5)
γreakc.zmesi – masna koncentracija skupnih flavonoidov v reakcijski zmesi (mg/L) A510 – absorbanca pri valovni dolžini 510 nm
k – smerni koeficient premice
Nato smo po naslednji zvezi določili masno koncentracijo skupnih flavonoidov v izvlečku:
γizvleč. =γreakc.zmesi· Vreakc.zmesi
Vizvleč. ...(6)
γizvleč. – masna koncentracija skupnih flavonoidov v izvlečku (mg/L) Vreakc.zmesi – volumen reakcijske zmesi (3 mL)
Vizvleč. – volumen odpipetiranega izvlečka
Z upoštevanjem volumna celotnega izvlečka pri ekstrakciji smo izračunali maso skupnih flavonoidov v izvlečku.
mv celot.izvleč. = γizvleč.· Vcelot.izvleč. ...(7)
mv celot.izvleč. – masa skupnih flavonoidov v celotnem izvlečku Vcelot.izvleč. – volumen celotnega izvlečka pri ekstrakciji
Masa skupnih flavonoidov v celotnem izvlečku je enaka masi skupnih flavonoidov v zatehti cvetnega prahu osmukanca, zato smo maso skupnih flavonoidov na g cvetnega prahu izračunali z naslednjo zvezo:
mna g cvetnega prahu= mv celot.izvleč.
mcv.prahu ...(8)
mna g cvetnega prahu – masa skupnih flavonoidov na g cvetnega prahu (mg/g)
