VISOKOŠOLSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1.

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Evgen Kozole

Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

VISOKOŠOLSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJSKA TEHNOLOGIJA

Ekstrakcijske metode za polarne benzotriazole v trdnih okoljskih vzorcih

DIPLOMSKO DELO

Evgen Kozole

MENTORICA: prof. dr. Helena Prosen

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisani Evgen Kozole sem avtor diplomskega dela z naslovom:

Ekstrakcijske metode za polarne benzotriazole v trdnih okoljskih vzorcih.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Helene Prosen;

• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v

predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 17. 08. 2021 Podpis avtorja:

ZAHVALA

Iskreno bi se rad zahvalil svoji mentorici, prof. dr. Heleni Prosen za vso strokovno pomoč, nasvete, usmeritev pri izdelavi diplomskega dela, spodbudne besede in nenazadnje tudi čas, ki mi ga je namenila.

Zahvalil bi se tudi moji družini, ki mi je omogočila študij in me pri tem podpirala.

Del zahvale pa gre tudi Luku, ki me je tekom študija spodbujal in mi stal ob strani takrat, ko sem to najbolj potreboval. Hvala!

Ekstrakcijske metode za polarne benzotriazole v trdnih okoljskih vzorcih

Povzetek:

Zaradi nenehnega razvoja človeštva in posledično tudi industrije ter želje po tem, da bi zaščitili pridelek, objekte in transportna sredstva, smo v okolje vnesli veliko nepotrebnih in nezaželjenih snovi, ki predstavljajo potencialno tveganje za mikroorganizme, rastline, živali in nenazadnje tudi za človeka samega. V zadnjih letih se je na področju okoljske kemije začel uporabljati relativno nov pojem imenovan »nova onesnaževala« (angl.

contaminants of emerging concern), s katerim želimo izpostaviti okoljska onesnaževala, katerim do nedavnega nismo posvečali posebne pozornosti. Sem spadajo farmacevtske učinkovine, droge, pesticidi, prehranski dodatki, nanomateriali itd. Tudi polarne benzotriazole uvrščamo v skupino novih onesnaževal. Gre za organske heterociklične spojine, ki so kemijsko stabilne, dobro topne v vodi in odporne na biorazgradnjo. Njihove povišane koncentracije so največkrat zabeležili v okolici letališč, saj se uporabljajo kot antikorozivna sredstva ter v tekočinah za odstranjevanje ledu in proti zmrzovanju letala.

V svojem delu sem izpostavil nekaj ekstrakcijskih tehnik, ki jih uporabljamo za določevanje polarnih benzotriazolov v trdnih okoljskih vzorcih (tla in sedimenti). Izmed vseh se mi zdi pomembno izpostaviti zlasti tiste, ki se jih smatra za »zeleno kemijo« in ki porabijo malo energije, topila in časa. To so ekstrakcija s pomočjo mikrovalov in ultrazvoka, ekstrakcija s superkritičnimi fluidi in ekstrakcija z vročo vodo pri povišanem tlaku. Pri tem pa je potrebno upoštevati, da gre za razmeroma drage tehnološke postopke, zato njihova uporaba v praksi še ni tako razširjena, vendar lahko predvidevamo, da se bo to spremenilo zaradi tehnološkega napredka, vedno večje okoljske ozaveščenosti in strožje okoljske zakonodaje.

Ključne besede: polarni benzotriazoli, ekstrakcijske metode, tla, sedimenti

Extraction methods for polar benzotriazoles in solid environmental samples

Abstract:

Due to the constant development of humanity and consequently also industry and the desire to protect crops, facilities and means of transport, we have introduced into the environment many unnecessary and undesirable substances that pose a potential risk to microorganisms, plants, animals and last but not least to humans. In recent years, a relatively new concept called "contaminants of emerging concern" has been used in the field of environmental chemistry, with which we want to highlight environmental pollutants to which we have not paid any special attention until recently. These include pharmaceutical ingredients, drugs, pesticides, food additives, nanomaterials, etc. Polar benzotriazoles are also classified as emerging pollutants. These are organic heterocyclic compounds that are chemically stable, well soluble in water and resistant to biodegradation. Their increased concentrations were most often recorded in the vicinity of airports, as they are used as anti-corrosion agents and in liquids for removing ice and anti-freeze aircraft. In my work, I highlighted some extraction techniques we use to determine polar benzotriazoles in solid environmental samples (soil and sediments). Of all of these, I find it important to highlight in particular those that are considered “green chemistry” and that consume little energy, solvent and time. These are microwave and ultrasonic extraction, supercritical fluid extraction, and hot water extraction at elevated pressure. It should be taken into consideration that these are relatively expensive technological processes, so their use in practice is not yet widespread, but we can assume that this will change due to technological progress, increasing environmental awareness and stricter environmental legislation.

Key words: polar benzotriazoles, extraction methods, soil, sediments

Kazalo

1 Uvod in namen dela ... 1

2 Polarni benzotriazoli ... 3

3 Vnos polarnih benzotriazolov v okolje ... 5

3.1 Polarni benzotriazoli v tleh ... 5

3.2 Polarni benzotriazoli v sedimentih ... 6

3.3 Toksičnost polarnih benzotriazolov ... 6

3.4 (Bio)razgradljivost polarnih benzotriazolov ... 7

4 Ekstrakcijske metode ... 9

4.1 Ekstrakcija trdno-tekoče... 10

4.2 Ekstrakcija po Soxhletu ... 10

4.3 Ekstrakcija s pomočjo mikrovalov ... 11

4.4 Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka ... 12

4.5 Ekstrakcija s supekritičnimi fluidi ... 14

4.6 Ekstrakcija z vročo vodo pod povišanim tlakom ... 14

4.7 Ekstrakcija polarnih benzotriazolov iz trdnih vzorcev... 17

5 Analizne metode ... 19

6 Eksperimentalni del ... 21

7 Zaključek ... 25

8 Literatura ... 27

Kazalo slik

Slika 1: Struktura benzotriazola v dveh izomernih stanjih ... 3

Slika 2: Struktura benzotriazola s ponazorjeno resonančno vezjo ... 3

Slika 3: Biotransformacije BTZ pri aerobnih in anaerobnih pogojih ... 8

Slika 4: Shema ekstrakcije tekoče-tekoče ... 9

Slika 5: Soxhletov ekstraktor ... 11

Slika 6: Shematski prikaz segrevanja z mikrovalovi ... 12

Slika 7: Prikaz nastanka mehurčkov zaradi akustične kavitacije ... 13

Slika 8: Kromatogram 1H-benzotriazola (BTZ) ... 23

Kazalo tabel

Tabela 2: Koncentracija polarnih benzotriazolov v trdnih vzorcih ... 17

Tabela 3: Gradient mobilne faze za določitev polarnih benzotriazolov (A - acetonitril, B - 0,1 % HCOOH v MQ)... 21

Tabela 4: Koncentracije in ploščine vrhov za BTZ ... 22

Kazalo grafov

Seznam uporabljenih kratic

BZ benzotriazoli BTZ benzotriazol

ClBZ 5-kloro-1H-bezotriazol DMBZ 5,6-dimetil-1H-bezotriazol 4MBZ 4-metil-1H-bezotriazol 5MBZ 5-metil-1H-bezotriazol 1OHBZ 1-hidroksi-1H-benzotriazol PCB poliklorirani bifenili

PAH policiklični aromatski ogljikovodiki UV ultravijolično

IR infrardeče

NMR nuklearna magnetna resonanca

1

1 Uvod in namen dela

Živimo v času, v katerem si življenja brez industrije in njenega napredka ne znamo predstavljati. Številni tehnološki napredki so se pokazali v prometu, zdravstvu, farmaciji, kmetijstvu in nenazadnje tudi v gradbeništvu. Ker se na posameznem področju uporabljajo določeni materiali in kemikalije, nastanejo pri tem zagotovo tudi odpadki, neposredno iz njih pa okoljska onesnaževala, katerih usoda se največkrat konča v vodi ali tleh. V veliki meri lahko rečemo, da se je zavedanje o ravnanju z odpadki spremenilo, vendar še zdaleč od tega, da bi dosegli cilj, kjer ne bi nastalo skorajda nič odpadkov.

Čeprav se upoštevajo vsi predpisi in smernice za zmanjšanje onesnaženja, še vedno prihaja do nekaterih izjem, pri katerih se dovoljene koncentracije prekoračijo, posledice v okolju pa so dolgotrajne.

Težava je v tem, da so nekatere izmed teh spojin obstojne in strupene za organizme v okolju in hkrati tudi za človeka. Med problematična in najpogostejša okoljska onesnaževala prištevamo težke kovine, PCBje, PAHe, razne pesticide, antibiotike itd. V zadnjih desetletjih pa se v okolju pojavljajo tudi tako imenovana »nova onesnaževala«.

Gre za skupino onesnaževal, ki v okolje pridejo z uporabo farmacevtskih učinkovin, drog, izdelkov osebne nege, prehranskih dodatkov in novih sintetičnih pesticidov, ki se jih uporablja v kmetijstvu. Mednje prištevamo tudi benzotriazole, ki so po strukturi lahko tako polarni kot nepolarni in slednji se bioakumulirajo. Primarno se uporabljajo kot antikorozivna sredstva, UV stabilizatorji v plastičnih materialih, barvah in prevlekah [1].

Učinke in vplive so začeli raziskovati v zadnjih letih, pri čemer so ugotovili, da za človeka ne predstavljajo večjega tvaganja, so pa toksični za rastline in vodne organizme.

Namen diplomskega dela je pregled ekstrakcijskih metod za določevanje polarnih benzotriazolov, ki se nahajajo v trdnih okoljskih vzorcih (tla in razni sedimenti). V nadaljevanju sem želel preizkusiti eno izmed ekstrakcijskih metod v praksi in opraviti čiščenje ekstrakta v modelni raztopini vode. Nato pa določiti tudi posamezne spojine z metodo visokoločljivostne tekočinske kromatografije in izračunati uspešnost ekstrakcije s podanim izkoristkom, vendar zaradi epidemije Covid-19 to ni bilo možno.

2

3

2 Polarni benzotriazoli

Benzotriazoli so organske heterociklične spojine, sestavljene iz triazola, ki predstavlja petčlenski obroč s tremi dušikovimi atomi, in benzenskega obroča. Osnovna struktura benzotriazola se lahko nahaja v dveh izomernih stanjih, 1H-benzotriazol ali 2H- benzotriazol, razlog za to je struktura triazolnega obroča in pozicija vodikovega atoma. S pomočjo spektroskopije (UV in IR) in NMR so ugotovili, da je pri sobni temperaturi pogostejša oblika prvega izomera (slika 1).

Slika 1: Struktura benzotriazola v dveh izomernih stanjih

Dokazali so tudi, da je lastnost vezi 1-2 ekvivalentna 2-3, ker vodikov atom ni močno vezan na strukturo in lahko stalno migrira med atomi dušika (slika 2). Ker se vodik obnaša na tak način, bi lahko stukturo ponazorili z resonančno vezjo. Zaradi svoje strukture lahko torej osnovna molekula benzotriazola deluje kot šibka kislina s tem, da odda proton, ali pa kot baza, tako da elektronski par na dušiku sprejme proton [2].

Slika 2: Struktura benzotriazola s ponazorjeno resonančno vezjo

Proizvodnja in komercialna uporaba benzotrizolov se je začela leta 1950 v ZDA, kjer so jih primarno uporabljali kot inhibitorje korozije in v toplotno-izmenjevalnih raztopinah.

Dodajali so jih tudi v razne tekočine in premaze v različnih koncetracijskih območjih, na primer 0,01-0,2 % v hladilnih sistemih atomobilov, v hidravličnih in zavornih tekočinah, antifrizu in tekočinah za odstranjevanje ledu na površinah letališča, kjer točne koncentracije niso bile znane, predvidevajo pa, da bi lahko bile nekaj 10 % [3, 4].

4 Ker ima osnovni benzotriazol in njegovi polarni derivati (na benzen vezana metilna, hidroksilna ali kloridna skupina) antikorozivne lastnosti, jih dandanes lahko najdemo praktično v vsakem gospodinjstvu, saj so prisotni v tabletah za pomivalni stroj, detergentih, praških za pranje perila, belilnih sredstvih itd. Mnoge klorirane benzotriazole (npr. 5-kloro-1H-benzotriazol) lahko največkrat zasledimo v proizvodnji plastike in polimernih materialov, kjer jih uporabljajo kot UV stabilizator. V enem izmed virov je bilo omenjeno, da ga dodajajo pri izdelavi polietilen teraftalata (PET) [5, 6]. Uporabljajo pa se lahko tudi kot biocidi (fungicidi, algicidi, herbicidi) v papirni in usnjarski industriji [7]. Zaradi širokega razpona uporabe se je njihova proizvodnja in uporaba od samega začetka močno povečala. V ZDA so zabeležili, da je bilo leta 2012 proizvedeno 850 ton benzotriazolov, v Avstraliji pa okrog 100 ton na leto [6].

Tabela 1: Lastnosti značilnih polarnih bezotriazolov in njihove strukture [1]

Ime spojine Struktura Molska

masa [g/mol]

pKa logKow topnost

1H-benzotriazol 119,12 8,38 1,44 21

5-kloro-1H-benzotriazol (ClBZ)

153,57 7,46 2,13 5,8

4-metil-1H-benzotriazol (4MBZ)

133,15 8,74 1,82 11

5-metil-1H-benzotriazol (5MBZ)

133,15 8,74 1,98 9,5

5,6-dimetil-1H- benzotriazol (DMBZ)

147,18 8,92 2,28 5,3

1-hidroksi-1H-benzotriazol (1OHBZ)

135,12 7,25 0,80 73

5

3 Vnos polarnih benzotriazolov v okolje

Največjo uporabo polarnih benzotriazolov pripisujemo temu, da se jih uporablja kot antikorozivna sredstva. Primarni onesnaževalci okolja so v veliki meri raztopine, ki se jih uporablja na letališčih, kjer služijo za zaščito letal in za odstranjevanje ledu. Težave se kažejo v tem, da odpadna količina uporabljene raztopine neustrezno odteka po kanalih, kjer se zbira z ostalo meteorno vodo ali pa enostavno pronica skozi tla in se nabira v okolju. Glede na študijo iz leta 1995 naj bi se kar 80 % raztopine deponiralo na tla med samim škropljenjem in vzletom letala [3]. Opravili so tudi analizo na več letališčih, kjer so v Zürichu (Švica) zabeležili koncentracijo BTZ okrog 240 µg/g, v Milwaukee (ZDA) je bila koncentracija 5MBZ 1130 µg/g, presenetljivo nizko koncentracijo BTZ pa so izmerili v Frankfurtu (Nemčija), ki je znašala med 0,536 µg/g in 1,425 µg/g [6].

Letališča niso edini vir benzotriazolov, ki jih vnesemo v okolje. Drugi najpogostejši vir je onesnaževanje vode z uporabo detergentov, raznih praškov in tablet za pomivalne stroje, katerim so dodani polarni benzotriazoli. Na zahodu Avstralije so v detergentu našli prisotnost BTZ v koncetraciji 4600 ng/L in 2600 ng/L 5MBZ. Prisotnost istih analitov so zaznali tudi v Veliki Britaniji, kjer naj bi tablete in praški za pomivalni stroj vsebovale 1,45 mg BTZ in 28,6 mg 5MBZ. Podobne koncentracije benzotriazolov v tabletah so našli tudi v Nemčiji, kjer so ugotovili, da se pri sami uporabi več kot 99 % benzotriazolov spere v odpadno komunalno vodo [8]. Eden od presenetljivih podatkov je tudi to, da so nekaj let nazaj odkrili prisotnost BTZ tudi v nekaterih vzorcih oblačil. Na Švedskem so v kosih oblačil izmerili srednjo vrednost BTZ in 5MBZ, ki sta znašali 3000 ng/g in 17,1 ng/g [6].

Iz zgoraj ugotovljenih podatkov lahko torej vidimo, da je glavni vir onesnaženja odpadna voda, preko katere se neposredno benzotriazoli nalagajo v tleh in sedimentih. Kljub naprednim tehnološkim postopkom in inovativnim načinom, s katerimi bi lahko odstranili organska polarna onesnaževala, so v okolju še vedno prisotna v manjših količinah. Da do vnosa v okolje ne bi več prihajalo, bi bilo potrebno zmanjšati porabo benzotriazolov, izboljšati tehnološke postopke odstranjevanja le-teh ali pa najti alternativne spojine z istimi lastnostmni, ki so prijazne okolju in organizmom.

3.1 Polarni benzotriazoli v tleh

V tla se benzotriazol in njegovi polarni derivati prenašajo preko onesnažene vode, lahko pa tudi preko uporabe aktivnega blata iz čistilnih naprav, ki služi kot gnojilo [1].

Koncentracije benzotriazolov v tleh so si med posameznimi mesti vzorčenja precej različne. Kjub temu, da imajo lastnost, da migrirajo, so njihove koncentracije majhne in skorajda zanemarljive, zato jih praksi težko potrdimo. Njihovo prisotnost (BTZ in metilirani derivati) so določili v Italiji v Lombardiji blizu industrijske cone, kjer so bile

6 koncentracije nekaj sto ng/g, v nasprotju s kmetijskimi polji, kjer jih praktično ni bilo prisotnih [6].

3.2 Polarni benzotriazoli v sedimentih

Čeprav imajo polarni benzotriazoli polarne lastnosti, so z analizo sedimentov dokazali, da se lahko absorbirajo in nalagajo tudi v njih. Le nekaj člankov omenja koncentracije BZ v sedimentih. Visoka koncentracija benzotriazola (13000 µg/kg) je bila zabeležena leta 2002 na letališču Fornebu v Oslu. Na istim mestu so opravili še nekaj paralelk in ugotovili, da je povprečna vrednost BTZ v treh vzorcih 420 µg/kg, medtem ko v treh drugih vzorcih niso našli njihove prisotnosti [9]. Relativno visoke koncentracije so zabeležili tudi v sedimentih dveh rek v mestih Saginaw in Detroit v ZDA, kjer so koncentracije za BTZ znašale 0,424-33,4 ng/g in 1,59-165 ng/g [6].

3.3 Toksičnost polarnih benzotriazolov

V samem začetku še ni bilo znano, kakšne učinke lahko povzročajo polarni benzotriazoli, dokler ni v enem izmed poročil leta 1977 EPA (Agencija za varstvo okolja ZDA) ugotovila, da so benzotriazoli v majhni količini lahko toksični in nevarni za zdravje človeka. V istem poročilu je bilo omenjeno tudi, da sta dva derivata mutagena za bakterije. Nekaj let kasneje so ugotovili, da 1-amino benzotriazol deluje kot inhibitor citokroma P-450, ki je odgovoren za oksidacijo organskih substanc in presnovo ksenobiotikov [3].

V današnjem času se predvsem uporabljajo testi z bioluminiscentnimi bakterijami za določevanje toksičnosti polutantov, ker gre za poceni teste, ki dajejo hiter odziv.

Ugotovili so, da so derivati benzotriazolov, ki vsebujejo več metilnih skupin, npr. DMBZ, bolj toksični za bioluminiscentne baterije kot 4MBZ ali 5MBZ, saj so bile EC50 vrednosti manjše za DMBZ (EC50DMBZ = 0,72 mg/L; EC504MBZ = 21 mg/L; EC505MBZ = 4,25 mg/L).

Ker imajo benzotriazoli inhibicijske lastnosti pri mikrobni aktivnosti, je bila postavljena hipoteza, da se ustvari močna kelacija med benzotriazoli in divalentnimi kationi, kar se kaže v zmanjšani koncentraciji bakra v obdobju rasti celic [6].

Koncentracija BZ okoli 50 mg/L se lahko pri rastlinah kaže v rumenenju kličnih listov, pri še enkrat višji koncentraciji pa inhibira njihovo rast. Čeprav je koncentracijsko območje benzotriazolov v vodnem okolju nekaj µg/L, kar je nižje od kriterija EC50 ali LOAEC, je potrebna natančnejša ocena potencialnega ekološkega tveganja, da bi ugotovili fiziološki odziv organizmov, ki so izpostavljeni okoljskim koncentracijam BZ.

NOAEC za BTZ, kateremu je bil izpostavljen nevretenčar (Ciona intestinalis) po 48 h je

7 10 mg/L. 5MBZ se je izkazal za bolj toksičnega kot BTZ za dve tipični vrsti vodnih bolh (Daphnia magna in D. galeat) [6].

Ugotovili so, da je bilo okvarjenih nekaj hormonsko posredovanih procesov in genov za levitev pri transkripciji hitina za skelet. Tekom raziskovanja se je postavilo tudi vprašanje, kakšen vpliv oziroma interakcije se kažejo v prisotnosti BZ in drugih spojin. V članku sem ponovno zasledil povezavo med prisotnostjo BZ in bakra v prsti. Opisano je bilo, da naj bi BZ neposredno vplival na dostopnost bakra s tem, da se tvori BZ-Cu kompleks, ki zmanjša toksičnost Cu, na katerega so občutljivi deževniki. S tem podatkom bi se lahko dodatno potrdila zgoraj omenjena hipoteza, ki govori o tem, da se lahko tvori kelacija med benzenovim obročem in divalentnimi kationi [6].

Pri vretenčarjih so opravljali in vitro in in vivo teste, s katerimi so želeli potrditi motnje v endokrinem sistemu. S pomočjo biološkega testa YES (angl. yeast estrogenic screen) so pokazali in vitro, da ima BTZ antiestrogensko aktivnost (deluje antagonistično na estrogenski receptor). Poleg antiestrogenske aktivnosti se kaže tudi antiandrogenska aktivnost (YAS biološki test). Estrogensko aktivnost so naprej opazovali in vivo pri ribah Oryzias melastigma, ki so bile izpostavljene predpostavljeni okoljski koncentraciji benzotriazola (10 µg/L). Kljub nizki koncentraciji je bilo opaženo, da povroča BTZ mutacije v ekspresiji gena, ki je pomemben za sintezo estrogena [6, 10].

Pri nekem drugem poskusu, ki so ga izvajali 28 dni pri izpostavljnosti koncentraciji pod 5 mg/L, so bile opažene patološke spremembe jeter pri obeh spolih ribe vrste Gobiocypris rarus. Poleg tega pa so se kazale histološke okvare v spolnih žlezah, kjer so zaznali degeneracijo pri jajčecih in moten potek spermatogeneze. Dokazana je bila tudi nevrotoksičnost, saj je bila pri ribah motena in poškodovana homeostaza centralnega živčnega sistema, kjer naj bi prišlo do apoptoze možganskih celic, čeprav natančnejših mehanizmov še ni možno razložiti. Po pridobljenih eksperimentalnih podatkih naj bi BTZ v večji meri prizadeli celično respiracijo, G-proteinske kaskade, od Ca²⁺ odvisno signalizacijo, celični cikel in prej omenjeno apoptozo [11, 12].

3.4 (Bio)razgradljivost polarnih benzotriazolov

Ugotavljali so tudi, kakšna je možnost biorazgradnje polarnih benzotriazolov s pomočjo mikroorganizmov. V splošnem so ugotovili, da sta ClBZ in 5MBZ biorazgradljiva, medtem ko BTZ in 4MBZ kažeta odpornost proti biorazgradnji. Med glavne faktorje, ki naj bi vplivali na biorazgradnjo, prištevajo temperaturo, aklimatizacijo, hranila/nutriente in redoks potecial. Primarno naj bi bile bakterije kolonije Pseudomonadaceae najpomembnejše za biorazgradnjo 5MBZ. V eni izmed študij so naredili FISH poskus (angl. fluorescence in situ hybridization), pri katerem sta bili vključeni dve vrsti

8 organizmov Alpha- in Beta-proteobacteria, s katerima so ugotovili, da lahko razgradijo BTZ in 5MBZ [6].

Ključno vlogo pri biorazgradnji imajo hranila, saj naj bi spodbujala kapaciteto biorazgradnje mikroorganizmov. Po eni strani naj bi imela pozitivni učinek s tem, ko spodbujajo biološko aktivnost in ekspresijo encimov, preko katere potem poteka razgradnja. Po drugi strani pa lahko dodatek lahko razgradljivih organskih hranil vpliva na razgradnjo preko neprimarne metabolne poti (kometabolizem). Študija je pokazala, da lahko metan-oksidirajoče bakterije povečajo odstranitev BZ z 20 % (samo BTZ kot substrat) na 75 % (BTZ in metan kot substrat). Prav tako naj bi na biorazgradnjo vplivali aerobni in anaerobni pogoji (Slika 3). Razgradnja BTZ in 5MBZ je favorizirana pri anaerobnih pogojih, medtem ko ClBZ pri aerobnih [6].

Biološka razgradnja ni edini način razgradnje benzotriazolov, saj jih lahko razgradimo tudi s pomočjo drugih procesov, npr. fotolize [6]. Benzotriazoli so občutljivi na fotorazgradnjo, ki je odvisna od pH in sestavin matrice. Protonirana oblika naj bi bila manj občutljiva od molekularne na UV svetlobi. BZ imajo pod simulirano sončno svetlobo razpolovne dobe med 6 h in 24 h, kar v realni matrici (vodi) predstavlja dobo 2- 8 dni [1].

Slika 3: Biotransformacije BTZ pri aerobnih in anaerobnih pogojih [6]

9

4 Ekstrakcijske metode

Dandanes se še vedno srečujemo z izzivom, kako bi lahko bila opravljena kemijska analiza okolju čim bolj prijazna, količine uporabljenega topila pa bi bile majhne.

Ekstrakcija je ena izmed najenostavnješih in najpogostejših tehnik, ki se jih poslužujemo v analizni kemiji in drugod. Gre za porazdeljevanje analita med dvema fazama, kjer ekstrahiramo iz trdnih ali tekočih zmesi topne komponente z uporabo topila. Največkrat gre za ekstrakcijo trdno-tekoče ali tekoče-tekoče. Postopek temelji na razliki v topnosti analita med posameznima komponentama v zmesi. Celoten proces je sestavljen iz dveh faz, v prvem delu pride do intenzivnega stika s topilom, v drugem delu pa do ločbe. Kot topilo se največkrat uporabljata voda ali pa hlapna organska topila. Zelo pomemben postopek je tudi sama predpriprava vzorcev, še posebej kadar gre za trdne vzorce, saj moramo zagotoviti dobro homogenost, da bo lahko ekstrakcija uspešna. Ekstrakcijo tekočih vzorcev navadno izvajamo v liju ločniku (Slika 4), za trdne vzorce pa uporabljamo standardno konvencionalno ekstrakcijo po Soxhletu [13, 14].

Pri ekstrakciji moramo biti pozorni na izbiro topila, pri čemer upoštevamo osnovno načelo, da se polarno raztaplja v polarnem in nepolarno v nepolarnem. Med drugim lahko vplivamo tudi na hitrost same ekstrakcije, in sicer:

• z razliko v koncentraciji – Gre za najpomembnejši dejavnik, ki predstavlja razliko med koncentracijo ekstrahirane snovi v topilu in v matrici, iz katere snov ekstrahiramo. Večja kot je razlika, hitrejša in učinkovitejša je ekstrakcija;

• z ekstrakcijsko površino – Ekstrakcija je odvisna od razpoložljive površine, saj je hitrost ekstrakcije in količina ekstrahirane komponente v določenem času sorazmerna s površino. Se pravi, večja kot je površina, bolj učinkovita je ekstrakcija;

• s temperaturo – Povišana temperatura povečuje učinkovitost ekstrakcije, ker je gibanje molekul hitrejše, viskoznost medija pa manjša. Edina stvar, na katero moramo paziti, je temperatura vrelišča topila in termična nestabilnost spojin [13].

Slika 4: Shema ekstrakcije tekoče-tekoče [14]

10

4.1 Ekstrakcija trdno-tekoče

Pri ekstrakciji trdno-tekoče ekstrahiramo topne spojine iz trdne matrice s topilom v tekočo fazo. Spojine, ki jih ponavadi pridobivamo z izluževanjem iz raznih trdnih matric, niso v trdnem stanju, lahko se nahajajo tudi v tekočem, na primer eterično olje raznih dišavnic, ki se nahaja v tekoči obliki, medtem ko je dišavnica v trdni. Na koncu postopka dobimo ekstrakt, v katerem se nahaja naša spojina.

V splošnem lahko postopek ekstrakcije opišemo v treh stopnjah:

• fazna sprememba, ki nastane ob raztapljanju topljenca,

• difuzija topljenca, ki se nahaja v porah trdega materiala in prehaja na površino delca,

• prenos topljenca skozi tekočinski film s površine delca v glavni tok topila [15].

4.2 Ekstrakcija po Soxhletu

Franz von Soxhlet je leta 1879 izumil nov ekstrakcijski sistem za ekstrakcijo spojin ob uporabi različnih topil. Sistem je bil prvotno namenjen za ekstrakcijo lipidov iz mleka [16]. Ekstrakcija po Soxhletu je konvencionalna tehnika, ki se uporablja zelo pogosto za ekstrahiranje želenih spojin iz trdnih zmesi in hkrati tudi kot primerjalna tehnika za druge ekstrakcije trdno-tekoče. Aparat, prikazan na sliki 5, sestavljajo bučka, povratni hladilnik in kondenzator. Postopek poteka tako, da v tulec iz filtrirnega materiala natehtamo vzorec. V destilacijski bučki segrevamo topilo pri čemer nastanejo pare, ki se utekočinijo v povratnem hladilniku. Kapljice kondenzata nato kapljajo na vzorec, kjer nastaja ekstrakcijska raztopina, ki vsebuje ekstrahirane spojine. Sistem je narejen tako, da ko raztopina doseže višino, na kateri je odtok, steče nazaj preko povratne zanke v bučko. Z vsakim ciklom torej opravimo ekstrakcijo in zagotovimo, da topilo kroži, netopne snovi pa ostanejo v tulcu. Po koncu ekstrakcije je potrebno še iz ekstrakcijske zmesi odstraniti topilo [15, 17].

11 Slika 5: Soxhletov ekstraktor [18]

4.3 Ekstrakcija s pomočjo mikrovalov

Ekstrakcija s pomočjo mikrovalov (angl. Microwave-assisted extraction, MAE) je tehnika, ki spada med zelene postopke, saj pri svojem delovanju porabi malo časa, topila in energije. Je tudi proces, pri katerem lahko opravljamo več ekstrakcij hkrati in s tem znantno zmanjšamo porabo časa. Klasične ekstrakcije trajajo lahko ponavadi tudi po več ur in porabijo več 100 mL topila, medtem ko naj bi bili volumni pri MAE 10x manjši [19].

Pri svojem delovanju oziroma ekstrakciji združuje energijo, ki nastaja s pomočjo mikrovalov, in topilo, s katerim izvajamo ekstrakcijo. Mikrovalovi so oblika elektromagnetne energije, ki imajo frekvenčni obseg 300-300 000 MHz. Mikrovalovno energijo sestavlja električno in magnetno polje, vendar samo električno polje povzroči segrevanje snovi. Na sliki 6 lahko vidimo princip segrevanja preko mikrovalov, ki poteka na ta način, da mikrovalovi direktno vplivajo na molekule z ionsko kondukcijo in rotacijo dipola, kar povzroča segrevanje celotne raztopine [20]. Rdeče pike označujejo lokalizirano supersegrevanje.

12 Ionska kondukcija je pojav, ko se molekule skušajo orientirati glede na električno polje, dipolna rotacija pa je interakcija, kjer se molekule skušajo poravnati z električnim poljem, ki se spreminja z veliko hitrostjo (4,910⁹ s^-1 pri frekvenci 2450 MHz).

Slika 6: Shematski prikaz segrevanja z mikrovalovi[21]

Proces segrevanja pri ekstrakciji z mikrovalovi lahko poteka po treh mehanizmih:

• Mehanizem I: Vzorec zmešamo s topilom, ki močno absorbira energijo mikrovalov, npr. etanol;

• Mehanizem II: Vzorec zmešamo z mešanico topil, ki vsebuje topila z visoko in majhno dielektrično izgubo, najpogosteje je to mešanica heksan:etanol (1:1);

• Mehanizem III: Vzorcem, ki imajo veliko dielektrično izgubo (visoka vsebnost vode) dodamo topila, ki prepuščajo mikrovalove, npr. ekstrakcija eteričnega olja [19].

Pomembno je vedeti, da lahko pri visokih temperaturah nekatera organska topila razpadejo na komponente, ki so okolju škodljive, zato se namesto njih vse bolj uveljavljajo ionske raztopine. Njihove dobre lastnosti so, da ne škodujejo okolju, imajo velik temperaturni razpon, so zelo polarne, nehlapne in raztapljajo tako organske kot anorganske komponente [20].

4.4 Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka

Glavni namen ekstrakcijskega procesa je, da celoten proces optimiziramo do te mere, da čim manj vplivamo na lastnosti spojine oziroma analita, pri tem pa dobimo sprejemljiv izkoristek ekstrakcije. Konvencionalne ekstrakcije trdno-tekoče, kot npr. maceracija,

13 infuzija, ekstrakcija po Soxhletu, so precej časovno potratne in zahtevajo sorazmerno veliko količino topila. Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka (angl. Ultrasound assisted extraction, USE) pa je »zelena« alternativna možnost ekstrakcije, ki pri svojem delovanju uporablja zmogljivo moč ultrazvoka. Z uporabo ultrazvoka lahko ekstrahiramo razne spojine in biomateriale, kot so polisaharidi, eterična olja, proteini, pigmenti, bioaktivne komponente itd.

Glavna razlika, ki loči zvok od ultrazvoka, je frekvenca valovanja. V splošnem ločimo valovanje zvoka v tri kategorije, saj obsegajo različna območja frekvence valovanja:

• slišni valovi, ki jih lahko prosto slišimo s človeškim ušesom (10 Hz – 20 kHz),

• infrazvočni valovi, ki imajo frekvenco pod slišnimi valovi (<16 Hz),

• ultrazvočni valovi, ki imajo frekvenco nad slišnimi valovi (>20 kHz) [22].

Glavna gonilna sila pri ultrazvočni ekstrakciji je akustična kavitacija. Ultrazvok se širi skozi medij in pri tem sproži kompresijo in redčenje molekul. Takšne spremembe tlaka povzročajo nastanek in navsezadnje kolaps mehurčkov v tekočem mediju. Pojav, kjer se mehurčki ustvarijo, širijo in kolapsirajo (implozija), imenujemo akustična kavitacija (Slika 7). Pri samem kolapsu pride do lokalnega povišanja temperature (do 5000 K) in visokega tlaka (do 1000 bar) [22, 23].

Slika 7: Prikaz nastanka mehurčkov zaradi akustične kavitacije (C = kompresija, R = redčenje)[21]

Na učinek kavitacije vplivata tudi gostota in viskoznost tekočine. Gostota je predvsem odvisna od deleža raztopljenih plinov v tekočini in same tekočine, viskoznost pa je odvisna od kohezivnih sil; večje kot so, višja bo viskoznost in težje bo prišlo do kavitacije.

Ko enkrat premagamo kohezivne sile, viskoznost nima več vpliva na spremembo tlaka, pri katerem pride do kolapsa [23].

V sonokemiji za generiranje ultrazvoka uporabljamo sonokemijske reaktorje. Ultrazvočni valovi v reaktorju povzročajo lokalne spremembe v turbulenci in mikrocirkulaciji tekočine. Sonokemijske reaktorje uporabljamo za kemijske sinteze, obdelavo odpadnih vod, degradacijo polimerov, ekstrakcijo itd. Najpogostejši uporabljen tip reaktorja je

14 sonotroda, ki jo sestavlja valjasta konica, ki je direktno potopljena v tekočino in sprošča ultrazvočne valove. Poleg sonotrod se na laboratorijskem nivoju uporabljajo predvsem ultrazvočne kadi, kjer se ultrazvok širi preko sten v tekočino [23].

4.5 Ekstrakcija s supekritičnimi fluidi

Superktitična ekstrakcija je relativno nov proces, ki temelji na separaciji željene komponente iz matrice z uporabo superkritičnega fluida kot ekstrakcijskega topila.

Ekstrahiramo običajno iz trdne matrice, lahko pa tudi iz tekočin [25]. Pri sub- in superkritični ekstrakciji uporabljamo kot topilo nadkritične fluide, ki imajo visoko topnost in prepustnost. Subkritični pogoji so tisti, pri katerih je tlak nad ali pod kritično vrednostjo, temperatura pa je nižja od kritične temperature. Pri superkritičnih pogojih pa sta tako tlak kot tudi temperatura fluida nad kritično vrednostjo [15].

Superkritični fluidi so dober nadomestek hlapnim organskim topilom, saj za seboj ne puščajo nobenih toksičnih ali nevarnih ostankov. Najpogosteje se za te namene uporabljata ogljikov dioksid in voda. Prednosti superkritičnega CO2 so, da ni toksičen, je brez vonja, okusa, inerten in poceni dostopen. Pogoji, da dosežemo superkritični CO2 so temperatura nad 31 ℃ in tlak 74 bar. Edina slaba lastnost tovrstne ekstrakcije je verjetno cena opreme, ki je precej draga [15, 25].

Če primerjamo superkritično ekstrakcijo s konvencionalnimi procesi, npr. z ekstrakcijo trdno-tekoče ali tekoče-tekoče, nam uporaba superkritičnih fluidov daje kar nekaj prednosti:

• visoka učinkovitost ekstrakcije,

• regulacija tlaka, kar omogoča lažje odstranjevanje topila iz ekstrakta,

• selektivnost raztapljanja, na katero vplivamo s spreminjanjem temperature in tlaka,

• nizka temperatura obratovanja [15].

4.6 Ekstrakcija z vročo vodo pod povišanim tlakom

Pri analizi trdnih vzorcev ima ekstrakcija pomembno vlogo pri pripravi vzorca. Do nedavnega oziroma dokler niso poznali podrobnejšega delovanja PHWE (angl.

Pressurised hot water extraction, PHWE), so se uporabljale klasične metode ekstrakcije npr. ekstrakcija tekoče-tekoče s topili, ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka, Soxhletova ekstrakcija. Kot smo že ugotovili, so konvencionalne metode časovno potratne, imajo majhne izkoristke in uporabljajo velike količine organskih topil. V zadnjih desetih letih so več pozornosti usmerili v smer raziskovanja in optimiziranja ekstrakcije z vročo vodo

15 pod povišanim tlakom. Prvič je bila omenjena leta 1994. V današnjem času se PHWE smatra kot alternativna možnost superkritični ekstrakciji in ekstrakciji z organskimi topili pod tlakom.

PHWE je precej priročna in jo smatramo za »zeleno kemijo«, saj pri svojem delovanju uporablja kot topilo vodo pri povišani temperaturi in pod tlakom v nadzorovanih pogojih.

Voda je lahko dostopna, netoksična, da se jo reciklirati in ne povzroča okoljskih težav.

Na ta način je PHWE postala razširjena in poceni ekstrakcijska metoda, s katero lahko ekstrahiramo polarna onesnaževala iz prsti, sedimentov in nenazadnje tudi iz rastlin.

Glavni parametri, ki vplivajo selektivnost in učinkovitost ekstrakcije, so temperatura, tlak, čas, pretok in količina dodatkov. Temperatura je primarni faktor, od katere sta odvisni učinkovitost in selektivnost ekstrakcije. Če ne kontroliramo temperature, vplivamo na fizikalno-kemijske lastnosti vode in na termolabilne analite, kar lahko vodi do njihovega razpada/razgradnje. Ponavadi je temperatura nekaj deset stopinj nad temperaturo vrelišča vode. Visoko difuzivnost, nizko viskoznost in zmanjšanje površinske napetosti dosežemo pri povišani temperaturi, kar je posledica pretrganja vodikovih vezi [26]. S tem ko uravnavamo tlak, uravnavamo tudi, v kakšni fazi se bo nahajala voda. Delovni tlak, ki ga vzdržujemo pri PHWE, je ponavadi 15 bar pri 200 ℃ ali 85 bar pri 300 ℃.

PHWE lahko izvajamo statično ali dinamično. Pri dinamičnem obratovanju sta pomembna parametra, ki ju uravnavamo, čas in pretok. Čas ekstrakcije je v veliki meri odvisen od temperature, narave matrice in analita. Pri statičnem načinu pa je učinkovitost ekstrakcije močno odvisna od ravnotežne porazdelitvene konstante in topnosti spojin pri določeni temperaturi. Zelo koncentrirani vzorci ali analiti z nizko topnostjo lahko povzročijo nepopolno ekstrakcijo zaradi omejene količine porabljene vode [27].

16

17

4.7 Ekstrakcija polarnih benzotriazolov iz trdnih vzorcev

Izmed vseh ekstrakcijskih tehnik, ki se uporabljajo za določevanje polarnih benzotriazolov, v literaturi zasledimo zlasti naslednje:

• LSE – (ekstrakcija trdno-tekoče), najenostavnješa metoda, ki zajema ekstrakcijo s topilom,

• Soxhletova ekstrakcija,

• PLE – način ekstrakcije, kjer poleg topila uporabimo še povišan tlak in temperaturo,

• PHWE,

• MAE,

• QuEChERS – (angl. quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) dvostopenjska tehnika, ki vključuje ekstrakcijo s topili in čiščenje z disperzivno SPE.

V tabeli 2 je zbranih nekaj določitev benzotriazolov, ki so jih opravili z različnimi vzorci in tudi različnimi metodami. Opazimo lahko, da koncentracije polarnih benzotriazolov precej nihajo, kar je lahko posledica same metode ali pa tudi matrice, v kateri se nahaja analit [1].

Tabela 2: Koncentracija polarnih benzotriazolov v trdnih vzorcih

spojine metoda vzorec vsebnost

BTZ LSE + LC-MS tla

sediment

0,1-1,7 µg/g 13 µg

BTZ, 5MBZ SPE + LC-MS/MS detergenti 25-3000 µg/g

BZT, 5MBZ, DMBZ LSE + SPE + LC-MS/MS

aktivno blato okoli 116 ng/g

BTZ, MBZ PLE + SPE +

LC-MS/MS

sedimenti okoli 240 ng/g

BTZ, 5MBZ MAE + HPLC-UV tla okoli 786 ng/g

18

19

5 Analizne metode

Ker so polarni benzotriazoli nizko hlapni in se v okolju nahajajo v nizkih koncentracijah, jih določamo z občutljivimi kromatografskimi tehnikami. Do sedaj se je izkazalo, da jih največkrat določujemo s tekočinsko kromatografijo (LC), ki je sklopljena z masnim spektrometrom (LC-MS), lahko pa jih določujemo tudi s plinsko kromatografijo (GC) [1]. Primarna razlika med tehnikama je v mobilni fazi, LC uporablja za mobino fazo tekočino, GC pa plin. Dandanes je pogost izraz za tekočinsko kromatografijo tudi HPLC (angl. high-performance liquid cromatography), saj pri svojem delovanju uporablja relativno visok delovni tlak.

Tako kot HPLC je tudi GC tehnika visoke ločljivosti. Analiti pri GC morajo biti hlapni ali pa imeti lastnost, da se pri povišani temperaturi uparijo. Približno 20 % vseh organskih spojin lahko analiziramo z GC, ne da bi vzorec pred tem potreboval posebno predpripravo. Ko pripravljamo vzorce za HPLC, pa morajo biti raztopljeni v topilu.

Če primerjamo HPLC in GC, lahko izpostavimo tri ključne razlike:

• difuzijski koeficient je pri HPLC manjši kot pri GC,

• viskoznost mobilne faze je večja pri HPLC, pri čemer se visoka viskoznost odraža tudi v tem, da imamo manjši difuzijski koeficient (molekule kažejo večjo rezistenco pri potovanju skozi mobilno fazo),

• kompresija mobilne faze je pri GC večja kot pri HPLC, kar je za HPLC prednost, saj je hitrost potovanja mobilne faze konstantna po celotni dolžini kolone [28].

Kolone, ki jih uporabljamo pri HPLC, so dolge od 5 do 30 cm, z notranjim premerom med 2 in 5 mm. Kot polnilo se ponavadi uporablja polarni silikagel. S kemično modifikacijo lahko dosežemo, da postane silikagel nepolaren, s tem dobimo reverzno fazo. Za separacijo polarnih benzotriazolov se uporabljajo kolone C18, C8 in fenilne.

Uporaba zadnjih dveh ni tako pogosta kot prve. Mobilna faza na začetku vsebuje visok delež vode, tekom analize pa se veča delež organskega topila (metanola ali acetonitrila) [1].

20

21

6 Eksperimentalni del

V okviru eksperimentalnega dela je bila na fakulteti izvedena le ena analiza, s katero sem pridobil umeritveno premico za 1H-benzotriazol (Tabela 4, Graf 1). Nadaljevanje eksperimentalnega dela je bilo onemogočeno zaradi epidemije Covid-19.

Analizo sem opravljal na tekočinskem kromatografu visoke ločljivosti z DAD (angl.

Diode-array detection) spektrofotometrijskim detektorjam Agilent 1100 Series, ZDA (Agilent Technologies, ZDA). Aparaturo sestavljajo še modul za razplinjevanje, kvarterna črpalka in avtomatski vzorčevalnik.

Ločbo sem izvajal na kromatografski koloni Kinetex XB-C18 (Phenomenex, ZDA) dimenzij 150 mm x 4,6 mm in velikosti delcev 5 µm.

UV detekcijo z HPLC sem izvajal z detektorjem DAD pri valovnih dolžinah 260 in 290 nm (Slika 8). Mobilna faza je bila sestavljena iz acetonitrila (A) in 0,1 % HCOOH v MQ (B), njen pretok pa je znašal 0,7 mL/min. Gradient mobilne faze za polarne benzotriazole je naveden v tabeli 2. Injiciral sem po 10 µL vzorca.

Pri svoji analizi sem uporabil osnovno standardno raztopino analita, ki je bila pripravljena iz trdnega standarda in raztopljena v acetonu. Koncentracija je na koncu znašala okoli 1 g/L, iz nje pa sem pripravil raztopine za umeritveno premico.

Tabela 3: Gradient mobilne faze za določitev polarnih benzotriazolov (A - acetonitril, B - 0,1 % HCOOH v MQ)

Čas (min) % A % B

0 5 95

0,5 15 85

13 35 65

20 100 0

25 5 95

22 Tabela 4: Koncentracije in ploščine vrhov za BTZ

Koncentracija [mg/L]

Ploščina Ploščinapovp.

10 412,8 409,4 392,9 405,0

20 827 801 790,6 806,2

30 1221,5 1229,6 1198 1216,4

40 1572,3 1583,4 1604,6 1586,8

50 1956,8 1953,5 1976,8 1962,4

Graf 1: Umeritvena premica za BTZ v modelni raztopini vode

y = 38,954x + 26,74 R² = 0,9995

0 500 1000 1500 2000 2500

0 10 20 30 40 50 60

ploščina

koncentracija [mg/L]

23 Slika 8: Kromatogram 1H-benzotriazola (BTZ)

24

25

7 Zaključek

Namen mojega diplomskega dela je bil podrobnejši pregled in opis literature na področju določevanja polarnih benzotriazolov v trdnih okoljskih vzorcih z različnimi ekstrakcijskimi tehnikami. Po prebrani liteteraturi lahko trdim, da se za njihovo določanje uporabljajo zelo raznolike tehnike, ki dajejo sorazmerno podobne in primerljive rezultate.

Seveda si vsak raziskovalec želi pridobiti na koncu opravljene analize realne rezultate, vendar včasih temu ni tako. To lahko pripisujemo kompleksnosti matrice, v kateri se nahaja analit in njegovi koncentraciji. S tem, ko imamo kompleksno matrico, obstaja več možnosti, da spojine med seboj interferirajo in motijo postopek analize. Naš glavni namen je torej poiskati metodo, katere selektivnost oziroma robustnost bo zmanjšala učinek matrice. Pri samem izvajanju analizne metode se pojavijo težave tudi pri kvantifikaciji, saj v primeru prenizkih koncentracij ne bomo dobili rezultata, kar je posledica koncentracije analita, ki je pod mejo zaznave. Na koncentracijo lahko vplivamo s tem, da optimiziramo ekstrakcijske pogoje, hkrati pa na ta način vplivamo tudi na obogatitvene faktorje, ki pripomorejo k boljšim rezultatom. Izmed vseh ekstrakcijskih tehnik se mi zdijo najbolj primerne tiste, ki pri analizi porabijo malo energije, časa in topila, saj s tem postane analiza bolj »zelena« in manj škodljiva za okolje. PHWE in ekstrakcija s superkritičnimi fluidi sta dobri alternativni možnosti, s katerimi bomo prispevali k manjši porabi organskih topil in ohranjali stabilnost okolja. V prihodnosti lahko pričakujemo še več napredka na tem področju, saj okoljska vizija stremi k temu, da so postopki čim bolj

»zeleni« in okolju prijazni.

26

27

8 Literatura

[1] I. Kraševec: Razvoj analiziranih metod za določanje benzotriazolnih spojin v okoljskih vzorcih. Ljubljana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo UL 2019, doktorska disertacija.

[2] C. Sease: Benzotriazole: A review for conservators. Stud. Conserv. 1978, 23, 76–

85.

[3] X. Wu, N. Chou, D. Lupher, L. C. Davis: Benzotriazoles: Toxicity and degradation. Conf. Hazard. Waste Res. 1998, No. 1977, 374–382.

[4] M. G. Cantwell, J. C. Sullivan, R. M. Burgess: Benzotriazoles: History,

environmental distribution, and potential ecological effects; Elsevier, 2015; Vol.

67.

[5] T. Reemtsma, U. Miehe, U. Duennbier, M. Jekel: Polar pollutants in municipal wastewater and the water cycle: Occurrence and removal of benzotriazoles.

Water Res. 2010, 44, 596–604.

[6] Z. Q. Shi, Y. S. Liu, Q. Xiong, W. W. Cai, G. G. Ying: Occurrence, toxicity and transformation of six typical benzotriazoles in the environment: A review. Sci.

Total Environ. 2019, 661, 407–421.

[7] M. T. Pena, X. Vecino-Bello, M. C. Casais, M. C. Mejuto, R. Cela: Optimization of a dispersive liquid-liquid microextraction method for the analysis of

benzotriazoles and benzothiazoles in water samples. Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 1679–1695.

[8] W. Vetter, J. Lorenz: Determination of benzotriazoles in dishwasher tabs from Germany and estimation of the discharge into German waters. Environ. Sci.

Pollut. Res. 2013, 20, 4435–4440.

[9] A. Careghini, A. Filippo Mastorgio, S. Saponaro, E. Sezenna: Bisphenol A, nonylphenols, benzophenones, and benzotriazoles in soils, groundwater, surface water, sediments, and food: A Review. Environ. Sci. Pollut. Res. 2015, 22, 5711–

5741.

[10] M. Giraudo, M. Lanie Douville, G. Cottin, M. Houde: Transcriptomic, cellular and life-history responses of Daphnia magna chronically exposed to

benzotriazoles: Endocrine-disrupting potential and molting effects. PLoS One 2017, 12, 1-24.

[11] X. Liang, C. J. Martyniuk, J. Zha, Z. Wang: Brain quantitative proteomic responses reveal new insight of benzotriazole neurotoxicity in female chinese rare minnow (Gobiocypris rarus). Aquat. Toxicol. 2016, 181, 67–75.

28 [12] X. Liang, M. Wang, X. Chen, J. Zha, H. Chen, L. Zhu, Z. Wang: Endocrine

disrupting effects of benzotriazole in rare minnow (Gobiocypris rarus) in a sex- dependent manner. Chemosphere 2014, 112, 154–162.

[13] N. Kugler: Optimiranje parametrov ekstrakcije lubja iglavcev in karakterizacija ekstrakta. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, magistrsko delo 2017.

[14] Chemistry LibreTexts. Overview of extraction.

https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Organic_Chemistry/Book%3A_Organic _Chemistry_Lab_Techniques_(Nichols)/04%3A_Extraction/4.02%3A_Overview _of_Extraction (pridobljeno 10. novembra 2020 )

[15] M. Travica: Superkritična ekstrakcija. Ljubljana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, UL 2020, diplomsko delo. 2020.

[16] M. D. Luque de Castro, F. Priego-Capote: Soxhlet extraction: Past and present Panacea. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2383–2389.

[17] M. Turičnik: Maščobne kisline v ekstraktu pistacije. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo UM 2015, diplomsko delo.

[18] Indiamart. Soxhlet extractors. https://www.indiamart.com/proddetail/soxhlet- extractors-6794651397.html (pridobljeno 14. novembra 2020)

[19] C. S. Eskilsson, E. Björklund: Analytical-scale microwave-assisted extraction. J.

Chromatogr. A 2000, 902, 227–250.

[20] A. Grdjan: Sinteza nanodelcev pod vplivom mikrovalov. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, UM 2012, diplomsko delo.

[21] CEM. Microwave heating – mechanism and theory.

https://cem.com/en/microwave-heating-mechanism-and-theory (pridobljeno 16.

novembra 2020)

[22] B. K. Tiwari: Ultrasound: A clean, green extraction technology. TrAC - Trends Anal. Chem. 2015, 71, 100–109.

[23] S. Zaplotnik: Vpliv intenzitete ultrazvočne kavitacije na funkcionalizacijo grafena. Ljubljana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, UL 2020, magistrsko delo.

[24] Researchgate. Valorization of agrifood by-products by extracting valuable

bioactive compouds using green processes.

https://www.researchgate.net/publication/320005221_Valorization_of_Agrifood_

By-

29 Products_by_Extracting_Valuable_Bioactive_Compounds_Using_Green_Proces ses/figures?lo=1 (pridobljeno 25. novembra 2020)

[25] E. Ibáñez, J. A. Mendiola, M. Castro-Puyana: Supercritical fluid extraction.

Encycl. Food Health. 2015, 8, 227–233.

[26] M. Mukhopadhyay, P. Panja: Pressurised hot water as a novel extractant of natural products: A Review. Indian Chem. Eng. 2010, 51, 311–324.

[27] C. C. Teo, S. N. Tan, J. W. H. Yong, C. S. Hew, E. S. Ong: Pressurized hot water extraction (PHWE). J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2484–2494.

[28] V. R. Meyer: Practical high-performance liquid chromatography: Fifth Edition.

Pract. High-Performance Liq. Chromatogr. Fifth Ed. 2010, 1–402.