3 MATERIALI IN METODE
3.9.5 Štetje celic
Pri določenih poskusih je bistvenega pomena preraščenost posodice za gojenje, zato je potrebno pred začetkom poskusa nasaditi točno določeno število celic.
Določena konfluentnost celic je ključna za uspešno izvedbo transfekcije, zato smo morali pred nasaditvijo celic za nadaljnjo transfekcijo določiti njihovo število.
Za štetje celic smo uporabili napravo ADAM-MC™.
ADAM-MC™ je avtomatski števec, ki poleg štetja celic omogoča tudi določanje viabilnosti le-teh. Delovanje naprave temelji na fluorescentni mikroskopiji. Celice pred štetjem obarvamo s fluorescentnim barvilom, propidijevim jodidom (PI). PI je interkalator, veže se na DNA in obarva jedra tarčnih celic. Barvilo lahko vstopi le v celice s poškodovanimi membranami ali z neaktivnim metabolizmom, posledično lahko obarva le jedra neviabilnih celic.
Za barvanje celic smo uporabili dve raztopini. AccuStain Solution T se uporablja za štetje vseh celic, saj poleg barvila PI vsebuje lizno raztopino, ki povzroči lizo viabilnih celic in omogoči njihovo obarvanje. AccuStain Solution N pa se uporablja za štetje neviabilnih celic. Vsebuje barvilo PI in PBS in obarva samo neviabilne celice [54].
Iz gojitvenih posodic s celicami smo najprej odstranili gojišče, celice sprali z enakim volumnom PBS in dodali 2 mL tripsin-EDTA. Po inkubaciji s tripsinom smo encim inaktivirali z dodatkom 3-kratnega volumna kompletnega gojišča in celice sprali s podlage. Suspenzijo smo prenesli v centrifugirko in dobro premešali z vibracijskim mešalnikom. Po 25 µL homogene suspenzije smo prenesli v dve mikrocentrifugirki. V eno mikrocentrifugirko smo suspenziji dodali 25 µL AccuStain Solution T, v drugo pa 25 µL AccuStain Solution N. Mešanici smo premešali z nastavkom pipete in nanesli dvakrat po 12,5 µL vsake mešanice v ustrezne luknjice na čip za štetje celic AccuChip. Čip smo vstavili v napravo ADAM-MC™, ki je preštela obarvane celice in izpisala podatke o številu vseh celic, številu neviabilnih celic, razliko med temi števili in izračunan odstotek viabilnosti celic v vzorcu.
Transfekcija celic
Transfekcija je način vnosa tujega genskega materiala v evkariontske celice, pri čemer se spremenijo njihove lastnosti. Za vnos genskega zapisa za preučevana
proteina smo uporabili ekspresijska vektorja. Kot negativno kontrolo smo uporabili vektorje brez zapisov za izbrane proteine.
Pri pripravi diplomske naloge smo celice prehodno transficirali. Pri prehodni transfekciji tuji genski material ne vstopa v genom. Pri celični liniji Huh-7 ne pride do pomnoževanja vnešenih vektorjev in se zato med delitvijo celic vektorji ne prenašajo iz generacije v generacijo. Vnesena nukleinska kislina se med delitvijo zato redči in vsaka hčerinska celica prejme manj genskega materiala.
Transfekcijo smo izvajali z uporabo reagenta GenJet™ In Vitro DNA Transfection Reagent (Ver. II). Delovanje reagenta temelji na tehnologiji biorazgradljivih polimerov kovalentno povezanih s kationskimi lipidi. Reagent tvori kompleks s plazmidno DNA, ki vstopi v celice z endocitozo. Po vstopu kompleks razpade, kationski polimer se razgradi v citoplazmi, plazmid pa vstopi v jedro (slika 9).
Slika 9: Grafični prikaz delovanja reagenta GenJet™ In Vitro DNA Transfection Reagent (Ver. II) [55].
Transfekcijo smo izvajali v triplikatih po protokolu optimiziranem za celice Huh-7.
Celice smo 24 ur pred transfekcijo nasadili na gojitveno ploščo s šestimi vdolbinicami. V vsako vdolbinico smo nasadili 500.000 celic, da je bila konfluentnost celic naslednji dan približno 90 %. Eno uro pred transfekcijo smo celicam zamenjali gojišče. Z asperacijsko pipeto smo odsesali staro gojišče in v vsako vdolbinico dodali 1 mL svežega kompletnega gojišča. Za vsako vdolbinico z nacepljenimi celicami smo razredčili 2 µg plazmidne DNA v 100 µL osnovnega gojišča DMEM in dobro premešali z nastavkom za pipete. Nato smo posebej za vsako vdolbinico razredčili 6 µL GenJetTM reagenta v 100 µL osnovnega gojišča in prav tako dobro premešali z nastavkom. Takoj po mešanju smo celoten
volumen razredčenega reagenta prenesli v mikrocentrifugirko z razredčeno plazmidno DNA. Mešanico smo premešali s pipeto in 15 min inkubirali na sobni temperaturi. Za redčenje DNA in reagenta smo uporabili osnovno gojišče DMEM, saj omogoča tvorbo kompleksov optimalne velikosti. Po inkubaciji smo na celice v vsako vdolbinico počasi po kapljicah ob istočasnem mešanju odpipetirali po 200 µL mešanice. Po dodatku mešanice smo plošče še enkrat dobro premešali in jih prenesli v inkubator na 37 °C. Po 5-urni inkubaciji smo odstranili gojišče, ki je vsebovalo komplekse, in v vsako vdolbinico dodali 3 mL kompletnega gojišča.
48 ur po transfekciji smo celice iz gojitvene plošče s 6 vdolbinicami presadili v gojitvene posodice T25.
Ocena učinkovitosti transfekcije
Učinkovitost transfekcije smo ocenili s fluorescentno mikroskopijo. S pomočjo mikroskopa InCellis smo spremljali zeleno fluorescenco v celicah, ki so bile transficirane z vektorji z zapisom za eGFP, pcDNA3-eGFP ali pLenti-CMV-MCS-GFP-SV-puro. Kot negativno kontrolo smo uporabili celice, ki so bile transficirane z drugimi vektorji. Učinkovitost transfekcije smo določali 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Za boljšo vizualizacijo smo za čas merjenja s celic odstranili kompletno gojišče in jim dodali enak volumen PBS, saj vsebuje kompletno gojišče barvni pH-indikator, ki zmanjša kontrastnost slike. Učinkovitost transfekcije je enaka ocenjenemu deležu fluorescirajočih celic. Predpostavili smo, da je bila učinkovitost transfekcije z vektorji pLenti-CMV-MCS-GFP-SV-puro ali pcDNA3-eGFP enaka učinkovitosti transfekcije z drugimi vektorji, saj so bili pogoji transfekcije in inkubacije vseh celic enake.
Delo s proteini 3.12.1 Izolacija proteinov
Izolacijo proteinov smo izvedli 72 ur po transfekciji. Pred začetkom protokola smo pripravili pufersko raztopino HEPES s pH 7,5, lizni pufer in pufer za izolacijo jedrne frakcije. Pred začetkom izolacije proteinov smo v 10 mL liznega pufra in 10 mL pufra za izolacijo jedrne frakcije dodali po eno tableto inhibitorjev proteaz cOmplete ULTRA, ki inhibirajo cisteinske, serinske, aspartatne proteaze in metaloproteaze. Pufra smo nato dobro premešali z vibracijskim mešalnikom do popolne raztopitve tablet. Vse uporabljene kemikalije smo pred uporabo ohladili.
Po protokolu smo najprej izolirali citoplazemsko frakcijo. Iz gojitvenih posodic smo odsesali kompletno gojišče in celice sprali z enakim volumnom PBS. Po odstranitvi PBS smo na celice dodali 1 mL liznega pufra z inhibitorji proteaz in s strgalom zdrgnili celice s podlage. Celice smo nato s pipeto splaknili s površine in jih hkrati resuspendirali. Celotni volumen nastale suspenzije smo prenesli v mikrocentrifugirke in jih takoj postavili na led. Naprej smo celoten postopek izvajali na ledu. Celice smo na ledu inkubirali 15-20 min, vmes smo jih večkrat
premešali z vibracijskim mešalnikom. Po koncu inkubacije smo celice še enkrat dobro premešali in jih centrifugirali 10 min na 4 °C pri hitrosti 12.000 g. Po centrifugiranju smo supernatant, ki je predstavljal citoplazemsko frakcijo, prenesli v nove mikrocentrifugirke in ga shranili na - 80 °C do nadaljnje uporabe.
Usedlino, ki je nastala pri centrifugiranju, smo najprej trikrat sprali z 1 mL liznega pufra brez dodanih inhibitorjev proteaz. Nato smo ga resuspendirali v pufru za izolacijo jedrne frakcije z inhibitorji proteaz, najprej s pomočjo pipete, nato še s pomočjo vibracijskega mešalnika. V primeru izolacije proteinov iz celic, transficiranih z vektorji pControl in FLAG-p54, smo za resuspendiranje uporabili 250 µL pufra, v primeru pT7-V5-SBP-C1 in pT7-V5-SBP-C1-PCBP2 pa smo uporabili 125 µL pufra za višjo koncentracijo proteinov v jedrni frakciji. Suspenzijo smo 30 min inkubirali na ledu in jo nato 15 min centrifugirali na 4 °C pri 12.000 g.
Po centrifugiranju smo supernatant, ki je predstavljal jedrno frakcijo, prenesli v nove mikrocentrifugirke in ga shranili na - 80 °C do nadaljnje uporabe.
3.12.2 Določanje koncentracije proteinov
Koncentracijo proteinov smo določali s testom BCA (angl. bicinchoninic acid assay), ki temelji na sposobnosti proteinov, da reducirajo Cu2+ do Cu1+ v alkalni raztopini. V prvem koraku poteče biuretska reakcija, pri kateri se bakrov ion poveže s proteini, tako nastane svetlo moder kompleks, bakrov ion pa se reducira. V drugem koraku se na reduciran bakrov ion Cu1+ vežeta dve molekuli bikinhonske kisline in pri tem nastane vijolično obarvan kompleks. Nastali vodotopni produkt absorbira svetlobo z valovno dolžino 562 nm, njegova količina je odvisna od količine nastalih Cu1+ ionov, vsebnost katerih pa je odvisna od koncentracije proteinov. Na redukcijo najbolj vplivajo cisteinski, triptofanski in tirozinski aminokislinski ostanki [56].
Za merjenje koncentracije smo uporabili Pierce™ BCA Protein Assay Kit, ki vsebuje dva reagenta (reagent A in reagent B). Delovni reagent smo pripravili tako, da smo zmešali reagent A in reagent B v razmerju 50:1. Meritve smo izvajali v mikrotitrski plošči s 96 vdolbinicami. V vdolbinice smo odpipetirali po 10 µL standardov ali vzorcev, ki smo jih nanesli v duplikatih. Za standarde smo uporabili raztopine govejega serumskega albumina (BSA) z znano koncentracijo, in sicer 2000 µg/mL, 1500 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 25 µg/mL in 0 µg/mL (slepi vzorec). Za meritev koncentracije proteinov v citoplazemski frakciji so bile standardne raztopine pripravljene z liznim pufrom, v primeru jedrne frakcije pa s pufrom za jedrno frakcijo. Vsem standardom in vsem vzorcem smo kar se da hitro, da ne bi prišlo do bistvenih razlik v času inkubacije, dodali 200 µL delovnega reagenta, ploščo 30 s stresali na stresalniku za mikrotitrske plošče in jo nato prenesli v inkubator na 37 °C. Po 30 min inkubacije smo s pomočjo spektrofotometra Epoch izmerili absorbanco pri 562 nm.
Absorbanco standardov smo uporabili za izračun umeritvene krivulje, ki smo ji določili enačbo:
y=kx+n,
kjer je y absorbanca vzorca, x pa njegova koncentracija.
S pomočjo enačbe umeritvene krivulje smo na podlagi izmerjene absorbance vzorcev izračunali koncentracije proteinov v njih.
3.12.3 NaDS-PAGE
S pomočjo poliakrilamidne gelske elektroforeze v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE) smo proteine ločili glede na njihovo molekulsko maso. Izvajali smo diskontinuirano elektroforezo. Uporabili smo 4 % zbiralni in 10
% ločevalni gel debeline 1 mm. Zamreženost ločevalnega gela smo izbrali glede na pričakovano velikost prekomerno izraženih proteinov. Sestava gelov je navedena v tabeli 10. Poleg zamreženosti sta se gela razlikovala tudi v vrednosti pH.
Tabela 10: Sestava ločevalnega in zbiralnega gela za NaDS-PAGE.
10 % (10 mL) 4 % (5 mL)
akrilamid/bisakrilamid (29:1) 2,5 mL 0,5 mL
10 % (w/v) APS 100 µL 50 µL
TEMED 6 µL 5 µL
Najprej smo sestavili napravo za vlivanje gela. Stekelca smo vstavili v nosilec in z vodo preverili, da sestavljena naprava ne pušča. V dveh centrifugirkah smo zmešali vse sestavine gelov razen tetrametiletilendiamina (TEMED), saj ta deluje kot aktivator in ga zato dodamo neposredno pred vlivanjem gela.
Akrilamid/bisakrilamid (AA) smo dodajali v digestoriju, ker je v monomerni obliki izjemno toksičen. Nato smo odlili vodo izmed stekelc, dodali TEMED v ločevalni gel, ga premešali in odpipetirali med stekelca. Na ločevalni gel smo odpipetirali izopropanol, da je bil zgornji rob gela raven. Ko se je ločevalni gel strdil, smo odlili izopropanol, dodali TEMED v zbiralni gel, ga premešali in odpipetirali do vrha stekelc. Med stekelca smo nato previdno vstavili glavniček.
Med polimerizacijo gelov smo pripravili vzorce za nanos. 3 µg izoliranih proteinov smo dodali 5 µL 4-kratnega nanašalnega pufra Laemmli in dopolnili z liznim
pufrom oziroma pufrom za jedrno frakcijo do 20 µL. V primeru priprave vzorcev iz citoplazemske frakcije smo uporabili lizni pufer, v primeru jedrne pa pufer za izolacijo jedrne frakcije. Pripravljene vzorce smo nato 5 min inkubirali pri 95 °C in kratko centrifugirali.
Ko je zbiralni gel polimeriziral, smo previdno odstranili glavničke in stekelca z geli prenesli v elektroforezno napravo. V kadičke smo nalili 1-kratni elektroforezni pufer, da so bila stekelca popolnoma potopljena. V žepke gelov smo nato nanesli celoten volumen pripravljenih vzorcev. Na vsak gel smo nanesli tudi 5 µL velikostnega standarda PageRuler Prestained Protein Ladder. Elektroforeza je potekala najprej 10 min pri 70 V, nato pa pri 120 V. Zaključili smo, ko je proteinska fronta skoraj dosegla roba gela.
3.12.4 Prenos western in imunodetekcija
Prenos western je metoda, s katero proteine iz poliakrilamidnega gela prenesemo na membrano. Pri našem delu smo proteine prenašali na polivinil difluoridno (PVDF) membrano, ki pred prenosom potrebuje aktivacijo z metanolom. Za aktivacijo smo membrano PVDF najprej 15 s inkubirali v metanolu, nato 2 min v vodi Milli-Q in 5 min v pufru za prenos. Kaseto smo pripravili v skladu s sliko 10. Kaseto smo nato previdno zaprli in jo vstavili v napravo za prenos western. Pri tem smo bili pozorni, da je bila kaseta pravilno orientirana. V kadičko smo do oznake nalili 1-kratni pufer za prenos in jo pokrili s pokrovom. Prenos je potekal čez noč pri konstantnem toku 100 mA.
Slika 10: Shema sestavljanja kasete za prenos Western.
Po končanem prenosu smo membrano previdno prenesli v plastično posodico in jo 1 uro blokirali v 5 % raztopini mleka v prahu v pufru TBST pri sobni temperaturi in ob konstantnem stresanju. Po blokiranju smo membrano enkrat sprali s pufrom TBST.
Na isti membrani smo želeli detektirati več proteinov z različnimi protitelesi, in sicer prekomerno izraženi protein in kontrolo nanosa, lamin A/C ali GAPDH (angl.
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Zato smo membrano previdno razrezali, tako da je bil vsak detektiran protein na ločenem kosu membrane.
Mesto razreza membrane smo določili na podlagi pričakovane velikosti proteinov.
Sledila je inkubacija s primarnimi protitelesi, ki je potekala 1,5 ure na sobni temperaturi pri rahlem stresanju. Primarna protitelesa smo predhodno redčili v 1
% raztopini mleka v pufru TBST, in sicer protitelesa proti FLAG-oznaki in lamin A/C 1:1000, proti V5-oznaki 1:4000 in proti GAPDH 1:50.000. Protitelesa proti FLAG-oznaki so bila že konjugirana z reporterskim encimom hrenovo peroksidazo (HRP), zato smo membrano s proteinom NONO v času inkubacije ostalih membran s primarnimi protitelesi stresali na 4 °C v pufru TBST. Po koncu inkubacije smo membrane sprali s TBST, in sicer štirikrat po 5 min. Sledila je 1-urna inkubacija s sekundarnimi protitelesi, označenimi s HRP, pri sobni temperaturi in ob rahlem stresanju. Sekundarna protitelesa smo predhodno redčili 1:2000 v 1 % mleku v TBST. Istočasno smo inkubirali tudi membrano s proteinom NONO s protitelesi proti FLAG-oznaki. Po inkubaciji smo membrane ponovno sprali s TBST (4-krat po 5 min).
Naslednji korak je bila detekcija na napravi LAS 4000. Membrane smo 5 min inkubirali v temi pri sobni temperaturi z reagentom Immobilon Classico Western HRP substrate. Po inkubaciji smo odstranili odvečni reagent in sestavili skupaj posamezne dele razrezane membrane. Membrano smo prenesli v LAS 4000 za opazovanje kemiluminiscence in naredili slike membran. Čas izpostavitve žarkom smo sproti prilagajali glede na signal. V primeru da kemiluminiscence nismo zaznali, smo uporabili močnejši reagent SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate. Ta reagent smo pripravili tako, da smo zmešali Luminol/Enhancer in Stable Peroxide Buffer v razmerju 1:1 in ga nato nanesli na membrano. Naprej je postopek potekal enako kot pri Immobilon Classico Western HRP substrate.
Oba reagenta vsebujeta substrat za HRP, luminol, in vodikov peroksid. HRP, ki je vezan na protitelesa, katalizira redukcijo H202, reakcija pa je sklopljena z oksidacijo luminola. Pri tej reakciji pride do kemiluniscence, ki jo zaznamo [57].
3.12.5 Odstranjevanje protiteles iz membran
Če so bili proteini, ki smo jih želeli detektirati z različnimi protitelesi, podobne velikosti, membrane nismo mogli natančno razrezati. V tem primeru smo najprej izvedli imunodetekcijo enega proteina, nato odstranili vezana protitelesa z membrane in izvedli še imunodetekcijo drugega proteina. Pri našem delu smo odstranili protitelesa proti V5-oznaki in nato vezali protitelesa proti GAPDH.
Najprej smo pripravili pufer za odstranjevanje protiteles. Membrano smo inkubirali v pripravljenem pufru 10 min pri sobni temperaturi, nato smo zamenjali
pufer in ponovili inkubacijo. Sledila je inkubacija v PBS (dvakrat po 10 minut) in inkubacija v TBST (dvakrat po 5 minut). Vse inkubacije so potekale pri sobni temperaturi in rahlem stresanju. Po uspešni odstranitvi protiteles proti V5-oznaki smo nadaljevali z imunodetekcijo po protokolu, ki je opisan v poglavju 3.12.4.
Delo z RNA in cDNA
Za namene preverjanja vpliva prekomerno izraženih proteinov na izražanje krožnih RNA molekul, smo izolirali celokupno RNA, izvedli reverzno transkripcijo in s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR) določili spremembe v izražanju circRNA.
3.13.1 Izlolacija RNA
Za izolacijo RNA smo uporabili TRI-reagent. To je raztopina fenola in gvanidinijevega izotiocianata, ki hkrati povzroči lizo celic in denaturira proteine.
Dodajanje kloroforma povzroči ločevanje faz, pri katerem so proteini ločeni v spodnji organski fazi, RNA je v zgornji vodni fazi, DNA pa se nahaja med obema fazama [58]. TRI-reagent tudi inaktivira ribonukleaze (RNaze). RNaze so encimi, ki razgrajujejo RNA in so prisotni povsod v okolju. Da bi preprečili razgradnjo RNA v naših vzorcih, smo pred delom z RNA vse delovne površine, rokavice in pripomočke očistili z etanolom in raztopino RNaseZAP, ki ob stiku uniči RNaze.
Poleg tega smo pri delu z RNA uporabljali pipetne nastavke s filtri, ki preprečujejo kontaminacijo z RNazami iz aerosolov, ki nastajajo med pipetiranjem. Da bi še bolj zmanjšali verjetnost kontaminacije vzorcev z RNazami, smo uporabljali samo kemikalije in mikrocentrifugirke, ki se v laboratoriju uporabljajo izključno za delo z RNA. RNA molekule so precej nestabilne, da bi čimbolj zmanjšali razgradnjo RNA, smo postopek, razen določenih korakov, izvajali na ledu.
72 ur po transfekciji celic smo odstranili kompletno gojišče, celice sprali s pufrom PBS in posodice prenesli iz brezprašne komore v digestorij, kjer smo celicam dodali po 1 µL TRI-reagenta in jih inkubirali 2-5 min pri sobni temperaturi. Celice s TRI-reagentom smo nato sprali s površine in celotni volumen suspenzije prenesli v mikrocentrifugirke. Tako pripravljene vzorce smo do nadaljevanja izolacije RNA shranili na - 80 °C ali pa neposredno izvedli nadaljnje korake izolacije. Če so bili vzorci zamrznjeni, smo jih pred nadaljnjo uporabo odtalili v vodni kopeli ali pri sobni temperaturi.
Vzorce smo najprej inkubirali 5 min na sobni temperaturi. Nato smo jim v digestoriju dodali 200 µL kloroforma in dobro premešali na vibracijskem mešalniku. Sledila je 10-minutna inkubacija na sobni temperaturi in 15-minutno centrifugiranje pri 4 °C in 12.000 g. Po centrifugiranju so se oblikovale tri ločene faze. 500 µL zgornje vodne faze smo previdno, da se ne bi dotaknili interfaze, prenesli v nove ohlajene mikrocentrifugirke. Glikogen s koncentracijo 5 mg/mL smo redčili do koncentracije 100 µg/mL in vzorcem dodali 10 µL razredčenega
glikogena ter 500 µL izopropanola. Vse vzorce smo premešali na vibracijskem mešalniku in kratko centrifugirali. Sledila je 10-minutna inkubacija na ledu in 15-minutna inkubacija pri - 20 °C ter 10-minutno centrifugiranje pri 4 °C in 12.000 g.
Nadaljevali smo s spiranjem vzorca. Po centrifugiranju smo čimveč supernatanta odpipetirali iz mikrocentrifugirk, pri tem smo pazili, da je usedlina ostala v mikrocentrifugirki. Dodali smo 500 µL ohlajenega 75 % etanola in vzorce premešali na vibracijskem mešalniku, da se je usedlina odlepila od podlage.
Vzorce smo 5 min centrifugirali pri 4 °C in 7500 g, odstranili supernatant in nato spiranje ponovili še dvakrat. Po zadnjem spiranju smo vzorce še enkrat centrifugirali 1 min pri 4 °C in 12.000 g in nato odpipetirali še ostanek supernatanta. Mikrocentrifugirke smo 20 min pustili odprte, da so se vzorci posušili na zraku. Ko so bili vzorci suhi, smo dodali 15 µL vode brez RNaz/DNaz, resuspendirali z nastavkom za pipeto in inkubirali 10 min na 55 °C. Vzorce smo nato na kratko centrifugirali in izmerili absorbanco, na podlagi katere smo določili čistost in koncentracijo izolirane RNA. Do nadaljnjih postopkov smo RNA shranili na - 80 °C.
3.13.2 Merjenje koncentracije in čistosti RNA
Koncentracijo in čistost RNA smo določili s pomočjo spektrofotometra NanoDrop™ One/OneC.
Nukleinske kisline absorbirajo svetlobo pri valovni dolžini 260 nm, proteini 280 nm in topila pri 230 nm. Čistost izolirane RNA smo zato določili na podlagi razmerja absorbanc A260/A280 in A260/A230. Obe vrednosti sta pri čisti RNA višji od 1,8. Vrednost nižja od 1,8 pri razmerju A260/A280 pomeni kontaminacijo s proteini, pri A260/A230 pa s topili. Koncentracijo RNA smo določili na podlagi absorbance pri 260 nm. Ena glavnih pomanjkljivosti spektrofotometrične analize je vpliv kontaminacije z genomsko DNA ali fenoli, ki prav tako absorbirajo svetlobo pri 260 nm in zato povzročijo napačne kvantitativne meritve.
Pri merjenju absorbance smo kot slepi vzorec uporabljali vodo. Meritve smo izvajali z 1,2 µL vzorca.
3.13.3 Merjenje celovitosti RNA
Pri oceni kvalitete izolirane RNA smo poleg koncentracije in čistosti RNA določili tudi stopnjo njene celovitosti, saj lahko pri izolaciji pride do kontaminacije z RNazami in posledično do razgradnje RNA. Za merjenje celovitosti RNA smo uporabili Agilent 2100 Bioanalyzer, ki temelji na mikropretočni kapilarni elektroforezi in se uporablja za analizo RNA, DNA in proteinov. 2100 Bioanalyzer omogoča oceno kakovosti RNA na podlagi razmerja 18S in 28S ribosomske RNA, ocene koncentracij, slike psevdogela, elektroferograma in številke celovitosti RNA (RIN, angl. RNA integrity number). RIN se izračuna s pomočjo algoritma, ki temelji na veliki zbirki podatkov o različnih RNA iz različnih tkiv.
Maksimalna vrednost RIN je 10 in pomeni popolno celovitost RNA. Prednosti naprave so majhna poraba vzorca in reagenta, hitrost analize in lažja priprava
Maksimalna vrednost RIN je 10 in pomeni popolno celovitost RNA. Prednosti naprave so majhna poraba vzorca in reagenta, hitrost analize in lažja priprava