Potrditev prekomernega izražanja s prenosom western in imunodetekcijo 43

qPCR smo kasneje določili še relativno razliko v mRNA proteinov NONO in PCBP2 v celicah s prekomerno izraženima proteinoma in kontrolnih vzorcih.

4.2.1 Potrditev prekomernega izražanja s prenosom western in imunodetekcijo

Prenos western in imunodetekcijo smo izvedli pri prvi neodvisni ponovitvi. Ločili smo citoplazemsko in jedrno proteinsko frakcijo, proteine nanesli na poliakrilamidni gel in izvedli NaDS-PAGE. Sledil je prenos western in imunodetekcija. Za imunodetekcijo smo uporabili primarna protitelesa proti FLAG-oznaki v primeru detekcije proteina NONO in primarna protitelesa proti V5-oznaki pri detekciji PCBP2. Sekundarna protitelesa so bila konjugirana s HRP, kar je omogočilo detekcijo proteinov na membrani.

Poleg imunodetekcije preučevanih proteinov smo izvedli tudi imunodetekcijo kontrol nanosa. Pri jedrni fazi smo kot kontrolo izbrali lamin A/C, pri citoplazemski pa protein GAPDH.

Prekomerno izražanje NONO je bilo uspešno tako v citoplazmi (slika 13) kot tudi v jedru (slika 14). Pri citoplazemski frakciji celic, transficiranih z vektorjem FLAG-p54, vidimo lise pri okoli 65 kDa, kar je višje od pričakovane velikosti NONO s FLAG-oznako 55,7 kDa. To je lahko posledica posttranslacijskih modifikacij proteina. Pri kontrolnih vzorcih, kjer smo celice transficirali z enakim vektorjem brez zapisa za NONO, ni lis pri tej velikosti. Pri jedrni fazi celic, transfeciranih s FLAG-p54, opazimo dve lisi pri približno 42 in 50 kDa, ki jih ni pri kontrolnih vzorcih. Podvojenost lis je vejetno posledica napake pri pripravi jedrne frakcije za nanos na gel in nepopolne denaturacije proteinov. Na membranah so prisotne tudi lise, ki pripadajo kontrolam nanosa. Pri citoplazemski frakciji se lise nahajajo pri približno 38 kDa, kar ustreza velikosti GAPDH 36 kDa. Pri jedrni frakciji pa so lise pri približno 73 in 90 kDa, kar je nekoliko več od velikosti lamina A/C 74 in 65 kDa. Velikosti lis, ki ustrezajo kontrolam nanosa, so pri vseh vzorcih približno enake. To potrjuje, da je prisotnost lis, ki pripadajo proteinu NONO, posledica prekomernega izražanja in ne razlik v nanosu vzorcev.

Slika 13: Potrditev prekomernega izražanja proteina NONO v citoplazmi celic Huh-7. V prvi žepek smo nanesli velikostni standard, v žepkih F1, F2 in F3 so citoplazemske frakcije celic, transficiranih z vektorjem brez zapisa za NONO pControl, v žepkih N1, N2 in N3 so citoplazemske frakcije celic, transficiranih z enakim vektorjem z zapisom za NONO. Z zeleno obrobo so označene lise, ki ustrezajo rekombinantnemu proteinu NONO, njegova pričakovana velikost je 55,7 kDa. Pri vseh vzorcih so prisotne lise pri približno 38 kDa, kar ustreza pričakovani velikosti GAPDH 36 kDa.

Slika 14: Potrditev prekomernega izražanja proteina NONO v jedru celic Huh-7. V prvem in zadnjem žepku je velikostni standard, v žepkih F1, F2 in F3 so jedrne frakcije celic, transficiranih z vektorjem brez zapisa za NONO pControl, v žepkih N1, N2 in N3 so jedrne frakcije celic, transficiranih z enakim vektorjem z zapisom za NONO. Z rdečo obrobo so označene lise, ki pripadajo kontroli nanosa lamin A/C. Z zeleno obrobo so označene lise, ki pripadajo rekombinantnemu proteinu NONO, njegova pričakovana velikost je 55,7 kDa. Dvojne lise so verjetno posledica slabe denaturacije vzorcev pred nanosom na poliakrilamidni gel.

Prekomerno izražanje PCBP2 je bilo prav tako uspešno v jedru (slika 15) in v citoplazmi (slika 16). V obeh primerih so v vzorcih celic, transficiranih z vektorjem pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, prisotne lise pri približno 43 kDa, ki ustrezajo pričakovani velikost rekombinantnega proteina 41,9 kDa. Pri kontrolnih vzorcih, kjer smo celice transficirali z enakim vektorjem brez zapisa za PCBP2, ni lis pri tej velikosti. Na membranah z označenim PCBP2 so prisotne tudi številne lise, ki ne ustrezajo velikosti rekombinantnega proteina. Najverjetneje so posledica nespecifične vezave primarnih protiteles proti V5-oznaki. Na membrani z nanešeno jedrno frakcijo so vidne tudi intenzivnejše lise pri približno 85 in 69 kDa.

Le-te pripadajo kontroli nanosa lamin A/C, čeprav so malo višje od pričakovane velikosti proteinov 74 kDa in 65 kDa. Velikosti teh lis so enake, kar potrjuje, da je prisotnost lis, ki pripadajo PCBP2, posledica prekomernega izražanja in ne razlik v količini nanešenega vzorca.

Slika 15: Potrditev prekomernega izražanja proteina PCBP2 v jedru celic Huh-7. V žepke T1, T2 in T3 smo nanesli jedrno frakcijo celic, ki so bile transficirane z vektorjem pT7-V5-SBP-C1, v žepkih P1, P2 in P3 so jedrne frakcije celic, transficiranih z enakim vektorjem z zapisom za PCBP2, v zadnji žepek je nanešen velikostni standard. Z zeleno obrobo so označene lise, ki pripadajo rekombinantnemu proteinu PCBP2, saj ustrezajo njegovi pričakovani velikosti 41,9 kDa. Z rdečo obrobo so označene lise, ki pripadajo kontroli nanosa lamin A/C. Neoznačene lise so posledica nespecifične vezave protiteles.

Slika 16: Potrditev prekomernega izražanja proteina PCBP2 v citoplazmi celic Huh-7. V prvi žepek smo nanesli velikostni standard, v žepkih T1, T2 in T3 so citoplazemske frakcije celic, transficiranih z vektorjem pT7-V5-SBP-C1, v žepkih P1, P2 in P3 pa so citoplazemske frakcije celic, transficiranih z enakim vektorjem z zapisom za PCBP2. Z zeleno obrobo so označene lise, ki ustrezajo pričakovani velikosti rekombinantnega proteina 41,9 kDa.

Na membrani z nanešeno citoplazemsko frakcijo zaradi podobne velikosti PCBP2 in kontrole nanosa GAPDH nismo mogli hkrati detektirati obeh proteinov.

Zato smo v tem primeru najprej izvedli imunodetekcijo PCBP2, nato odstranjevanje protiteles in imunodetekcijo GAPDH. Po postopku odstranjevanja protiteles z membrane smo ponovno detektirali kemiluminiscenco. Detekcija je potekala pod enakimi pogoji kot predhodna detekcija PCBP2. Na membrani nismo zaznali nobene lise (slika 17), kar potrjuje uspešno odstranitev sekundarnih protiteles, konjugiranih s HRP. Predpostavili smo, da smo odstranili tudi primarna protitelesa, saj naj bi uporabljena metoda omogočala odstranjevanje tako sekundarnih kot tudi primarnih protiteles [64]. Poleg tega smo za detekcijo GAPDH in PCBP2 uporabili protitelesa iz različnih organizmov, zato pri ponovni detekciji na isti membrani ne bi prišlo do navzkrižnega signala.

Slika 17: Odstranjevanje protiteles z membrane na sliki 17. Po odstranjevanju protiteles na membrani ni ostalo nobene lise.

Na sliki 18 so prikazani rezultati imunodetekcije GAPDH. Intenzivne lise so prisotne pri približno 38 kDa, kar ustreza pričakovani velikosti GAPDH 36 kDa.

Tudi v tem primeru so velikosti lis enake, kar potrjuje, da so lise, ki pripadajo PCBP2, posledica prekomernega izražanja rekombinantnega proteina v citoplazmi.

Slika 18: Rezultat imunodetekcije proteina GAPDH v citoplazemski frakciji celic Huh-7. V prvi žepek smo nanesli velikostni standard, v žepkih T1, T2 in T3 so citoplazemske frakcije celic, transficiranih z vektorjem pT7-V5-SBP-C1, v žepkih P1, P2 in P3 pa so citoplazemske frakcije celic, transficiranih z enakim vektorjem z zapisom za PCBP2. Pri vseh vzorcih so vidne intenzivne lise pri približno 38 kDa, kar ustreza pričakovani velikosti GAPDH 36 kDa.

4.2.2 Potrditev prekomernega izražanja s qPCR

Prekomerno izražanje NONO in PCBP2 smo potrdili tudi s pomočjo qPCR. Na podlagi dobljenih Cp-vrednosti smo določili relativno razliko v koncentraciji mRNA NONO in PCBP2 med celicami, ki so bile transficirane z vektorji z zapisi za NONO

oziroma PCBP2, in kontrolnimi celicami, ki so bile transficirane z vektorji brez zapisov za izbrana proteina pControl oziroma pT7-V5-SBP-C1.

Izražanje NONO v celicah, transficiranih z vektorjem FLAG-p54, je bilo 30,68-krat višje kot v kontrolnih celicah (slika 19). Razlika v izražanju je bila statistično značilna, saj je bila izračunana p-vrednost manjša od 0,05, in sicer 1,73 x 10^-11, kar pomeni, da smo uspešno prekomerno izrazili mRNA.

Slika 19: Določanje izražanja NONO s qPCR. Graf prikazuje razmerje med povprečjem izražanja mRNA NONO v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in v kontrolnih celicah ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev. P-vrednost: **** < 0,0001.

Pri prekomernem izražanju PCBP2 je prav tako prišlo do statistično značilnega povečanja izražanja (slika 20). V celicah, transficiranih z vektorjem z zapisom za PCBP2, je bilo izražanje mRNA PCBP2 8,44-krat večje kot v kontrolnih celicah.

Izračunana p-vrednost je bila enaka 4,60 x 10^-9, kar je manj od stopnje značilnosti (a=0,05) in posledično je razlika v izražanju statistično značilna.

Slika 20: Določanje izražanja PCBP2 s qPCR. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne mRNA PCBP2 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in v kontrolnih celicah ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev. P-vrednost: **** < 0,0001.

Celovitost izolirane RNA

Kakovost izolirane RNA smo analizirali s pomočjo kapilarne elektroforeze Agilent 2100 Bioanalyzer. Za analizo smo iz vsake neodvisne ponovitve izbrali tri vzorce in na podlagi teh sklepali o kvaliteti izolacije RNA pri vsaki neodvisni ponovitvi.

Kot rezultat analize smo pridobili elektroferograme analiziranih vzorcev, RIN-vrednosti (slika 21) in slike psevdogelov (slika 22), ki prikazujejo, kako bi vzorci izgledali pri izvedbi AGE. Na podlagi dobljenih rezultatov smo ocenili stopnjo razgrajenosti izolirane RNA. Pri vseh vzorcih, razen pt7 1.1, so bile RIN-vrednosti višje od 9,5. Na elektroferogramih pa sta bila izrazita dva pika, ki pripadata 18s in 28s rRNA in ni bilo prisotnih pikov pri manjših dolžinah, kar pomeni, da je bila RNA v teh vzorcih celovita. Pri izolaciji vzorca pt7 1.1 je verjetno prišlo do kontaminacije z RNazami in do razgradnje RNA, saj je RIN enak 2,5 in najvišji pik je prisoten med 25 in 200 nt. To dokazujejo tudi slike psevdogelov, na katerih pri vseh vzorcih, razen pt7 1.1, vidimo dve lisi pri okoli 2000 in 4000 nt. Pri vzorcu pt7 1.1 pa ni izrazitih lis, največja intenziteta signala pa je pri nizkih dolžinah med 25 in 200 nt.

Slika 21: Analiza celovitosti izolirane RNA – elektroferogrami in RIN. Oznaka vzorca je sestavljena iz imena uporabljenega za transfekcijo vektorja (nono pomeni FLAG-p54, pflag – pControl, pcbp2 – pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, pt7 - pT7-V5-SBP-C1), številke ponovitve in številke vzorca v triplikatu. Na x-osi so označene dolžine fragmentov RNA, na y-osi je označena fluorescenca. Izrazit pik pri 4000 nt pri vseh vzorcih razen pt7 1.1 pripada 28s rRNA, izrazit pik pri 2000 nr pa pripada 18s rRNA. RIN je število celovitosti RNA in njena maksimalna vrednost je 10. Pri vzorcu pt7 1.1 je prišlo do kontaminacije z RNazami in razgradnje RNA, saj je RIN-vrednost samo 2.5 in najvišji pik je med 25 in 200 nt.

51

Slika 22: Analiza celovitosti izolirane RNA – psevdogel. Oznaka vzorca je sestavljena iz imena uporabljenega za transfekcijo vektorja (nono pomeni FLAG-p54, pflag – pControl, pcbp2 – pT7-V5-SBP-C1-PCBP2), številke ponovitve in številke vzorca v triplikatu. Slika prikazuje, kako bi izgledali vzorci na agaroznem gelu pri izvedbi AGE.

Pri vseh vzorcih razen pt7 1.1 sta prisotni intenzivni lisi pri 2000 in 4000 nt, kar dokazuje njihovo celovitost. Pri vzorcu pt7 1.1 je prišlo do razgradnje RNA, saj ni izrazitih lis in najbolj intenziven signal je med 25 in 200 nt.

Vpliv prekomernega izražanja proteinov na izražanje circRNA

Po potrditvi prekomernega izražanja NONO in PCBP2 smo preverili vpliv prekomernega izražanja teh proteinov na izražanje izbranih krožnih RNA (tabela 17). Izražanje circRNA smo analizirali s qPCR. Da bi določili vpliv NONO, smo na podlagi dobljenih Cp-vrednosti izračunali relativno razliko med izražanjem circRNA v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in izražanjem v kontrolnih celicah, transficiranih s pControl. Da bi določili vpliv PCBP2 pa smo primerjali izražanje circRNA v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1. Za vsak vzorec smo izračunali tudi standardno deviacijo in p-vrednost, ki je pokazatelj statistične značilnosti rezultatov.

Instrument Name: DE24802359 Firmware:

© Copyright 2003 - 2009 Agilent Technologies, Inc.

Chip Information:

2100 expert_Eukaryote Total RNA Nano_DE24802359_2020-09-30_13-12-42.xad Page 1 of 19 Created:

© Copyright 2003 - 2009 Agilent Technologies, Inc.

Chip Information:

2100 expert_Eukaryote Total RNA Nano_DE24802359_2020-09-30_13-12-42.xad Page 1 of 19 Created:

Tabela 17: Seznam analiziranih krožnih RNA.

NONO PCBP2

hsa_circ_0008016 hsa_circ_0008016 hsa_circ_0008274 hsa_circ_0008274 hsa_circ_0040921 hsa_circ_0040921 hsa_circ_0014879 hsa_circ_0014879 hsa_circ_0062682 hsa_circ_0062682 hsa_circ_0001955 hsa_circ_0001955 hsa_circ_0048492 hsa_circ_0001917 hsa_circ_0004094 hsa_circ_0028196 hsa_circ_0062022

Izražanje hsa_circ_0001917 je bilo v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, za 3 % nižje kot v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1 (slika 23).

Razlika ni bila statistično značilna.

Slika 23: Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0001917. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0001917 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in kontrolnih celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Izražanje hsa_circ_0014879 je bilo za 29 % večje v celicah s prekomerno izraženim NONO (slika 24) in za 4 % nižje v celicah s prekomerno izraženim PCBP2 (slika 25) kot v kontrolnih celicah. V obeh primerih je bila izračunana p-vrednost večja od stopnje značilnosti.

Slika 24: Vpliv prekomernega izražanja NONO na izražanje hsa_circ_0014879. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0014879 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo.

Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Slika 25:Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0014879. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0014879 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in kontrolnih celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Izražanje hsa_circ_0028196 je bilo v celicah s prekomerno izraženim PCBP2 samo za 1 % večje kot v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1 (slika 26), izračunana p-vrednost je bila pri tem bistveno večja od stopnje značilnosti.

Slika 26: Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0028196. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0028196 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in v kontrolnih celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

V celicah s prekomerno izraženim NONO je bilo izražanje hsa_circ_0008016 za 59 % nižje kot v kontrolnih celicah (slika 27). P-vrednost je bila v tem primeru 0,06, kar je več od stopnje značilnosti, zato ničelne domneve nismo mogli zavrniti.

Slika 27: Vpliv prekomernega izražanja NONO na izražanje hsa_circ_0008016. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0008016 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo.

Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

V celicah s prekomerno izraženim PCBP2 je bilo izražanje hsa_circ_0008016 za 43 % večje kot v kontrolnih celicah (slika 28). Tudi v tem primeru razlika ni bila statistično značilna.

Slika 28: Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0008016.Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0008016 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in kontrolnih celicah , transficiranih s pT7-V5-SBP-C1, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih

V celicah, transficiranih z vektorjem z zapisom za NONO, je bilo izražanje hsa_circ_0048492 za 22 % večje kot v celicah, transficiranih z vektorjem brez zapisa za NONO (slika 29). P-vrednost je bila pri tem previsoka, da bi lahko razliko v izražanju opredelili kot statistično značilno.

Slika 29: Vpliv prekomernega izražanja NONO na hsa_circ_0048492. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0048492 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

V celicah s prekomerno izraženim NONO je bila hsa_circ_0062682 za 33 % bolj izražena kot v kontrolnih celicah (slika 30). Razlika ni bila statistično značilna.

Slika 30:Vpliv prekomernega izražanja NONO na izražanje hsa_circ_0062682. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0062682 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo.

Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

V celicah s prekomerno izraženim PCBP2 je bila hsa_circ_0062682 za 2,5 % bolj izražena kot v kontrolnih celicah (slika 31). Razlika ni bila statistično značilna.

Slika 31: Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0062682. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0062682 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo.

Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Izražanje hsa_circ_0040921 je bilo v primerjavi s kontrolnimi celicami znižano v celicah s prekomerno izraženim NONO, in sicer za 12 % (slika 32). Izračunana p-vrednost je bila prevelika, da bi lahko potrdili statistično značilnost.

Slika 32: Vpliv prekomernega izražanja NONO na izražanje hsa_circ_0040921. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0040921 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo.

Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Izražanje hsa_circ_0040921 je bilo v primerjavi s kontrolnimi celicami znižano v celicah s prekomerno izraženim PCBP2, in sicer za 6 % (slika 33). Izračunana p-vrednost je bili prevelika, da bi lahko potrdili statistično značilnost.

Slika 33: Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0040921. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0040921 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in kontrolnih celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Za analizo izražanja hsa_circ_0008274 s qPCR smo uporabili več začetnih nukleotidov. Najprej smo uporabili prvi par začetnih nukleotidov, vendar talilna krivulja ni imela samo enega izrazitega vrha, ki je značilen za specifično pomnoževanje, zato smo reakcijo ponovili z drugim zaporedjem. V prvem poskusu je bilo izražanje hsa_circ_0008274 v celicah, transficiranih z FLAG-p54, za 16 % večje kot v celicah, transficiranih s pControl (slika 34). V celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, pa je bilo izražanje te krožne RNA za 6

% manjše kot v kontrolnih celicah (slika 35). Razliki nista bili statistično značilni.

Slika 34: Vpliv prekomernega izražanja NONO na izražanje hsa_circ_0008274 – rezultat qPCR z uporabo prvega para začetnih oligonukleotidov. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0008274 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Slika 35: Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0008274 – rezultat qPCR z uporabo prvega para začetnih oligonukleotidov. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0008274 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in kontrolnih celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

V drugem poskusu je prišlo do večjih razlik v izražanju. V celicah s prekomerno izraženim NONO je bilo izražanje hsa_circ_0008274 za 48 % večje kot v kontrolnih celicah (slika 36). P-vrednost je bila enaka 0,07, kar je blizu stopnje značilnosti, vendar preveč za potrditev alternativne domneve. V celicah s prekomerno izraženim PCBP2 je bilo izražanje hsa_circ_0008274 za 35 % večje kot v kontrolnih celicah, vendar razlika v izražanju ni bila statistično značilna (slika 37).

Slika 36: Vpliv prekomernega izražanja NONO na izražanje hsa_circ_0008274 - rezultat qPCR z uporabo drugega para začetnih oligonukleotidov. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0008274 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Slika 37: Vpliv prekomernega izražanja PCBP2 na izražanje hsa_circ_0008274 - rezultat qPCR z uporabo drugega para začetnih oligonukleotidov. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0008274 v celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1-PCBP2, in kontrolnih celicah, transficiranih s pT7-V5-SBP-C1, ter standardno deviacijo. Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev.

Izražanje hsa_circ_0001955 je bilo v celicah, transficiranih s FLAG-p54, za 37 % večje kot v celicah transficiranih s pControl (slika 38). Razlika v izražanju je bila statistična značilna, saj je bila p-vrednost enaka 0,007, kar je manj od stopnje značilnosti in zato smo lahko potrdili alternativno domnevo.

Slika 38: Vpliv prekomernega izražanja NONO na izražanje hsa_circ_0001955. Graf prikazuje razmerje med povprečjem prisotne hsa_circ_0001955 v celicah, transficiranih s FLAG-p54, in kontrolnih celicah, transficiranih s pControl, ter standardno deviacijo.

Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev. P-vrednost: ** <

Relativno izražanje je izračunano na podlagi treh neodvisnih ponovitev. P-vrednost: ** <

In document DIPLOMSKO DELO (Strani 61-83)