Nabor gostiteljev bakteriofaga so preverjali z analizo pojavljanja plakov. Bakteriofag BF25/12 je učinkoval proti nekaterim sevom D. fangzhongdai in D. dadantii. Interakcijo med BF25/12 in D. fangzhongdai so preučili še na ravni celičnih in bakteriofagnih ultrastruktur. Poročali so o razgradnji bakterijskih znotrajceličnih granul kot odgovor na okužbo z bakteriofagom. Razgradnja granul je verjetno posledica bakterijskega stresa zaradi okužbe z bakteriofagom, pri čemer bi lahko ti opazovani presnovni vključki (ang.
inclusions) povečali sposobnost preživetja bakterije in omejili bakteriofagno okužbo (Alič in sod., 2017b).
Genom bakteriofaga B25/12 sestavlja linearna dvoverižna DNA dolžine 43872 baznih parov. Analiza genoma podpira razvrstitev bakteriofaga BF25/12 v družino Podoviridae.
Genom obsega gene strukturnih proteinov in proteinov, ki sodelujejo pri razmnoževanju bakteriofaga. V genomu je bil identificiran gen za endolizin, kar se sklada z opaženo morfologijo plakov (halo efekt). V genomu niso našli genov za odpornost proti antibiotikom ali genov za toksine (slika 6). Največja podobnost genoma BF25/12 je z genomom bakteriofaga PP16, ki okužuje bakterije rodu Pectobacterium (79 % identičnost). Podobnost z genomi drugih poznanih poddružine Podoviriade pa je bistveno manjša (< 33 %) (Alič in sod., 2017b). Naknandne analize bakteriofag BF25/12 uvrščajo v nov rod Phimunavirus (Buttimer in sod., 2020).
A B
Slika 6: Anotiran genom BF25/12. Geni, ki kodirajo ohranjene proteine so označeni z rumeno barvo, tisti, ki kodirajo proteine, katerih funkcijo ne moremo predvideti z bioinformacijsko analizo, pa so označeni s sivo. Predstavljene enote genoma so v baznih parih (povzeto po Alič in sod., 2017b).
Pri oceni primernosti bakteriofaga kot sredstva za biološko zatiranje moramo upoštevati vpliv dejavnikov okolja na stabilnost bakteriofaga. BF25/12 je stabilen pri nevtralnem in alkalnem pH, a občutljiv za kisel pH in UV sevanje. Stabilnost bakteriofaga je odvisna tudi od sestave gojišča in koncentracije bakteriofaga. Za dolgoročno shranjavanje bakteriofaga BF25/12 sta najbolj primerni temperaturi 4 °C in –80 °C. Pri bakteriofagih, ki so bili daljše obdobje shranjeni na –20 °C, pa je titer padel. Od vseh testiranih temperatur je bila temperatura 28 °C najmanj ustrezna za dolgoročno shranjevanje (Alič in sod., 2017b).
Eden izmed največjih izzivov pri uporabi bakteriofagov za biološko zatiranje je pojav odpornosti bakterij. Alič in sod. so raziskovali razvoj odpornosti pri bakteriji D. fangzhongdai B16 proti okužbi z bakteriofagom BF25/12. Razvoj odpornih kolonij B16 je bil odvisen od koncentracije bakteriofaga. Najvišjo stopnjo odpornosti so bakterije razvile pri koncentraciji bakteriofaga med 104 in 105 PFU/mL (Alič in sod., 2017b).
3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL
3.1.1 Bakterija D. fangzhongdai
V magistrski nalogi smo uporabili pet sevov D. fangzhongdai, in sicer, B16, MK7, JS5T, S1 in NCPPB 3274. Vse bakterije so bile shranjene v sistemu za shranjevanje bakterijskih kultur MicrobankTM (Pro-Lab Diagnostics) pri –20 °C. V preglednici 2 so predstavljeni podatki o izvoru sevov.
3.1.2 Bakteriofag BF25/12
V magistrski nalogi smo uporabili bakteriofag BF25/12, ki so ga Alič in sod. izolirali iz orhidej z bolezenskimi znaki mehkih gnilob. Po izolaciji so bakteriofage namnožili v obogatitveni suspenziji z bakterijskimi sevi D. fangzhongdai (skupina UDL-3).
Namnožene bakteriofage so sprali s plošč, jih prefiltrirali skozi celulozni filter s premerom por 0,2 µm (Sarstedt) ter shranili pri 4 °C (Alič in sod., 2017b).
3.1.3 Raztopine, gojišča in pufri
V tem poglavju so opisani protokoli za pripravo raztopin, gojišč in pufrov, ki smo jih uporabili v eksperimentalnem delu magistrske naloge.
3.1.3.1 Raztopina 1 M MgSO4
Za pripravo 1 L raztopine 1 M MgSO4 smo odtehtali 246 g MgSO4 × 7 H2O in raztopili v 1 L deionizirane vode. Raztopino smo flitrirali skozi celulozni fliter s premerom por 0,2 µm. Raztopino smo do uporabe hranili pri 4 °C.
3.1.3.2 Raztopina 1 M CaCl2
Za pripravo 1 L raztopine 1 M CaCl2 smo odtehtali 147 g CaCl2 × 2 H2O in raztopili v 1 L deionizirane vode. Raztopino smo flitrirali skozi celulozni fliter s premerom por 0,2 µm. Raztopino smo do uporabe hranili pri 4 °C.
3.1.3.3 Trdno gojišče LB z MgSO4 in CaCl2
Za pripravo 1 L trdnega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2 smo odtehtali 10 g triptona (DB 211705), 5 g kvasnega ekstrakta (DB 212750), 15 g agarja (DB 214010) in 0,5 g NaCl.
Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Gojišče smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Po avtoklaviranju smo v 1 L gojišča dodali 10 mL 1 M MgSO4 in 2 mL 1 M CaCl2. Tako pripravljeno gojišče smo razlili v petrijevke in pustili, da se strdi. Petrijevke z gojiščem smo do uporabe smo hranili pri sobni temperaturi.
3.1.3.4 Tekoče gojišče LB z MgSO4 in CaCl2
Za pripravo 1 L tegočega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2 smo odtehtali 10 g triptona (DB 211705), 5 g kvasnega ekstrakta (DB 212750) in 0,5 g NaCl. Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Gojišče smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Po avtoklaviranju smo v 1 L gojišča dodali 10 mL 1 M MgSO4 in 2 mL 1 M CaCl2. Tekoče gojišče smo do uporabe hranili pri sobni temperaturi.
3.1.3.5 Mehki agar LB z MgSO4 in CaCl2
Za pripravo 1 L mehkega agarja LB z MgSO4 in CaCl2 smo odtehtali 10 g triptona (DB 211705), 5 g kvasnega ekstrakta (DB 212750), 4 g agarja (DB 214010) in 0,5 g NaCl.
Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Gojišče smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Po avtoklaviranju smo v 1 L gojišča dodali 10 mL 1 M MgSO4 in 2 mL 1 M CaCl2. Mehki agar smo do uporabe hranili v vodni kopeli pri 48 °C.
3.1.3.6 Fosfatni pufer (PB)
Za pripravo 1 L fosfatnega pufra (PB) smo odtehtali 1,3425 g Na2HPO4 × 2 H2O in 0,4 g NaH2PO4 × 2 H2O. Obe navedeni sestavini smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Pufer smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Do uporabe smo hranili pri sobni temperaturi.
3.1.3.7 Fiziološka raztopina magnezija z želatino (pufer SMG)
Za pripravo 1 L fiziološke raztopine magnezija z želatino (pufer SMG) smo odtehtali 2 g MgSO4 × 7 H2O; 5,8 g NaCl in 0,1 g želatine (Merck 1.04070) ter dolili 50 mL 1 M Tris HCl pufra (pH 7,5). Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Pufer smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Do uporabe smo hranili pri sobni temperaturi.
3.2 METODE
3.2.1 Analiza pojavljanja plakov
3.2.1.1 Priprava redčitev bakteriofaga
Najprej smo pripravili redčitveno vrsto bakteriofaga. Založna koncentracija bakteriofaga je bila 3,2 × 109 plakotvornih enot (PFU)/mL. V mikrocentrifugirki smo pripravili bakteriofag s koncentracijo 1,0 × 109 PFU/mL (v 1375 µL pufra SMG smo dodali 625 µL bakteriofaga). Pripravili smo redčitve tako pripravljene bakteriofagne kulture v pufru SMG od 10-1 do 10-7 v korakih z desetkratnim redčenjem (v 1800 µL pufra SMG smo dodali po 200 µL bakteriofaga ustrezne koncentracije). Redčitve smo pripravili v mikrocentrifugirkah z nižjo vezavo proteinov (Protein LoBind, Eppendorf).
3.2.1.2 Priprava bakterijske suspenzije
Pet sevov D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1 in NCPPB 3274), ki so bili shranjeni v sistemu za shranjevanje bakterijskih kultur MicrobankTM (Pro-Lab Diagnostics) pri –20 °C smo nacepili na trdno gojišče LB z MgSO4 in CaCl2. Bakterije smo preko noči inkubirali pri 28 °C. Naslednji dan smo bakterijsko kulturo precepili na sveže trdno gojišče LB z MgSO4 in CaCl2 in bakterije ponovno inkubirali preko noči pri 28 °C.
Iz trdne prekonočne kulture smo v pufru PB pripravili bakterijsko suspenzijo s koncentracijo 107 kolonijskih enot (CFU)/mL. Koncentracijo bakterijske suspenzije smo določili z merjenjem turbidnosti, izraženo v enotah McFarland. Pripravljeno bakterijsko suspenzijo smo sinhronizirali v fazi rasti s 30 minutno inkubacijo pri 4 °C. Po sinhronizaciji smo bakterijsko suspenzijo desetkrat redčili v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Tako pripravljeno bakterijsko suspenzijo smo inkubirali 16 ur s stresanjem (100 obr./min) pri temperaturi 28 °C. Naslednji dan smo 16 ur staro bakterijsko suspenzijo sinhronizirali z inkubacijo pri 4 °C (do uporabe, ne več kot 5 ur).
3.2.1.3 Priprava petrijevk za analizo pojavljanja plakov
Pripravili smo 9 mL alikvote mehkega agarja z MgSO4 in CaCl2 in jih shranili v vodni kopeli pri 48 °C. Pripravili smo desetkratno redčitev sinhroniziranih bakterijskih suspenzij (3.2.1.2) v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Posameznemu alikvotu mehkega agarja smo dodali 275 µL tako pripravljene bakterijske suspenzije (slika 7).
Mehki agar z dodano bakterijo smo najprej 15–20 sekund stresali na vibracijskem mešalniku, nato pa zlili po trdnem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2 v petrijevki. Petrijevke smo pustili odprte v laminariju, da se je mehki agar strdil (15–20 min). Nato smo na plošče nanesli 30 µL kapljice posamezne koncentracije bakteriofaga. Za negativno
kontrolo smo nakapljali pufer SMG brez dodanega bakteriofaga. Po nanosu kapljic smo petrijevke pustili v laminarju, da so se kapljice posušile (15–20 min).
Tako pripravljene petrijevke smo inkubirali pri štirih temperaturah: 20, 28, 37 in 42 °C.
Rezultate analize pojavljanja plakov smo preverili po 18 in 42 urah inkubacije. Rezultate smo beležili pisno in s fotografiranjem. Naredili smo 1 biološko ponovitev.
Slika 7: Shema metode analize pojavljanja plakov. SMG označuje nakapljano kaplico pufra SMG, v katerem so bili razredčeni bakteriofagi.
3.2.2 Analiza adsorpcije
3.2.2.1 Priprava bakteriofaga
V pufru SMG smo pripravili bakteriofagno suspenzijo s koncentracijo 7,2 × 107 PFU/mL.
Bakteriofagno suspenzijo smo do uporabe hranili pri 4 °C.
3.2.2.2 Priprava bakterijske suspenzije za test adsorpcije
Pripravili smo bakterijsko suspenzijo D. fangzhongdai B16, kot je bilo opisano pri analizi pojavljanja plakov (3.2.1.2), s to razliko, da smo bakterijske suspenzije inkubirali pri temperaturi analize adsorpcije (28 ali 37 °C).
3.2.2.3 Priprava suspenzij za test adsorpcije
S pomočjo denzitometra smo izmerili turbidnost 16 ur stare bakterijske suspenzije, ki je bila izražena v enotah McFarland. Iz dobljene meritve smo po enačbi 1 preračunali koncentracijo (c) bakterijske suspenzije na enoto CFU/mL:
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) = 𝑚𝑒𝑟𝑖𝑡𝑒𝑣 𝑀𝑐𝐹𝑎𝑟𝑙𝑎𝑛𝑑 × 3 × 108 ... (1)
Pripravili smo dve suspenziji, suspenzijo z bakterijo (SB) in kontrolno suspenzijo (KS).
V centrifugirko KS smo dodali 27 mL tekočega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2, ki je bilo predhodno ogreto na temperaturo analize. V centrifugirko SB pa smo dodali bakterijsko suspenzijo in tekoče gojišče LB z MgSO4 in CaCl2, ki smo ju preračunali po enačbi 2 in 3. Volumen (V) dodane bakterije smo preračunali tako, da je bila multipliciteta okužbe (MOI) enaka 0,1.
𝑉(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) =7,2 𝑥 107𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 𝑥 30 𝑚𝐿
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) 𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 ... (2)
𝑉(𝑔𝑜𝑗𝑖šč𝑎) = 27 𝑚𝐿 − 𝑉(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) ... (3)
V obe centrifugirki smo dodali 3 mL bakteriofaga s koncentracijo 7,2 × 107 PFU/mL. Ob dodatku je prišlo do desetkratnega redčenja bakteriofaga (7,2 × 106 PFU/mL). Končni volumen v obeh centrifugirkah je znašal 30 mL (slika 8).
Slika 8: Shema priprave suspenzije z bakterijo (SB) in kontrolne suspenzije (KS).
3.2.2.4 Test adsorpcije
Takoj po dodatku bakteriofaga smo vsebino v obeh centrifugirkah nežno premešali na vibracijskem mešalniku, odvzeli vzorec za časovno točko 0 min in obe centrifugirki postavili v vodno kopel ogreto na temperaturo analize adsorpcije (28 ali 37 °C). V časovnih točkah 2, 5, 10, 15, 20, 25 in 30 min smo iz centrifugirke v vodni kopeli odvzeli dvakrat po 1 mL vzorca (za dve tehnični ponovitvi) in ga redčili v 9 mL ohlajenega pufra SMG. Pri tem je ponovno prišlo do desetkratnega redčenja bakteriofaga (7,2 × 105 PFU/mL). Takoj po redčenju smo vzorce nežno premešali na vibracijskem mešalniku.
Vzorce smo nato prefiltrirali skozi filter s premerom por 0,22 µm. V filtratu smo dobili proste bakteriofage, ki se niso adsorbirali na bakterijske celice. Iz centrifugirke KS, kjer nismo dodali bakterijske kulture, smo vzorce odvzeli le v prvi (0 min) in zadnji (30 min) časovni točki. Filtrate smo shranili v mikrocentrifugirkah z nižjo vezavo poteinov (Protein LoBind, Eppendorf).
3.2.2.5 Določitev titra bakteriofaga
V nadaljevanju smo določili koncentracije prostih bakteriofagov v posameznih časovnih točkah.
Najprej smo pripravili bakterijsko suspenzijo D. fangzhongdai B16, kot je bilo opisano pri analizi pojavljanja plakov (3.2.1.2). Sinhronizirano bakterijsko suspenzijo smo desetkrat redčili v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Pripravili smo 3,5 mL alikvote mehkega agarja LB z MgSO4 in CaCl2 in jih shranili v vodni kopeli pri 48 °C. Pripravili smo redčitve filtratov, ki smo jih dobili pri testu adsorpcije (3.2.2.4) v SMG pufru od 10-1 do 10-4 v korakih z desetkratnim redčenjem (v 108 µL SMG pufra smo dodali 12 µL filtrata ustrezne koncentracije). Posameznemu alikvotu mehkega agarja smo dodali 100 µL desetkrat redčene bakterijske suspenzije in enak volumen posamezne redčitve filtrata.
Nato smo mehki agar z dodano bakterijo in filtratom stresali 15–20 sekund na vibracijskem mešalniku in ga prelili čez petrijevko s trdim gojiščem LB z MgSO4 in CaCl2.
Tako pripravljene petrijevke smo inkubirali pri 28 °C. Po 8 urni inkubaciji smo prešteli plake in izračunali delež adsorbiranih bakteriofagov v suspenziji v različnih časovnih točkah. Najprej smo po enačbi 4 izračunali koncentracijo prostih bakteriofagov v izhodni suspenziji na enoto PFU/mL.
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑣) =š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝑝𝑙𝑎𝑘𝑜𝑣
100 µ𝐿 × 10 × 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑑č𝑒𝑛𝑗𝑎 ... (4)
Iz dobljenih vrednosti smo po enačbi 5 izračunali delež adsorbiranih (% ads.) bakteriofagov. Razliko vrednosti PFU/mL prostega bakteriofaga v SB in vrednost PFU/mL prostega bakteriofaga v KS smo delili z vrednostjo PFU/mL prostega bakteriofaga v KS. Da smo dobili delež adsorbiranih bakteriofagov, smo dobljeno množili z vednostjo 100.
% 𝑎𝑑𝑠. 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑣 = 𝑐(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑣 𝑣 𝐾𝑆)−𝑐(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎 𝑣 𝑆𝐵)
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎 𝑣 𝐾𝑆) × 100 ... (5)
Slika 9: Shema metode analize adsorpcije bakteriofagov na tarčne bakterije; (SB) suspenzija z bakterijo, (KS) kontrolna suspenzija.
3.2.3 Spremljanje kinetike rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga
3.2.3.1 Priprava bakterijske suspenzije
Pripravili smo bakterijsko suspenzijo petih sevov D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1 in NCPPB 3274) kot je bilo opisano pri analizi pojavljanja plakov (3.2.1.2), s to razliko, da smo bakterijske suspenzije inkubirali pri temperaturi 28 ali 37 °C.
3.2.3.2 Priprava redčitev bakteriofaga
Izhodna koncentracija bakteriofaga je bila 7,2 × 107 PFU/mL. Pripravili smo redčitve izhodne suspenzije bakteriofaga v pufru SMG od 10-1 do 10-6 v korakih z desetkratnim redčenjem (v 1440 µL pufra SMG smo dodali po 160 µL bakteriofaga ustrezne koncentracije). Redčitve smo pripravili v mikrocentrifugirkah z nižjo vezavo poteinov (Protein LoBind, Eppendorf).
3.2.3.3 Priprava mikrotitrske plošče
Najprej smo sinhronizirano bakterijsko suspenzijo desetkrat redčili v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Pripravili smo mikrotitrsko ploščo. V vdolbinice bakterije z bakteriofagom (slika 10) smo dodali 190 µL tekočega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2; 6,3 µL desetkrat redčene bakterijsko suspenzije in enak volumen posamezne koncentracije bakteriofaga. V vdolbinice bakterije brez bakteriofaga smo namesto bakteriofaga dodali 6,3 µL pufra SMG. Za negativno kontrolo pa smo v jamico dodali le 202,6 µL tekočega
gojišča LB z MgSO4 in CaCl2. Vsebino v jamicah smo premešali s pipetiranjem. Na koncu smo mikrotitrsko ploščo zatisnili z optično folijo in jo dali v predogret instrument Tecan, kjer smo nastavili program za merjenje absorbance pri 595 nm pri temperaturi 28 ali 37 °C. Meritev je potekala 24 ur v 10 minutnih časovnih intervalih.
Od dobljenih meritev absorbance v vdolbinicah bakterije z ali brez bakteriofaga smo odšteli povprečno vrednost tehničnih ponovitev negativne kontrole.
Slika 10: Shema priprave mikrotitrske plošče za spremljanje kinetike rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga.
3.2.3.4 Test LAS
Občutljivost bakterij za okužbo z bakteriofagom pri različnih temperaturnih pogojih v tekoči kulturi smo ovrednotili s testom LAS (ang. liquid assay score). Občutljivost seva za okužbo z bakteriofagom v 12 urnem časovnem intervalu smo izračunali po enačbi 6 in 7. Dobljene vrednosti so enake površini med krivuljo rasti bakterije brez bakteriofaga in rasti bakterije z bakteriofagom, deljeno s površino pod krivuljo rasti bakterije brez bakteriofaga ter pomnoženo s 100. Rezultat 0 pomeni, da ni prišlo do inhibicije rasti bakterij, in da bakterija ni občutljiva za okužbo z bakteriofagom. V nasprotju pa vrednost 100 predstavlja popolno odsotnost rasti bakterije okužene z bakteriofagi (Xie in sod., 2018).
𝑝𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑝𝑜𝑑 𝑔𝑟𝑎𝑓𝑜𝑚 = ∑ 𝑂𝐷(𝑖+1)+𝑂𝐷(𝑖) 2
72𝑖=1 ... (6)
𝐿𝐴𝑆 =𝑃𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑟𝑎𝑠𝑡𝑖 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒 𝑏𝑟𝑒𝑧 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎− 𝑃𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑟𝑎𝑠𝑡𝑖 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒 𝑧 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑚
𝑃𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑟𝑎𝑠𝑡𝑖 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒 𝑏𝑟𝑒𝑧 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎 × 100 ... (7)
4 REZULTATI
4.1 ANALIZA POJAVLJANJA PLAKOV
Pri S1 in NCPPB 3274 pri temperaturah 20, 28, 37 in 42 °C nismo opazili vpliva bakteriofaga na rast bakterij (slika 11). Pri sevih B16, MK7 in JS5T, zraslih na trdnem gojišču, smo na nekaterih mestih, kjer smo nakapljali kapljice bakteriofaga, opazili območja razbistritve, torej območja brez rasti bakterij, ki jih imenujemo plaki. Pri visokih koncentracijah nanešenega bakteriofaga so se posamezni plaki zlili v enotno cono (čista cona oz. cona popolne lize). Pri nižjih koncentracijah pa smo opazili ločene posamezne plake ali pa plakov ni bilo.
Občutljivost bakterij B16, MK7 in JS5T za okužbo z bakteriofagom je bila temperaturno odvisna. Pri nižji temperaturi inkubacije (20 in 28 °C) so bili posamezni plaki dobro vidni (premer ≥ 1 mm) tudi pri najnižjih koncentracijah nanešenega bakteriofaga (slika 11 in 13, preglednica 5). Medtem ko pri enakih koncentracijah nanešenega bakteriofaga pri višji temperaturi inkubacije (37 in 42 °C) plakov ni bilo ali so bili slabše vidni (premer <
1 mm, slika 12).
Pri 20 in 28 °C smo pri bakteriji B16 in MK7 opazili motne obroče okoli čistih con oz.
posameznih plakov (slika 11). Ta pojav imenujemo halo efekt. Pri 28 °C smo halo efekt opazili tudi pri bakteriji JS5T, vendar je bil ta manj izrazit (tanjši obroči okoli čistih con oz. posameznih plakov). Z daljšanjem časa inkubacije smo pri B16 in MK7 opazili povečevanje in razslojitev halo obroča, s svetlejšim in manj motnim obročem na notranji strani ter s temnejšim in bolj motnim obročem na zunanji strani (slika 13). Pri temperaturi 37 in 42 °C halo efekta nismo opazili.
Po 42 urah inkubacije pri 28 °C in 37 °C so se pri bakterijah B16, MK7 in JS5T na površini čistih con začele pojavljati bakterijske kolonije. To nakazuje na razvoj odpornosti bakterij proti okužbi z bakteriofagom (preglednica 5).
Slika 11: Rezultati analize občutljivosti bakterijskih sevov D. fangzhongdai B16, MK7, JS5T, S1 ali NCPPB 3274 za bakteriofag BF25/12 pri temperaturah 20, 28, 37 ali 42 °C po 18 urni inkubaciji. Po 30 µL posamezne redčitve bakteriofaga BF25/12 smo nanesli na bakterijsko kulturo petih sevov D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1, NCPPB 3274) in plošče inkubirali 18 ur pri izbrani temperaturi. Nanešene koncentracije bakteriofaga si sledijo od zgoraj navzdol; od najvišje (109 PFU/mL) proti najnižji (102 PFU/mL). Redčitve bakteriofaga so bile pripravljene v pufru SMG, ki je nanešen na bakterijsko kulturo tudi kot kontrola.
Slika 12: Primeri plakov s premerom manjšim od 1 mm, ki so na sliki 11 težko vidni s prostim očesom; (A) plaki pri B16 pri nanešeni koncentraciji bakteriofaga 103 PFU/mL pri 37 °C; (B) plaki pri B16 pri nanešeni koncentraciji bakteriofaga 104 PFU/mL pri 42 °C; (C) plaki pri MK7 pri nanešeni koncentraciji bakteriofaga 103 PFU/mL pri 37 °C; (D) plaki pri JS5T pri nanešeni koncentraciji bakteriofaga 104 PFU/mL pri 20 °C.
Preglednica 5: Rezultati analize občutljivosti bakterijskih sevov D. fangzhongdai B16, MK7 ali JS5T za bakteriofag BF25/12 pri temperaturah 20, 28, 37 ali 42 °C
sev Ta čista cona/plakib premer plakov halo efektc odporne bakterijed
B16
a – Temperatura v enoti °C, pri kateri smo naredili analizo pojavljanja plakov.
b – Prisotnost čiste cone oz. posameznih plakov je označena s plusom (+), konfluentna bakterijska rast pa je označena z minusom (−). Število v oklepaju predstavlja zadnjo nanešeno koncentracijo bakteriofaga v enoti PFU/mL, kjer smo še lahko opazili čisto cono ali prisotnost posameznih plakov.
c – Halo efekt so motni obroči okoli čistih con oz. posameznih plakov. Prisotnost halo efekta je označena s plusom (+), odsotnost pa z minusom (−). Število v okolepaju predstavlja čas od začetka inkubacije, ko smo opazili halo efekt.
d – Pojav bakterijskih kolonij na površini čistih con oz. posameznih plakov je označen s plusom (+), odsotnost pa z minusom (−). Število v okelpaju predstavlja čas od začetka inkubacije, ko smo opazili pojav teh bakterijskih kolonij.
Slika 13: Rezultati analize občutljivosti izbranih bakterijskih sevov D. fangzhongdai B16, MK7 ali JS5T za bakteriofag BF25/12 pri temperaturah 20, 28, 37 ali 42 °C po 42 urni inkubaciji. Po 30 µL posamezne redčitve bakteriofaga BF25/12 smo nanesli na bakterijsko kulturo petih sevov D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1, NCPPB 3274) in plošče inkubirali 42 ur pri izbrani temperaturi. Prikazani so rezultati B16, MK7 in JS5T, ki so se razlikovali od rezultatov po 18 urni inkubaciji (slika 11). Nanešene koncentracije bakteriofaga si sledijo od zgoraj navzdol; od najvišje (109 PFU/mL) proti najnižji (102 PFU/mL). Redčitve bakteriofaga so bile pripravljene v pufru SMG, ki je nanešen na bakterijsko kulturo tudi kot kontrola.
4.2 ANALIZA ADSORPCIJE
Pri 28 in 37 °C se je del populacije bakteriofaga v prvih petih minutah zelo hitro adsorbiral (hitra faza adsorpcije). Po petih minutah pa je hitrost adsorpcije upadla (počasna faza adsorpcije) (slika 14).
Razlike v adsorpciji bakteriofagov pri 28 in 37 °C smo analizirali s Student t-testom, ki je pokazal, da temperatura statistično pomembno vpliva (p < 0,05) na odstotek adsorbiranih bakteriofagov v vseh časovnih točkah, razen pri 0 min.
Slika 14: Adsorpcija bakteriofaga BF25/12 na bakterijo D. fangzhongdai B16 pri 28 in 37 °C. Prikazani so odstotki adsorbiranih bakteriofagov na bakterije v različnih časovnih točkah po dodatku bakteriofaga k suspenziji bakterijske kulture inkubirane pri temperaturi 28 ali 37 °C. Rezultati za izvedeno analizo pri temperaturi 28 °C so prikazani z modro, pri 37 °C pa z rumeno barvo. Student t-test je pokazal statistično značilne razlike (< 0,05) v odstotku adsorbiranih bakteriofagov pri 28 in 37 °C pri vseh časovnih točkah, razen pri 0 min. Za vsako temperaturo smo naredili 3 biološke ponovitve. Pri posamezni biološki ponovitvi smo naredili 2 tehnični ponovitvi.
4.3 SPREMLJANJE KINETIKE RASTI BAKTERIJ V TEKOČI KULTURI V PRISOTNOSTI BAKTERIOFAGA
4.3.1 Vpliv bakteriofaga BF25/12 na kinetiko rasti bakterij pri 28 in 37 °C
Bakteriofag BF25/12 pri 28 in 37 °C ni imel vpliva na kinetiko rasti bakterij S1 in NCPPB 3274 (rezultati v Prilogi B). Medtem ko se je kinetika rasti bakterij B16, MK7 in JS5T
spreminjala v odvisnosti od različnih temperatur in koncentracij dodanega bakteriofaga (slika 15).
Pri 28 °C pri tretmajih z najvišjimi začetnimi koncentracijami dodanega bakteriofaga pri B16, MK7 in JS5T sprva nismo opazili povečanja vrednosti absorbance oz. je bilo le-to minimalno (slika 15, Priloga C). Po 10 urah inkubacije pa smo opazili ponovno povišanje absorbance, kar je lahko povezano s pojavom odpornosti bakterij proti bakteriofagu.
Pri 28 °C pri tretmajih s srednjimi začetnimi koncentracijami dodanega bakteriofaga smo pri B16 in MK7 sprva opazili povečanje vrednosti absorbance, ki je dosegla vrh med 3.
in 6. uro inkubacije, nato pa padla (slika 15). Višina vrha je korelirala z začetno koncentracijo dodanega bakteriofaga (Priloga C). Nižja kot je bila začetna koncentracija dodanega bakteriofaga, višja je bila vrednost izmerjene absorbance. Po 10 urah inkubacije pa smo opazili ponovno povišanje absorbance, kar je lahko povezano s pojavom odpornosti bakterij proti bakteriofagu. Pri bakteriji JS5T pa smo prve 4−5 ur spremljali povečanje vrednosti absorbance, ki ji je sledil padec med 6. in 7. uro inkubacije, nato ponovna, a mnogo počasnejša rast (slika 15).
Pri 28 °C pri tretmajih z najnižjimi koncentracijami dodanega bakteriofaga je bila krivulja rasti bakterije primerljiva s krivuljo rasti bakterije brez bakteriofaga.
Pri 28 °C pri tretmajih z najnižjimi koncentracijami dodanega bakteriofaga je bila krivulja rasti bakterije primerljiva s krivuljo rasti bakterije brez bakteriofaga.