Znotraj osrednjega genoma D. fangzhongdai pa so identificirali sedem gruč genov (ang.
gene cluster), ki so skupni vsem sevom (preglednica 3). Krizobaktinski in akromobaktinski operon je odgovoren za biosintezo sideroforjev, ki sodelujejo pri privzemu železa. Gruča genov ind-vfm-expI sodeluje pri sintezi antioksidanta indigoidina in pri regulaciji zaznavanja kvoruma. Sevom D. fangzhongdai so skupni geni, ki kodirajo sintezo toksina zeamin, citotoksina cianobaktin in tiopeptidov. Slednji imajo antibiotično aktivnost. Poleg tega je pri vseh sevih D. fangzhongdai prisotna gruča genov, ki kodira kompleks neribosomske peptidne sintaze (NRPS) in poliketidne sintaze (PKS).
Kompleksi NRPS/PKS sodelujejo pri sintezi polimerov peptidil/karbonilnih verig.
Številni zgoraj omenjeni metaboliti in efektorji imajo pomembno vlogo pri intraspecifični kompeticiji in prilagajanju neugodnim razmeram v okolju ter dajejo sevom D.
fangzhongdai selektivno prednost v različnih okoljih (Alič in sod., 2019).
Poleg zgoraj opisanih sedmih gruč genov, so odkrili še dodatnih pet, ki so prisotne le pri nekaterih sevih D. fangzhongdai (preglednica 3). Dva od teh operonov vključujeta gene, za katere predvidevajo, da so vključeni v sintezo arilpropilenov in bakteriocinov.
Bakteriocini so peptidni/polipeptidni toksini, ki jih bakterije sintetizirajo za zaviranje rasti sorodnih bakterijskih sevov (Cotter in sod., 2013), aril-polienske spojine pa so strukturno podobne karotenoidom in verjetno ščitijo bakterije pred reaktivnimi vrstami kisika (ROS) (Schöner in sod., 2016). Bakteriocini so prisoti pri vseh sevih D. fangzhongai, razen pri JS5T. Gensko zaporedje za sintezo arilpoliena pa je bilo identificirano pri vseh sevih
D. fangzhongdai, z izjemo pri sevih JS5T, B16 in MK7. Tretja prepoznana gruča genov kodira NRPS, ki je prisoten pri sevih JS5T, S1, B16 in MK7. Ker v podatkovni bazi ni bilo podatkov o homolognih genih s poznano funkcijo drugih bakterij, ne poznamo sekundarnega metabolita, katerega sintetizira produkt zaporedja NRPS. Pri sevu NCPPB 3274 so prepoznali dve skupini NRPS, ena od teh kodira trans aciltransferazno PKS (Alič in sod., 2019).
Preglednica 3: Predvidena prisotnost sekundarnih metabolitov, sideroforjev in bakteriocinov v sevih D. fangzhongdai identificiranih z analizo determinant genomov s programom antiSMASH (povzeto po Alič in sod., 2019).
Z analizo genoma so v genomih sevov D. fangzhongdai potrdili prisotnost mobilnih genetskih elementov (MGE) (Alič in sod., 2019). MGE so zaporedja DNA, ki se lahko premikajo po genomu in spreminjajo število svojih kopij, kar pogosto vpliva na aktivnost prepisa bližnjih genov. Med MGE uvrščamo transpozicijske elemente, genome bakteriofagov (profagi) in plazmide. Število posameznih MGE se med sevi D. fangzhongdai razlikuje (preglednica 4). V genomih sevov D. fangzhongdai lahko najdemo insercijska zaporedja (IS), profage in plazmide. IS je kratko zaporedje DNA, ki deluje kot preprost transpozicijski element (Mahillon in Chandler, 1998). Število IS se med posameznimi sevi giblje od nič (S1) do pet (ND14b). V genomu seva ND14b in M074 so našli eno, pri NCPPB 3274 pa dve profagni zaporedji. Pri sevu NCPPB 3274 obe profagni zaporedji pripadata bakteriofagom iz družine Myoviridae, in sicer, Haemophilus virusu HP1 in HP2 ter bakteriofagu Enterobacteria P88. Ostali sevi D.
fangzhongdai pa v svojih genomih niso vsebovali celotnih profagnih zaporedij, temveč le kratke profagne fragmente. Pri sevu S1 so odkrili plazmid, ki ima zapis za odpornost proti antibiotiku streptomicinu. Pomembni deli genomov bakterij, ki so jih pod drobnogled vzeli tudi v študiji Alič in sod., so elementi CRISPR, ki zagotavljajo pridobljeno imunost proti virusom in plazmidom. Vsi predstavniki vrste D. fangzhongdai v svojih genomih vsebujejo več elementov CRISPR (preglednica 4). Največ (sedem) so jih našli pri sevu B16 in MK7 (Alič in sod., 2019).
Preglednica 4: Prisotnost različnih mobilnih genetskih elementov in CRISPR v genomih sevov D. fangzhongdai (prirejeno po Alič in sod., 2019).
2.2 BAKTERIOFAGI KOT SREDSTVA ZA BIOLOŠKO ZATIRANJE
2.2.1 Prednosti uporabe bakteriofagov
Široka uporaba antibiotikov v medicini in kmetijstvu v zadnjih 70 letih je prispevala k razvoju odpornosti številnih patogenih bakterij proti antibiotikom (Pirnay in Kutter, 2020). Na primer; v nasadih jabolk in hrušk, kjer so prekomerno uporabljali antibiotik streptomicin za zdravljenje hruševega ožiga, je povzročiteljica Erwinia amylovora razvila odpornost proti tem antibiotiku (Förster in sod., 2015; Sholberg in sod., 2016; Svircev in sod., 2018; Tancos in sod., 2016). Posledično se povečuje zanimanje za raziskovanje naravnih načinov obvladovanja bakterijskih okužb, med katere sodi tudi uporaba bakteriofagov (Scircev in sod., 2018).
Uporaba bakteriofagov ima številne prednosti:
(1.) Bakteriofagi so prisotni povsod, kjer lahko najdemo njihove bakterijske gostitelje, zato jih lahko izoliramo iz raznovrstnih okoljskih virov, kot so voda, zemlja, rastlinski in živalski material.
(2.) Bakteriofagi se podvajajo, dokler je v okolju prisotna gostiteljska bakterija.
(3.) Bakteriofagi so varni za uporabo, ker ne morejo okužiti evkariontskih celic.
(4.) Bakteriofagi so najpogosteje zelo specifični in lahko okužujejo eno vrsto ali celo en sam sev bakterije, ne da bi pri tem poškodovali ostalih bakterij v okolju (npr.
pomembne bakterije v mikrobioti).
(5.) Večina izoliranih bakteriofagov je precej stabilnih in jih lahko več mesecev shranjujemo pri 4 °C brez občutne izgube virulence (Jones in sod, 2007).
2.2.2 Bakteriofagna terapija v kmetijstvu: začetki, izzivi in rešitve
Bakteriofagi predstavljajo atraktiven način preprečevanja in obvladovanja najrazličnejših bakterijskih okužb, tudi rastlinskih. Prvi eksperimentalni dokaz, da lahko z bakteriofagi zdravimo tudi rastlinske bolezni, sega v leto 1924. Znanstveniki so takrat dokazali, da filtrat, pridobljen iz razpadajočega zelja, prepreči bolezen zeljne gnilobe, ki jo povzroča bakterija Xanthomonas campestris pv. Campestris (Mallmann in Hemstreet, 1924 cit. po Jones in sod., 2007). Leta 1935 so izvedli prvo terensko analizo, kjer so semena koruze predhodno tretirali z bakteriofagi in poročali o upadu Stewartove bolezni, ki jo povzroča bakterija Pantoea stewartii (Thomas, 1935 cit. po Jones in sod., 2007). Kasneje so uporabo bakteriofagov med drugim preizkušali za obvladovanje hruševega ožiga na jablanah in hruškah, bakterijske uvelosti (ang. bacterial wilt) na tobaku, bakterijskih razjed na citrusih (ang. citrus bacterial canker) in bakterijske pegavosti na geraniji (Jones in sod., 2007).
Kljub številnim prednostim pa so se v praksi le redki bakteriofagi izkazali za uspešne pri nadzoru rastlinskih bolezni. Eden od izzivov bakteriofagne terapije je, da lahko bakterije razvijejo odpornost proti okužbi z bakteriofagom. Negativen vpliv pojava odpornih bakterij lahko zmanjšamo z uporabo bakteriofagih koktajlov, namesto aplikacije posameznega bakteriofaga. Poleg tega moramo pri nadzoru bakterijskih povzročiteljev rastlinskih bolezni upoštevati kompleksno dinamiko med bakteriofagi, bakterijami in njihovim okoljem. Bakteriofagi so v naravi izpostavljeni številnim okoljskim dejavnikom, ki lahko močno vplivajo na njihovo stabilnost in infektivnost. UV sevanje, pH in temperatura lahko inaktivirajo ali celo uničijo bakteriofage. Zmanjševanju titra bakteriofaga se lahko zato izognemo z aplikacijo bakteriofaga v času, ko je sončno sevanje manjše (zgodaj zjutraj in zvečer). Uspešno aplikacijo bakteriofagov lahko dosežemo tudi z zaščitnimi pripravki, ki bakteriofagom omogočijo preživetje v spremenljivem okolju (Jones in sod., 2007; Svircev in sod., 2018). Alternativni način uporabe bakteriofaga je uporaba sistema za dovajanje živih bakterijskih celic, ki zagotovi preživetje in nadaljnje podvojevanje bakteriofagov pred prihodom bakterijskih povzročiteljev bolezni (Svircev in sod., 2018). Primer take uporabe so opisali Iriarte in sod., ki so žive celice oslabljenega bakterijskega seva Xanthomonas perforans uporabili za ohranitev populacije bakteriofagov v in na tleh (Iriarte in sod., 2012).
Drug način uporabe bakteriofagov za nadzor bolezni je integrirani pristop, kjer bakteriofage kombiniramo z drugimi biokontrolnimi sredstvi. V študiji iz leta 2005 so Obradovic in sod. pokazali, da kombinacija acibenzolar-S-metila in bakteriofagov deluje veliko boljše proti bolezni bakterijska pegavost na paradižniku, kot vsak posebej (Obradovic in sod., 2005).
Čas uporabe bakteriofagov je ključnega pomena za uspeh obvladovanja bakterijskih okužb. Bakteriofage lahko uporabimo za zmanjšanje že obstoječe populacije bakterijskih povzročiteljev bolezni ali pa aplikacijo načrtujemo za čas, ko pričakujemo povečanje njihove populacije. Učinkovitost obeh načinov je potrebno oceniti kot del biokontrolnega razvojnega programa (Svircev in sod., 2018).
2.2.3 Obvladovanje bolezni mehkih gnilob Dickeya spp. z uporabo bakteriofagov
Na področju kmetijstva so uporabo bakteriofagov med drugim preizkušali tudi za obvladovanje mehkih gnilob, ki jo povzročajo Dickeya spp. (Czajkowski in sod., 2016).
Do sedaj so največjo pozornost posvečali iskanju bakteriofagov, ki bi učinkovali proti D. solani, ki je eden pomembnejših povzročiteljev mehke gnilobe na krompirju. Prva opisana litična bakteriofaga D. solani sta LIMEstone1 in LIMEstone2, iz družine Myoviridae. Zanju je značilna ikozaedrična glava in krčljivi rep ter, da specifično okužujeta le seve D. solani. Za opisana bakteriofaga so testirali njuno uporabnost za obvladovanje bolezni krompirja. Poročali so o znatno zmanjšani pojavnosti okužbe na gomoljih krompirja, ki so jih pred sajenjem tretirali z LIMEstone1 in LIMEstone2 (Adriaenssens in sod., 2012). Iz Poljske so leta 2014 poročali o uspešni izolaciji devetih litičnih bakteriofagov, ki okužujejo Dickeya spp. Vsi bakteriofagi pripadajo družini Myoviridae in imajo podobno morfologijo kapside. Bakteriofagi se med seboj razlikujejo po obsegu gostiteljev, vsi pa okužujejo D. solani. Preverili so tudi njihovo uporabnost za biološko zatiranje. Izkazalo se je, da bakteriofagi učinkovito zmanjšujejo populacije D. solnai in vitro kot tudi na površinah krompirjevih gomoljev (Czajkowski in sod., 2014). Czajkowski in sod. so poročali tudi o dveh bakteriofagih (ϕPD10.3 in ϕPD23.1), ki okužujeta D. solani in nekatere vrste Pectobacterium spp. Od prej opisanih bakteriofagov se razlikujeta v širšem naboru gostiteljskih bakterij in v velikosti kapside in genoma. Bakteriofaga ϕPD10.3 in ϕPD23.1 imata velik aplikativni potencial za nadzor bolezni krompirja, zlasti v kompleksnih okoljih, kjer pričakujemo več kot eno vrsto bakterijskih povzročiteljev bolezni mehkih gnilob (Czajkowski in sod., 2015).
Druga poročila o bakteriofagih, ki učinkujejo proti vrstam rodu Dickeya, opisujejo bakteriofage, izolirane iz Kaspijskega morja (Soleimani-Delfan in sod., 2015), številne bakteriofage izolirane iz odpadne in rečne vode na Škotskem (Day in sod., 2018) ter bakteriofage, izolirani iz odpadne vode in rastlinskega materiala v Sloveniji (Alič in sod., 2017b).
2.2.3.1 Karakterizacija bakteriofaga BF25/12
Alič in sod. so leta 2017 prvič poročali o bakteriofagu iz družine Podoviridae, ki učinkuje proti Dickeya spp. Gre za bakteriofag BF25/12, ki so ga izolirali iz listov orhidej Phalaenopsis z bolezenskimi zanki mehkih gnilob (Alič in sod., 2017b).
Za bakteriofag BF25/12 so značilni veliki (s premerom 6 mm) prozorni plaki, s halo efektom, ki nakazuje prisotnost lizinov (slika 5). V raziskavi Alič in sod. so bakteriofag preučili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) in ga na podlagi opazovane morfologije uvrstili v družino Podoviridae (Alič in sod., 2017b) (slika 5).
Slika 5: (A) Morfologija plakov BF25/12 in (B) morfologija BF25/12 vizualizirana s TEM (prirejeno po