UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Julija RŽIŠNIK
VPLIV TEMPERATURE NA INTERAKCIJO MED BAKTERIJO DICKEYA FANGZHONGDAI IN BAKTERIOFAGOM BF 25/12 (PODOVIRIDAE)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Julija RŽIŠNIK
VPLIV TEMPERATURE NA INTERAKCIJO MED
BAKTERIJO DICKEYA FANGZHONGDAI IN BAKTERIOFAGOM BF25/12 (PODOVIRIDAE)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
THE INFLUENCE OF TEMPERATURE ON INTERACTION BETWEEN DICKEYA FANGZHONGDAI AND PODOVIRIDAE
BACTERIOPHAGE BF25/12 M. SC. THESIS
Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Molekulske in funkcionalne biologije na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno na Nacionalnem inštitutu za biologijo, v laboratorijih Oddelka za biotehnologijo in sistemsko biologijo.
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala izr. prof. dr. Mateja Butalo, somentorico dr. Tanjo Dreo in za recenzentko prof. dr. Marjanco Starčič Erjavec.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Jerneja AMBROŽIČ AVGUŠTIN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Član: izr. prof. dr. Matej BUTALA
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: dr. Tanja DREO
Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za biotehnologijo in sistemsko biologijo
Članica: prof. dr. Marjanca STARČIČ ERJAVEC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora:
Julija Ržišnik
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 577.2(043.2)
KG Dickeya spp., Dickeya fangzhongdai, bakteriofag BF25/12, Podoviridae, obvladovanje bolezni rastlin, mehke gnilobe, orhideje, temperatura, plaki, adsorpcija bakteriofaga, kinetika okužbe z bakteriofagom, test LAS AV RŽIŠNIK, Julija, dipl. biol. (UN)
SA BUTALA, Matej (mentor), DREO, Tanja (somentorica), STARČIČ ERJAVEC, Marjanca (recenzentka)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Magistrski študijski program druge stopnje Molekulska in funkcionalna biologija
LI 2021
IN VPLIV TEMPERATURE NA INTERAKCIJO MED BAKTERIJO DICKEYA FANGZHONGDAI IN BAKTERIOFAGOM BF25/12 (PODOVIRIDAE) TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja)
OP X, 46 str., 7 pregl., 15 sl., 3 pril., 57 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Sevi bakterije Dickeya fangzhongdai povzročajo bolezen mehkih gnilob, ki je v Sloveniji odgovorna za veliko ekonomsko škodo v tržnih obratih vzgoje orhidej. Ena od možnosti za obvladovanje bolezni je, da bi bakteriofag BF25/12, ki specifično okužuje nekatere seve D. fangzhongdai, uporabili kot sredstvo za obvladovanje bolezni orhidej. Pred implementacijo uporabe bakteriofaga v praksi je potrebno dobro poznavanje lastnosti interakcije med bakteriofagom in gostiteljsko bakterijo pri različnih okoljskih pogojih, kot so pH, UV sevanje in temperatura. Namen magistrske naloge je bil raziskati vpliv temperature na interakcijo med bakterijo D.
fangzhongdai in bakteriofagom BF25/12. Vpliv temperature na interakcijo smo proučevali z analizo pojavljanja plakov, analizo adsorpcije in s spremljanjem rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga. Ugotovili smo, da so sevi D.
fangzhongdai B16, MK7 in JS5T bolj občutljivi za okužbo z bakteriofagom pri nižjih (20 in 28 °C) kot pri višjih (37 in 42 °C) temperaturah. Skladno s tem smo ugotovili, da se pri nižji temperaturi (28 °C) na površino D. fangzhongdai B16 adsorbira več bakteriofagov kot pri višji (37 °C). S spremljanjem rasti bakterij smo opazili, da se med različnimi sevi D. fangzhongdai pojavljajo razlike v poteku okužbe pri različnih temperaturah. Pri 28 °C sta seva B16 in MK7 občutljiva, sev JS5T zmerno občutljiv, seva S1 in NCPPB 3274 pa neobčutljiva za okužbo z bakteriofagom. Pri 37 °C pa je bilo vseh pet sevov neobčutljivih za okužbo. Ocenjujemo, da ima bakteriofag pri 28
°C aplikativen potencial za uporabo pri obvladovanju bolezni orhidej, vendar moramo pri tem upoštevati možnost razvoja odpornosti bakterij.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 577.2(043.2)
CX Dickeya spp., Dickeya fangzhongdai, bacteriophage BF25/12, Podoviridae, plant disease control, soft-root, orchids, temperature, plaques, bacteriophage
adsorption, bacteriophage infection kinetics, liquid assay score AU RŽIŠNIK, Julija, dipl. biol. (UN)
AA BUTALA, Matej (supervisor), DREO, Tanja (co-adviser), STARČIČ ERJAVEC, Marjanca (reviewer)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Molecular and Functional Biology
PY 2021
TI THE INFLUENCE OF TEMPERATURE ON INTERACTION BETWEEN BACTERIA DICKEYA FANGZHONGDAI AND PODOVIRIDAE
BACTERIOPHAGE BF25/12
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO X, 46 p., 7 tab., 15 fig., 3 ann., 57 ref.
LA sl AL sl/en
AB Strains of bacteria Dickeya fangzhongdai cause soft-rot disease, which is responsible for high economic loss in commercial production of orchids in Slovenia. One of the disease control options is the bacteriophage BF25/12, which specifically infects some of the strains of D. fangzhongdai and could therefore be used to control soft-rot in orchids. Before the bacteriophage can be used in practice, the interactions with the host bacterium under different environmental conditions such as pH, UV radiation and temperature need to be studied. The aim of this master thesis was to investigate the effect of temperature on the interaction between D. fangzhongdai and bacteriophage BF25/12. The study was conducted by plaque assay, adsorption test and by monitoring bacterial growth in liquid media in the presence of bacteriophage.
Strains B16, MK7 and JS5T were found to be more susceptible to bacteriophage infection at lower temperatures (20 and 28 °C) than at higher temperatures (37 and 42 °C). In addition, it was found that more bacteriophages were adsorbed on the surface of D. fangzhongdai B16 at 28 °C than at 37 °C. By monitoring the bacterial growth, the differences in infection kinetics between different D. fangzhongdai strains at different temperatures were observed. At 28 °C, strains B16 and MK7 were sensitive, strain JS5T was moderately sensitive, and strains S1 and NCPPB 3274 were insensitive to bacteriophage infection. Howevert, at 37 °C, all five strains were insensitive to infection. It is concluded that bacteriophage BF25/12 has potential application for orchid disease control at 28 °C, but the possibility of bacterial resistance should be considered.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VII KAZALO SLIK VIII KAZALO PRILOG
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
IX X
1 UVOD 1
1.1 NAMEN 1
1.2 HIPOTEZE 1
2 PREGLED OBJAV 2
2.1 ROD DICKEYA 2
2.1.1 Bolezen mehkih gnilob rastlin 2
2.1.1.1 Povzročitelji in bolezenski znaki 2
2.1.1.2 Potek okužbe z bakterijami iz rodu Dickeya 3
2.1.2 Taksonomija rodu Dickeya 4
2.1.3 Bakterija Dickeya fangzhongdai 5
2.1.3.1 Geografska in gostiteljska razširjenost vrste D. fangzhongdai ter opisi
bolezenskih znakov, ki jih povzroča 7
2.1.3.2 Genomska karakterizacija vrste D. fangzhongdai 8
2.2 BAKTERIOFAGI KOT SREDSTVA ZA BIOLOŠKO ZATIRANJE 12
2.2.1 Prednosti uporabe bakteriofagov 12 2.2.2 Bakteriofagna terapija v kmetijstvu: začetki, izzivi in rešitve 13 2.2.3 Obvladovanje bolezni mehkih gnilob Dickeya spp. z uporabo
bakteriofagov 14
2.2.3.1 Karakterizacija bakteriofaga BF25/12 15
3 MATERIAL IN METODE 17
3.1 MATERIAL 17
3.1.1 Bakterija D. fangzhongdai 17
3.1.2 Bakteriofag BF25/12 17
3.1.3 Raztopine, gojišča in pufri 17
3.1.3.1 Raztopina 1 M MgSO4 17
3.1.3.2 Raztopina 1 M CaCl2 17
3.1.3.3 Trdno gojišče LB z MgSO4 in CaCl2 17
3.1.3.4 Tekoče gojišče LB z MgSO4 in CaCl2 18
3.1.3.5 Mehki agar LB z MgSO4 in CaCl2 18
3.1.3.6 Fosfatni pufer (PB) 18
3.1.3.7 Fiziološka raztopina magnezija z želatino (pufer SMG) 18
3.2 METODE 19
3.2.1 Analiza pojavljanja plakov 19
3.2.1.1 Priprava redčitev bakteriofaga 19
3.2.1.2 Priprava bakterijske suspenzije 19
3.2.1.3 Priprava petrijevk za analizo pojavljanja plakov 19
3.2.2 Analiza adsorpcije 20
3.2.2.1 Priprava bakteriofaga 20
3.2.2.2 Priprava bakterijske suspenzije za test adsorpcije 20
3.2.2.3 Priprava suspenzij za test adsorpcije 20
3.2.2.4 Test adsorpcije 21
3.2.2.5 Določitev titra bakteriofaga 22
3.2.3 Spremljanje kinetike rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti
bakteriofaga 23
3.2.3.1 Priprava bakterijske suspenzije 23
3.2.3.2 Priprava redčitev bakteriofaga 23
3.2.3.3 Priprava mikrotitrske plošče 23
3.2.3.4 Test LAS 24
4 REZULTATI 25
4.1 ANALIZA POJAVLJANJA PLAKOV 25
4.2 ANALIZA ADSORPCIJE 29
4.3 SPREMLJANJE KINETIKE RASTI BAKTERIJ V TEKOČI KULTURI V
PRISOTNOSTI BAKTERIOFAGA 29
4.3.1 Vpliv bakteriofaga BF25/12 na kinetiko rasti bakterij pri 28 in 37 °C 29
4.3.2 Test LAS 32
5 RAZPRAVA 34
6 SKLEPI 39
7 POVZETEK 40
8 VIRI 41
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Fenotipska karakterizacija D. fangzhongdai v primerjavi z ostalimi Dickeya spp. (povzeto po Alič in sod., 2018 in Tian in sod., 2016). ...5 Preglednica 2: Izvor in genomske značilnosti različnih sevov vrste D. fangzhongdai
(povzeto po Alič in sod., 2019). ...8 Preglednica 3: Predvidena prisotnost sekundarnih metabolitov, sideroforjev in
bakteriocinov v sevih D. fangzhongdai identificiranih z analizo determinant genomov s programom antiSMASH (povzeto po Alič in sod., 2019)... 11 Preglednica 4: Prisotnost različnih mobilnih genetskih elementov in CRISPR v genomih sevov D. fangzhongdai (prirejeno po Alič in sod., 2019). ... 12 Preglednica 5: Rezultati analize občutljivosti bakterijskih sevov D. fangzhongdai B16, MK7 ali JS5T za bakteriofag BF25/12 pri temperaturah 20, 28, 37 ali 42 °C... 27 Preglednica 6: Občutljivost petih sevov D. fangzhongdai B16, MK7, JS5T, S1 ali NCPPB 3274 za okužbo z bakteriofagom BF25/12 v tekoči kulturi pri 28 ali 37 °C ovrednotena s testom LAS.. ... 32 Preglednica 7: Povzetek rezultatov vpliva temperature na interakcijo med petimi sevi D.
fangzhongdai in bakteriofagom BF25/12. ... 33
KAZALO SLIK
Slika 1: Bolezenski znaki mehkih gnilob, ki jo povzročajo bakterije iz rodu Dickeya, pri
nekaterih izmed gospodarsko pomembnih poljščinah (Reverchon in Nasser, 2013). ...2
Slika 2: Shematski prikaz cikla okužbe z bakterijo iz rodu Dickeya (prirejeno po Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2016). ...4
Slika 3: Morfologija kolonij petih različnih sevov bakterije D. fangzhongdai na trdnem gojišču LB, gojenih 40 ur pri 28 °C (Alič in sod., 2018). ...6
Slika 4: Filogenetsko drevo sevov D. fangzhongdai in reprezentativnih sevov drugih vrst rodu Dicekya (Alič in sod., 2019). ... 10
Slika 5: (A) Morfologija plakov BF25/12 in (B) morfologija BF25/12 vizualizirana s TEM (prirejeno po Alič in sod., 2017b). ... 15
Slika 6: Anotiran genom BF25/12 (povzeto po Alič in sod., 2017b). ... 16
Slika 7: Shema metode analize pojavljanja plakov. ... 20
Slika 8: Shema priprave suspenzije z bakterijo (SB) in kontrolne suspenzije (KS). ... 21
Slika 9: Shema metode analize adsorpcije bakteriofagov na tarčne bakterije. ... 23
Slika 10: Shema priprave mikrotitrske plošče za spremljanje kinetike rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga. ... 24
Slika 11: Rezultati analize občutljivosti bakterijskih sevov D. fangzhongdai B16, MK7, JS5T, S1 ali NCPPB 3274 za bakteriofag BF25/12 pri temperaturah 20, 28, 37 ali 42 °C po 18 urni inkubaciji.. ... 26
Slika 12: Primeri plakov s premerom manjšim od 1 mm, ki so na sliki 11 težko vidni s prostim očesom. ... 27
Slika 13: Rezultati analize občutljivosti izbranih bakterijskih sevov D. fangzhongdai B16, MK7 ali JS5T za bakteriofag BF25/12 pri temperaturah 20, 28, 37 ali 42 °C po 42 urni inkubaciji.. ... 28
Slika 14: Adsorpcija bakteriofaga BF25/12 na bakterijo D. fangzhongdai B16 pri 28 in 37 °C.. ... 29
Slika 15: Vpliv bakteriofaga BF25/12 na kinetiko rasti sevov D. fangzhongdai B16, MK7 ali JS5T gojenih v tekoči kulturi pri 28 ali 37 °C.. ... 31
KAZALO PRILOG
Priloga A: Vpliv bakteriofaga BF25/12 na kinetiko rasti sevov D. fangzhongdai B16, MK7 ali JS5T gojenih v tekoči kulturi pri 28 ali 37 °C.
Priloga B: Vpliv bakteriofaga BF25/12 na kinetiko rasti sevov D. fangzhongdai S1 ali NCPPB 3274 gojenih v tekoči kulturi pri 28 ali 37 °C.
Priloga C: Maksimalne vrednosti absorbance, ki so jih dosegle rastne krivulje sevov D. fangzhongdai B16, MK7 in JS5T gojenih v tekoči kulturi v prisotnosti različnih koncentracij bakteriofaga BF25/12.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI Abi abortivna okužba (ang. abortive infection)
BUG Biologov univerzalni rastni medij (ang. Biolog universal growth medium)
c koncentracija (ang. concentration)
CFU kolonijska enota (ang. colony forming unit)
CPG kazamino kislina-pepton-glukoza (ang. casamino acid-peptone- glucose)
CRISPR gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromskih ponovitev (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid) IS insercijsko zaporedje (ang. insertion sequence)
KS kontrolna suspenzija
LB Luria-Bertani
MGE MOI
mobilni genetski elementi (ang. mobile genetic elements) multipliciteta okužbe (ang. multiplicity of infection)
NRPS neribosomska peptidna sintaza (ang. non-ribosomal peptide synthesis)
PB fosfatni pufer (ang. phosphate buffer)
PFU plakotvorna enota (ang. plaque-forming unit)
PK pozitivna kontrola
PKS poliketidna sintaza (ang. polyketide synthase) ROS reaktivne vrste kisika (ang. reactive oxygen species)
SD standardni odklon
SMG fiziološka raztopina magnezija z želatino (ang. saline magnesium glucose)
T2SS sistem izločanja tipa II (ang. type II secretion system) TEM transmisijska elektronska mikroskopija (ang. transmission
electron microscopy)
UV ultravijolično (ang. ultraviolet)
V volumen (ang. volume)
1 UVOD
Rod Dickeya obsega skupino bakterij, ki povzročajo bolezen mehkih gnilob rastlin. Te prizadenejo mnogo gospodarsko pomembnih poljščin in okrasnih rastlin, kot sta na primer krompir in orhideje (Toth in sod., 2011; Alič in sod., 2017a). Ena od zadnjih opisanih vrst rodu je Dickeya fangzhongdai, ki povzroča mehke gnilobe v tržnih obratih vzgoje orhidej v Sloveniji (Alič in sod., 2017a). Sev, izoliran v pridelavi orhidej (D. fangzhongdai B16), je občutljiv za bakteriofag BF25/12 iz družine Podoviridae (Alič in sod., 2017b). V odsotnosti učinkovitih fitofarmacevtskih sredstev bi uporaba bakteriofagov lahko predstavlja novo možnost obvladovanja bolezni orhidej. Za načrtovanje uporabe bakteriofaga v celotnem ciklu vzgoje orhidej, ki vključuje širok razpon temperatur, je nujno dobro poznavanje lastnosti interakcije med bakteriofagom in za orhideje škodljivo bakterijo D. fangzhongdai pri različnih temperaturah.
1.1 NAMEN
Namen magistrske naloge je bil preučiti interakcijo med petimi različnimi sevi D. fangzhondai, izoliranimi iz različnih rastlin in okolij (orhideje, azijske hruške, Aglaonema sp., voda) ter bakteriofagom BF25/12, v odvisnosti od različnih temperatur.
Ugotovitve o odvisnosti okužbe od temperature bi razširile poznavanje interakcije med bakterijo in bakteriofagom in omogočile nadaljnjo oceno primernosti bakteriofaga za obvladovanje bolezni orhidej.
1.2 HIPOTEZE
(1.) Občutljivost izbranih sevov bakterije D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1 in NCBPP 3274) za okužbo z bakteriofagom BF25/12 je temperaturno odvisna.
(2.) Učinkovitost adsorpcije bakteriofaga BF25/12 na bakterijo D. fangzhongdai B16 je temperaturno odvisna.
(3.) Med petimi različnimi sevi bakterije D. fangzhongdai (B16, JS5T, MK7, S1 in NCBPP 3274) se pojavljajo razlike v poteku okužbe z bakteriofagom BF25/12 pri različnih temperaturah.
2 PREGLED OBJAV 2.1 ROD DICKEYA
Rod Dickeya je skupina po Gramu negativnih bakterij iz družine Enterobacteriaceae.
Bakterije iz rodu Dickeya so ene izmed povzročiteljic bolezeni mehkih gnilob rastlin.
Predstavniki tega rodu okužujejo širok nabor gospodarsko pomembnih rastlinskih vrst in povzročajo velike ekonomske izgube po celem svetu. Sprva so bile bakterije iz rodu Dickeya najdene le v tropskih regijah, v zadnjih desetletjih pa se pogosto pojavljajo tudi v Evropi, kjer povzročajo veliko gospodarsko škodo, zlasti v pridelavi krompirja (Toth in sod., 2011).
2.1.1 Bolezen mehkih gnilob rastlin
2.1.1.1 Povzročitelji in bolezenski znaki
Bolezen mehkih gnilob rastlin povzročajo različne vrste bakterij, najpogosteje iz rodu Dickeya in Pectobacterium ter nekatere vrste Pseudomonas, Bacillus in Clostridium (Pritchard in sod., 2016). V nadaljevanju magistrske naloge se bomo osredotočili na bolezen mehkih gnilob rastlin, ki jo povzročajo bakterije iz rodu Dickeya.
Bolezenski znaki mehkih gnilob, ki jo povzročajo bakterije iz rodu Dickeya, se pri rastlini kažejo kot mehka in mokra gniloba, ki se pri mnogih rastlinah širi po steblu navzgor in ob prisotnosti zraka počrni. Gniloba nima vonja, dokler okuženega tkiva ne kolonizirajo sekundarni organizmi. Bolezen mehkih gnilob, ki jo povzročajo bakterije iz rodu Dickeya, prizadene širok nabor gostiteljskih rastlin (slika 1) (Czajkowski, 2011; Reverchon in Nasser, 2013).
Slika 1: Bolezenski znaki mehkih gnilob, ki jo povzročajo bakterije iz rodu Dickeya, pri nekaterih izmed gospodarsko pomembnih poljščinah, kot so: (A) krompir, (B) cikorija, (C) Arabidopsis sp., (D) korenje, (E) paradižnik, (F,G) zelena in rdeča paprika ter (H) zelje (Reverchon in Nasser, 2013).
2.1.1.2 Potek okužbe z bakterijami iz rodu Dickeya
Interakcija med bakterijo iz rodu Dickeya in gostiteljsko rastlino je zelo zapletena. Proces okužbe lahko razdelimo na tri ključne korake: (i) adhezija na površino rastline in prodiranje v rastlinsko tkivo skozi mesta ran ali skozi odprtine kot so listne reže, (ii) vdor po apoplastni poti in (iii) razgradnja celične stene (Reverchon in Nasser, 2013).
Da pride do učinkovite kolonizacije, se morajo bakterije najprej uspešno pritrdi in nato prodreti v tkiva gostitelja. Poleg tega se morajo prilagajati okoljskim pogojem, s katerimi se gostitelji srečujejo. Bakterije iz rodu Dickeya imajo v ta namen razvite zapletene regulatorne mreže, ki uravnavajo izražanje genov za dejavnike virulence. Med dejavnike virulence uvrščamo gradnike celične ovojnice (lipopolisaharidi in zunajcelični polisaharidi), gibljivost celic, sistem za privzem železa, zaščito pred kislimi in oksidativnimi stresi ter zaščito proti antibakterijskim spojinam, ki jih sintetizira gostiteljska rastlina (Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2016; Reverchon in Nasser, 2013).
Ko bakterije najdejo svojega gostitelja, lahko sprva prebivajo kot epifiti na rastlinskih površinah. V ugodnih razmerah, kot so blage temperature (< 30 °C), visoka vlažnost in slaba razpoložljivost kisika, se bakterije namnožijo in razširijo po ksilemskem žilnem sistemu (Pérombelon, 2002). Fitopatogeni cikel bakterij iz rodu Dickeya lahko razdelimo na dve glavni fazi. Sprva se bakterije razmnožujejo brez pojava bolezenskih znamenj na gostiteljski rastlini (asimptomatična faza). V naslednji stopnji pa pride do presnovnega obrata, ko bakterije začnejo izdelovati pektinaze, ki razgradijo pektinske polimere v rastlinski celični steni. Delovanje pektinaz povzroči razgradnjo celične stene, lizo rastlinskih celic in sprostitev celične vsebine. Pektinaze imajo poleg virulence tudi pomembno presnovno vlogo, saj bakterija uporabi razgradne produkte rastlinske celice kot vir hranil. Zaradi delovanja pektinaz se na rastlini pojavijo bolezenski znaki, značilni za bolezen mehkih gnilob (simptomatska faza) (slika 2) (Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2016).
Slika 2: Shematski prikaz cikla okužbe z bakterijo iz rodu Dickeya. Bakterije se uspešno širijo z okuženim rastlinskim materialom. Dokler ne najdejo svojega gostitelja, lahko živijo kot saprofiti v prsti in vodi.
Posamezna poročila pa navajajo, da jih med rastlinami prenašajo tudi insekti. Ko bakterije najdejo svojega gostitelja, lahko sprva prebivajo kot epifiti na rastlinskih površinah. V ugodnih razmerah se bakterije razmnožijo in z razgrajevanjem rastlinskega tkiva na gostiteljski rastlini povzročajo bolezenske znake, značilne za bolezen mehkih gnilob (prirejeno po Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2016).
2.1.2 Taksonomija rodu Dickeya
Domena: Bakterije Deblo: Proteobakterije
Razred: Gama proteobakterije Red: Enterobacterales
Družina: Enterobacteriaceae Rod: Dickeya
Taksonomska klasifikacija rodu Dickeya je bila večkrat spremenjena. Sprva so bili predstavniki vključeni v rod Erwinia, ki je vseboval tako pektinolitične kot nepektinolitične povzročitelje rastlinskih bolezni. Leta 1998 je znanstvena skupnost pektinilitične enterobakterije (E. chrysanthemi in E. carotovora) premestila v rod Pectobacterium (Hauben in sod., 1998). Kasneje se je izkazalo, da se vrsta Pectobacterium chrysanthemi (prej E. chrysanthemi) močno razlikuje od drugih Pectobacterium spp. in je bila zato premeščena v nov rod, imenovan Dickeya (Samson in sod., 2005). Po nekaj preureditvah rod Dickeya danes obsega 12 vrst - Dickeya zeae, Dickeya dadantii, Dickeya chrysanthemi, Dickeya solani, Dickeya aquatica, Dickeya dianthicola, Dickeya paradisiaca, Dickeya fangzhongdai, Dickeya undicola, Dickeya lacustris, Dickeya oryzae, Dickeya poaceiphila (Hugouvieux-Cotte-Pattat in sod., 2019;
Hugouvieux-Cotte-Pattat in sod., 2020; Oulghazi in sod., 2019; Parkinson in sod., 2014;
Samson in sod., 2005; Tian in sod., 2016; Toth in sod., 2011; Wang in sod., 2020). Tako rod Dickeya kot rod Pectobacterium sta bila uvrščena med 10 najpomembnejših rastlinskih patogenih bakterij glede na njihov ekonomski vpliv (Mansfield in sod., 2012).
2.1.3 Bakterija Dickeya fangzhongdai
Bolezen mehkih gnilob je bila do nedavnega opisana le na zelnatih rastlinah. Leta 2016 pa so na Kitajskem prvič poročali o vrsti iz rodu Dickeya, ki okužuje tudi drevesa. V raziskavi Tiana in sod. so preučevali seve iz azijskih hrušk (Pyrus pyrifolia) z razjedami z izcedkom (ang. bleeding canker). Izolirali so tri seve (JS5T, LN1 in QZH3), ki so jih na podlagi molekularnih analiz uvrstili v rod Dickeya. Ker pa so se sevi po fenotipskih in kemotaksonomskih značilnostih močno razlikovali od obstoječih vrst iz rodu Dickeya, so vse tri seve uvrstili v nov takson. Novo odkrito vrsto so poimenovali Dickeya fangzhongdai. Tipski sev vrste D. fangzhongadi je JS5T (Tian in sod., 2016).
D. fangzhongdai je vrsta gibljivih paličastih (ang. motile rods) po Gramu negativnih bakterij. Rastejo na gojišču iz kvasnega peptona, dekstroze ter adenina in po 48 urah inkubacije pri 28 °C tvorijo kolonije s premerom 2 mm. Bakterije D. fangzhongdai so pektinolitične in lahko razgradijo krompirjevo tkivo. Rastejo tudi pri 39 °C in katabolizirajo (−)-D-arabinozo, (+) melibiozo, (+) rafinozo, manitol, mio-inozitol, L- vinsko kislino, timidin in gentiobiozo. Za razliko od nekaterih vrst rodu Dickeya pa so nezmožni presnove 5-keto-D-glukonata in β-gentiobioze, kazeina, L-ramnoze in D- galaktonske kisline-γ-laktona (preglednica 1) (Alič in sod., 2018; Tian in sod., 2016).
Preglednica 1: Fenotipska karakterizacija D. fangzhongdai v primerjavi z ostalimi Dickeya spp.
(1) D. fangzhongdai, (2) D. solani, (3) D. dadantii subsp. Dadantii, (4) D. dianthicola, (5) D. chrysanthemi, (6) D. zeae, (7) D. paradisiaca, (8) D. aquatica, (+) pozitivno, (−) negativno, (v) variabilno (odstotek pozitivnih sevov) (povzeto po Alič in sod., 2018 in Tian in sod., 2016).
Bakterija D. fangzhongdai se od vseh drugih vrst iz rodu Dickeya razlikuje po sposobnosti presnove D-psikoze, znane tudi kot D-aluloza (preglednica 1). Gre za nizkoenergijski ogljikov hidrat, ki je v naravi prisoten v majhnih količinah (Chung in sod., 2012). He in sod. so poročali o bakterijskih sevih, ki D-psikozo pretvorijo v D-fruktozo z uporabo D-psikoze-3-epimeraze (He in sod, 2016). O vlogi D-psikoze pri bakterijah zaenkrat še ni veliko znanega, medtem ko so pri rastlinah dokazali, da D-psikoza sodeluje v rastlinski signalizaciji (Kato-Noguchi, 2005). Sposobnost presnove D-psikoze bi lahko zato imela pomembno selekcijo prednost pri povzročiteljih rastlinskih bolezni kot je D. fangzhongdai (Kano in sod., 2011; Alič in sod., 2018).
Profil maščobnih kislin D. fangzhongdai se razlikuje od drugih vrst iz rodu Dicekya.
Prevladujoče maščobne kisline so C16: 1ω7c / C16: 1ω6c, C16: 0 in C18: 1ω7c, s pomembnimi deležem C12: 0, C14: 0, C13: 0 3-OH / iso-C15: 1 H in C14: 0 3-OH / iso-C16: 1. (Tian in sod., 2016).
Alič in sod. so leta 2018 razširili opis vrste na osnovi primerjalne študije več sevov D. fangzhongdai. Med drugim so raziskali tudi fenotipsko raznolikost znotraj vrste. V raziskavo so vključili seve JS5T, S1, B16, MK7 in NCPPB 3274. Vse zgoraj naštete seve so gojili na štirih različnih gojiščih: CPG, LB, BUG in KingB. Sevi S1, B16, MK7 in NCPPB 3274 so tvorili za rod Dickeya značilne okrogle, umbilicirane in nemukozne kolonije. Morfologija kolonije seva JS5T pa se je bistveno razlikovala od ostalih Dickeya spp. Na vseh testiranih gojiščih so bile kolonije seva JS5T okrogle in mukozne in so se od ostalih razlikovale po vodnati konzistenci (Alič in sod., 2018) (slika 3).
Slika 3: Morfologija kolonij petih različnih sevov bakterije D. fangzhongdai na trdnem gojišču LB, gojenih 40 ur pri 28 °C (Alič in sod., 2018).
Sevi D. fangzhongdai se med seboj razlikujejo tudi v presnovnih značilnostih. Glede na sposobnosti asimilacije različnih virov ogljika lahko seve D. fangzhongdai razdelimo v tri ločene skupine: (i) sev MK7 in NCPPB; (ii) sev B16 in S1 in (iii) sev JS5T. Sevi D. fangzhongdai B16, S1 in JS5T so odporni proti linkomicinu in litijevem kloridu ter so metabolično aktivni ob prisotnosti α-D-laktoze in inozitola. Vsi sevi pa so odporni proti troleandomicinu, rifamicinu SV, Niaproofu 4, vankomicinu, tetrazolij vijoličnem in tetrazolij modrem. Podobnost profila asimilacije različnih virov ogljika med različnimi sevi D. fangzhongdai znaša 90 %. Sevi izvirajo iz različnih okolij, ki imajo specifične
T
značilnosti, gostiteljske pritiske in okoljske omejitve. Fenotipska raznolikost je zato verjetno posledica ekoloških razlik v okoljih, kjer so bili najdeni posamezni sevi D.
fangzhongdai. (Alič in sod., 2018). Opažene fenotipske raznolikosti pa ne moremo razložiti z rezultati študije primerjalne genomike; ta ni pokazala povezave med genomom in fenotipskimi značilnosti ali okoljem, kjer so bili posamezni sevi najdeni (Alič in sod., 2019).
2.1.3.1 Geografska in gostiteljska razširjenost vrste D. fangzhongdai ter opisi bolezenskih znakov, ki jih povzroča
Bakterije vrste D. fangzhongdai povzročajo bolezni povezane z razgradnjo rastlinskega tkiva, ki prizadenejo poleg številnih gospodarsko pomembnih poljščin in dreves tudi okrasne rastline.
O vrsti so prvič poročali leta 2016 na Kitajskem in jo opisali kot povzročitelja razjed z izcedkom na azijskih hruškah (Tian in sod., 2016). Kasneje so o teh bakterijah poročali kot povzročiteljih mehke gnilobe na orhidejah – sprva v Sloveniji (Alič in sod., 2017a), dve leti kasneje pa na Kitajskem (Shen in sod., 2019). Bolezen mehkih gnilob se na listih orhidej najprej kaže kot mokre lise, ki se v ugodnih razmerah (visoka vlažnost in blage temperature) hitro povečujejo in razširijo po celem listu. V nekaj dneh se razgradi celotna notranjost lista. Vrsta D. fangzhongdai je kot eden od povzročiteljev mehkih gnilob orhidej odgovorna za veliko ekonomsko škodo v tržnih obratih vzgoje orhidej (Alič in sod., 2017a; Shen in sod., 2019).
V Maleziji veliko gospodarsko škodo povzroča bolezen sadne gnilobe, ki prizadene sadeže kruhovca (Artocarpus heterophyllus). Iz rastlin z bolezenskimi znaki sadne gnilobe so izolirali bakterijski sev in ga identificirali kot D. fangzhongdai. Gre za prvi opis bolezni sadne gnilobe, ki jo povzročajo bakterije iz rodu Dickeya v Maleziji (Jaffar in sod., 2019).
V začetku julija 2014 je v okrožju Orange v New Yorku prišlo do hudega izbruha bolezni mehke gnilobe na čebuli (Allium cepa). Po vročem in vlažnem vremenu so se pojavili bolezenski znaki, ki so vključevali klorozo, razgradnjo listov, rjavenje in propad rastlin v nekaj dneh. Čebulice obolelih rastlin so bile navzven videti normalno, notranja tkiva pa so bila močno razgrajena. V Združenih državah Amerike so že leta 1986 poročali o izbruhu bolezni mehke gnilobe na čebuli, vendar so šele pred nedavnim identificirali D. fangzhongdai kot njenega povzročitelja (Ma in sod., 2019).
Na Tajvanu so vrsto D. fangzhongdai identificirali kot povzročitelja mehke gnilobe na mladi čebuli (Allium fistulosum). Bolezenski znaki so se skladali s tistimi, ki so jih pri navadni čebuli opisali Ma in sod.. Tsai in sod. so poleg tega poročali, da so se bolezenski
znaki okuženih mladih čebul v laboratoriju razlikovali od tistih, ki so jih opazili pri naravni okužbi na terenu (Tsai in sod., 2019).
Vrsto D. fangzhongdai so odkrili tudi na Aglaonemi sp. v Sveti Luciji in jo našli v vzorcih vode s Škotske in Malezije (Alič in sod., 2018; Pritchard in sod., 2013). Na osnovi podobnosti v zaporedju dnaX nekateri avtorji domnevajo, da številni sevi nekdanje Erwinia chrysanthemi, o katerih so poročali z Japonske, prav tako taksonomsko spadajo v vrsto D. fangzhongdai. To nakazuje na široko geografsko in gostiteljsko območje D. fanzhongdai (Alič in sod., 2018; Suharjo in sod., 2014).
Alič in sod. so iz čistilne naprave uspešno izolirali bakteriofage iz različnih družin, ki so bili aktivni proti D. fangzhongdai. Zato domnevajo, da so bakterije D. fangzhongdai v naravi veliko bolj razširjene, kot lahko trenutno sklepamo na podlagi poročanj o bolezenskih znakih rastlin (Alič in sod., 2017b).
2.1.3.2 Genomska karakterizacija vrste D. fangzhongdai
Vrsta D. fangzhongdai vključuje seve, ki so bili izolirani iz različnih rastlin in vodnih virov (preglednica 2).
Preglednica 2: Izvor in genomske značilnosti različnih sevov vrste D. fangzhongdai. Velikost genoma je prikazana v baznih parih, razmerje baznih parov G:C pa v odstotkih (povzeto po Alič in sod., 2019).
Alič in sod. so primerjali genome zgoraj omenjenih sevov D. fangzhongdai z genomi 31 sevov, ki pripadajo drugim predstavnikom Dickeya spp. Osrednji genom (ang. core genome) je definiran kot skupek genov, ki so prisotni pri vseh sevih ene vrste. Pri vrsti D. fangzhongdai je v osrednjem genomu zapisanih 3520 genov, ki predstavljajo približno tri četrtine genoma posameznega seva. Osrednji genom je relativno dobro ohranjen, saj ima 89 % genov najmanj 95 % identičnost na nukleotidnem zaporedju. Velikost osrednjega genoma D. fangzhongdai je podobna velikosti filogenetsko sorodnima vrstama D. dianthicola (3386 genov) in D. dadantii (3711 genov). Osrednji genom sorodne D. solani pa je nekoliko večji, saj ima zapis za 4009 genov. Omenjeni osrednji
genomi so veliko večji od osrednjega genoma drugih vrst Enterobacterales. To nakazuje na visoko genetsko ohranjenost med vrstami rodu Dickeya. Razlog za to je verjetno v tem, da je večina dejavnikov virulence in njihovih regulatorjev pri Dickeya spp. zapisanih prav v osrednjem genomskem zaporedju (Alič in sod., 2019).
Genomska analiza je pokazala, da imajo bakterije D. fangzhongdai širok nabor genov za encime, ki razgrajujejo celično steno, enako kot modelni sev D. dadantii 3937. Poleg tega so z genomsko analizo pokazali, da imajo z modelnim sevom sorodne gene za sistem izločanja (T2SS) »Stt«, ki ni razširjen med ostalimi vrstami Dickeya (Alič in sod., 2019).
V genomu D. fangzhongdai so našli le 38 genov, ki pri drugih vrstah Dickeya niso prisotni. Večino genov, ki so specifični le za vrsto D. fangzhongdai in imajo predvideno funkcijo, je vključenih v uravnavanje prepisa genov ali metabolizem. Eden od vrstnospecifičnih genov kodira pektinazo iz družine PL10 polisaharidnih liaz. Ta gen se bistveno razlikuje od pektinaz, ki jih najdemo pri drugih Dickeya spp. ali drugih bakterijskih povzročiteljev bolezni rastlin (Alič in sod., 2019).
Primerjalna analiza genomov je na podlagi genomske podobnosti razkrila dodatno združevanje sevov D. fangzhongdai. Seve lahko razdelimo na tri skupine: sevi podobni JS5T, sevi podobni ND14b in sev NCPPB 3274, ki se uvršča ločeno od ostalih, saj je genetsko najbolj oddaljen od ostalih sevov D. fangzhongdai (slika 4). Ohranjenost genoma je znotraj članov iste skupine izredno visoka. Vsaka izmed skupin ima nabor 90−160 genov, ki so značilni le za člane te skupine in so odsotni pri drugih sevih D. fangzhongdai. Zanimivo je, da večina teh genov ni prisotna v genomih drugih bakterij iz rodu Dickeya. Vsi sevi v skupini sevov podobnih ND14b so izolirani iz istega okolja (vode) v isti državi. Skupina sevov podobnih JS5T pa združuje seve, izolirane iz zelo različnih okolji (voda, eno- in dvokaličnice) iz različnih geografskih območji. Rezultati Alič in sod. zato nakazujejo, da pri bakterijah D. fangzhongdai genomska sorodnost ni povezana z njihovim življenjskim prostorom (Alič in sod., 2019).
Slika 4: Filogenetsko drevo sevov D. fangzhongdai in reprezentativnih sevov drugih vrst rodu Dicekya (Alič in sod., 2019).
Znotraj osrednjega genoma D. fangzhongdai pa so identificirali sedem gruč genov (ang.
gene cluster), ki so skupni vsem sevom (preglednica 3). Krizobaktinski in akromobaktinski operon je odgovoren za biosintezo sideroforjev, ki sodelujejo pri privzemu železa. Gruča genov ind-vfm-expI sodeluje pri sintezi antioksidanta indigoidina in pri regulaciji zaznavanja kvoruma. Sevom D. fangzhongdai so skupni geni, ki kodirajo sintezo toksina zeamin, citotoksina cianobaktin in tiopeptidov. Slednji imajo antibiotično aktivnost. Poleg tega je pri vseh sevih D. fangzhongdai prisotna gruča genov, ki kodira kompleks neribosomske peptidne sintaze (NRPS) in poliketidne sintaze (PKS).
Kompleksi NRPS/PKS sodelujejo pri sintezi polimerov peptidil/karbonilnih verig.
Številni zgoraj omenjeni metaboliti in efektorji imajo pomembno vlogo pri intraspecifični kompeticiji in prilagajanju neugodnim razmeram v okolju ter dajejo sevom D.
fangzhongdai selektivno prednost v različnih okoljih (Alič in sod., 2019).
Poleg zgoraj opisanih sedmih gruč genov, so odkrili še dodatnih pet, ki so prisotne le pri nekaterih sevih D. fangzhongdai (preglednica 3). Dva od teh operonov vključujeta gene, za katere predvidevajo, da so vključeni v sintezo arilpropilenov in bakteriocinov.
Bakteriocini so peptidni/polipeptidni toksini, ki jih bakterije sintetizirajo za zaviranje rasti sorodnih bakterijskih sevov (Cotter in sod., 2013), aril-polienske spojine pa so strukturno podobne karotenoidom in verjetno ščitijo bakterije pred reaktivnimi vrstami kisika (ROS) (Schöner in sod., 2016). Bakteriocini so prisoti pri vseh sevih D. fangzhongai, razen pri JS5T. Gensko zaporedje za sintezo arilpoliena pa je bilo identificirano pri vseh sevih
D. fangzhongdai, z izjemo pri sevih JS5T, B16 in MK7. Tretja prepoznana gruča genov kodira NRPS, ki je prisoten pri sevih JS5T, S1, B16 in MK7. Ker v podatkovni bazi ni bilo podatkov o homolognih genih s poznano funkcijo drugih bakterij, ne poznamo sekundarnega metabolita, katerega sintetizira produkt zaporedja NRPS. Pri sevu NCPPB 3274 so prepoznali dve skupini NRPS, ena od teh kodira trans aciltransferazno PKS (Alič in sod., 2019).
Preglednica 3: Predvidena prisotnost sekundarnih metabolitov, sideroforjev in bakteriocinov v sevih D. fangzhongdai identificiranih z analizo determinant genomov s programom antiSMASH (povzeto po Alič in sod., 2019).
Z analizo genoma so v genomih sevov D. fangzhongdai potrdili prisotnost mobilnih genetskih elementov (MGE) (Alič in sod., 2019). MGE so zaporedja DNA, ki se lahko premikajo po genomu in spreminjajo število svojih kopij, kar pogosto vpliva na aktivnost prepisa bližnjih genov. Med MGE uvrščamo transpozicijske elemente, genome bakteriofagov (profagi) in plazmide. Število posameznih MGE se med sevi D. fangzhongdai razlikuje (preglednica 4). V genomih sevov D. fangzhongdai lahko najdemo insercijska zaporedja (IS), profage in plazmide. IS je kratko zaporedje DNA, ki deluje kot preprost transpozicijski element (Mahillon in Chandler, 1998). Število IS se med posameznimi sevi giblje od nič (S1) do pet (ND14b). V genomu seva ND14b in M074 so našli eno, pri NCPPB 3274 pa dve profagni zaporedji. Pri sevu NCPPB 3274 obe profagni zaporedji pripadata bakteriofagom iz družine Myoviridae, in sicer, Haemophilus virusu HP1 in HP2 ter bakteriofagu Enterobacteria P88. Ostali sevi D.
fangzhongdai pa v svojih genomih niso vsebovali celotnih profagnih zaporedij, temveč le kratke profagne fragmente. Pri sevu S1 so odkrili plazmid, ki ima zapis za odpornost proti antibiotiku streptomicinu. Pomembni deli genomov bakterij, ki so jih pod drobnogled vzeli tudi v študiji Alič in sod., so elementi CRISPR, ki zagotavljajo pridobljeno imunost proti virusom in plazmidom. Vsi predstavniki vrste D. fangzhongdai v svojih genomih vsebujejo več elementov CRISPR (preglednica 4). Največ (sedem) so jih našli pri sevu B16 in MK7 (Alič in sod., 2019).
Preglednica 4: Prisotnost različnih mobilnih genetskih elementov in CRISPR v genomih sevov D. fangzhongdai (prirejeno po Alič in sod., 2019).
2.2 BAKTERIOFAGI KOT SREDSTVA ZA BIOLOŠKO ZATIRANJE
2.2.1 Prednosti uporabe bakteriofagov
Široka uporaba antibiotikov v medicini in kmetijstvu v zadnjih 70 letih je prispevala k razvoju odpornosti številnih patogenih bakterij proti antibiotikom (Pirnay in Kutter, 2020). Na primer; v nasadih jabolk in hrušk, kjer so prekomerno uporabljali antibiotik streptomicin za zdravljenje hruševega ožiga, je povzročiteljica Erwinia amylovora razvila odpornost proti tem antibiotiku (Förster in sod., 2015; Sholberg in sod., 2016; Svircev in sod., 2018; Tancos in sod., 2016). Posledično se povečuje zanimanje za raziskovanje naravnih načinov obvladovanja bakterijskih okužb, med katere sodi tudi uporaba bakteriofagov (Scircev in sod., 2018).
Uporaba bakteriofagov ima številne prednosti:
(1.) Bakteriofagi so prisotni povsod, kjer lahko najdemo njihove bakterijske gostitelje, zato jih lahko izoliramo iz raznovrstnih okoljskih virov, kot so voda, zemlja, rastlinski in živalski material.
(2.) Bakteriofagi se podvajajo, dokler je v okolju prisotna gostiteljska bakterija.
(3.) Bakteriofagi so varni za uporabo, ker ne morejo okužiti evkariontskih celic.
(4.) Bakteriofagi so najpogosteje zelo specifični in lahko okužujejo eno vrsto ali celo en sam sev bakterije, ne da bi pri tem poškodovali ostalih bakterij v okolju (npr.
pomembne bakterije v mikrobioti).
(5.) Večina izoliranih bakteriofagov je precej stabilnih in jih lahko več mesecev shranjujemo pri 4 °C brez občutne izgube virulence (Jones in sod, 2007).
2.2.2 Bakteriofagna terapija v kmetijstvu: začetki, izzivi in rešitve
Bakteriofagi predstavljajo atraktiven način preprečevanja in obvladovanja najrazličnejših bakterijskih okužb, tudi rastlinskih. Prvi eksperimentalni dokaz, da lahko z bakteriofagi zdravimo tudi rastlinske bolezni, sega v leto 1924. Znanstveniki so takrat dokazali, da filtrat, pridobljen iz razpadajočega zelja, prepreči bolezen zeljne gnilobe, ki jo povzroča bakterija Xanthomonas campestris pv. Campestris (Mallmann in Hemstreet, 1924 cit. po Jones in sod., 2007). Leta 1935 so izvedli prvo terensko analizo, kjer so semena koruze predhodno tretirali z bakteriofagi in poročali o upadu Stewartove bolezni, ki jo povzroča bakterija Pantoea stewartii (Thomas, 1935 cit. po Jones in sod., 2007). Kasneje so uporabo bakteriofagov med drugim preizkušali za obvladovanje hruševega ožiga na jablanah in hruškah, bakterijske uvelosti (ang. bacterial wilt) na tobaku, bakterijskih razjed na citrusih (ang. citrus bacterial canker) in bakterijske pegavosti na geraniji (Jones in sod., 2007).
Kljub številnim prednostim pa so se v praksi le redki bakteriofagi izkazali za uspešne pri nadzoru rastlinskih bolezni. Eden od izzivov bakteriofagne terapije je, da lahko bakterije razvijejo odpornost proti okužbi z bakteriofagom. Negativen vpliv pojava odpornih bakterij lahko zmanjšamo z uporabo bakteriofagih koktajlov, namesto aplikacije posameznega bakteriofaga. Poleg tega moramo pri nadzoru bakterijskih povzročiteljev rastlinskih bolezni upoštevati kompleksno dinamiko med bakteriofagi, bakterijami in njihovim okoljem. Bakteriofagi so v naravi izpostavljeni številnim okoljskim dejavnikom, ki lahko močno vplivajo na njihovo stabilnost in infektivnost. UV sevanje, pH in temperatura lahko inaktivirajo ali celo uničijo bakteriofage. Zmanjševanju titra bakteriofaga se lahko zato izognemo z aplikacijo bakteriofaga v času, ko je sončno sevanje manjše (zgodaj zjutraj in zvečer). Uspešno aplikacijo bakteriofagov lahko dosežemo tudi z zaščitnimi pripravki, ki bakteriofagom omogočijo preživetje v spremenljivem okolju (Jones in sod., 2007; Svircev in sod., 2018). Alternativni način uporabe bakteriofaga je uporaba sistema za dovajanje živih bakterijskih celic, ki zagotovi preživetje in nadaljnje podvojevanje bakteriofagov pred prihodom bakterijskih povzročiteljev bolezni (Svircev in sod., 2018). Primer take uporabe so opisali Iriarte in sod., ki so žive celice oslabljenega bakterijskega seva Xanthomonas perforans uporabili za ohranitev populacije bakteriofagov v in na tleh (Iriarte in sod., 2012).
Drug način uporabe bakteriofagov za nadzor bolezni je integrirani pristop, kjer bakteriofage kombiniramo z drugimi biokontrolnimi sredstvi. V študiji iz leta 2005 so Obradovic in sod. pokazali, da kombinacija acibenzolar-S-metila in bakteriofagov deluje veliko boljše proti bolezni bakterijska pegavost na paradižniku, kot vsak posebej (Obradovic in sod., 2005).
Čas uporabe bakteriofagov je ključnega pomena za uspeh obvladovanja bakterijskih okužb. Bakteriofage lahko uporabimo za zmanjšanje že obstoječe populacije bakterijskih povzročiteljev bolezni ali pa aplikacijo načrtujemo za čas, ko pričakujemo povečanje njihove populacije. Učinkovitost obeh načinov je potrebno oceniti kot del biokontrolnega razvojnega programa (Svircev in sod., 2018).
2.2.3 Obvladovanje bolezni mehkih gnilob Dickeya spp. z uporabo bakteriofagov
Na področju kmetijstva so uporabo bakteriofagov med drugim preizkušali tudi za obvladovanje mehkih gnilob, ki jo povzročajo Dickeya spp. (Czajkowski in sod., 2016).
Do sedaj so največjo pozornost posvečali iskanju bakteriofagov, ki bi učinkovali proti D. solani, ki je eden pomembnejših povzročiteljev mehke gnilobe na krompirju. Prva opisana litična bakteriofaga D. solani sta LIMEstone1 in LIMEstone2, iz družine Myoviridae. Zanju je značilna ikozaedrična glava in krčljivi rep ter, da specifično okužujeta le seve D. solani. Za opisana bakteriofaga so testirali njuno uporabnost za obvladovanje bolezni krompirja. Poročali so o znatno zmanjšani pojavnosti okužbe na gomoljih krompirja, ki so jih pred sajenjem tretirali z LIMEstone1 in LIMEstone2 (Adriaenssens in sod., 2012). Iz Poljske so leta 2014 poročali o uspešni izolaciji devetih litičnih bakteriofagov, ki okužujejo Dickeya spp. Vsi bakteriofagi pripadajo družini Myoviridae in imajo podobno morfologijo kapside. Bakteriofagi se med seboj razlikujejo po obsegu gostiteljev, vsi pa okužujejo D. solani. Preverili so tudi njihovo uporabnost za biološko zatiranje. Izkazalo se je, da bakteriofagi učinkovito zmanjšujejo populacije D. solnai in vitro kot tudi na površinah krompirjevih gomoljev (Czajkowski in sod., 2014). Czajkowski in sod. so poročali tudi o dveh bakteriofagih (ϕPD10.3 in ϕPD23.1), ki okužujeta D. solani in nekatere vrste Pectobacterium spp. Od prej opisanih bakteriofagov se razlikujeta v širšem naboru gostiteljskih bakterij in v velikosti kapside in genoma. Bakteriofaga ϕPD10.3 in ϕPD23.1 imata velik aplikativni potencial za nadzor bolezni krompirja, zlasti v kompleksnih okoljih, kjer pričakujemo več kot eno vrsto bakterijskih povzročiteljev bolezni mehkih gnilob (Czajkowski in sod., 2015).
Druga poročila o bakteriofagih, ki učinkujejo proti vrstam rodu Dickeya, opisujejo bakteriofage, izolirane iz Kaspijskega morja (Soleimani-Delfan in sod., 2015), številne bakteriofage izolirane iz odpadne in rečne vode na Škotskem (Day in sod., 2018) ter bakteriofage, izolirani iz odpadne vode in rastlinskega materiala v Sloveniji (Alič in sod., 2017b).
2.2.3.1 Karakterizacija bakteriofaga BF25/12
Alič in sod. so leta 2017 prvič poročali o bakteriofagu iz družine Podoviridae, ki učinkuje proti Dickeya spp. Gre za bakteriofag BF25/12, ki so ga izolirali iz listov orhidej Phalaenopsis z bolezenskimi zanki mehkih gnilob (Alič in sod., 2017b).
Za bakteriofag BF25/12 so značilni veliki (s premerom 6 mm) prozorni plaki, s halo efektom, ki nakazuje prisotnost lizinov (slika 5). V raziskavi Alič in sod. so bakteriofag preučili s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) in ga na podlagi opazovane morfologije uvrstili v družino Podoviridae (Alič in sod., 2017b) (slika 5).
Slika 5: (A) Morfologija plakov BF25/12 in (B) morfologija BF25/12 vizualizirana s TEM (prirejeno po Alič in sod., 2017b).
Nabor gostiteljev bakteriofaga so preverjali z analizo pojavljanja plakov. Bakteriofag BF25/12 je učinkoval proti nekaterim sevom D. fangzhongdai in D. dadantii. Interakcijo med BF25/12 in D. fangzhongdai so preučili še na ravni celičnih in bakteriofagnih ultrastruktur. Poročali so o razgradnji bakterijskih znotrajceličnih granul kot odgovor na okužbo z bakteriofagom. Razgradnja granul je verjetno posledica bakterijskega stresa zaradi okužbe z bakteriofagom, pri čemer bi lahko ti opazovani presnovni vključki (ang.
inclusions) povečali sposobnost preživetja bakterije in omejili bakteriofagno okužbo (Alič in sod., 2017b).
Genom bakteriofaga B25/12 sestavlja linearna dvoverižna DNA dolžine 43872 baznih parov. Analiza genoma podpira razvrstitev bakteriofaga BF25/12 v družino Podoviridae.
Genom obsega gene strukturnih proteinov in proteinov, ki sodelujejo pri razmnoževanju bakteriofaga. V genomu je bil identificiran gen za endolizin, kar se sklada z opaženo morfologijo plakov (halo efekt). V genomu niso našli genov za odpornost proti antibiotikom ali genov za toksine (slika 6). Največja podobnost genoma BF25/12 je z genomom bakteriofaga PP16, ki okužuje bakterije rodu Pectobacterium (79 % identičnost). Podobnost z genomi drugih poznanih poddružine Podoviriade pa je bistveno manjša (< 33 %) (Alič in sod., 2017b). Naknandne analize bakteriofag BF25/12 uvrščajo v nov rod Phimunavirus (Buttimer in sod., 2020).
A B
Slika 6: Anotiran genom BF25/12. Geni, ki kodirajo ohranjene proteine so označeni z rumeno barvo, tisti, ki kodirajo proteine, katerih funkcijo ne moremo predvideti z bioinformacijsko analizo, pa so označeni s sivo. Predstavljene enote genoma so v baznih parih (povzeto po Alič in sod., 2017b).
Pri oceni primernosti bakteriofaga kot sredstva za biološko zatiranje moramo upoštevati vpliv dejavnikov okolja na stabilnost bakteriofaga. BF25/12 je stabilen pri nevtralnem in alkalnem pH, a občutljiv za kisel pH in UV sevanje. Stabilnost bakteriofaga je odvisna tudi od sestave gojišča in koncentracije bakteriofaga. Za dolgoročno shranjavanje bakteriofaga BF25/12 sta najbolj primerni temperaturi 4 °C in –80 °C. Pri bakteriofagih, ki so bili daljše obdobje shranjeni na –20 °C, pa je titer padel. Od vseh testiranih temperatur je bila temperatura 28 °C najmanj ustrezna za dolgoročno shranjevanje (Alič in sod., 2017b).
Eden izmed največjih izzivov pri uporabi bakteriofagov za biološko zatiranje je pojav odpornosti bakterij. Alič in sod. so raziskovali razvoj odpornosti pri bakteriji D. fangzhongdai B16 proti okužbi z bakteriofagom BF25/12. Razvoj odpornih kolonij B16 je bil odvisen od koncentracije bakteriofaga. Najvišjo stopnjo odpornosti so bakterije razvile pri koncentraciji bakteriofaga med 104 in 105 PFU/mL (Alič in sod., 2017b).
3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL
3.1.1 Bakterija D. fangzhongdai
V magistrski nalogi smo uporabili pet sevov D. fangzhongdai, in sicer, B16, MK7, JS5T, S1 in NCPPB 3274. Vse bakterije so bile shranjene v sistemu za shranjevanje bakterijskih kultur MicrobankTM (Pro-Lab Diagnostics) pri –20 °C. V preglednici 2 so predstavljeni podatki o izvoru sevov.
3.1.2 Bakteriofag BF25/12
V magistrski nalogi smo uporabili bakteriofag BF25/12, ki so ga Alič in sod. izolirali iz orhidej z bolezenskimi znaki mehkih gnilob. Po izolaciji so bakteriofage namnožili v obogatitveni suspenziji z bakterijskimi sevi D. fangzhongdai (skupina UDL-3).
Namnožene bakteriofage so sprali s plošč, jih prefiltrirali skozi celulozni filter s premerom por 0,2 µm (Sarstedt) ter shranili pri 4 °C (Alič in sod., 2017b).
3.1.3 Raztopine, gojišča in pufri
V tem poglavju so opisani protokoli za pripravo raztopin, gojišč in pufrov, ki smo jih uporabili v eksperimentalnem delu magistrske naloge.
3.1.3.1 Raztopina 1 M MgSO4
Za pripravo 1 L raztopine 1 M MgSO4 smo odtehtali 246 g MgSO4 × 7 H2O in raztopili v 1 L deionizirane vode. Raztopino smo flitrirali skozi celulozni fliter s premerom por 0,2 µm. Raztopino smo do uporabe hranili pri 4 °C.
3.1.3.2 Raztopina 1 M CaCl2
Za pripravo 1 L raztopine 1 M CaCl2 smo odtehtali 147 g CaCl2 × 2 H2O in raztopili v 1 L deionizirane vode. Raztopino smo flitrirali skozi celulozni fliter s premerom por 0,2 µm. Raztopino smo do uporabe hranili pri 4 °C.
3.1.3.3 Trdno gojišče LB z MgSO4 in CaCl2
Za pripravo 1 L trdnega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2 smo odtehtali 10 g triptona (DB 211705), 5 g kvasnega ekstrakta (DB 212750), 15 g agarja (DB 214010) in 0,5 g NaCl.
Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Gojišče smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Po avtoklaviranju smo v 1 L gojišča dodali 10 mL 1 M MgSO4 in 2 mL 1 M CaCl2. Tako pripravljeno gojišče smo razlili v petrijevke in pustili, da se strdi. Petrijevke z gojiščem smo do uporabe smo hranili pri sobni temperaturi.
3.1.3.4 Tekoče gojišče LB z MgSO4 in CaCl2
Za pripravo 1 L tegočega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2 smo odtehtali 10 g triptona (DB 211705), 5 g kvasnega ekstrakta (DB 212750) in 0,5 g NaCl. Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Gojišče smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Po avtoklaviranju smo v 1 L gojišča dodali 10 mL 1 M MgSO4 in 2 mL 1 M CaCl2. Tekoče gojišče smo do uporabe hranili pri sobni temperaturi.
3.1.3.5 Mehki agar LB z MgSO4 in CaCl2
Za pripravo 1 L mehkega agarja LB z MgSO4 in CaCl2 smo odtehtali 10 g triptona (DB 211705), 5 g kvasnega ekstrakta (DB 212750), 4 g agarja (DB 214010) in 0,5 g NaCl.
Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Gojišče smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Po avtoklaviranju smo v 1 L gojišča dodali 10 mL 1 M MgSO4 in 2 mL 1 M CaCl2. Mehki agar smo do uporabe hranili v vodni kopeli pri 48 °C.
3.1.3.6 Fosfatni pufer (PB)
Za pripravo 1 L fosfatnega pufra (PB) smo odtehtali 1,3425 g Na2HPO4 × 2 H2O in 0,4 g NaH2PO4 × 2 H2O. Obe navedeni sestavini smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Pufer smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Do uporabe smo hranili pri sobni temperaturi.
3.1.3.7 Fiziološka raztopina magnezija z želatino (pufer SMG)
Za pripravo 1 L fiziološke raztopine magnezija z želatino (pufer SMG) smo odtehtali 2 g MgSO4 × 7 H2O; 5,8 g NaCl in 0,1 g želatine (Merck 1.04070) ter dolili 50 mL 1 M Tris HCl pufra (pH 7,5). Vse navedene sestavine smo najprej raztopili v 0,9 L deionizirane vode in šele nato dopolnili do 1 L. Pufer smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Do uporabe smo hranili pri sobni temperaturi.
3.2 METODE
3.2.1 Analiza pojavljanja plakov
3.2.1.1 Priprava redčitev bakteriofaga
Najprej smo pripravili redčitveno vrsto bakteriofaga. Založna koncentracija bakteriofaga je bila 3,2 × 109 plakotvornih enot (PFU)/mL. V mikrocentrifugirki smo pripravili bakteriofag s koncentracijo 1,0 × 109 PFU/mL (v 1375 µL pufra SMG smo dodali 625 µL bakteriofaga). Pripravili smo redčitve tako pripravljene bakteriofagne kulture v pufru SMG od 10-1 do 10-7 v korakih z desetkratnim redčenjem (v 1800 µL pufra SMG smo dodali po 200 µL bakteriofaga ustrezne koncentracije). Redčitve smo pripravili v mikrocentrifugirkah z nižjo vezavo proteinov (Protein LoBind, Eppendorf).
3.2.1.2 Priprava bakterijske suspenzije
Pet sevov D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1 in NCPPB 3274), ki so bili shranjeni v sistemu za shranjevanje bakterijskih kultur MicrobankTM (Pro-Lab Diagnostics) pri –20 °C smo nacepili na trdno gojišče LB z MgSO4 in CaCl2. Bakterije smo preko noči inkubirali pri 28 °C. Naslednji dan smo bakterijsko kulturo precepili na sveže trdno gojišče LB z MgSO4 in CaCl2 in bakterije ponovno inkubirali preko noči pri 28 °C.
Iz trdne prekonočne kulture smo v pufru PB pripravili bakterijsko suspenzijo s koncentracijo 107 kolonijskih enot (CFU)/mL. Koncentracijo bakterijske suspenzije smo določili z merjenjem turbidnosti, izraženo v enotah McFarland. Pripravljeno bakterijsko suspenzijo smo sinhronizirali v fazi rasti s 30 minutno inkubacijo pri 4 °C. Po sinhronizaciji smo bakterijsko suspenzijo desetkrat redčili v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Tako pripravljeno bakterijsko suspenzijo smo inkubirali 16 ur s stresanjem (100 obr./min) pri temperaturi 28 °C. Naslednji dan smo 16 ur staro bakterijsko suspenzijo sinhronizirali z inkubacijo pri 4 °C (do uporabe, ne več kot 5 ur).
3.2.1.3 Priprava petrijevk za analizo pojavljanja plakov
Pripravili smo 9 mL alikvote mehkega agarja z MgSO4 in CaCl2 in jih shranili v vodni kopeli pri 48 °C. Pripravili smo desetkratno redčitev sinhroniziranih bakterijskih suspenzij (3.2.1.2) v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Posameznemu alikvotu mehkega agarja smo dodali 275 µL tako pripravljene bakterijske suspenzije (slika 7).
Mehki agar z dodano bakterijo smo najprej 15–20 sekund stresali na vibracijskem mešalniku, nato pa zlili po trdnem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2 v petrijevki. Petrijevke smo pustili odprte v laminariju, da se je mehki agar strdil (15–20 min). Nato smo na plošče nanesli 30 µL kapljice posamezne koncentracije bakteriofaga. Za negativno
kontrolo smo nakapljali pufer SMG brez dodanega bakteriofaga. Po nanosu kapljic smo petrijevke pustili v laminarju, da so se kapljice posušile (15–20 min).
Tako pripravljene petrijevke smo inkubirali pri štirih temperaturah: 20, 28, 37 in 42 °C.
Rezultate analize pojavljanja plakov smo preverili po 18 in 42 urah inkubacije. Rezultate smo beležili pisno in s fotografiranjem. Naredili smo 1 biološko ponovitev.
Slika 7: Shema metode analize pojavljanja plakov. SMG označuje nakapljano kaplico pufra SMG, v katerem so bili razredčeni bakteriofagi.
3.2.2 Analiza adsorpcije
3.2.2.1 Priprava bakteriofaga
V pufru SMG smo pripravili bakteriofagno suspenzijo s koncentracijo 7,2 × 107 PFU/mL.
Bakteriofagno suspenzijo smo do uporabe hranili pri 4 °C.
3.2.2.2 Priprava bakterijske suspenzije za test adsorpcije
Pripravili smo bakterijsko suspenzijo D. fangzhongdai B16, kot je bilo opisano pri analizi pojavljanja plakov (3.2.1.2), s to razliko, da smo bakterijske suspenzije inkubirali pri temperaturi analize adsorpcije (28 ali 37 °C).
3.2.2.3 Priprava suspenzij za test adsorpcije
S pomočjo denzitometra smo izmerili turbidnost 16 ur stare bakterijske suspenzije, ki je bila izražena v enotah McFarland. Iz dobljene meritve smo po enačbi 1 preračunali koncentracijo (c) bakterijske suspenzije na enoto CFU/mL:
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) = 𝑚𝑒𝑟𝑖𝑡𝑒𝑣 𝑀𝑐𝐹𝑎𝑟𝑙𝑎𝑛𝑑 × 3 × 108 ... (1)
Pripravili smo dve suspenziji, suspenzijo z bakterijo (SB) in kontrolno suspenzijo (KS).
V centrifugirko KS smo dodali 27 mL tekočega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2, ki je bilo predhodno ogreto na temperaturo analize. V centrifugirko SB pa smo dodali bakterijsko suspenzijo in tekoče gojišče LB z MgSO4 in CaCl2, ki smo ju preračunali po enačbi 2 in 3. Volumen (V) dodane bakterije smo preračunali tako, da je bila multipliciteta okužbe (MOI) enaka 0,1.
𝑉(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) =7,2 𝑥 107𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 𝑥 30 𝑚𝐿
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) 𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 ... (2)
𝑉(𝑔𝑜𝑗𝑖šč𝑎) = 27 𝑚𝐿 − 𝑉(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒) ... (3)
V obe centrifugirki smo dodali 3 mL bakteriofaga s koncentracijo 7,2 × 107 PFU/mL. Ob dodatku je prišlo do desetkratnega redčenja bakteriofaga (7,2 × 106 PFU/mL). Končni volumen v obeh centrifugirkah je znašal 30 mL (slika 8).
Slika 8: Shema priprave suspenzije z bakterijo (SB) in kontrolne suspenzije (KS).
3.2.2.4 Test adsorpcije
Takoj po dodatku bakteriofaga smo vsebino v obeh centrifugirkah nežno premešali na vibracijskem mešalniku, odvzeli vzorec za časovno točko 0 min in obe centrifugirki postavili v vodno kopel ogreto na temperaturo analize adsorpcije (28 ali 37 °C). V časovnih točkah 2, 5, 10, 15, 20, 25 in 30 min smo iz centrifugirke v vodni kopeli odvzeli dvakrat po 1 mL vzorca (za dve tehnični ponovitvi) in ga redčili v 9 mL ohlajenega pufra SMG. Pri tem je ponovno prišlo do desetkratnega redčenja bakteriofaga (7,2 × 105 PFU/mL). Takoj po redčenju smo vzorce nežno premešali na vibracijskem mešalniku.
Vzorce smo nato prefiltrirali skozi filter s premerom por 0,22 µm. V filtratu smo dobili proste bakteriofage, ki se niso adsorbirali na bakterijske celice. Iz centrifugirke KS, kjer nismo dodali bakterijske kulture, smo vzorce odvzeli le v prvi (0 min) in zadnji (30 min) časovni točki. Filtrate smo shranili v mikrocentrifugirkah z nižjo vezavo poteinov (Protein LoBind, Eppendorf).
3.2.2.5 Določitev titra bakteriofaga
V nadaljevanju smo določili koncentracije prostih bakteriofagov v posameznih časovnih točkah.
Najprej smo pripravili bakterijsko suspenzijo D. fangzhongdai B16, kot je bilo opisano pri analizi pojavljanja plakov (3.2.1.2). Sinhronizirano bakterijsko suspenzijo smo desetkrat redčili v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Pripravili smo 3,5 mL alikvote mehkega agarja LB z MgSO4 in CaCl2 in jih shranili v vodni kopeli pri 48 °C. Pripravili smo redčitve filtratov, ki smo jih dobili pri testu adsorpcije (3.2.2.4) v SMG pufru od 10-1 do 10-4 v korakih z desetkratnim redčenjem (v 108 µL SMG pufra smo dodali 12 µL filtrata ustrezne koncentracije). Posameznemu alikvotu mehkega agarja smo dodali 100 µL desetkrat redčene bakterijske suspenzije in enak volumen posamezne redčitve filtrata.
Nato smo mehki agar z dodano bakterijo in filtratom stresali 15–20 sekund na vibracijskem mešalniku in ga prelili čez petrijevko s trdim gojiščem LB z MgSO4 in CaCl2.
Tako pripravljene petrijevke smo inkubirali pri 28 °C. Po 8 urni inkubaciji smo prešteli plake in izračunali delež adsorbiranih bakteriofagov v suspenziji v različnih časovnih točkah. Najprej smo po enačbi 4 izračunali koncentracijo prostih bakteriofagov v izhodni suspenziji na enoto PFU/mL.
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑣) =š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝑝𝑙𝑎𝑘𝑜𝑣
100 µ𝐿 × 10 × 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑑č𝑒𝑛𝑗𝑎 ... (4)
Iz dobljenih vrednosti smo po enačbi 5 izračunali delež adsorbiranih (% ads.) bakteriofagov. Razliko vrednosti PFU/mL prostega bakteriofaga v SB in vrednost PFU/mL prostega bakteriofaga v KS smo delili z vrednostjo PFU/mL prostega bakteriofaga v KS. Da smo dobili delež adsorbiranih bakteriofagov, smo dobljeno množili z vednostjo 100.
% 𝑎𝑑𝑠. 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑣 = 𝑐(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑣 𝑣 𝐾𝑆)−𝑐(𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎 𝑣 𝑆𝐵)
𝑐 (𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎 𝑣 𝐾𝑆) × 100 ... (5)
Slika 9: Shema metode analize adsorpcije bakteriofagov na tarčne bakterije; (SB) suspenzija z bakterijo, (KS) kontrolna suspenzija.
3.2.3 Spremljanje kinetike rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga
3.2.3.1 Priprava bakterijske suspenzije
Pripravili smo bakterijsko suspenzijo petih sevov D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1 in NCPPB 3274) kot je bilo opisano pri analizi pojavljanja plakov (3.2.1.2), s to razliko, da smo bakterijske suspenzije inkubirali pri temperaturi 28 ali 37 °C.
3.2.3.2 Priprava redčitev bakteriofaga
Izhodna koncentracija bakteriofaga je bila 7,2 × 107 PFU/mL. Pripravili smo redčitve izhodne suspenzije bakteriofaga v pufru SMG od 10-1 do 10-6 v korakih z desetkratnim redčenjem (v 1440 µL pufra SMG smo dodali po 160 µL bakteriofaga ustrezne koncentracije). Redčitve smo pripravili v mikrocentrifugirkah z nižjo vezavo poteinov (Protein LoBind, Eppendorf).
3.2.3.3 Priprava mikrotitrske plošče
Najprej smo sinhronizirano bakterijsko suspenzijo desetkrat redčili v tekočem gojišču LB z MgSO4 in CaCl2. Pripravili smo mikrotitrsko ploščo. V vdolbinice bakterije z bakteriofagom (slika 10) smo dodali 190 µL tekočega gojišča LB z MgSO4 in CaCl2; 6,3 µL desetkrat redčene bakterijsko suspenzije in enak volumen posamezne koncentracije bakteriofaga. V vdolbinice bakterije brez bakteriofaga smo namesto bakteriofaga dodali 6,3 µL pufra SMG. Za negativno kontrolo pa smo v jamico dodali le 202,6 µL tekočega
gojišča LB z MgSO4 in CaCl2. Vsebino v jamicah smo premešali s pipetiranjem. Na koncu smo mikrotitrsko ploščo zatisnili z optično folijo in jo dali v predogret instrument Tecan, kjer smo nastavili program za merjenje absorbance pri 595 nm pri temperaturi 28 ali 37 °C. Meritev je potekala 24 ur v 10 minutnih časovnih intervalih.
Od dobljenih meritev absorbance v vdolbinicah bakterije z ali brez bakteriofaga smo odšteli povprečno vrednost tehničnih ponovitev negativne kontrole.
Slika 10: Shema priprave mikrotitrske plošče za spremljanje kinetike rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga.
3.2.3.4 Test LAS
Občutljivost bakterij za okužbo z bakteriofagom pri različnih temperaturnih pogojih v tekoči kulturi smo ovrednotili s testom LAS (ang. liquid assay score). Občutljivost seva za okužbo z bakteriofagom v 12 urnem časovnem intervalu smo izračunali po enačbi 6 in 7. Dobljene vrednosti so enake površini med krivuljo rasti bakterije brez bakteriofaga in rasti bakterije z bakteriofagom, deljeno s površino pod krivuljo rasti bakterije brez bakteriofaga ter pomnoženo s 100. Rezultat 0 pomeni, da ni prišlo do inhibicije rasti bakterij, in da bakterija ni občutljiva za okužbo z bakteriofagom. V nasprotju pa vrednost 100 predstavlja popolno odsotnost rasti bakterije okužene z bakteriofagi (Xie in sod., 2018).
𝑝𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑝𝑜𝑑 𝑔𝑟𝑎𝑓𝑜𝑚 = ∑ 𝑂𝐷(𝑖+1)+𝑂𝐷(𝑖) 2
72𝑖=1 ... (6)
𝐿𝐴𝑆 =𝑃𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑟𝑎𝑠𝑡𝑖 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒 𝑏𝑟𝑒𝑧 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎− 𝑃𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑟𝑎𝑠𝑡𝑖 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒 𝑧 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑜𝑚
𝑃𝑙𝑜šč𝑖𝑛𝑎 𝑟𝑎𝑠𝑡𝑖 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗𝑒 𝑏𝑟𝑒𝑧 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑓𝑎𝑔𝑎 × 100 ... (7)
