času. Posamezna krivulja predstavlja kinetiko rasti bakterij brez (PK) oz. v prisotnosti različnih koncentracij dodanega bakteriofaga (100−107 PFU/mL), kot je navedeno pod grafi. Koncentracije bakteriofaga so barvno kodirane in navedene v enoti PFU/mL. Rezultati prikazujejo reprezentativno biološko ponovitev. Rezultati ostalih dveh bioloških ponovitev so v Prilogi A. Na grafu so prikazane povprečne vrednosti dveh tehničnih ponovitev, ki smo jih dobili tako, da smo od dobljenih meritev absorbance odšteli povprečno vrednost tehničnih ponovitev negativne kontrole (tekoče gojišče brez dodane bakterije in bakteriofaga).
4.3.2 Test LAS
S testom LAS smo ovrednotili občuljivost bakterij za okužbo z bakteriofagom. Pri bakteriji S1 in NCPPB 3274 se vrednosti testa LAS niso bistveno razlikovale pri 28 in 37 °C in so bile pri obeh temperaturah nizke (preglednica 14). To nakazuje, da niti temperatura niti bakteriofag nimata vpliva na rast bakterij S1 in NCPPB 3274. Medtem, pa je bila občutljivost bakterij B16, MK7 in JS5T za okužbo z bakteriofagom pri 28 °C odvisna od začetne koncentracije dodanega bakteriofaga. Višja kot je bila začetna koncentracija bakteriofaga v tretmaju, višje so bile vrednosti testa LAS (pregledica 14).
V nasprotju s tem pa pri temperaturi 37 °C nismo opazili občutnega vpliva bakteriofaga na vrednost LAS. Pri vseh koncentracijah dodanega bakteriofaga so bile vrednosti testa LAS nizke, z izjemo najvišje dodane koncentracije bakteriofaga (107 PFU/mL), ko je bakterija potrebovala več časa, da se je prilagodila rastnim pogojem (daljša lag faza rasti) in zato kasneje vstopila v log fazo rasti.
Xie in sod. so na podlagi poteka okužbe z bakteriofagom opisali tri skupine bakterijskih sevov; (i) občutljivi, (ii) zmerno občutljivi in (iii) neobčutljivi sevi (Xie in sod., 2018).
Pri D. fangzhongdai sevu S1 in NCPPB 3274 nismo opazili vpliva bakteriofaga na rast bakterij in ju lahko zato uvrstimo v skupino neobčutljivih sevov (preglednica 6). Glede na občutljivost seva B16 in MK7 za okužbo z bakteriofagom pri 28 °C ju lahko uvrstimo v skupino občutljivih sevov. Sev JS5T pa je v primerjavi s sevom B16 in MK7 zmerno občutljiv. V nasprotju s tem, pa lahko pri temperaturi 37 °C vseh pet D. fangzhongdai sevov uvrstimo v kategorijo neobčutljivih sevov.
Preglednica 6: Občutljivost petih sevov D. fangzhongdai B16, MK7, JS5T, S1 ali NCPPB 3274 za okužbo z bakteriofagom BF25/12 v tekoči kulturi pri 28 ali 37 °C ovrednotena s testom LAS. Vrednosti testa LAS prikazujejo občuljivost seva na okužbo z bakteriofagom pri različnih temperaturnih pogojih v 12 urnem časovnem intervalu. Vrednost 0 pomeni, da bakteriofag ni vplival na rast bakterije in, da bakterija ni občutljiva za okužbo z bakteriofagom. V nasprotju pa vrednost 100 predstavlja popolno odsotnost rasti bakterije okužene z bakteriofagi. Za vsako temperaturo smo izračunali povprečne vrednosti testa LAS treh bioloških ponovitev. Pri posamezni biološki ponovitvi smo naredili 2 tehnični ponovitvi.
Občutljivosti seva za okužbo z bakteriofagom ovrednotena s testom LAS
B16 MK7 JS5T S1 NCPPB 3274
4.4 POVZETEK RAZULTATOV
Pridobljene rezultate naloge pregledno prikazujemo spodaj (preglednica 7).
Preglednica 7: Povzetek rezultatov vpliva temperature na interakcijo med petimi sevi D. fangzhongdai in bakteriofagom BF25/12.
Temperatura B16 MK7 JS5T S1 NPPB 3274
Analiza pojavljanja plakov 20 °C premer plakov > 1 mm, halo
efekt po 42h premer plakov > 1 mm,
halo efekt po 42h premer plakov = 1 mm, ni halo efekta bakterija neobčutljiva za okužbo z
bakteriofagom
premer plakov > 1 mm, halo efekt po 18h
37 °C premer plakov < 1 mm premer plakov < 1 mm premer plakov < 1 mm 42 °C
Analiza adsorpcije 28 °C v 30 min se adsorbira malo pod 100 % bakteriofagov
/ / /
37 °C v 30 min se adsorbira okoli 80 % bakteriofagov
Spremljanje kinetike rasti bakterije v tekoči kulturi v prisotnosti faga 28 °C
• visoke koncentracije dodanega bakteriofaga: ni povečanja vrednosti absorbance (ni rasti bakterije), po 10 urah ponovno povišanje absorbance (pojav odpornosti)
• srednje koncentracije dodanega bakteriofaga:
absorbanca doseže vrh med 3. in 6. uro nato pade, po 10 urah ponovno povišanje absorbance (pojav odpornosti)
• nizke koncentracije dodanega bakteriofaga: krivulja meritev absorbance podobna kot pri rasti bakterije brez bakteriofaga
• visoke koncentracije dodanega bakteriofaga: ni povečanja vrednosti absorbance (ni rasti bakterije), po 10 urah ponovno povišanje absorbance (pojav odpornosti)
• koncentracije dodanega bakteriofaga med 106 in 105 PFU/mL: absorbanca doseže vrh med 3. in 6. uro nato pade, po 10 urah ponovno povišanje absorbance (pojav odpornosti)
• koncentracije dodanega bakteriofaga med 104 in 103 PFU/mL: prve 4–5h povečanje vrednosti absorbance, ki ji je sledil padec med 6. in 7. uro inkubacije nato ponovna, a mnogo počasnejša rast
• nizke koncentracije dodanega bakteriofaga: krivulja meritev absorbance podobna kot pri rasti bakterije brez bakteriofaga
različne koncentracije bakteriofaga niso vplivale na kinetiko rasti bakterij
37 °C bakteriofag ni vplival na kinetiko rasti bakterije, razen pri najvišji koncentraciji dodanega bakteriofaga (107 PFU/mL), kjer smo opazili zamik v lag fazi rasti bakterije
bakteriofag ni vplival na kinetiko rasti bakterije, razen pri najvišji koncentraciji dodanega bakteriofaga (107 PFU/mL), kjer smo opazili zamik v lag fazi rasti bakterije
Test LAS 28 °C bakterija občutljiva za okužbo z bakteriofagom bakterija zmerno občutljiva za okužbo z bakteriofagom bakterija neobčutljiva za okužbo z bakteriofagom
37 °C bakterija neobčutljiva za okužbo z bakteriofagom bakterija neobčutljiva za okužbo z bakteriofagom
5 RAZPRAVA
V magistrski nalogi smo raziskali vpliv različnih temperatur na interakcijo med petimi sevi bakterije D. fangzhongdai B16, MK7, JS5T, S1 in NCPPB 3274 in bakteriofagom BF25/12. Raziskava omogoča vpogled v potek okužbe z bakteriofagom pri različnih temperaturnih pogojih in je nujna za oceno primernosti bakteriofaga BF25/12 kot sredstva za biološko zatiranje.
Z analizo pojavljanja plakov (slika 11 in 13) in s spremljanjem rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga (slika 15) smo pokazali, da so sevi B16, MK7 in JS5T za okužbo z bakteriofagom BF25/12 bolj občutljivi pri nižjih (20 in 28 °C) kot pri višjih (37 in 42 °C) temperaturah. Zato lahko potrdimo hipotezo, da je občutljivost bakterij za okužbo z bakteriofagom BF25/12 temperaturno odvisna.
Na podlagi oblike rastnih krivulj bakterij z bakteriofagom in vrednosti testa LAS lahko pri 28 °C B16 in MK7 uvrstimo v skupino občutljivih sevov. Sev JS5T je v primerjavi s sevom B16 in MK7 zmerno občutljiv, seva S1 in NCPPB pa sta neobčutljiva. V nasprotju s tem, pa lahko pri temperaturi 37 °C vseh pet sevov D. fangzhongdai uvrstimo v kategorijo neobčutljivih sevov. Zato lahko potrdimo hipotezo, da se med petimi različnimi sevi bakterije D. fangzhongdai (B16, MK7, JS5T, S1 in NCBPP 3274) pojavljajo razlike v poteku okužbe z bakteriofagom BF25/12 pri različnih temperaturah.
Največjo podobnost v odzivu na okužbo z bakteriofagom BF25/12 smo opazili pri bakterijah B16 in MK7, kar se sklada s podobnostjo nukleotidnih zaporedij genomov teh dveh sevov. Podobnost v morfologiji plakov pri različnih temperaturah inkubacije (slika 11 in 13) in podobnost v kinetiki rasti bakterije B16 in MK7 pri 28 in 37 °C v prisotnosti različnih koncentracij bakteriofaga (slika 15) nakazuje, da imata bakteriji B16 in MK7 pri različnih temperaturnih pogojih podoben potek okužbe. To se sklada z rezultati genetske analize sevov D. fangzhongdai, kjer so poročali o veliki podobnosti genomov bakterij B16 in MK7 (Alič in sod., 2019).
Kinetika adsorpcije bakteriofaga BF25/12 na bakterije D. fangzhongdai B16 se najbolj sklada z zaporednim modelom oz. s teorijo površinske reakcije. Zaporedni model oz. teorija površinske reakcije predlaga, da se bakteriofagi sprva reverzibilno (hitra faza adsorpcije) potem pa ireverzibilno pritrdijo na površino bakterije (počasna faza adsorpcije) (Storms in sod., 2015). To se sklada z našimi rezultati analize adsorpcije (slika 14) in z opisi drugih avtorjev, ki predlagajo, da virusi iz družine Podoviridae, kamor spada tudi BF25/12, najprej prepoznajo svojega gostitelja preko reverzibilne vezave na primarni receptor, nato razgradijo ekstracelularni matriks bakterije in se ireverzibilno
vežejo na sekundarni receptor (Rossman in Rao, 2012). Za potrditev hipoteze pa bi morali v prihodnosti izvesti dodatne eksperimentalne poskuse.
Na podlagi rezultatov analize adsorpcije smo poleg tega ugotovili, da je učinkovitost adsorpcije bakteriofaga BF25/12 na bakterijo D. fangzhongdai B16 boljša pri 28 kot pri 37 °C (slika 14). Zato lahko potrdimo hipotezo, da je učinkovitost adsorpcije bakteriofaga BF25/12 na bakterijo D. fangzhongdai B16 temperaturno odvisna.
Nekateri avtorji so zmanjšano stopnjo v adsorpciji pri spremenjenih temperaturnih pogojih razložili z odsotnostjo ali konformacijsko spremembo bakteriofagnega receptorja (Sillankorva in sod., 2004; McConnell in Wright, 1979). Na sistemu bakterije D. fangzhongdai B16 in bakteriofaga BF25/12 pa smo pokazali, da se tudi pri 37 °C manjši del populacije bakteriofaga adsorbira na površino bakterij (slika 14). To pomeni, da so tudi pri 37 °C bakteriofagni receptorji prisotni, vendar pa so lahko le-ti slabše dostopni.
Slabšo učinkovitost adsorpcije bakteriofaga BF25/12 pri višjih temperaturah (37 °C) bi lahko razložila temperaturno odvisna sprememba površinskih polisaharidov bakterije D. fangzhongdai za katere domnevamo, da imajo pomembno vlogo pri bakteriofagni adsorpciji. Bakterije iz rodu Dickeya na površino izločajo različne polisaharide in lipopolisaharide (Ranjan in sod., 2021), ki predstavljajo fizično prepreko za bakteriofagno okužbo. Da lahko bakteriofag kljub temu okuži bakterijsko celico, mora najprej prepoznati svojega gostitelja npr. prek površinskih polisaharidov, se pritrditi in razgraditi bakterijski zaščitni ovoj, preden lahko v bakterijsko celico iztisne svoj genetski material. Za bakteriofage iz družine Podoviridae so značilne depolimeraze, s katerimi lahko razgradijo bakterijske površinske polisaharide in tako dostopajo do bakterijske celice (Knecht in sod., 2020). Alič in sod. so v genomu BF25/12 identificirali gen za protein repa, ki ima encimsko funkcijo (Alič in sod., 2017b).
Kasnejše bioinformacijske raziskave so pokazale, da ima protein repa glukanazno aktivnost (neobjavljeni podatki). Domnevamo, da bi lahko imel ta encim pomembno vlogo pri prepoznavi gostitelja in razgradnji bakterijskih površinskih polisaharidov.
Sprememba v sestavi površinskih polisaharidov bakterije D. fangzhongdai bi lahko za bakteriofag BF25/12 pomenila, da bo slabše prepoznal svojega gostitelja. McConnell in Wright sta preučevala vpliv temperature na okužbo bakterije Salmonella anatum z bakteriofagom Felix-01. Opazila sta, da temperatura vpliva na spremembo v sintezi površinskih polisaharidov, ki predstavljajo mesto adsorpcije za bakteriofag Felix-01.
Posledično sprememba temperature vpliva tudi na spremembo v učinkovitosti adsorpcije bakteriofaga (McConnell in Wright, 1979). Tako bi lahko tudi v našem primeru spremembo v učinkovitosti adsorpcije pri višji temperaturi (37 °C) povezali s temperaturno odvisno spremembo v sestavi površinskih polisaharidov D. fangzhongdai, za katere domnevamo, da imajo pomembno vlogo pri adsorpciji bakteriofaga BF25/12.
Da bi lahko potrdili našo hipotezo pa so v prihodnosti potrebne dodatne raziskave za določitev receptorskega mesta BF25/12.
Pri različnih temperaturah smo opazili različno učinkovitost okužbe z bakteriofagom BF25/12, ki se je v analizi pojavljanja plakov kazala tudi v različni velikosti plakov (slika 11 in 12). Abedon in Yin sta opisala, da je velikost plakov odvisna od difuzije bakteriofagov, ki jo določajo lastnosti bakteriofaga in gostota agarja (Abedon in Yin, 2009). V našem primeru bi lahko pri višjih temperaturah inkubacije (42 °C) prišlo do večjega izsuševanja agarnih plošč, kar bi vplivalo na spremembo gostote agarja. Večjo gostoto agarja pa povezujemo s počasnejšo difuzijo bakteriofagov in s posledično manjšimi plaki (Abedon in Yin, 2009). Nastanek manjših plakov pri 37 °C v primerjavi s tistimi pri 28 °C pa lahko deloma razložimo tudi s slabšo učinkovitostjo adsorpcije pri 37 °C. Abedon in Yin sta opisala, da na velikost plakov med drugim vpliva tudi učinkovitost adsorpcije. Hitrejša in učinkovitejša kot je adsorpcija, večji bodo plaki (Abedon in Yin, 2009). Kot je razvidno iz naših rezultatov analize adsorpcije, se pri 28 °C adsorbira več bakteriofagov kot pri 37 °C (slika 14), medtem ko se hitrost adsorpcije ni bistveno razlikovala med obema temperaturnima pogojema. Manjše plake pri 37 °C v primerjavi s tistimi pri 28 °C bi zato lahko le deloma pripisali slabši učinkovitosti adsorpcije pri 37 °C.
Domnevamo, da temperatura ne vpliva le na adsorpcijo ampak tudi na druge korake v bakteriofagni okužbi. Kljub temu, da se bakteriofagi slabše adsorbirajo na bakterije pri 37 °C, z rezultati analize adsorpcije ne moremo v celoti pojasniti majhnih plakov pri 37 in 42 °C na trdnem gojišču (slike 11, 12 in 13) ter odsotnost okužbe pri 37 °C v tekočem gojišču (slika 15). Na podlagi rezultatov sklepamo, da temperatura vpliva tudi na učinkovitost enega od korakov okužbe, ki sledi adsorpciji. Na drugih sistemih bakterije in bakteriofaga so pokazali, da temperatura pomembno vpliva na prenos bakteriofagnega genoma v bakterijsko celico (Lof in sod., 2017) in na sposobnost lize bakterijske celice (Taj in sod., 2014). V prihodnosti bi bilo zato smiselno narediti dodatne analize in preveriti vpliv temperature na druge kinetične parametre bakteriofagne okužbe, kot sta dolžina latentne dobe in število novonastalih bakteriofagov.
Halo efekt, ki smo ga opazili pri temperaturi 20 in 28 °C, je verjetno posledica delovanja bakteriofagnih encimov, ki imajo sposobnost razgrajevanja bakterijskih površinskih polisaharidov. Halo efekt je bil opisan tudi pri nekaterih drugih bakteriofagih iz družine Podoviridae (Oliveira in sod., 2017). Po eni hipotezi je halo efekt posledica presežka bakteriofagnih encimov, ki se sprostijo ob lizi bakterijskih celic okuženih z bakteriofagi. Ker so ti encimi bistveno manjši od bakteriofagov, lahko difundirajo dlje, tj. na območje konfluentne rasti bakterij. Ti bakteriofagni encimi razgradijo bakterijski ekstracelularni matriks in vplivajo na rast bakterije (Abedon in Yin, 2009; Abedon, 2017; Jurczak-Kurek in sod., 2017; Knecht in sod., 2020). Drugi avtorji
pa navajajo, da bi bil halo efekt lahko posledica difuzije novonastalih bakteriofagov. Ko bakterijska populacija vstopi v stacionarno fazo rasti, se podvajanje bakteriofagov zelo upočasni ali celo ustavi. Kljub temu pa so proteini repa bakteriofaga z encimsko funkcijo lahko še vedno sposobni razgradnje bakterijskega ekstracelularnega matriksa. Halo efekt se zato pojavil šele čez čas, ko novonastali bakteriofagi difundirajo iz območja primarno okuženih bakterij (Cornelissen in sod., 2011). V genomu BF25/12 so identificirali gen za protein repa z glukanazno aktivnostjo in gen za endolizin. Oba imata predvideno vlogo razgrajevanja polisaharidov (neobjavljeni podatki). To se sklada z opaženim halo efektom v naši analizi pojavljanja plakov.
Odsotnost halo efekta pri višjih (37 in 42 °C) in razslojitev halo obroča pri nižjih temperaturah (28 °C) bi bila lahko posledica staranja bakterijskih celic v kulturi konfluentne rasti. Manjše plake pri višjih temperaturah inkubacije med drugim povezujemo tudi s počasnejšim potekom bakteriofagne okužbe. Staranje bakterijskih celic v kulturi konfluentne rasti onemogoči nastajanje oz. širjenje plakov, s tem pa tudi zmanjša skupni učinek bakteriofagnih encimov, ki so odgovorni za nastanek halo efekta (Abedon in Yin, 2009, cit. po Jurczak-Kurek in sod., 2017). Razslojitev halo obroča, ki smo ga opazili v analizi pojavljanja plakov (slika 13) so opisali tudi Jurczak-Kurek in sod., ki so poročali, da je bilo za številne plake bakteriofagov iz družine Podoviridae, kamor uvrščamo tudi bakteriofag BF25/12, značilna večja motnost proti robu plaka (Jurczak-Kurek in sod., 2017). Takšno morfologijo imenujemo morfologija »centra tarče« (ang. Bull's Eye Plaque), ki so jo nekateri avtorji razložili z zmanjšanjem učinkovitosti litičnih encimov, ki jo povzroča staranje bakterijskih celic v kulturi konfluentne rasti (Abedon in Yin, 2009, cit. po Jurczak-Kurek in sod., 2017).
Potek okužbe z bakteriofagom pri različnih temperaturah smo opazovali tudi v tekoči kulturi. Opazili smo, da prihaja do neskladnosti rezultatov, ki smo jih dobili z analizo pojavljanja plakov na trdnem gojišču (slika 11 in 13) in spremljanjem kinetike rasti bakterij v tekoči kulturi (slika 15). Način gojenja bakterij lahko vpliva na številne kinetične parametre, zato je lahko vzrok za neskladnost rezultatov verjetno posledica različne dinamike interakcije bakteriofag-bakterija, ko bakterije rastejo na trdni površini ali v tekočem gojišču.
Glede na sposobnosti nadzora rasti svojega gostitelja ocenjujemo, da ima bakteriofag BF25/12 pri 28 °C potencial za uporabo pri biološkem nadzoru bolezni orhidej. Pri 28 °C je bakteriofag vplival na rast bakterij B16 in MK7 v tekoči kulturi tudi pri zelo nizkih MOI vrednosti (10-8) (slika 15). To pomeni, da se je moral bakteriofag BF25/12 zelo hitro namnožiti in povečati svojo koncentracijo, da je okužil in liziral dovolj velik delež bakterijske populacije, da smo to opazili kot padec rastne krivulje bakterij. To se sklada tudi z opažanji pri analizi pojavljanja plakov, kjer smo največje plake opazili pri temperaturi 28 °C (slika 11 in 13). Virulenca bakteriofaga je opredeljena kot
sposobnost bakteriofaga, da nadzoruje rast svojega gostitelja in je pomembna pri oceni aplikativnega potenciala bakteriofaga v biokontrolne namene (Xie in sod., 2018).
Komercialni cikel vzgoje orhidej poteka v temperaturnem območju od 20 od 28 °C. Naši rezultati nakazujejo, da ima pri 28 °C bakteriofag BF25/12 primerne lastnosti za uporabo pri obvladovanju bolezni orhidej. Neobčutljivost bakterij za okužbo z bakteriofagom pri višjih temperaturah pa bi za aplikacijo lahko predstavljala problem tekom transporta in poleti, ko se lahko temperature dvignejo nad optimalno vrednost (28 °C).
Pri oceni primernosti uporabe bakteriofaga kot sredstva za biološko zatiranje je potrebno upoštevati tudi možnost razvoja odpornosti bakterij proti okužbi z bakteriofagom. Pri 28 in 37 °C smo na trdnem (slika 13) in v tekočem gojišču (slika 15) pri sevih B16, MK7 in JS5T opazili ponovno rast bakterij. To nakazuje na razvoj odpornosti bakterij proti okužbi z bakteriofagom in se sklada z opažanji Alič in sod., ki so poročali o pojavu odpornosti seva B16 proti okužbi z BF25/12 (Alič in sod., 2017b). Iz literature poznamo več različnih mehanizmov, kako bakterije razvijejo odpornost proti okužbi z bakteriofagom. Eni izmed teh so mehanizmi, ki preprečijo adsorpcijo in mehanizmi, ki vodijo v abortivno infekcijo (Abi) (Labrie in sod., 2010). Da bi ugotovili mehanizem, kako bakterije D. fanzhongdai razvijejo odpornost proti okužbi z BF25/12, bi morali v prihodnosti izvesti dodatne poskuse.
6 SKLEPI
Na podlagi rezultatov magistrske naloge smo prišli do naslednjih sklepov:
• Temperatura pomembno vpliva na občutljivost sevov D. fangzhongdai na okužbo z bakteriofagom BF25/12. Z analizo pojavljanja plakov in s spremljanjem rasti bakterij v tekoči kulturi smo pokazali, da so sevi B16, MK7 in JS5T na okužbo z bakteriofagom BF25/12 bolj občutljivi pri nižjih (20 in 28 °C) kot pri višjih (37 in 42 °C) temperaturah.
• Temperatura vpliva na adsorpcijo bakteriofaga BF25/12 na bakterijo D. fangzhongdai B16. Pri temperaturi 28 °C se na bakterije adsorbira več bakteriofagov kot pri temperaturi 37 °C. Temperatura je statistično pomembno vplivala na odstotek adsorbiranih bakteriofagov v vseh časovnih točkah analize, razen pri 0 min.
• Pri različnih temperaturnih pogojih imajo različni sevi D. fangzhongdai različen potek okužbe z bakteriofagom BF25/12. Potek okužbe smo spremljali v tekoči kulturi. Na podlagi oblike rastnih krivulj in vrednosti testa LAS lahko pri 28 °C B16 in MK7 uvrstimo v skupino občutljivih sevov. Sev JS5T je v primerjavi s sevom B16 in MK7 zmerno občutljiv, seva S1 in NCPPB pa sta neobčutljiva. V nasprotju s tem, pa lahko pri temperaturi 37 °C vseh pet sevov D. fangzhongdai uvrstimo v kategorijo neobčutljivih sevov.
• Ocenjujemo, da ima bakteriofag pri 28 °C aplikativen potencial za obvladovanje bolezni orhidej, vendar moramo pri tem upoštevati možnost razvoja odpornosti bakterij. Aplikacija bakteriofaga pri višjih temperaturah pa bi bila lahko slabše učinkovita.
7 POVZETEK
Sevi bakterije D. fangzhongdai povzročajo bolezen mehkih gnilob, ki prizadene številne gospodarsko pomembne poljščine, okrasne rastline in drevesa. V Sloveniji mehke gnilobe predstavljajo velik problem v tržnih obratih vzgoje orhidej. Bakterijske bolezni je v praksi težko nadzorovati, večina fitofarmacevtskih sredstev pa ima omejeno učinkovitost. Zato je potreba po iskanju alternativnih načinov nadzora bolezni velika. Ena od možnosti za obvladovanje bolezni je, da bi bakteriofag BF25/12, ki specifično okužuje nekatere seve D. fangzhongdai, uporabili kot sredstvo za biološko zatiranje. Pred implementacijo uporabe bakteriofaga v praksi, je potrebno dobro poznavanje njegovih interakcij z gostiteljsko bakterijo pri različnih okoljskih pogojih. Ker cikel vzgoje orhidej vključuje širok razpon temperatur, smo v magistrski nalogi želeli raziskati vpliv različnih temperatur na interakcijo med petimi različnimi sevi D. fangzhondai (B16, MK7, JS5T, S1, NCPPB 3274) in bakteriofagom BF25/12. Namen raziskave je boljše poznavanje poteka okužbe z bakteriofagom pri različnih temperaturah, ki je nujno za nadaljnjo oceno primernosti bakteriofaga za biološko zatiranje. Vpliv temperature na interakcijo med bakterijo in bakteriofagom smo preverjali z analizo pojavljanja plakov, z analizo adsorpcije in s spremljanjem rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga. Pri nižjih temperaturah (20 in 28 °C) so bili sevi B16, MK7 in JS5T bolj občutljivi za okužbo z bakteriofagom kot pri višjih (37 in 42 °C) temperaturah. Medtem pa sta bila sev S1 in NCPPB 3274 pri vseh temperaturah neobčutljiva za okužbo z bakteriofagom.
Temperaturno odvisna občutljivost sevov se je v analizi pojavljanja plakov kazala v različni velikosti plakov. Pri B16, MK7 in JS5T smo največje plake (premer ≥ 1 mm) opazili pri nižjih temperaturah, medtem, ko so bili pri višjih temperaturah pri enakih začetnih koncentracijah nanešenega bakteriofaga plaki komaj opazni (premer < 1 mm) ali pa jih ni bilo. Na modelnem sistemu bakterije D. fangzhongdai B16 in bakteriofaga BF25/12 smo z analizo adsorpcije preverili vpliv temperature na adsorpcijo bakteriofaga.
Pri 28 °C se je v 30 minutah adsorbiralo malo pod 100 % bakteriofagov, medtem, ko se je v enakem času pri 37 °C adsorbiralo okoli 80 % bakteriofagov. Temperatura je statistično pomembno vplivala na odstotek adsorbiranih bakteriofagov v vseh časovnih točkah analize, razen pri 0 min. S spremljanjem rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga smo preverjali vpliv temperature na kinetiko okužbe z bakteriofagom. Glede
Pri 28 °C se je v 30 minutah adsorbiralo malo pod 100 % bakteriofagov, medtem, ko se je v enakem času pri 37 °C adsorbiralo okoli 80 % bakteriofagov. Temperatura je statistično pomembno vplivala na odstotek adsorbiranih bakteriofagov v vseh časovnih točkah analize, razen pri 0 min. S spremljanjem rasti bakterij v tekoči kulturi v prisotnosti bakteriofaga smo preverjali vpliv temperature na kinetiko okužbe z bakteriofagom. Glede