BIOLOŠKA AKTIVNOST KOMPLEKSOV

Konjugat Tf-PLL je namenjen vezavi, stabilizaciji in učinkovitemu vnosu INK v endosomalno pot. Ko so kompleksi v celici, začnejo postopno razpadati, kar vodi do sproščanja INK, ki nato aktivirajo endosomalne receptorje TLR. Aktivacijo imunskega sistema smo preučevali na kompleksih Tf-PLL/poli(I:C), ki aktivirajo receptor TLR3, kar vodi do proizvodnje IL-6 v celicah HMVEC-dLy Ad.

4.5.1 Časovno spremljanje aktivacije imunskega odziva po stimulaciji primarne celične linije s kompleksi Tf-PLL/poli(I:C)

Slika 51 prikazuje časovni potek aktivacije imunskega odziva s samo poli(I:C) (beli stolpci), v kompleksih s Tf-PLL (črni stolpci) in v kompleksih s samim PLL (sivi stolpci).

Masno razmerje med poli(I:C) in Tf-PLL oziroma PLL smo približno določili na osnovi testa zmanjšane mobilnosti na gelu, in sicer smo uporabili razmerje, pri katerem pride do popolne zaustavitve gibanja (podrobno predstavljeno v točki 4.2.1). K poli(I:C) smo dodali 2-kratno maso konjugata Tf-PLL glede na poli(I:C) oziroma 1,5-kratno maso PLL.

Vidimo, da po 12 urah stimulacije najmočnejši imunski odziv povzroči sama poli(I:C).

Aktivacija s kompleksi Tf-PLL/poli(I:C) je zelo nizka, s PLL/poli(I:C) pa je sploh ni. Po 18 urah je odziv na samo poli(I:C) in na komplekse Tf-PLL/poli(I:C) skoraj enak, medtem ko PLL/poli(I:C) še vedno povzroči le neznatno aktivacijo. Po 24 urah je situacija povsem drugačna. Daleč najmočnejšo aktivacijo povzročijo kompleksi Tf-PLL/poli(I:C), in sicer je približno 2,5-krat višja od same poli(I:C). Poleg tega je nivo aktivacije s samo poli(I:C) in kompleksi PLL/poli(I:C) po 24 urah zelo primerljiv. Po 36 urah je situacija podobna tisti pri 24 urah. Še vedno najvišjo proizvodnjo IL-6 povzročijo kompleksi Tf-PLL/poli(I:C), sledijo pa jim kompleksi PLL/poli(I:C). Po 36 urah najslabšo aktivacijo povzroči sama poli(I:C).

Rezultate smo podrobno komentirali v točki 5.1.5 poglavja Razprava in Sklepi.

0

Slika 51: Časovno spremljanje količine IL-6 v supernatantih celic HMVEC-dLy Ad po stimulaciji s kompleksi Tf-PLL/poli(I:C)

Količino IL-6 v supernatantih smo določili s testom ELISA. Supernatante smo zbirali 12, 18, 24 in 36 ur po stimulaciji. Bel stolpec predstavlja stimulacijo s samo poli(I:C). Črn stolpec predstavlja stimulacijo s poli(I:C) v kompleksih s konjugatom transferina in poli-L-lizina (Tf-PLL), pri čemer je masno razmerje med poli(I:C) in Tf-PLL znašalo 1: 2. Siv stolpec prikazuje stimulacijo s poli(I:C) v kompleksih s samim PLL, masno razmerje med poli(I:C) in PLL pa je znašalo 1: 1,5. Graf omogoča relativno primerjavo aktivacije receptorja TLR3 z različnimi vzorci.

4.5.2 Konjugat Tf-PLL omogoča učinkovit vnos poli(I:C) v primarno celično linijo ter aktivacijo imunskega odziva

V točki 4.4 smo s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo uspeli pokazati, da je vnos ODN 10104 s konjugatom Tf-PLL veliko bolj učinkovit od vnosa prostega ODN. Na tem mestu pa smo želeli potrditi in ovrednotiti biološki pomen učinkovitejšega vnosa poli(I:C) v celice HMVEC-dLy Ad.

Slika 52 prikazuje primerjavo uspešnosti aktivacije receptorja TLR3 s samo poli(I:C) in v kompleksih s Tf-PLL. Poskus smo izvedli tako, da smo celice HMVEC-dLy Ad stimulirali s samo poli(I:C) in v kompleksih s Tf-PLL, nato pa smo po 1 oziroma 3 urah odstranili gojišče in s tem vso poli(I:C), ki se v tem času ni vnesla v celice. Količino nastalega IL-6 smo po 36 urah stimulacije z vneseno poli(I:C) preverjali s testom ELISA. Pričakovali smo, da se sama poli(I:C) po 1 oziroma 3 urah ne vnese v celice, medtem ko v kompleksih s Tf-PLL pride do učinkovite receptorsko-posredovane endocitoze in posledičnega vnosa v znotrajcelične razdelke. Razlika bi morala biti vidna glede na aktivacijo receptorja TLR3 in posledično proizvodnjo IL-6. Naša pričakovanja potrjujejo rezultati na sliki 52. V primeru, ko smo odstranili gojišče po 1 uri, je aktivacija s samo poli(I:C) zelo šibka in skoraj enaka negativni kontroli (gojišče). To pomeni, da po 1 uri ne pride do vnosa proste poli(I:C) v celice. Nasprotno poli(I:C) v kompleksih s Tf-PLL že po 1 uri pride v celice in

omogoči močno aktivacijo (skoraj 13-krat višjo, kot v primeru proste poli(I:C)), kar potrjuje veliko učinkovitost vnosa s pripravljenimi konjugati. Ob odstranitvi gojišča po 3 urah je situacija zelo podobna, le da je v tem času prišlo v celice več proste poli(I:C) kot tudi poli(I:C) v kompleksih, kar je povzročilo močnejši imunski odziv. Razlika med aktivacijo s prosto poli(I:C) v primerjavi z vezano v kompleksih je po odstranitvi gojišča po 3 urah še višja (skoraj 15-kratna).

*

Poli(I:C) (1h) Poli(I:C) + TfPLL (1h) Poli(I:C) (3h) Poli(I:C) + TfPLL (3h) Gojišče Standard (5 pg/ml)

A (450 nm)

*

*P < 0,05

Slika 52: Količina IL-6 v supernatantih celic HMVEC-dLY Ad po stimulaciji s samo poli(I:C) oziroma v kompleksih s Tf-PLL ob odstranitvi gojišča

Količino IL-6 v supernatantih celic smo določili s testom ELISA. Po 1 oziroma 3 urah stimulacije celic smo odstranili gojišče in s tem poli(I:C), ki v tem času ni vstopila v celice. Supernatante vseh vzorcev smo zbrali 36 ur po stimulaciji celic. Kot negativno kontrolo smo uporabili supernatant gojišča celic, kot pozitivno pa standardno raztopino IL-6. Iz slike je razvidno, da konjugat med transferinom in poli-L-lizinom (Tf-PLL) omogoča učinkovit celični vnos poli(I:C).

4.5.3 Kompetitivna inhibicija s prostim Tf

Na koncu smo želeli ugotoviti ali je učinkovit vnos poli(I:C) s konjugati Tf-PLL res posledica preko Tf posredovane endocitoze. Izvedli smo test kompetitivne inhibicije vnosa kompleksov Tf-PLL/poli(I:C) s prostim Tf v 100-kratnem molarnem prebitku. Kot v točkah 4.5.1 in 4.5.2 smo spremljali odziv preko aktivacije receptorja TLR3. Količino IL-6 smo določili 24 ur po stimulaciji, saj smo predvidevali, da bi efekt po daljših časih izginil.

Poleg tega je iz slike 51 razvidno, da pride kasneje do močne aktivacije tudi s kompleksi PLL/poli(I:C), medtem ko je po 24 urah aktivacija v kompleksih s Tf-PLL še vedno bistveno višja kot s PLL. Predvidevali smo, da bo prost Tf zasedel TfR, zato bo imel vnos preko Tf posredovane endocitoze slabši učinek, kar bi se odražalo v šibkejši aktivaciji receptorja TLR3.

Slika 53 potrjuje naša pričakovanja. Količina IL-6 v supernatantih celic HMVEC-dLy Ad po 24-urni stimulaciji s kompleksi Tf-PLL/poli(I:C) (1. stolpec) je skoraj 3-krat višja kot v primeru inhibicije enakega vzorca s prostim Tf (2. stolpec). Vidimo tudi, da je aktivacija s poli(I:C) v kompleksih s Tf-PLL in inhibiciji s prostim Tf podobno nizka kot v primeru s poli(I:C) v kompleksih s PLL (3. stolpec). To dokazuje pomen Tf za učinkovit celični vnos s kompleksi Tf-PLL.

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

Poli(I:C) + TfPLL Poli(I:C) + TfPLL + Tf Poli(I:C) + PLL Gojišče

A (450 nm)

*

*P < 0,05

Slika 53: Kompetitivna inhibicija vnosa kompleksov s prostim transferinom

S testom ELISA smo določili količino IL-6 v supernatantih celic HMVEC-dLy Ad po stimulaciji s poli(I:C) v kompleksih s konjugatom transferina in poli-L-lizina (Tf-PLL). Tekom stimulacije smo v vzorce dodali 100-kratni molarni prebitek prostega transferina (Tf), ki je s Tf iz konjugata Tf-PLL tekmoval za vezavo na TfR. Supernatante smo zbrali 24 ur po stimulaciji celic. Iz slike je razvidno, da inhibicija s prostim Tf zmanjša učinkovitost vnosa s Tf/TfR posredovano endocitozo.