Preverjanje konformacije Tf

Ohranitev nativne strukture Tf v konjugatu Tf-PLL je bistvenega pomena za biološko aktivnost kompleksov. Ker smo v postopku izolacije z gelsko filtracijo uporabili pufer, ki vsebuje 1,5 M GndCl (sestava opisana v preglednici 6), smo se želeli prepričati, da pri teh pogojih ne pride do porušenja sekundarne strukture Tf. Sicer smo vzorce po gelski filtraciji dializirali, pri čemer bi v primeru, da se je v času izolacije Tf denaturiral, najverjetneje prišlo do renaturacije, smo vseeno želeli pokazati, da GndCl pri 1,5 M koncentraciji sploh ne povzroči denaturacije Tf.

4.1.3.1 Merjenje cirkularnega dikroizma Tf, PLL in konjugata Tf-PLL

Preden smo se lotili preiskovanja vpliva GndCl na sekundarno strukturo Tf smo pogledali, kakšna je sekundarna struktura samega Tf, PLL ter izoliranega in dializiranega konjugata Tf-PLL. Zato smo izmerili in primerjali CD spektre omenjenih vzorcev.

Na osnovi določene tridimenzionalne strukture 35 odstotkov sekundarne strukture Tf predstavlja alfa vijačnica, 17 odstotkov pa beta plošča. Ker je CD spekter seštevek alfa, beta in neurejene strukture, bi moral CD spekter Tf spominjati na alfa vijačnico (slika 29 v poglavju Materiali in metode), pomaknjeno navzgor in z delno zabrisanimi karakterističnimi vrhovi. Na sliki 39 je razvidno, da se CD spekter Tf ujema s pričakovanim. PLL je sintetični polimer različnega števila lizinskih ostankov, zato je pričakovati, da bo njegova struktura povsem neurejena. Na sliki 39 vidimo, da je CD spekter PLL dejansko zelo podoben tistemu, ki je značilen za neurejeno obliko (slika 29 v poglavju Materiali in metode).

Slika 39: Cirkularni dikroizem transferina in poli-L-lizina

CD spekter transferina (Tf) je označen z neprekinjeno črto, poli-L-lizina (PLL) pa s prekinjeno. CD spekter Tf spominja na alfa vijačnico, pomaknjeno navzgor in z delno zabrisanimi karakterističnimi vrhovi, CD spekter PLL pa je zelo podoben tistemu, ki je značilen za neurejeno obliko.

Slika 40 prikazuje CD izoliranega konjugata Tf-PLL, raztopljenega v dializnem pufru (sestava je opisana v preglednici 6) v koncentraciji 0,1 mg/ml glede na Tf. CD spekter je prikazan le v območju od valovne dolžine 210 nm do 260 nm, saj pri nižjih valovnih dolžinah dializni pufer moti meritev. Na tej sliki je prikazana primerjava CD spektrov konjugata v primerjavi s samim Tf in PLL, ki sta sicer že prikazana na sliki 39, vendar v celotnem območju valovih dolžin. Vidimo, da je CD spekter konjugata Tf-PLL približen seštevek spektrov Tf in PLL, kar je bilo tudi pričakovati.

Slika 40: Cirkularni dikroizem konjugata Tf-PLL v primerjavi s samim Tf in PLL

CD spekter transferina (Tf) je označen s tanko neprekinjeno črto, poli-L-lizina (PLL) s prekinjeno črto, konjugata med transfeinom in poli-L-lizinom (Tf-PLL) pa z debelo neprekinjeno črto. CD spekter konjugata Tf-PLL je približen seštevek spektrov Tf in PLL.

4.1.3.2 Vpliv 1,5 M GndCl na sekundarno strukturo Tf

Da bi se prepričali, kakšen vpliv ima 1,5 M GndCl na sekundarno strukturo Tf, smo izmerili CD Tf in Tf z dodanim 1,5 M GndCl (brez dialize) ter s primerjavo spektrov ocenili vpliv prisotnosti denaturanta.

Slika 41 prikazuje CD spekter Tf in Tf z dodanim 1,5 M ultra-čistim GndCl. Spekter je posnet le pri valovnih dolžinah od 210 nm do 260 nm, saj je pri nižjih valovnih dolžinah topilo motilo meritev. Koncentracija vzorcev je bila v obeh primerih 0,1 mg/ml.

Ker se spektra na sliki 41 skoraj povsem prekrivata, lahko sklepamo, da je sekundarna struktura Tf enaka sekundarni strukturi Tf z dodanim 1,5 M GndCl. To pomeni, da se sekundarna struktura Tf pri pogojih izolacije ohranja.

-15 -10 -5 0 5 10

210 220 230 240 250 260

Valovna dolžina (nm)

Cirkularni dikroizem (mdeg)

Tf Tf_GndCl

Slika 41: Cirkularni dikroizem transferina in transferina z dodanim 1,5 M GndCl

Neprekinjena črta prikazuje CD spekter transferina (Tf), prekinjena pa CD spekter Tf z dodanim 1,5 M GndCl. Spektra sta posneta pri valovni dolžini od 210 nm do 260 nm. Ker se skoraj povsem prekrivata, lahko sklepamo, da je sekundarna struktura Tf enaka sekundarni strukturi Tf z dodanim 1,5 M GndCl.

4.1.3.3 Toplotna denaturacija Tf in Tf z dodanim 1,5 M GndCl

Ker smo se želeli dodatno prepričati, da ne pride do denaturacije Tf z 1,5 M GndCl, smo izvedli še toplotno denaturacijo samega Tf in Tf z dodanim 1,5 M GndCl brez dialize in dogajanje spremljali z merjenjem CD. Če ni prišlo do denaturacije Tf ob dodatku GndCl, bi moral Tf ohraniti sekundarno strukturo, ki pa bi se porušila ob segrevanju do dovolj visoke temperature. Porušenje strukture bi se odražalo v premiku CD spektra navzgor (če opazujemo CD v odvisnosti od valovne dolžine pred in po toplotni denaturaciji), oziroma bi opazili prevoj (če opazujemo vrednost CD pri izbranih valovnih dolžinah, v odvisnosti od temperature).

Slika 42 prikazuje primerjavo Tf (A) in Tf z dodanim 1,5 M GndCl (B) pred toplotno denaturacijo in po njej. Vidimo, da tako pri vzorcu Tf, kot vzorcu Tf z dodanim GndCl pride do premika krivulje navzgor, kar pomeni porušenje sekundarne strukture. Zato lahko sklepamo, da sam 1,5 GndCl ni porušil sekundarne strukture Tf, saj se je ta porušila šele po segretju na 95 °C. Na sliki C sta grafa A in B združena, kar omogoča lažjo primerjavo spektrov. Lahko opazimo, da sta bila spektra obeh vzorcev pred in po toplotni denaturaciji glede na obliko skoraj povsem enaka, kar pomeni, da je prišlo do podobnega porušenja sekundarne strukture. To še dodatno potrjuje, da GndCl ni povzročil denaturacije Tf.

Slika 42: Cirkularni dikroizem transferina in Tf z dodanim 1,5 M GndCl v odvisnosti od valovne dolžine pred in po toplotni denaturaciji

A: Prikaz CD spektra transferina (Tf) pred toplotno denaturacijo (neprekinjena črta) in po njej (prekinjena črta). B: CD spekter Tf z dodanim 1,5 M GndCl pred toplotno denaturacijo (neprekinjena črta) in po njej (prekinjena črta). C: Združeni sliki A in B za lažjo vizualno primerjavo. Tako pri vzorcu Tf kot vzorcu Tf z dodanim GndCl pride do premika krivulje navzgor, kar pomeni porušenje sekundarne strukture.

Slika 43 prikazuje spremembo CD v odvisnosti od temperature za vzorec Tf in Tf z dodanim GndCl. S tem poskusom smo dokončno potrdili, da 1,5 M GndCl ne povzroči denaturacije Tf, saj je v obeh primerih viden prevoj, ki predstavlja prehod iz nativne v denaturirano obliko Tf. Če bi GndCl povzročil denaturacijo Tf, prevoja ne bi bilo, saj bi bila sekundarna struktura že porušena. Viden je premik k nižji temperaturi zaradi destabilizacije Tf ob dodatku GndCl.

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

20 30 40 50 60 70 80 90

T (°C)

Cirkularni dikroizem (mdeg)

Tf Tf_GndCl

Slika 43: Sprememba cirkularnega dikroizma transferina in Tf z dodanim 1,5 M GndCl v odvisnosti od temperature

Toplotna denaturacija transferina (Tf) je prikazana s prekinjeno črto, Tf z dodanim GndCl pa z neprekinjeno.

Vrednost CD je povprečje vrednosti pri 215 nm in 222 nm. V obeh primerih je viden prevoj, ki predstavlja prehod iz nativne v denaturirano obliko Tf.

Z gelsko filtracijo smo izolirali komplekse Tf-PLL z ustrezno čistostjo. Z merjenjem CD spektrov smo pokazali, da v postopku izolacije ni prišlo do opaznih sprememb v strukturi Tf, kar je pomembno za funkcionalnost kompleksov in njihovo biološko aktivnost.

4.2 PRIPRAVA KOMPLEKSOV MED KONJUGATOM TF-PLL IN NUKLEINSKIMI