3.3.8 Raztopine za razredčevanje in dodatki
• Ringerjeva raztopina ¼ jakosti
Ringerjevo raztopino smo uporabljali za razredčevanje vzorcev mleka in sirov po Kochu, pripravili in sterilizirali (15 min pri 121 °C) pa smo jo po navodilih proizvajalca (Merck).
• Raztopina dikalijevega hidrogenfosfata (K2HPO4)
Za pripravo primarnih razredčitev vzorcev sira smo uporabljali raztopino dikalijevega hidrogenfosfata. Raztopino smo pripravili po navodilih proizvajalca (Kemika, Zagreb) ter sterilizirali pri 121 °C za 15 min.
• Raztopina cikloserina
Raztopino cikloserina (Sigma-Aldrich) smo potrebovali pri pripravi gojišča TSC.
Natehtali smo 0,24 g ter ga homogeno zmešali s 6 mL destilirane vode. Ker smo raztopino cikloserina dodajali v sterilna gojišča, smo morali raztopljeni cikloserin sterilizirati. To smo storili s filtracijo preko filtrov Millipore z velikostjo por v membrani 0,22 μm v aseptičnih pogojih in tako dobili sterilno 4 % raztopino cikloserina.
• Raztopina kalcijevega klorida
V mleko smo dodajali tudi kalcijev klorid (kalgan) v prahu v razmerju 2 g/10 L mleka. Natehtali smo ustrezno količino kalgana v posodi in raztopili v približno 1 dL vode in nato celotno raztopino dodali mleku v sirarskem kotlu.
3.3.9 Hitri test za določanje prisotnosti zaviralnih snovi
Uporabljali smo hitri test Twin sensor (Unisensor, KIT 020), ki vsebuje mikrotitrsko ploščico s protitelesi in receptorji, ter merilni listič. S testom smo ugotavljali prisotnost tetraciklinov in betalaktamskih antibiotikov v mleku pred sprejemom.
3.4 METODE
Pri praktičnem delu magistrske naloge smo uporabili različne analize in metode, s katerimi smo ugotavljali mikrobiološko in kemijsko kakovost surovega senenega mleka ter mikrobiološko, kemijsko in senzorično kakovost sirov iz surovega senenega mleka, ki smo ga tudi sami izdelovali.
3.4.1 Tehnološki postopek izdelave sira iz surovega senenega mleka
Izdelava sira je potekala v Mlekarni Celeia v njihovem oddelku kletne sirarne. Po sprejemu približno 200 L surovega senenega mleka smo najprej opravili osnovne analize kemijske in higienske kakovosti ter podrobnejše analize mikrobiološke ustreznosti. Opravili smo tudi nujni hitri test na prisotnost zaviralnih snovi ter mleko po negativnem rezultatu prečrpali v sirarski kotel. Nato smo mleko segreli na 32 °C, dodali 2 g/10 L mleka CaCl2 (kalgan), ki smo ga predhodno raztopili v vodi, ter SK oz. SK+ZK po navodilih proizvajalca. Ker smo imeli manj mleka, kot ga proizvajalec priporoča na enoto pakiranja SK, smo vsebino vrečke
raztopili v 1 L steriliziranega mleka in odmerili primerno količino nastale suspenzije za našo količino mleka. ZK, ki je mono kultura, smo natehtali v erlenmajerico, dodali ogreto seneno mleko iz kotla, premešali, da se je raztopila ter mešanico dodali k mleku v sirarski kotel. Po dodatku kultur smo mleku vzdrževali temperaturo ob konstantnem mešanju ter čez pol ure dodali še tekoče sirišče v koncentraciji 2,5 mL/10 L mleka, ki pa smo mu zaradi manj agresivnega učinka ob vlivanju v mleko pred dodatkom v mleko dodali malo tople vode.
Po dodatku sirišča smo vsebino sirarskega kotla mešali še eno do dve minuti, nato mešala ugasnili in zaprli kotel. Po približno 40 minutah smo začeli preverjati čvrstost koaguluma s školjkastim lomom preko prsta. Ko je koagulum dosegel primerno čvrstost, smo začeli z njegovo obdelavo, ki jo sestavljata faza predsirjenja in faza dosirjenja. V fazi predsirjenja, ki je namenjena rezanju koaguluma in oblikovanju sirnega zrna, smo najprej koagulum rezali 15 minut s harfami, ki so nameščene v kotlu. Rezanju koaguluma je sledilo 20 minutno mešanje vsebine kotla, s čimer smo dokončno oblikovali sirno zrno ter na koncu 3 minutno počivanje. Nato smo pričeli s fazo dosirjenja, ki je namenjena dogrevanju in sušenju sirnega zrna do njegove klenosti. Sledili smo shemi segrevanja, ki je prikazana v preglednici 3 do T 41 °C.
Preglednica 3: Temperaturna shema dogrevanja in sušenja sirnega zrna Temperatura °C Čas zadrževanja min
34 5
36 5
38 5
41 2
Po dogrevanju in sušenju smo pričeli z oblikovanjem klenega sirnega zrna tako, da smo pod sirarski kotel podstavili mizo z oblikovali ter spustili sirno zrno skupaj s sirotko skozi spodnji iztok sirarskega kotla. Ko so bila oblikovala napolnjena, je sledilo stiskanje sirnine pod stiskalnico, kjer smo na vsake pol ure sire obrnili in hkrati za 1 bar povečali pritisk, da smo prišli od 1 do 5 barov, kar je trajalo približno 2,5 h. Po končanjem stiskanju smo sire prenesli v slanico za 16 ur. Po soljenju smo sire osušili in prenesli v zorilnico, kjer so pri 12 °C in pri 85 % relativni vlagi zoreli 90 dni. Med zorenjem smo sire negovali tako, da smo jih redno obračali vsak ponedeljek, sredo in petek. Po potrebi smo jih obrisali z vlažno krpo ali oprali s slanico.
3.4.2 Vzorčenje surovega senenega mleka in sirov
Surovo seneno mleko smo vzorčili na sprejemu s sterilno zajemalko in analize izvedli neposredno po vzorčenju.
Sire za mikrobiološke, kemijske, senzorične analize smo vzorčili:
• po stiskanju,
• po soljenju v slanici,
• po 90-ih dneh zorenja.
Za potrebe mikrobiološke raziskave smo v aseptičnih pogojih in z aseptičnim priborom odtehtali 10 g reprezentativnega vzorca sira bolj iz sredine v sterilno vrečko, 10-kratno
razredčili z dodatkom raztopine dikalijevega hidrogenfosfata (K2HPO4) ter vsebino vrečke dobro pregnetli v gnetilniku. S tem smo dobili primarno raztopino, ki smo jo uporabili kot izhodno raztopino za nadaljnje mikrobiološke analize. Tako smo pripravili vse vzorce sira.
Sir, vzorčen po stiskanju, smo shranili v sterilno vrečko in ga pri 5 °C hranili do naslednjega dne, ko smo vzorčili še sir po soljenju v slanici in vzorca sočasno analizirali. Tretje vzorčenje sirov smo izvedli po 90-ih dneh zorenja v zorilnici in analize izvedli neposredno po vzorčenju.
Za kemijske analize smo s čistim priborom pripravili reprezentativne vzorce sirov. Za senzorično analizo sirov nismo posebej predpripravili, ampak smo jih tretirali sproti med samo analizo.
3.4.3 Analize surovega senenega mleka
Vzorcem surovega senenega mleka smo določali kemijsko sestavo, ugotavljali prisotnost zaviralnih snovi ter mikrobiološko ustreznost, ki smo jo delno opravili z inštrumentalnimi metodami in delno s klasičnimi tehnikami nacepljanja na trda gojišča.
3.4.3.1 Kemijske analize in hitri test na prisotnost zaviralnih snovi
Vsebnost osnovnih kemijskih komponent smo v surovem senenem mleku določali z instrumentom Milkoscan, medtem ko smo hitri test na prisotnost zaviralnih snovi izvedli s komercialnim testom Twin sensor. Kemijske analize in hitri test na prisotnost zaviralnih snovi v mleku so za nas izvajali v mlekarni Celeia po rutinskem postopku.
Maščobe, beljakovine, laktozo in suhe snovi smo v mleku določali z instrumentom MilkoScan 6000 (ISO 9622:2013), ki vsebuje sistem infrardeče svetlobe z enojnim žarkom, kiveto in detektorjem. Metoda temelji na FTIR tehniki (Fourier Transform Infrared Spectroscopy), ki vključuje namensko izdelan interferometer v območju vseh valovnih dolžin infrardečega spektra od 2 do 10 µm. Količina infrardeče svetlobe, ki je vzorec ne absorbira, preide na detektor. Količina maščobe, laktoze in beljakovin je izražena kot masni delež, v odstotkih (%). Suho snov merimo brez maščobe.
Prisotnosti zaviralnih snovi smo izvedli s pomočjo komercialnega hitrega testa Twin sensor (Unisensor, KIT 020), kjer smo v mikrotitrsko ploščico odpipetirali 0,2 mL vzorca mleka ter inkubirali pri 40 °C 3 minute. V mikrotitrski ploščici so že prisotni receptorji in protitelesa, ki v času inkubacije vežejo ustrezne analite, če so le ti prisotni. Po inkubaciji v suspenzijo vzorca pokončno postavimo listič, ki je sestavljen iz več membran. Po treh minutah lahko odčitamo rezultat na lističu, ki ga vidimo v obliki črt, kamor se določeni vezani receptorji ujamejo. Srednja črta predstavlja kontrolo; če se obarva črta nad njo, imamo v mleku prisotne tetracikline, če se obarva črta pod njo pa betalaktamske antibiotike.
3.4.3.2 Mikrobiološke analize
V sklopu mikrobioloških analiz mleka smo v surovem senenem mleku ugotavljali higiensko kakovost, kjer smo s pomočjo instrumentov FOSSOMATIC 5000 in BactoScan FC določali ŠSC oz. SŠMO. Oba instrumenta se rutinsko uporabljata v mlekarni Celeia. Poleg
instrumentalno določene mikrobiološke/higienske kakovosti smo v vzorcih surovega senenega mleka mikrobiološko ustreznost določali še s klasičnimi metodami nacepljanja na trda gojišča ali petrifilme, kjer smo določali prisotnost sulfit reducirajočih klostridijev, mezofilnih kokov, mezofilnih laktobacilov, stafilokokov ter E. coli in koliformnih MO (mlekarna Celeia), medtem ko so prisotnost Listeria monocytogenes in Salmonela sp. za nas določali na Inštitutu za mlekarstvo in probiotike na Oddelku za zootehniko Biotehniške fakultete.
• Določanje števila somatskih celic (ŠSC)
ŠSC smo določali s pomočjo instrumenta FOSSOMATIC 5000 s tehniko fluorooptične pretočne citometrije (ISO 13366-2:2006), kjer fluorescentna barvila specifično obarvajo somatske celice. Pri analizi aparat odpipetira vzorec mleka ter ga zmeša z raztopino barvila, ki obarva celice. Vzorec mleka izpostavimo modri svetlobi, pri kateri obarvane SC emitirajo rdečo svetlobo, ki jo je možno šteti kot svetlobne impulze s fotoojačevalnikom. Število SC izrazimo v tisočih na mililiter mleka (število x 1000/mL).
• Določanje skupnega števila mikroorganizmov (SŠMO)
SŠMO smo določali s pomočjo instrumenta BactoScan FC (2007, FOSS, Danska) skladno s standardom ISO 16297:2013, ki deluje na principu pretočne citometrije. V aparatu se bakterije obarvajo s fluorescenčnim barvilom, komponente mleka pa se razgradijo in dispergirajo, da ne motijo detektorja. Fluorescentni detektor zazna imitirajočo svetlobo, ki jo oddajajo obarvane bakterije, ki gredo skozi pretočno celico kot tanek curek. Svetlobni pulzi se pretvorijo v električne, ki se nato kot seštevek prikažejo na monitorju. Rezultate podamo v kolonijskih enotah na mL (KE/mL).
• Določanje števila mikroorganizmov s štetjem na petrifilmih in petrijevih ploščah Preostale mikrobiološke metode smo izvajali s konvencialno metodo nacepljanja na trda gojišča oz. petrifilme in inkubacijo.
Vzorec surovega senenega mleka, odvzet na sprejemu, smo pred analizo dobro premešali ter redčili po Kochu do koncentracije, pri kateri smo predvidevali, da bodo nacepljene petrijeve plošče števne. Pri mikrobiološki analizi surovega senenega mleka smo določali število sulfit reducirajočih klostridijev, mezofilnih kokov, mezofilnih laktobacilov, stafilokokov (S.
aureus, S. saprophiticus) ter E. coli in koliformnih bakterij. Prisotnost Listeria monocytogenes in Salmonela sp. so določali na Inštitutu za mlekarstvo in probiotike.
Pri določanju števila kolonijskih enot sulfit reducirajočih klostridijev z gojiščem TSC smo v brezprašni komori prenesli 1 mL primerno razredčenega vzorca surovega senenega mleka v sterilno prazno petrijevo ploščo ter ga prelili z raztopljenim, a primerno ohlajenim (cca. 45
°C) TSC gojiščem. Nato smo z nežnimi krožnimi gibi razredčen vzorec mleka vmešali v gojišče ter pustili, da se strdi. Ko se je strdilo, smo preko njega ponovno prelili tanko plast gojišča TSC. Ko se je strdila še ta, smo nacepljene vzorce mleka inkubirali v pogojih, ki jih prikazuje preglednica 4. Po inkubaciji smo kot pozitiven rezultat na prisotnost sulfit reducirajočih klostridijev šteli izrasle kolonije črne barve.
Tudi pri določanju števila mezofilnih kokov in mezofilnih laktobacilov smo uporabili tehniko prelivanja z raztopljenim gojiščem. Prav tako smo v aseptičnih pogojih prenesli po 1 mL ustrezno razredčenih vzorcev surovega senenega mleka v prazne sterilne petrijeve plošče, prelili z ustreznim raztopljenim in ohlajenim gojiščem (M17 za mezofilne koke, MRS za mezofilne laktobacile), vmešali vzorec mleka v gojišče, pustili, da se strdi in inkubirali (preglednica 4). Po inkubaciji smo prešteli vse izrasle kolonije na gojišču M17 (mezofilni koki) oz. na gojišču MRS (mezofilni laktobacili), a samo na petrijevih ploščah s števnim številom kolonij, torej na tistih, na katerih je zraslo od 10 do 300 kolonij.
Za določanje stafilokokov smo uporabili tehniko razmaza, kjer smo v aseptičnih pogojih na predhodno razlito in strjeno gojišče CHROMagar Staph aureus odpipetirali po 0,1 mL ustrezne razredčitve vzorca ter ga razmazali s sterilno plastično razmazovalno paličico ter inkubirali (preglednica 4). Po inkubaciji smo kot pozitiven rezultat šteli le kolonije roza do bledo vijolične barve.
E. coli in koliformne mikroorganizme smo določali na komercialno pripravljenih petrifilmih tako, da smo v aseptičnih pogojih odpipetirali po 1 mL primerne razredčitve vzorca mleka na petrifilm, ga previdno pokrili in inkubirali pri pogojih, navedenih v preglednici 4. Kot pozitiven rezultat za določanje E. coli smo šteli izrasle modre do rdečo-modre kolonije, ki jih je obdajal zračni mehurček. Preostale koliformne bakterije pa so bile rdeče barve z zračnim mehurčkom. Upoštevali smo petrifilme, na katerih je zraslo do 150 kolonij.
Listeria monocytogenes in Salmonela sp. so za nas določali na Inštitutu za mlekarstvo in probiotike, in sicer po uveljavljeni metodi, ki temelji na treh korakih: obogatitev vzorca, izolacija s selektivnimi gojišči ter identifikacija oz. potrditev z različnimi testi. Po končani analizi so nam posredovali rezultate.
Preglednica 4: Odnos do kisika ter čas in temperatura inkubacije za določanje posameznih skupin mikroorganizmov
Gojišče Skupina MO Atmosferski
pogoji inkubacije
Čas in temperatura inkubacije TSC sulfit reducirajoči klostridiji anaerobno 18-24 ur, 37 °C
M17 mezofilni koki
(laktokoki in enterokoki) aerobno 24-48ur, 30 °C
MRS mezofilni laktobacili anaerobno 69-75 ur, 30 °C
CHROMagar Staph stafilokoki
(S. aureus, S. saprophiticus) aerobno 18-24 ur, 37 °C 3M petrifilm
E.coli/coliform count plate E. coli, koliformni MO aerobno 24 ur, 37 °C
Po preštevanju izraslih kolonij na petrijevih ploščah smo za izračun števila mikroorganizmov v vzorcu surovega senenega mleka uporabili enačbo:
𝑁 = Σ𝐾𝐸
(𝑛1+0,1×𝑛2)× 𝑅 …(1)
N – število mikroorganizmov
ΣKE – vsota kolonij prešteta na vseh števnih ploščah n1 – število števnih petrijevih plošč prve razredčitve n2 – število števnih petrijevih plošč druge razredčitve R – razredčitveni faktor prve razredčitve
3.4.4 Analize sirov
V nalogi smo analizirali vzorce sirov iz različnih faz tehnološkega postopka in sicer sirnino po stiskanju, sire po soljenju v slanici ter 90 dni zorene sire. Pri odvzetih vzorcih smo opravili mikrobiološke, kemijske oziroma senzorične analize.
3.4.4.1 Kemijske analize
Kemijske analize smo izvedli samo pri 90 dni zorenih sirih, in sicer smo analize za potrebe naloge izvajali v mlekarni Celeia po rutinskem postopku. S klasičnimi metodami smo določali vsebnost soli, suhe snovi, mlečne maščobe in mlečne maščobe v suhi snovi, medtem ko smo z aparatom Foodscan določili vsebnost beljakovin. Metode in opisi so:
• Določanje vsebnosti soli (NaCl)
Vsebnost soli smo določali z metodo ugotavljanja vsebnosti natrijevih ionov (Na+) v siru. Uporablja se tehnika večkratnega dodatka standarda, kar pomeni, da se večji količini raztopine preiskovanega vzorca večkrat zaporedoma doda majhna količina standardne raztopine z znano koncentracijo Na+ ionov. Potencial vzorca se s tem spreminja in ga merimo z iono-selektivnimi elektrodami pred dodatkom ter po vsakem dodatku standardne raztopine. Iz razlik potencialov in s pomočjo algoritma se izračuna koncentracija natrija v vzorcu. Rezultate podamo kot vsebnost NaCl v g/100 g vzorca (interni vir podjetja).
• Določanje vsebnosti maščobe
Vsebnost maščobe smo določali po referenčni metodi Van Gulik (ISO 3433:2008), ki temelji na principu raztapljanja beljakovinskega ovoja okoli maščobnih kroglic, pri čemer s centrifugiranjem izločamo maščobo. Količino odčitamo neposredno na skali butirometra in jo izrazimo kot odstotek maščobe v vzorcu.
• Določanje suhe snovi (SS)
SS je količina ostanka, ki ga dobimo s sušenjem vzorca pri T 102 °C do konstantne teže. Rezultat izražamo v utežnih odstotkih (ISO 5534: 2004).
• Določanje beljakovin v siru z aparatom Foodscan™ Lab
Aparat Foodscan™ Lab izvaja meritve na osnovi infrardeče tehnologije, s pomočjo katere lahko istočasno in natančno določimo več parametrov. Monokromatična svetloba spektra 850-1050 nm presveti vzorec in detektor izmeri količino svetlobe, ki je prišla skozi vzorec. Rezultati gredo skozi digitalni signalni procesor, kjer nato računalnik z uporabo kalibracije preračuna rezultate (interni vir podjetja).
Iz rezultatov kemijskih analiz sira smo izračunali % maščobe v suhi snovi ter % vode v nemastni snovi sira. Podatke smo obdelali v programu Excel.
Količino maščobe v suhi snovi smo izračunali po enačbi:
% maščobe v suhi snovi = %m
%SS× 100 … (2)
Količino vode v nemastni snovi smo izračunali iz podatkov o vsebnosti suhe snovi in maščobe, ki smo ju uporabili v enačbi:
% vode v nemastni snovi = % (100−SS)
100 − %mm× 100 … (3)
3.4.4.2 Mikrobiološke analize
Vse mikrobiološke analize sirov so potekale s konvencionalno metodo štetja na petrijevih ploščah oz. petrifilmih in inkubacijo.
Primarne raztopine vzorcev sirov v raztopini dikalijevega hidrogenfosfata smo nato naprej redčili z Ringerjevo raztopino ¼ jakosti po Kochu, in sicer v dveh paralelkah do primerne razredčitve, pri kateri smo predvidevali, da bodo nacepljene petrijeve plošče števne.
V sirih smo določali prisotnost sulfit reducirajočih klostridijev, mezofilnih kokov, mezofilnih laktobacilov, stafilokokov ter E. coli in koliformnih bakterij, kar smo opravili v mikrobiološkem laboratoriju mlekarne Celeia, medtem ko so prisotnost Listeria monocytogenes in Salmonela sp. za nas določali na Inštitutu za mlekarstvo in probiotike v Domžalah in nam po opravljenih analizah posredovali rezultate.
Vse mikrobiološke analize so potekale po postopkih, opisanih v podpoglavju »Določanje števila mikroorganizmov s štetjem na petrijevih ploščah in petrifilmih« poglavja 3.3.3.2.
Mikrobiološke analize po vzorcih so:
• Vzorci sirnine po stiskanju
Določali smo prisotnost sulfit reducirajočih klostridijev, mezofilnih kokov, mezofilnih laktobacilov, stafilokokov, E. coli in koliformnih bakterij ter Listeria monocytogenes in Salmonela sp.
• Vzorci sirov po soljenju v slanici
Določali smo prisotnost sulfit reducirajočih klostridijev, mezofilnih kokov, mezofilnih laktobacilov, stafilokokov ter E. coli in koliformnih bakterij.
• 90 dni zoreni siri
Določali smo prisotnost sulfit reducirajočih klostridijev, mezofilnih kokov, mezofilnih laktobacilov, stafilokokov, E. coli in koliformnih bakterij ter Listeria monocytogenes in Salmonela sp.
3.4.4.3 Senzorična analiza
Senzorično smo analizirali sire, zorene 90 dni, kjer smo uporabili 20 točkovni sistem.
Ocenjevali smo zunanji videz, barvo, testo in konsistenco, prerez, vonj ter okus. Test deluje na principu odbijanja točk za vsako zaznano napako. Vsota vrednosti za vse ocenjevane lastnosti je 20; ocena 0 pomeni zelo slabo izraženo ali neprimerno senzorično lastnost, najvišje ocene (ocena 1, 2, 3 oz. 10) pa optimalne do odlično izražene posamezne senzorične lastnosti. Najvišje možno število točk za določen parameter prikazuje preglednica 5.
Senzorično analizo sirov sta podala senzorična panela iz mlekarne Celeia in z Inštituta za mlekarstvo in probiotike Biotehniške fakultete. Slednji je bil strokovni panel in je vseboval 4 osebe. Panel iz mlekarne je bil sestavljen iz glavnih tehnologov proizvodnje, oseb iz razvoja in Ide Simončič. V obeh panelih je skupno ocenjevalo povprečno 15 istih oseb.
Ocenjevanje je potekalo na dveh lokacijah (mlekarna Celeia in Inštitut za mlekarstvo in probiotike) v senzoričnem laboratoriju.
Preglednica 5: Senzorične lastnosti in točkovno vrednotenje posamezne lastnosti
Lastnosti Najvišje
število točk Zunanji videz 2
Barva 1
Testo, konsistenca 2
Prerez 3
Vonj 2
Okus 10
Skupaj 20
3.4.4.4 Statistična analiza podatkov
Statistično izvrednotenje podatkov smo izvedli s programom IMB SPSS statistics 23. Za obdelavo rezultatov smo uporabili osnovno statistično proceduro Decriptive statistics in Explore (izračun povprečja in standardnega odklona).
3.5 LABORATORIJSKA IN DRUGA OPREMA
Med laboratorijskim delom smo v mlekarni Celeia uporabljali različno opremo. To so:
tehtnice, avtoklav, vodna kopel, petrijeve plošče, steklovina, stojala, nastavki, pipete,