Optične metode določitve spola zarodka v valilnem jajcu

Pri spektroskopskih metodah obsevamo vzorec z elektromagnetnim valovanjem znane energije ter beležimo elektromagnetna valovanja, ki ga oddajajo (snov odda del energije) ali absorbirajo (snov sprejme energijo) posamezne sestavine v vzorcu (Kramar, 2014). Z metodo optične spektroskopije je mogoče na temelju biokemične sestave celic določiti njihove lastnosti. Iz genetskih in biokemičnih razlik lahko pridobimo tudi informacijo o spolu zarodka/živali. Pri kokoših imajo samci dva večja spolna kromosoma Z, samice pa večji spolni kromosom Z in manjši spolni kromosom W. Ker je spolni kromosom Z večji od spolnega kromosoma W, je količina DNK pri samcih (petelinih) za cca 2 % večja od količine DNK pri samicah (kokoših) (Steiner in sod., 2011). Pri odraslih pticah sta že bili preizkušeni metodi določanja spola z uporabo ultravijolične resonančne ramanske spektroskopije in infrardeče absorbcijske spektroskopije na osnovi razlik v DNK, ki je bila izolirana iz celic perja. Infrardeča spektroskopija (IR) je bila uporabljena za določanje spola zarodkov v neinkubiranih jajcih, kjer se je ugotavljala količina DNK v celicah zarodnega diska (blastodermalnih celicah) (Steiner in sod., 2011). Pri pticah rdeče krvničke (eritrociti) vsebujejo jedro in torej nosijo genetsko informacijo o spolu zarodka/živali. Analize krvi nudijo tudi vpogled v presnovne razlike. Še pred začetkom spolne diferenciacije endokrinih žlez razvojne razlike med zarodki samcev in samic vplivajo na sestavo krvi (Galli in sod., 2017). Optične metode seksiranja in ovo potekajo brez fizičnega stika z zarodkom in so uporabne neposredno na licu mesta. Omogočajo določitev spola zarodka v realnem času, brez nevarnosti kontaminacije in brez nepotrebnega čakanja na rezultate kemijskih ali genetskih analiz jajčnih tkiv ali tekočin. Imajo torej jasne prednosti v primerjavi z drugimi metodami in ovo seksiranja, ki temeljijo na analizah hormonov ali DNK v odvzetih vzorcih jajčnega materiala (Galli in sod., 2017). Še več, optična spektroskopija je dobrodošla tudi z vidika zagotavljanja dobrobiti živali pod pogojem, da je izpeljana pred sedmim dnevom valjenja, torej pred dnevom, ko postane zarodek občutljiv na zunanje dražljaje (Aleksandrowicz in Herr, 2015).

2.3.10.1.1 In ovo seksiranje s spektroskopijo krvi zarodka

Pri kokoših traja valjenje (razvoj zarodka) 21 dni. Po treh dneh valjenja se pojavi vitelinski krvožilni sistem (kroženje krvi v rumenjakovi vrečki) in ta omogoča izvedbo spektroskopske analize krvi. Na tej stopnji valjenja je zarodek velik 5 do 7 mm, prekrvavljeno področje rumenjakove vrečke doseže velikost okrog 3 cm (Galli in sod., 2017).

Ker jajčna lupina ni prozorna, je treba v njej narediti nekaj milimetrov veliko odprtino (okence), da bi imeli optični dostop do ožilja (Galli in sod., 2017). Spektre je mogoče pridobiti pod mikroskopom z ene od glavnih žil vitelinskega krvožilnega sistema, po možnosti mora biti žila večja od 100 µm. Infrardeče valovanje valovne dolžine  =785 nm in P  200 mW ima dovolj energije, da lahko vzbudi nihanja funkcionalnih skupin v strukturi molekul. Energija tega nihanja je specifična za vsako funkcionalno skupino, zato v IR spektru vidimo adsorpcijske trakove pri določenih valovnih dolžinah. Uporaba bližnje infrardeče (NIR) spektroskopije omogoča v povezavi z objektivom z visoko numerično zaslonko pridobivanje spektra razpršenega sevanja v nekaj sekundah. Meritev ne povzroči poškodb sten krvnih žil ali morebitnega nastanka krvnih strdkov. Tudi do termičnih poškodb eritrocitov ne pride, saj te srce po krvožilju potiska z dokaj veliko hitrostjo in zato ostanejo v žarišču laserja le za delček sekunde (Galli in sod., 2016).

2.3.10.1.2 Ramanska spektroskopija

Ramanska spektroskopija temelji na neelastičnemu sipanju monokromatske svetlobe, ki ima izvor v laserju v območju vidnega, delu blizu infrardečega ali delu blizu ultravijoličnega spektra elektromagnetnega valovanja (Kramar, 2014). Za izvajanje ramanske spektroskopije se torej uporabljajo laserji z valovnimi dolžinami med bližnjo infrardečo in bližnjo ultravijolično. Vzorec se osvetli, na vzorcu sipano svetlobo se zbere, odfiltrira vpadno svetlobo z valovno dolžino izvora, preostanek svetlobe pa se razkloni in odvede na detektor.

Neelastično sipanje ali ramansko sipanje pomeni, da se delu svetlobe, ki se siplje na nekaterih vzorcih, spremeni frekvenca. Frekvenčni premik je odvisen od kemijske strukture snovi, zato metodo lahko uporabimo za identifikacijo snovi (Kramar, 2014). V primerjavi z infrardečo spektroskopijo so ramanske spektralne črte ožje. In ovo seksiranje s pomočjo ramanske spektroskopije je bilo uporabljeno na valilnih jajcih kokoši z belo barvo lupine po

Slika 4: Odprto jajce s 4 dni starim zarodkom (Aleksandrowicz in Herr, 2015)

3,5 dneh valjenja (Galli in sod., 2016). Spekter zarodkove krvi je kompleksen in večina črt izhaja iz hemoglobina. Po odstranitvi fluorescenčnega ozadja in normalizaciji so si povprečni spektri jajc z moškimi in jajc z ženskimi zarodki precej blizu skupaj. Vendar pa spekter razlik poudarja majhne razlike v območju 600–1500 cm^-1 (Slika 5) (Galli in sod., 2017). Negativne razlike v območjih 700–800 in 900–1000 cm^-1 se pripisuje razteznim vibracijam fosfodiesterskih vezi v nukleinskih kislinah kot tudi načinom raztezanja C – C.

Poročajo tudi o fosfodioksi razteznih vibracijah v nukleinskih kislinah pri ~ 1100 cm^-1. Pasovi beljakovin amid III so v območju 1200–1300 cm^-1. Razlike pri 1300 in 1450 cm^-1 se pripisuje načinom deformacije CHx v lipidih in beljakovinah (Slika 5). Zato z ramansko spektroskopijo ne odkrivamo razlik med spoloma samo na osnovi večje vsebnosti DNK v moških celicah, ampak je že v zgodnji fazi embrionalnega razvoja, pred razvojem endokrinih žlez, celotna biokemija krvi odvisna od spola zarodka (Galli in sod., 2017). Z izpopolnjeno klasifikacijsko in optimizacijsko strategijo je mogoče te razlike dodobra izkoristiti.

Enostavneje povedano to pomeni, da v analizo vključimo samo tiste spektralne regije, iz katerih lahko izluščimo informacije o spolu zarodka. Tako na primer pasove (proge), povezane z nukleinskimi kislinami izberemo v območju 724 ter 1071-1193 cm^-1. Pasove (proge) povezane z beljakovinami izberemo pri 616, 724, 1071-1093, 1159-1180, 1237-1257, 1262-1284 in 1303-1324 cm^-1. Po opravljeni izbiri spektrov, se vsakega izmed njih izrazi v obliki podnabora vrednosti intenzivnosti, ki se jih je za razvrščanje uporabilo v linearni diskriminatorni analizi. S tem pristopom je mogoče pravilno odbrati 90% spektrov (Galli in sod., 2017). Prenosljivost načina odbiranja spektrov se preveri na podatkih, ki se jih pridobi v neodvisnem poskusu. Rezultati dosedanjih raziskav kažejo, da je na ta način mogoče doseči 90 % natančnost določanja spola. Napake pri razvrščanju spektrov so

Slika 5: Ramanski spekter krvi samcev in samic (prirejeno po Galli in sod., 2017)

najverjetneje povezane z variabilnostjo v biokemijskih lastnostih krvi, medtem ko prisotnost rumenjaka in beljaka v spektrih na razvrščanje ne vpliva (Galli in sod., 2017).

2.3.10.1.3 Fluorescenčna spektroskopija

Z analizo spektra pridobljenega z ramansko spektroskopijo je moč ugotoviti, da se v povprečni intenzivnosti fluorescence spola razlikujeta, čeprav obstaja tudi precejšnje prekrivanje. Zato so znanstveniki veliko naporov vložili v iskanje vira te fluorescence in možnosti, da bi ga izkoristili pri določanju spola. Najprej je bilo ugotovljeno, da samo rdeče krvničke (eritrociti) kažejo intenzivno fluorescenco, medtem ko vse preostale embrionalne in zunaj embrionalne tekočine in tkiva dajejo ramanski spekter, ki je skoraj prost vsakršnega ozadja. V študiji so Galli in sod. (2017) proučevali časovni razvoj fluorescence vse do 12.

dne valjenja. Povečanje fluorescence je bilo zabeleženo do 8. dneva valjenja, kar je sovpadalo s povečanjem hematokrita v času eritropoeze ter povečanjem hemoglobina med dozorevanjem eritrocitov. Ti rezultati kažejo, da je hemoglobin vir opažene bližnje infrardeče fluorescence. Časovni potek razvoja fluorescence je bil nato analiziran pri obeh spolih. Jajca z moškimi in ženskimi zarodki so največjo razliko v fluorescenci izkazovala pri 3,5 dneh valjenja, kasneje je ta razlika postopoma upadala (Galli in sod., 2017). Na tej točki valjenja je bila ugotovljena razlika v obliki fluorescenčnega spektra med krvjo zarodkov ženskega in moškega spola. Po 4. dnevu valjenja je ostala intenzivnost fluorescence pri samcih visoka, medtem ko je razlika v obliki spektra hitro pojemala in do 5. dneva valjenja v celoti izginila. Po 9. dnevu valjenja sta si tudi intenzivnosti fluorescence pri obeh spolih postali podobni. Večja intenzivnost fluorescence v krvi zarodkov moškega spola na začetku valjenja je nastopala v povezavi z razlikami v eritropoezi med spoloma.

Spektralne razlike, ki obstajajo pri povratni razpršitvi spektra krvi zarodkov po 3,5 dneh valjenja so bile deležne nadaljnjih raziskav z metodo glavnih komponent (ang. Principal Component Analysis, PCA) (Galli in sod., 2017). Gre za statistično tehniko, ki analizira medsebojno soodvisnost spremenljivk z namenom, da se število spremenljivk zmanjša. Pri tem se osnovni nabor spremenljivk preslika v množico novih spremenljivk, tako imenovanih glavnih komponent. Teh je toliko, kolikor je osnovnih spremenljivk in so med seboj neodvisne. Glavne komponente se izražajo kot linearna kombinacija osnovnih spremenljivk in ohranjajo njihovo skupno variabilnost. V konkretni raziskavi sta prva in druga glavna komponenta (PC – ang. Principal Components) opisovali varianco intenzivnosti fluorescence in oblike spektra, medtem ko so višje komponente opisovale le varianco ramanskega signala. Tako je npr. nalagalni vektor PC1 predstavljal povprečni spekter in je vključeval tako fluorescenčne kot tudi ramanske signale razprševanja. PC1 rezultat je bil višji pri zarodkih moškega spola in je predstavljal večjo intenzivnost fluorescence. Nalagalni vektor PC2 je predstavljal širok fluorescenčni signal s središčem pri 1800 cm^-1. PC2 rezultat je bil višji pri zarodkih moškega spola in fluorescenca, ki jo opisuje ta komponenta, predstavlja spektralno značilnost krvi zarodkov moškega spola. Razlike v intenzivnosti in spektralni obliki, ki se pojavijo po 3,5 dneh valjenja je mogoče izkoristiti pri seksiranju in

ovo. Če se osredotočimo samo na fluorescenco (vrednosti PC1 in PC2) bomo dosegli približno 85 % natančnost določitve spola, 15 % napaka se pojavi zaradi prekrivanja podatkov. Z vključitvijo višjih glavnih komponent, ki opisujejo variabilnost ramanskega spektra, lahko natančnost določitve spola zarodkov povečamo na preko 90 % (Galli in sod., 2017)

2.3.10.1.4 Avtomatska optična spektroskopija

Za določanje spola zarodkov z metodo optične spektroskopije je ključnega pomena razvoj avtomatiziranega sistema, ki bi omogočal njeno implementacijo na industrijskem nivoju.

Avtomatizacija mora vključevati izdelavo odprtine (okenca) v jajčni lupini kot tudi kasnejšo

zatesnitev te odprtine v tistih jajcih, v katerih se nahajajo zarodki ženskega spola. Uporaba CO2 laserja (Krautwald-Junghanns in sod., 2018) zagotavlja hitro in čisto odstranitev majhnega dela lupine brez poškodb jajčnih struktur, ki se nahajajo pod lupino. CO2 laserji velike moči potrebujejo za izdelavo okenca v lupini manj kot sekundo. Dvigovanje izrezanega koščka lupine mora biti opravljeno avtomatsko brez poškodb zarodka ali zunaj embrionalnega krvožilnega sistema. Obvezna je kakovostna zatesnitev okenca v lupini jajc z ženskimi zarodki, za kar se uporabljajo biokompatibilni materiali. Zaradi lažje dostopnosti do vitelinskega krvožilnega sistema, se okence v lupini izreže na koničastem delu jajca. Ker pa se jajca v predvalilnikih nahajajo naložena s koničastim delom navzdol, lahko slaba zatesnitev okenca v lupini vodi do iztekanja tekočin iz jajca in pogina zarodka (Galli in sod., 2017). Laboratorijski poskusi kažejo, da se lahko ob pravilno izpeljanih postopkih na valilnih jajcih izognemo padcu v valilnosti. To velja tudi v primeru večjih okenc s premerom do 12 mm. Sistem, ki temelji na kameri omogoča tako avtomatsko odbiro žile kot tudi

Slika 6: Izdelava odprtine v lupini jajca s pomočjo laserja in uporaba spektroskopije za določitev spola zarodka na osnovi količine DNK (Randall, 2016)

usmeritev žarišča laserja v njeno notranjost (Slika 6). Načeloma je postavitev za spektrometrijo lahko zelo preprosta: potrebujemo le vzorec, ustrezni spektrometer in laserski izvor. Ob izbiri ustrezne opreme traja meritev le nekaj sekund. Da bi zadostili potrebam večjih komercialnih valilnic je mogoče montirati tudi več vzporednih spektroskopskih sistemov (Galli in sod., 2017).