UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ZOOTEHNIKO
Katja LAVRIČ MRVAR
MOŽNOSTI UPORABE DAN STARIH PETELINČKOV LAHKEGA TIPA
DIPLOMSKO DELO
Visokošolski strokovni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ZOOTEHNIKO
Katja LAVRIČ MRVAR
MOŽNOSTI UPORABE DAN STARIH PETELINČKOV LAHKEGA TIPA
DIPLOMSKO DELO
Visokošolski strokovni študij - 1. stopnja
POSSIBLE SOLUTIONS FOR THE USE OF DAY-OLD MALE LAYER CHICKS
B. SC. THESIS
Professional Study Programmes
Ljubljana, 2021
Diplomsko delo je zaključek visokošolskega strokovnega študijskega programa 1. stopnje Kmetijstvo – živinoreja.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za zootehniko je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Dušana Terčiča.
Recenzent: iz. prof. dr. Aleš Kuhar
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: izr. prof. dr. Klemen POTOČNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Dušan TERČIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: izr. prof. dr. Aleš KUHAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum predstavitve:
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dv1
DK UDK 636.5(043.2)=163.6
KG perutnina, kokoši, nesni tip, dan stari petelinčki, uporaba AV LAVRIČ MRVAR, Katja
SA TERČIČ, Dušan (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko, Visokošolski strokovni študijski program 1. stopnje Kmetijstvo – živinoreja
LI 2021
IN MOŽNOSTI UPORABE DAN STARIH PETELINČKOV LAHKEGA TIPA TD Diplomsko delo (Visokošolski strokovni študij - 1. stopnja)
OP VI, 19 str., 6 sl., 46 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Pri kokoših obstajajo negativne korelacije med nesnostjo in pitovnimi lastnostmi.
Zato so na selekcijskih centrih usmerjeni bodisi v pridobivanje kokoši lahkega (nesnega) tipa, bodisi se ukvarjajo s selekcijo kokoši težkega (mesnega) tipa.
Petelinčki lahkega tipa so pri teh sistemih pridobivanja končnih križancev višek.
Rastejo namreč počasi, slabo izkoriščajo krmo, njihovo meso ni mehko. Pobijanje dan starih petelinčkov lahkega tipa je zelo problematično z etičnega, okoljskega in ekonomskega vidika. Zato se iščejo alternativne metode, s katerimi bi se izognili rutinskemu pobijanju teh živali. Trenutno so v ospredju zanimanja naslednje tri metode: pitanje petelinov lahkega tipa, uporaba kombiniranih pasem ter določitev spola zarodkom v valilnih jajcih (t.i. »in ovo« seksiranje). Glavni slabosti pitanja petelinov nesnega tipa sta dolgo trajanje pitanja, velika poraba krme in posledično veliki stroški za krmo. Kombiniranih pasem kokoši, ki bi zagotavljale ekonomsko opravičljivo prirejo mesa in jajc na trgu ni moč dobiti. Trenutno najboljša alternativa je uporaba optične spektroskopije, s katero se spol zarodka v valilnem jajcu določi po štirih dneh valjenja, torej še preden se pri zarodku razvije senzorični živčni sistem.
Metoda omogoča, da se jajca z moškimi zarodki kmalu po začetku valjenja odstrani iz valilnika s čimer se prihrani pri energiji, odstranjena jajca pa lahko predelamo v krmo za živali. Glavne skrbi povezane s spektroskopsko metodo vključujejo natančnost določitve spola, stroškovno učinkovitost in dovolj veliko hitrost določanja spola, ki bi ustrezala potrebam industrije. V diplomski nalogi so opisani mehanizmi določanja spola pri pticah in možne rešitve za problem odvečnih petelinčkov nesnega tipa.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Dv1
DC UDC 636.5(043.2)=163.6
CX poultry, laying hens, male-layer chick, utilization AU LAVRIČ MRVAR, Katja
AA TERČIČ Dušan, (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Animal Science, Professional Study Programme in Agriculture – Animal Husbandry
PY 2021
TY POSSIBLE SOLUTIONS FOR THE USE OF DAY-OLD MALE LAYER CHICKS DT B. Sc. Thesis (Professional Study Programmes)
NO VI, .19 p., 6 fig., 46 ref.
LA sl Al sl/en
AB In chickens, there are negative correlations between laying performance and fattening performance. Therefore, selection centers focus on either selection of egg-type chickens or selection of meat-type chickens. As a result, one-day old male layer chicks are considered as defects in production. This is because, they have a slow growth rate, low feed conversion, and their meat is not tender at maturity. The culling of day-old male chicks in layer production raises animal welfare, environmental, economic and ethical issues. Therefore, researchers are looking for alternative methods to avoid the routine killing of male layer chicks. Currently, three different methods are in focus: raising male eggs for meat production, using dual-purpose breeds, and sex identification in hatching eggs (i.e. »in ovo« sexing). The main disadvantages of rearing male laying hens are the long fattening period, the high feed consumption and the resulting high feed costs. Dual purpose breeds that would allow economically viable production of meat and eggs are not available. The best alternative at present would be to use in ovo spectroscopy for sex determination in the hatching egg on the fourth day of incubation, before the chick embryo develops its sensory nervous system. As a result, the male hatching eggs are removed early and do not hatch. This saves energy costs and the removed male hatching eggs could then be processed into a high quality feed. Some concerns regarding these technologies are the accuracy of sexing, cost effectiveness, and producing rates fast enough for the industry. This thesis describes the mechanisms of sex determination in birds and possible solutions to the problem of male layer chicks being discarded.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV KAZALO VSEBINE V
KAZALO SLIK VI
1 UVOD ... 1
2 PREGLED LITERATURE ... 1
2.1 MEHANIZEM DOLOČITVE SPOLA PRI PTICAH ... 1
2.1.1 Spolna determinacija spola ... 1
2.1.2 Vplivi na primarno razmerje med spoloma ... 2
2.3 METODE DOLOČANJA SPOLA PRI PTICAH ... 4
2.3.1 Določanje spola ptic na osnovi njihovega obnašanja ... 4
2.3.2 Določanje spola ptic na podlagi morfoloških značilnosti ... 5
2.3.3 Določanje spola ptic z analizo steroidnih hormonov v iztrebkih .... 5
2.3.4 Določanje spola ptic z uporabo ultrazvoka ... 6
2.3.5 Kirurške metode določanja spola ptic ... 6
2.3.6 Določanje spola ptic s citogenetsko analizo (kariotipizacija) ... 6
2.3.7 Določanje spola ptic s pretočno citometrijo ... 7
2.3.8 Določanje spola ptic z molekularno genetskimi metodami ... 7
2.3.9 Določanje spola ptic na osnovi morfometričnih lastnosti valilnih jajc ... 9
2.3.10 Določitev spola zarodka v valilnem jajcu (seksiranje »in ovo«) ... 9
2.3.10.1 Optične metode določitve spola zarodka v valilnem jajcu ... 10
2.3.10.1.1 In ovo seksiranje s spektroskopijo krvi zarodka ... 10
2.3.10.1.2 Ramanska spektroskopija ... 11
2.3.10.1.3 Fluorescenčna spektroskopija ... 13
2.3.10.1.4 Avtomatska optična spektroskopija ... 14
2.4 PITANJE PETELINOV LAHKEGA TIPA NA MANJŠE TELESNE MASE ... 15
2.5 REJA KOMBINIRANIH PASEM ... 16
2.6 KASTRACIJA PETELINČKOV LAHKEGA TIPA ... 17
3 RAZPRAVA ... 18
4 SKLEPI ... 19
5 VIRI ... 21 ZAHVALA
KAZALO SLIK
Slika 1: Določitev in diferanciacija spola pri pticah (Kuroiwa, 2018) ... 2 Slika 2: Proces nastajanja jajca in njegovo valjenje s časovno skalo dogodkov, ko bi kokoš lahko vplivala na primarno razmerje med spoloma (prirejeno po Pike in Petrie, 2003) ... 4 Slika 3: Karakterizacija spolno specifičnega CHD gena (slika levo) in rezultat pomnoževanja obeh kopij genov na agaroznem gelu (slika desno) (Carr, 2008) .. 8 Slika 4: Odprto jajce s 4 dni starim zarodkom (Aleksandrowicz in Herr, 2015) 11 Slika 5: Ramanski spekter krvi samcev in samic (prirejeno po Galli in sod., 2017) ... 12 Slika 6: Izdelava odprtine v lupini jajca s pomočjo laserja in uporaba
spektroskopije za določitev spola zarodka na osnovi količine DNK (Randall, 2016) ... 14
1 UVOD
Med rastjo, ki je najpomembnejša lastnost pri pitanju perutnine in nesnostjo, ki je najpomembnejša lastnost pri reji nesnic, obstajajo negativne genetske korelacije. Zato so se že pred desetletji na perutninskih selekcijskih centrih usmerili v razvoj linij oziroma genotipov kokoši, ki so specializirani (selekcionirani) bodisi za prirejo mesa ali prirejo jajc (Krautwald-Junghanns in sod., 2018). Medtem, ko pri težkem (brojlerskem) tipu za prirejo mesa koristimo oba spola, se pitanje petelinčkov lahkega (nesnega) tipa ekonomsko ne izplača. Zato se en dan stare petelinčke lahkega tipa v valilnicah usmrti, bodisi z maceracijo (mletjem) ali plinom CO2. Ta praksa povzroča gospodarsko in okoljsko škodo ter sproža številna etična vprašanja oziroma pomisleke v povezavi z dobrobitjo živali (Giersberg in Kemper, 2018). Že nekaj časa se raziskave na tem področju usmerjajo v iskanje strategij, s katerimi bi se izognili pobijanju dan starih petelinčkov lahkega tipa, ali bi bilo to izpeljano na etično sprejemljiv in ekonomsko vzdržen način. Trenutno so najbolj aktualni trije načini reševanja navedene problematike in sicer (Giersberg in Kemper, 2018): a.) določitev spola zarodkom s pomočjo endokrinoloških in optičnih metod v zelo zgodnjih fazah valjenja, b.) reja kombiniranih pasem, kjer kokoši znesejo dovolj jajc, petelini pa se solidno pitajo s čimer je upravičena ekonomičnost njihove reje in c.) pitanje petelinčkov lahkega (nesnega) tipa zlasti v pogojih ekološke reje in/ali do manjše telesne mase. Namen diplomske naloge je podrobneje predstaviti vse zgoraj izpostavljene aktualne rešitve za problem »odvečnih«
petelinčkov lahkega tipa.
2 PREGLED LITERATURE
2.1 MEHANIZEM DOLOČITVE SPOLA PRI PTICAH 2.1.1 Spolna determinacija spola
Pri pticah je sistem določitve spola podoben kot pri sesalcih. Gre za kromosomsko spolno determinacijo, pri kateri je spol določen z geni, ki se nahajajo na specifičnih, tako imenovanih spolnih kromosomih. Za razliko od sesalcev, so pri pticah samice heterogametne, samci pa homogametni. Zarodki z dvema spolnima kromosomoma Z se razvijejo kot samci (ZZ), tisti z enim spolnim kromosomom Z in drugim W pa kot samice (ZW) (Smith in sod., 2007). Trenutno sta v obtoku dve hipotezi o določitvi spola pri pticah.
Prva pravi, da je število Z kromosomov ključni dejavnik, ki določa spol, druga pa predvideva, da na W kromosomu obstaja gen, ki nadzoruje razvoj jajčnikov oziroma zavira razvoj testisov (Kuroiwa, 2018). V preteklosti se je veliko študij osredotočalo na razumevanje funkcionalnih vlog Z kromosoma pri določanju spola in spolnih fenotipov pri piščancih. Smith in sod. (2007) so dokazali, da je gen z oznako DMRT1, ki se nahaja na kromosomu Z, potreben za določitev moškega spola pri piščancih. Ker pa sta pri samcih
prisotna dva Z kromosoma (ZZ), pri samicah pa le eden (ZW), naj bi prav dvojna doza DMRT1 gena pri samcih bila tista, ki determinira razvoj samca (Slika 1). Kljub temu, da je gen DMRT1 nujen za razvoj testisov, ni jasnih dokazov, da ta gen nadzoruje primarno določitev spola (pojav testisov ali jajčnika). V splošnem so genetski dejavniki, ki uravnavajo diferenciacijo spola pri vretenčarjih dobro ohranjeni, čeprav se mehanizmi, ki sprožijo postopek diferenciacije kot tudi hierarhične interakcije med dejavniki, ki na to vplivajo, med posameznimi vrstami zelo razlikujejo. Spolni kromosom W obstaja prvenstveno pri pticah, žuželkah, ribah, plazilcih, rakih in sviloprejkah. Za razliko od kromosoma Z, je kromosom W manjši in na njem se nahaja le nekaj genov. Funkcionalne lastnosti kromosoma W so pri
pticah (ZW sistem – ptice) povsem drugačne od funkcionalnih lastnosti kromosoma Y pri sesalcih (sistem XY – sesalci) (Mank, 2012). Je pa res, da kromosom W pri pticah še ni bil tako podrobno proučen kot kromosom Y pri sesalcih, še zlasti niso bile proučene majhne hetero kromatične regije, ki se nahajajo na njem. Obstajajo poročila o več vlogah kromosoma W v ključnih spolno specifičnih evolucijskih procesih in določanju spola. Pri pticah igra kromosom W pomembno vlogo v lastnostih fitnesa pri samicah, določitvi spola in posledično diferenciaciji spola v času embrionalnega razvoja. Pri sviloprejki ima kromosom W prevladujočo vlogo v določitvi ženskega spola, kar kaže na obstoj dominantnega feminizirajočega gena na tem kromosomu (Kiuchi in sod., 2014). Kot je bilo že omenjeno, pri pticah gen DMRT1 na kromosomu Z vpliva na oblikovanje testisov (Smith in sod., 2009), medtem ko geni, ki bi vplivali na razvoj jajčnikov, še niso bili ugotovljeni.
2.1.2 Vplivi na primarno razmerje med spoloma
Primarno razmerje med spoloma je določeno ob oploditvi jajčne celice. Skladno z
Slika 1: Določitev in diferenciacija spola pri pticah (Kuroiwa, 2018)
Mendlovimi zakoni dedovanja, je pri genetski določitvi spola, kakršna je prisotna tudi pri pticah, verjetnost za spočetje samca enaka verjetnosti za spočetje samice (50 % samci : 50
% samice). Vendar je bilo v več raziskavah ugotovljeno, da je lahko to razmerje tudi porušeno, kar se razlaga z več hipotezami (Pike in Petrie, 2003). Ena od njih pravi, da v kolikor v določenem okolju obstaja med spoloma razlika v reprodukcijski zmožnosti, bodo starši v večjem številu reproducirali živali tistega spola, ki v tem okolju izkazuje večji fitnes.
Manipulacija s primarnim razmerjem med spoloma je zanimiva zlasti zato, ker bi se, v kolikor bi bili pri tem uspešni, lahko izognili reprodukciji živali tistega spola, ki v dani proizvodni usmeritvi ekonomsko niso zanimive. Navkljub vse obsežnejšim dokazom o odklonih v primarnem razmerju med spoloma nam mehanizmi, ki do teh odklonov pripeljejo, niso povsem jasni (Goerlich-Jansson in sod., 2013). Ptice so zelo primeren model za študij manipulacij v primarnem razmerju med spoloma, saj so samice heterogametne in zato obstaja možnost, da vplivajo na spol svojih potomcev (Goerlich-Jansson in sod., 2013).
Manipulacijo v primarnem razmerju med spoloma je mogoče izvajati na različnih stopnjah razvoja jajčne celice. V literaturi se navajajo naslednji mehanizmi (Slika 2) (Pike in Petrie, 2003):
a.) Neistočasen (asinhroničen) razvoj foliklov. Namesto, da bi folikli dozorevali po strogo hierarhičnem vrstnem redu, se predovulatorni folikli razvijejo po spolno specifični poti, kar lahko pojasni ovipozicijo jajčnih celic, v katerih je večinsko zastopana samo ena vrsta spolnih kromosomov, na kar je pri pticah mogoče pogosto naleteti. To lahko pomeni, da lahko določen dejavnik, verjetno v kombinaciji z različno stopnjo dozorevanja foliklov, determinira spol v času mejoze. Badyaev in sod. (2006) so zapisali, da se folikli razvijejo v spolno specifičnih grozdih, izpostavljeni so različnemu maternalnemu okolju in različni akumulaciji maternalnih substanc (npr. spolnih hormonov, karotenoidov), kar lahko vpliva na rezultat mejoze. Obe navedeni hipotezi predpostavljata nenaključno segregacijo kromosomov v času mejoze, kar je najverjetnejši potencialni mehanizem, ki povzroči izkrivljeno primarno razmerje med spoloma (Pike in Petrie, 2003).
b.) Nenaključna segregacija kromosomov. Tik pred ovulacijo gre oocita skozi fazo mejoze I. V tem času se dvojno število kromosomov razpolovi in haploidna jajčna celica zadrži bodisi Z (moški) ali W (ženski) spolni kromosom, medtem ko se neaktivno polarno telo izloči. Snovi v rumenjaku, ki se naložijo v času hitre rasti lahko vplivajo na mejozo, da se pri tem oblikuje določen spol (Badyaev in sod., 2008). Druga možnost bi bila, da maternalna plazma v močno prekrvavljenih foliklih vpliva na segregacijo kromosomov na način, da se prednostni spolni kromosom zadrži v jajčni celici (Pike in Petrie, 2003).
c.) Folikularni abortus. Če po končani mejozi jajčna celica vsebuje neželeni spolni kromosom, lahko ta jajčna celica namesto ovulacije doživi abortus (Emlen, 1997). Abortus se zgodi z ovulacijo jajčne celice v trebušno votlino, čeprav to pogosto pripelje do zdravstvenih problemov in se jemlje bolj kot patološki pojav. Bolj pogost proces je folikularna atrezija, to je uničenje in reabsorbcija foliklov (Pike in Petrie, 2003).
č.) Spolno specifična oploditev/razvoj zarodka. Gre za post ovulatorni, sekundarni mehanizem, ki določa razmerje med spoloma. Ker moramo valilna jajca inkubirati več ur ali celo dni, da bi dobili dovolj tkiv zarodka, ki bi omogočala molekularno določitev spola, lahko valilna jajca, v katerih ni prišlo do razvoja zarodkov kažejo na prilagoditev razmerja med spoloma preko selektivne oploditve/razvoja zarodka (Goerlich-Jansson in sod., 2013).
2.3 METODE DOLOČANJA SPOLA PRI PTICAH
Določanje spola pri pticah je zahtevnejše in veliko težavnejše kot pri sesalcih, saj je več kot 50 % vrst ptic monomorfnih. Tudi pri bimorfnih vrstah ptic ne obstaja neka zunanja, jasno vidna lastnost, po kateri bi se spola razlikovala takoj po izvalitvi, kar onemogoča določitev spola na podlagi morfoloških razlik. Za določanje spola pri prostoživečih in čistopasemskih pticah je bilo uporabljenih že veliko metod, mnoge se uporabljajo še danes, vendar so vse, z izjemo molekularnih metod, bodisi premalo zanesljive ali pa je njihova izvedba predraga in prezapletena. Metoda določitve spola mora biti zanesljiva, hitra, gospodarna, etična in varna tako za žival kateri določamo spol kot tudi za osebo, ki spol določa (Vučićević in sod., 2016).
2.3.1 Določanje spola ptic na osnovi njihovega obnašanja
Prve metode za določanje spola pri pticah so temeljile na proučevanju različnih oblik obnašanj, včasih celo celotnega etograma, vendar najpogosteje so se osredotočale na obnašanje v času razmnoževanja. Te metode so omejeno uporabne, vezane so v glavnem na čas paritvene sezone in zahtevajo prisotnost živali obeh spolov (Jodice in sod., 2000). Eno od večjih težav pri njihovi praktični uveljavitvi predstavlja dejstvo, da samice številnih prostoživečih vrst ptic ob odsotnosti samca prevzamejo vzorce obnašanj, ki so značilni za samce.
Slika 2: Proces nastajanja jajca in njegovo valjenje s časovno skalo dogodkov, ko bi kokoš lahko vplivala na primarno razmerje med spoloma (prirejeno po Pike in Petrie, 2003)
2.3.2 Določanje spola ptic na podlagi morfoloških značilnosti
Razlikovanje spolov na podlagi morfoloških značilnosti je še danes najpogostejša metoda določanja spola ptic. Metoda je preprosta in poceni, nekoliko bolj zanesljiva od proučevanja obnašanja, vendar še vedno dokaj nezanesljiva. Razlike v fenotipu so lahko celo tako izrazite, da samce in samice zmotno pripišemo različnim vrstam (npr. Eclectus roratus), čeprav je to slučaj le pri majhnem številu vrst. Pri več kot polovici vrst ptic spola spolno zrelih živali ni mogoče določiti na podlagi morfoloških značilnosti (Heinsohn in sod., 2005).
Glavni pomanjkljivosti te metode sta dve: prvič, vedeti moramo kakšna je zunanjost samca in samice določene vrste in drugič, metodo lahko uporabimo šele pri spolno dozorelih živalih. Pri določanju spola se lahko osredotočimo na več zunanjih lastnosti kot npr. velikost in telesno maso, dolžino repa, obliko, velikost in barvo perja, dolžino glave in kljuna, debelino osnove kljuna, dolžino peruti od zapestnega sklepa do najbolj oddaljene konice, dolžino ali debelino stopalne kosti ali razdaljo med sramnimi kostmi (Vučičević in sod., 2016). Težavo predstavlja dejstvo, da lahko v morfoloških lastnostih obstajajo razlike tudi znotraj istega spola, predvsem zaradi geografskih razlik, letnega časa ali faze reprodukcijskega cikla. Nekateri raziskovalci so spol ptic določali z analizo njihovih zvokov, vendar te metode ni mogoče šteti za zanesljivo in široko uporabno, saj temelji na hipotezi, da imata struktura kljuna in velikost telesa pomembno vlogo pri oblikovanju zvokov. Pri samcih večine vrst je kljun močnejši, zato se oglašajo brez ponavljajočih zvočnih vzorcev.
Pomanjkljivost zvokovne metode je tudi ta, da je uporabna samo pri odraslih živalih, ki se oglašajo glasno (Volodin in sod., 2009). V komercialnih rejah perutnine se za določanje spola koristi razlika v kloaki samca in samice oziroma ugotavlja se prisotnost psevdopenisa.
Metodo sta prvič opisala dva japonska profesorja, zato je poznana tudi pod imenom japonska metoda. Je poceni, hitra in učinkovita metoda, ki se zadnjih nekaj desetletij koristi pri več vrstah rejne perutnine. Uspeh metode, katere izvedba običajno traja 2-3 sekunde, je odvisen od izkušenj osebja, ki vrši ločevanje po spolu in se giblje v mejah od 95 % pri izkušenejšem do 60 % pri manj izkušenem in neizkušenem osebju (Bramwell, 2003). Pri prostoživečih pticah (običajno iz vrst Procellariiformes, Sphenisciformes in Gruiformes) se analizira velikost odprtine kloake, ki bi morala biti zaradi prehoda jajca pri samicah večja kot pri samcih. Ta tehnika ima več omejitev med katerimi velja omeniti potrebo po visoko usposobljenem osebju, živali morajo biti v fazi reprodukcije, poznati je treba čas, ki je pretekel od znesenja jajca in poznati je treba izgled kloake samca (Boersma in Davies, 1987).
2.3.3 Določanje spola ptic z analizo steroidnih hormonov v iztrebkih
Določanje steroidnih hormonov v iztrebkih ptic se za namene določanja spola koristi že od leta 1978 in temelji na določanju razmerja med koncentracijo estrogena ter testosterona.
Vzorec za analizo mora biti vedno svež, žival kateri vzorec jemljemo pa izolirana od preostalih živali. Omenjena metoda ima več šibkih točk: a.) poznati moramo referenčne vrednosti za nivoje hormonov pri samcih in samicah, b.) obstaja sezonska variabilnost v
izločanju hormonov in c.) pri spolno nezrelih živalih obstajajo pomembna odstopanja (Vučičević in sod., 2016).
2.3.4 Določanje spola ptic z uporabo ultrazvoka
Pri sesalcih lahko ultrazvok uspešno uporabimo tako v prenatalnem kot tudi v postnatalnem obdobju. Pri pticah uporabo ultrazvoka otežuje obstoj zračnih vrečk in perja, pa tudi majhen razmik med prsnico in sramnimi kostmi (McMillan, 1988). Pri uporabi translokalnih sond je potrebno spirati kloako, verjetno najpomembnejša tehnična pomanjkljivost te metode pa je potreba po sondah zelo majhnih dimenzij.
2.3.5 Kirurške metode določanja spola ptic
Kirurške metode za določanje spola pri pticah (laparoskopija in laparotomija) so zelo zanesljive, saj omogočajo neposredno vizualizacijo spolnih žlez. Vendar obstaja tveganje za pooperativne okužbe in potreba po uporabi splošne anestezije, zaradi česar so neprimerne za uporabo v komercialni praksi (Jones in sod., 1984). Kirurške metode vključujejo uporabo različnih instrumentov, kot so otoskop, artoskop, mini laparoskop ali fiberoptični endoskop.
Zaradi majhne velikosti mladičev, kirurške metode težko uporabimo na komaj izvaljenih živalih, težko jih uporabimo tudi pri odraslih, zelo zamaščenih živalih, kjer maščobno tkivo preprečuje vizualizacijo spolnih žlez (Vučičević in sod., 2016).
2.3.6 Določanje spola ptic s citogenetsko analizo (kariotipizacija)
Kariotip predstavlja opis števila, velikosti in oblike vseh kromosomov neke celice oz.
organizma. Tako npr. kariotip kokoši sestavlja 78 kromosomov; od tega je 38 parov nespolnih (avtosomalnih) kromosomov in 1 par spolnih kromosomov. Citogenetske analize se pri sesalcih uporabljajo v različnih primerih, med drugim je s pregledom spolnih kromosomov mogoče določiti tudi spol živali. Pri pticah je za razliko od sesalcev proučevanje morfologije spolnih kromosomov težavnejše. Samci ptic so homogametni (ZZ), samice so heterogametne (ZW) (Krautwald-Junghanns in sod., 2018). Prva težava, s katero se soočimo je potreba po odvzemu krvi, ki je pri pticah precej stresen in posledično tvegan poseg. Poleg tega se v številu kromosomov posamezne vrste zelo razlikujejo (število kromosomov se giblje med 40 in 126) in ni mogoče uporabiti univerzalne metode določanja spola z analizo Z in W kromosomov. Dodatno pri pticah, ki ne letijo (npr. noj, emu, nandu), razlika v velikosti med kromosomoma Z in W praktično ne obstaja (Smith in sod., 2007).
Vse naštete ovire otežujejo postopek pridobivanja jasnega kariotipa in zmanjšujejo natančnost citogenetske analize.
2.3.7 Določanje spola ptic s pretočno citometrijo
Metoda, ki uporablja pretočno citometrijo je bila za določanje spola ptic v poskusne namene prvič uporabljena leta 1990 (Nakamura in sod., 1990). Osnovana je na majhni, vendar izmerljivi razliki v količini DNK v celicah samcev in samic. Po lizi celičnih membran se jedro obarva s fluorescentnimi barvili, ki interkalirajo v DNK verige. V nadaljevanju laserski žarki vzbudijo molekule barve, oddana barva se zazna in podatke obdela računalnik. Tehnika je bila uporabljena pri vrstah ptic s pomembnimi razlikami v velikosti Z in W kromosomov.
Vendar lahko polimorfizmi na ravni spolnih kromosomov ali obstoj ponavljajočih se zaporedij DNK močno vplivajo na zanesljivosti rezultatov, zato metode ni mogoče šteti za zanesljivo (Tiersch in sod., 1991).
2.3.8 Določanje spola ptic z molekularno genetskimi metodami
Vse doslej navedene metode določanja spola pri pticah (npr. določanje steroidnih hormonov v iztrebkih, laparoskopija, kariotipizacija, …) zahtevajo veliko časa za dosego rezultatov, so zahtevne, drage in v glavnem invazivne (Morinha in sod., 2012). Da bi odpravili te pomanjkljivosti, so bile v začetku zadnjega desetletja 20. stoletja predstavljene metode določanja spola ptic z analizo molekul DNK oziroma molekularno genetske metode, ki temeljijo predvsem na spolno specifičnih označevalcih (markerjih). Razlike v zaporedjih nukleotidov med W in Z kromosomoma ptic letalcev so omogočile razvoj več molekularnih tehnik, ki se v zadnjih dveh desetletjih uspešno uporabljajo za določanje spola. Analiza DNK se je izkazala kot odlična osnova za razvoj zanesljive, hitre in ekonomične metode določanja spola ptic. Razvoj verižne reakcije s polimerazo (ang. PCR – Polymerase Chain Reaction) je sredi osemdesetih let prejšnjega stoletja pomenil začetek popolnoma nove dobe v raziskavah molekul DNK (Cerit in Avanus, 2007). Sodobna literatura navaja molekularno genetske raziskave kot najbolj zanesljive za določanje spola ptic. Prednost molekularno genetskih metod pri določanju spola ptic se kaže tudi v tem, da za izolacijo DNK zadostuje količinsko zelo majhen vzorec, npr. eno pero, vzorec iztrebkov, kapljica krvi. Dodatno, vzorčenje posameznih tkiv zmeraj ne zahteva neposrednega stika z živaljo oziroma njeno lovljenje in fiksiranje, kar je za živali stresno. Analizo DNK lahko izvedemo na zarodkih, ne le na novo izvaljenih mladičih. Prvo tipiziranje DNK je leta 1991 razkrilo ponavljajoče se zaporedje na W kromosomu, hkrati je bilo ugotovljeno, da pri kokoših 70 – 90 % kromosoma W tvorijo ponavljajoča se zaporedja (Saitoh in sod., 1991). Leta 1992 je bila za določitev spola piščančjega zarodka uporabljena tehnika PCR nakar sta sledila razvoj in uporaba številnih metod: SSCP (ang. Single Strand Conformation Polymorphism), uporaba za W-kromosom specifičnih začetnih oligonukleotidov, RAPD (ang. Random Amplified Polymorphic DNA – naključno pomnožena polimorfna DNK), RFLP (ang. Restriction Fragment Length Polymorphism - polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov), AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism), pomnoževanje mikrosatelitov, ARMS (ang. Amplification Refractory Mutation System) in kvantitativni PCR v realnem času
(Vučičević in sod., 2016). Določitev spolno specifičnih nukleotidnih zaporedij na kromosomih Z in W, ki običajno ne sodelujejo pri razvoju spola ter njihova uporaba za določanje spola ptic, predstavlja revolucijo na tem področju. Zaporedja, ki so v tem pogledu najpomembnejša so: gen Wpkci, gen EE0.6, ATP5A1W gen in Spindling geni. Kljub vsem naštetim genom, so številne analize pokazale, da je CHD gen (ang. Chromo Helicase DNA - vezni gen) najboljši kandidat za uporabo kot univerzalni molekularni označevalec pri določanju spola ptic. Gen CHD-W je bil prvič opisan leta 1995, gen CHD-Z je bil odkrit dve leti kasneje (Cerit in Avanus, 2007). Ker so ohranjena kodirajoča nukleotidna zaporedja genov CHD-Z in CHD-W enako dolga, njihovega razlikovanja na agaroznem gelu ni mogoče opraviti. Razlike, ki omogočajo določitev spola, so prisotne na nivoju introna, saj je intronsko nukleotidno zaporedje podvrženo hitrim spremembam in mutacijam (Kahn in sod., 1998). Gen CHD ima več intronov, vendar se eden izmed njih, za katerega pomnoževanje se uporabljata začetna oligonukleotida 2550F/2718R, koristi pri določanju spola ptic.
Navedena začetna oligonukleotida se vežeta na zelo ohranjeno eksonsko zaporedje obeh kopij genov (črni okvirji na sliki 3 levo), v nadaljevanju pa se pomnoži nekodirajoči intron, ki je različne dolžine pri CHD-Z (600 baznih parov) in CHD-W (450 baznih parov) (Slika 3) (Carr, 2008). Ker samica poseduje spolna kromosoma Z in W, bomo pri njej določili introna dveh različnih velikosti (dve progi na agaroznem gelu – slika 3 desno), samec pa poseduje dva spolna kromosoma Z, zato bomo pri njemu določili introna iste velikosti (ena proga na agaroznem gelu – slika 3 desno) (Carr, 2008).
Za razliko od vseh predhodno navedenih metod določanja spola ptic, edino molekularno genetske metode, ki temeljijo na analizi genov CHD, združujejo zanesljivost, ekonomičnost in hitro dobivanje rezultatov. Dodatna prednost se kaže v tem, da lahko kot vzorec uporabimo količinsko zelo majhen vzorec (na primer pero, kapljico krvi ali bris ustne votline), zato ni nujno, da bo vzorčenje ogrozilo fizično integriteto živali, kateri določamo
Slika 3: Karakterizacija spolno specifičnega CHD gena (slika levo) in rezultat pomnoževanja obeh kopij genov na agaroznem gelu (slika desno) (Carr, 2008)
spol, hkrati se izognemo stresu živali in ne rušimo dobrega počutja živali (Vučičević in sod., 2016).
2.3.9 Določanje spola ptic na osnovi morfometričnih lastnosti valilnih jajc
Vsekakor najboljša, najhitrejša, najenostavnejša in najcenejša bi bila metoda, po kateri bi spol piščanca določili na svežih, neinkubiranih valilnih jajcih na osnovi njihovih morfometričnih lastnosti (širine, višine, razmerja širina/višina, volumna, mase, barve jajčne lupine). V tej povezavi je bilo opravljenih več raziskav, pri različnih pasmah kokoši oziroma vrstah perutnine (npr. Imholt 2010; Yilmaz-Dikmen in Dikmen 2013; Makovec, 2016), vendar v nobeni ni bilo mogoče korelirati razlik v morfometričnih lastnostih jajc s spolom piščancev/kebčkov, ki so se iz teh jajc izvalili.
2.3.10 Določitev spola zarodka v valilnem jajcu (seksiranje »in ovo«)
Trenutno je določanje spola zarodkov v valilnih jajcih (seksiranje »in ovo«) tista metoda, ki največ obeta v reševanju problematike pobijanja dan starih petelinčkov lahkega tipa. V zadnjih nekaj letih je bilo preizkušenih nekaj pristopov, da bi prišli do metode, ki bo primerna za praktično uporabo v valilnicah. Ko obravnavamo metode določanja spola zarodkov v valilnih jajcih (med valjenjem) je treba upoštevati nekaj naslednjih ključnih vidikov (Hendrix Genetics, 2020):
a.) Invazivne ali ne-invazivne tehnologije. Pri nekaterih tehnologijah je potrebno v lupini valilnega jajca narediti odprtino. To lahko vodi v kontaminacijo vsebine jajca in posledično slabšo valilnost.
b.) Natančnost določitve spola. Ta mora biti približno taka, kot če bi spol piščancev določali po izvalitvi (npr. po barvi puha, po operjenosti, cca. 98 %).
c.) Spol mora biti določen čim prej po vlaganju jajc v valilnike: Ni povsem jasno, kdaj zarodek občuti bolečino. Prvi senzorični živci se v kokošjem zarodku pojavijo po 4. dneh valjenja, vendar pa se sinaptična povezava do hrbtenjače ne razvije pred 7. dnevom valjenja (Krautwald-Junghanns in sod., 2018). To pomeni, da v prvem tednu valjenja kokošji zarodek ne občuti bolečine. Optimalno bi bilo, če bi spol določili še pred vlaganjem jajc v valilnike.
č.) Hitrost seksiranja. Seksiranje mora potekati čim hitreje (vsaj 40.000 jajc/uro), saj pri tem postopku jajca vzamemo iz valilnika, kjer hitro izgubljajo toploto.
d.) Primernost opreme za delovanje v valilnici. Oprema za določanje spola mora biti robustna in prilagojena za delovanje v okolju valilnice.
Obstajata dva principa, na katerih sloni določanje spola piščancev „in ovo“: a.) spektroskopija – skozi jajce ali odprtino v jajcu se spusti snop laserske svetlobe in analizira energijo sevanja po stiku z zarodkom, b.) testiranje biooznačevalcev – okrog 9. dneva valjenja se iz valilnega jajca vzame vzorec alantoisne tekočine in testira prisotnost hormonov ali opravi PCR test spolnih kromosomov (Hendrix Genetics, 2020).
2.3.10.1 Optične metode določitve spola zarodka v valilnem jajcu
Pri spektroskopskih metodah obsevamo vzorec z elektromagnetnim valovanjem znane energije ter beležimo elektromagnetna valovanja, ki ga oddajajo (snov odda del energije) ali absorbirajo (snov sprejme energijo) posamezne sestavine v vzorcu (Kramar, 2014). Z metodo optične spektroskopije je mogoče na temelju biokemične sestave celic določiti njihove lastnosti. Iz genetskih in biokemičnih razlik lahko pridobimo tudi informacijo o spolu zarodka/živali. Pri kokoših imajo samci dva večja spolna kromosoma Z, samice pa večji spolni kromosom Z in manjši spolni kromosom W. Ker je spolni kromosom Z večji od spolnega kromosoma W, je količina DNK pri samcih (petelinih) za cca 2 % večja od količine DNK pri samicah (kokoših) (Steiner in sod., 2011). Pri odraslih pticah sta že bili preizkušeni metodi določanja spola z uporabo ultravijolične resonančne ramanske spektroskopije in infrardeče absorbcijske spektroskopije na osnovi razlik v DNK, ki je bila izolirana iz celic perja. Infrardeča spektroskopija (IR) je bila uporabljena za določanje spola zarodkov v neinkubiranih jajcih, kjer se je ugotavljala količina DNK v celicah zarodnega diska (blastodermalnih celicah) (Steiner in sod., 2011). Pri pticah rdeče krvničke (eritrociti) vsebujejo jedro in torej nosijo genetsko informacijo o spolu zarodka/živali. Analize krvi nudijo tudi vpogled v presnovne razlike. Še pred začetkom spolne diferenciacije endokrinih žlez razvojne razlike med zarodki samcev in samic vplivajo na sestavo krvi (Galli in sod., 2017). Optične metode seksiranja in ovo potekajo brez fizičnega stika z zarodkom in so uporabne neposredno na licu mesta. Omogočajo določitev spola zarodka v realnem času, brez nevarnosti kontaminacije in brez nepotrebnega čakanja na rezultate kemijskih ali genetskih analiz jajčnih tkiv ali tekočin. Imajo torej jasne prednosti v primerjavi z drugimi metodami in ovo seksiranja, ki temeljijo na analizah hormonov ali DNK v odvzetih vzorcih jajčnega materiala (Galli in sod., 2017). Še več, optična spektroskopija je dobrodošla tudi z vidika zagotavljanja dobrobiti živali pod pogojem, da je izpeljana pred sedmim dnevom valjenja, torej pred dnevom, ko postane zarodek občutljiv na zunanje dražljaje (Aleksandrowicz in Herr, 2015).
2.3.10.1.1 In ovo seksiranje s spektroskopijo krvi zarodka
Pri kokoših traja valjenje (razvoj zarodka) 21 dni. Po treh dneh valjenja se pojavi vitelinski krvožilni sistem (kroženje krvi v rumenjakovi vrečki) in ta omogoča izvedbo spektroskopske analize krvi. Na tej stopnji valjenja je zarodek velik 5 do 7 mm, prekrvavljeno področje rumenjakove vrečke doseže velikost okrog 3 cm (Galli in sod., 2017).
Ker jajčna lupina ni prozorna, je treba v njej narediti nekaj milimetrov veliko odprtino (okence), da bi imeli optični dostop do ožilja (Galli in sod., 2017). Spektre je mogoče pridobiti pod mikroskopom z ene od glavnih žil vitelinskega krvožilnega sistema, po možnosti mora biti žila večja od 100 µm. Infrardeče valovanje valovne dolžine =785 nm in P 200 mW ima dovolj energije, da lahko vzbudi nihanja funkcionalnih skupin v strukturi molekul. Energija tega nihanja je specifična za vsako funkcionalno skupino, zato v IR spektru vidimo adsorpcijske trakove pri določenih valovnih dolžinah. Uporaba bližnje infrardeče (NIR) spektroskopije omogoča v povezavi z objektivom z visoko numerično zaslonko pridobivanje spektra razpršenega sevanja v nekaj sekundah. Meritev ne povzroči poškodb sten krvnih žil ali morebitnega nastanka krvnih strdkov. Tudi do termičnih poškodb eritrocitov ne pride, saj te srce po krvožilju potiska z dokaj veliko hitrostjo in zato ostanejo v žarišču laserja le za delček sekunde (Galli in sod., 2016).
2.3.10.1.2 Ramanska spektroskopija
Ramanska spektroskopija temelji na neelastičnemu sipanju monokromatske svetlobe, ki ima izvor v laserju v območju vidnega, delu blizu infrardečega ali delu blizu ultravijoličnega spektra elektromagnetnega valovanja (Kramar, 2014). Za izvajanje ramanske spektroskopije se torej uporabljajo laserji z valovnimi dolžinami med bližnjo infrardečo in bližnjo ultravijolično. Vzorec se osvetli, na vzorcu sipano svetlobo se zbere, odfiltrira vpadno svetlobo z valovno dolžino izvora, preostanek svetlobe pa se razkloni in odvede na detektor.
Neelastično sipanje ali ramansko sipanje pomeni, da se delu svetlobe, ki se siplje na nekaterih vzorcih, spremeni frekvenca. Frekvenčni premik je odvisen od kemijske strukture snovi, zato metodo lahko uporabimo za identifikacijo snovi (Kramar, 2014). V primerjavi z infrardečo spektroskopijo so ramanske spektralne črte ožje. In ovo seksiranje s pomočjo ramanske spektroskopije je bilo uporabljeno na valilnih jajcih kokoši z belo barvo lupine po
Slika 4: Odprto jajce s 4 dni starim zarodkom (Aleksandrowicz in Herr, 2015)
3,5 dneh valjenja (Galli in sod., 2016). Spekter zarodkove krvi je kompleksen in večina črt izhaja iz hemoglobina. Po odstranitvi fluorescenčnega ozadja in normalizaciji so si povprečni spektri jajc z moškimi in jajc z ženskimi zarodki precej blizu skupaj. Vendar pa spekter razlik poudarja majhne razlike v območju 600–1500 cm-1 (Slika 5) (Galli in sod., 2017). Negativne razlike v območjih 700–800 in 900–1000 cm-1 se pripisuje razteznim vibracijam fosfodiesterskih vezi v nukleinskih kislinah kot tudi načinom raztezanja C – C.
Poročajo tudi o fosfodioksi razteznih vibracijah v nukleinskih kislinah pri ~ 1100 cm-1. Pasovi beljakovin amid III so v območju 1200–1300 cm-1. Razlike pri 1300 in 1450 cm-1 se pripisuje načinom deformacije CHx v lipidih in beljakovinah (Slika 5). Zato z ramansko spektroskopijo ne odkrivamo razlik med spoloma samo na osnovi večje vsebnosti DNK v moških celicah, ampak je že v zgodnji fazi embrionalnega razvoja, pred razvojem endokrinih žlez, celotna biokemija krvi odvisna od spola zarodka (Galli in sod., 2017). Z izpopolnjeno klasifikacijsko in optimizacijsko strategijo je mogoče te razlike dodobra izkoristiti.
Enostavneje povedano to pomeni, da v analizo vključimo samo tiste spektralne regije, iz katerih lahko izluščimo informacije o spolu zarodka. Tako na primer pasove (proge), povezane z nukleinskimi kislinami izberemo v območju 724 ter 1071-1193 cm-1. Pasove (proge) povezane z beljakovinami izberemo pri 616, 724, 1071-1093, 1159-1180, 1237- 1257, 1262-1284 in 1303-1324 cm-1. Po opravljeni izbiri spektrov, se vsakega izmed njih izrazi v obliki podnabora vrednosti intenzivnosti, ki se jih je za razvrščanje uporabilo v linearni diskriminatorni analizi. S tem pristopom je mogoče pravilno odbrati 90% spektrov (Galli in sod., 2017). Prenosljivost načina odbiranja spektrov se preveri na podatkih, ki se jih pridobi v neodvisnem poskusu. Rezultati dosedanjih raziskav kažejo, da je na ta način mogoče doseči 90 % natančnost določanja spola. Napake pri razvrščanju spektrov so
Slika 5: Ramanski spekter krvi samcev in samic (prirejeno po Galli in sod., 2017)
najverjetneje povezane z variabilnostjo v biokemijskih lastnostih krvi, medtem ko prisotnost rumenjaka in beljaka v spektrih na razvrščanje ne vpliva (Galli in sod., 2017).
2.3.10.1.3 Fluorescenčna spektroskopija
Z analizo spektra pridobljenega z ramansko spektroskopijo je moč ugotoviti, da se v povprečni intenzivnosti fluorescence spola razlikujeta, čeprav obstaja tudi precejšnje prekrivanje. Zato so znanstveniki veliko naporov vložili v iskanje vira te fluorescence in možnosti, da bi ga izkoristili pri določanju spola. Najprej je bilo ugotovljeno, da samo rdeče krvničke (eritrociti) kažejo intenzivno fluorescenco, medtem ko vse preostale embrionalne in zunaj embrionalne tekočine in tkiva dajejo ramanski spekter, ki je skoraj prost vsakršnega ozadja. V študiji so Galli in sod. (2017) proučevali časovni razvoj fluorescence vse do 12.
dne valjenja. Povečanje fluorescence je bilo zabeleženo do 8. dneva valjenja, kar je sovpadalo s povečanjem hematokrita v času eritropoeze ter povečanjem hemoglobina med dozorevanjem eritrocitov. Ti rezultati kažejo, da je hemoglobin vir opažene bližnje infrardeče fluorescence. Časovni potek razvoja fluorescence je bil nato analiziran pri obeh spolih. Jajca z moškimi in ženskimi zarodki so največjo razliko v fluorescenci izkazovala pri 3,5 dneh valjenja, kasneje je ta razlika postopoma upadala (Galli in sod., 2017). Na tej točki valjenja je bila ugotovljena razlika v obliki fluorescenčnega spektra med krvjo zarodkov ženskega in moškega spola. Po 4. dnevu valjenja je ostala intenzivnost fluorescence pri samcih visoka, medtem ko je razlika v obliki spektra hitro pojemala in do 5. dneva valjenja v celoti izginila. Po 9. dnevu valjenja sta si tudi intenzivnosti fluorescence pri obeh spolih postali podobni. Večja intenzivnost fluorescence v krvi zarodkov moškega spola na začetku valjenja je nastopala v povezavi z razlikami v eritropoezi med spoloma.
Spektralne razlike, ki obstajajo pri povratni razpršitvi spektra krvi zarodkov po 3,5 dneh valjenja so bile deležne nadaljnjih raziskav z metodo glavnih komponent (ang. Principal Component Analysis, PCA) (Galli in sod., 2017). Gre za statistično tehniko, ki analizira medsebojno soodvisnost spremenljivk z namenom, da se število spremenljivk zmanjša. Pri tem se osnovni nabor spremenljivk preslika v množico novih spremenljivk, tako imenovanih glavnih komponent. Teh je toliko, kolikor je osnovnih spremenljivk in so med seboj neodvisne. Glavne komponente se izražajo kot linearna kombinacija osnovnih spremenljivk in ohranjajo njihovo skupno variabilnost. V konkretni raziskavi sta prva in druga glavna komponenta (PC – ang. Principal Components) opisovali varianco intenzivnosti fluorescence in oblike spektra, medtem ko so višje komponente opisovale le varianco ramanskega signala. Tako je npr. nalagalni vektor PC1 predstavljal povprečni spekter in je vključeval tako fluorescenčne kot tudi ramanske signale razprševanja. PC1 rezultat je bil višji pri zarodkih moškega spola in je predstavljal večjo intenzivnost fluorescence. Nalagalni vektor PC2 je predstavljal širok fluorescenčni signal s središčem pri 1800 cm-1. PC2 rezultat je bil višji pri zarodkih moškega spola in fluorescenca, ki jo opisuje ta komponenta, predstavlja spektralno značilnost krvi zarodkov moškega spola. Razlike v intenzivnosti in spektralni obliki, ki se pojavijo po 3,5 dneh valjenja je mogoče izkoristiti pri seksiranju in
ovo. Če se osredotočimo samo na fluorescenco (vrednosti PC1 in PC2) bomo dosegli približno 85 % natančnost določitve spola, 15 % napaka se pojavi zaradi prekrivanja podatkov. Z vključitvijo višjih glavnih komponent, ki opisujejo variabilnost ramanskega spektra, lahko natančnost določitve spola zarodkov povečamo na preko 90 % (Galli in sod., 2017)
2.3.10.1.4 Avtomatska optična spektroskopija
Za določanje spola zarodkov z metodo optične spektroskopije je ključnega pomena razvoj avtomatiziranega sistema, ki bi omogočal njeno implementacijo na industrijskem nivoju.
Avtomatizacija mora vključevati izdelavo odprtine (okenca) v jajčni lupini kot tudi kasnejšo
zatesnitev te odprtine v tistih jajcih, v katerih se nahajajo zarodki ženskega spola. Uporaba CO2 laserja (Krautwald-Junghanns in sod., 2018) zagotavlja hitro in čisto odstranitev majhnega dela lupine brez poškodb jajčnih struktur, ki se nahajajo pod lupino. CO2 laserji velike moči potrebujejo za izdelavo okenca v lupini manj kot sekundo. Dvigovanje izrezanega koščka lupine mora biti opravljeno avtomatsko brez poškodb zarodka ali zunaj embrionalnega krvožilnega sistema. Obvezna je kakovostna zatesnitev okenca v lupini jajc z ženskimi zarodki, za kar se uporabljajo biokompatibilni materiali. Zaradi lažje dostopnosti do vitelinskega krvožilnega sistema, se okence v lupini izreže na koničastem delu jajca. Ker pa se jajca v predvalilnikih nahajajo naložena s koničastim delom navzdol, lahko slaba zatesnitev okenca v lupini vodi do iztekanja tekočin iz jajca in pogina zarodka (Galli in sod., 2017). Laboratorijski poskusi kažejo, da se lahko ob pravilno izpeljanih postopkih na valilnih jajcih izognemo padcu v valilnosti. To velja tudi v primeru večjih okenc s premerom do 12 mm. Sistem, ki temelji na kameri omogoča tako avtomatsko odbiro žile kot tudi
Slika 6: Izdelava odprtine v lupini jajca s pomočjo laserja in uporaba spektroskopije za določitev spola zarodka na osnovi količine DNK (Randall, 2016)
usmeritev žarišča laserja v njeno notranjost (Slika 6). Načeloma je postavitev za spektrometrijo lahko zelo preprosta: potrebujemo le vzorec, ustrezni spektrometer in laserski izvor. Ob izbiri ustrezne opreme traja meritev le nekaj sekund. Da bi zadostili potrebam večjih komercialnih valilnic je mogoče montirati tudi več vzporednih spektroskopskih sistemov (Galli in sod., 2017).
2.4 PITANJE PETELINOV LAHKEGA TIPA NA MANJŠE TELESNE MASE
Ena od možnih alternativ za reševanje problematike odvečnih petelinčkov lahkega tipa bi lahko bilo njihovo pitanje na manjše telesne mase. Ta sistem vključuje krajše obdobje pitanja s sprejemljivim izkoriščanjem krme, kar je predpogoj za doseganje gospodarske učinkovitosti pitanja. V evropski zakonodaji je kokelet opredeljen kot piščanec z maso očiščenega klavnega trupa manjšo od 650 g (Uredba komisije (ES) št. 543/2008 z dne 16.
junija 2008 o uvedbi podrobnih pravil za izvajanje Uredbe Sveta (ES) št. 1234/2007 glede tržnih standardov za perutninsko meso, 2008). Koenig in sod. (2012a) so v pogojih zaprte reje pitali po 2350 petelinčkov vsakega od dveh genotipov: a.) srednje težkega Lohmann Brown (LB) in b.) lahkega Lohmann Selected Leghorn (LSL). Živali obeh genotipov so dobivale dve krmni mešanici: a.) popolno krmno mešanico za pitovne piščance - BD (1. do 21. dan starter; 22. do 49. dan finišer) ter b.) popolno krmno mešanico za jarčke lahkega tipa – LHD (1. do 21. dan starter; 22. do 49. dan finišer). LHD starter je vseboval nekaj več metabolne energije (12,8 MJ/kg) od BD starterja (12,6 MJ ME/kg), vendar manj surovih beljakovin (LHD = 21,0 %; BD = 22,0 %) (Koenig in sod., 2012a). Od 22. dne pitanja naprej so živali dobivale dva različna finišerja, pri čemer je BD finišer vseboval precej več metabolne energije in surovih beljakovin kot LHD finišer (BD = 13,5 MJ ME/kg, 19,5 % SB; LHD = 11,4 MJ ME/kg, 18,0 % SB). Po 49. dneh pitanja so piščanci v posameznih poskusnih skupinah dosegli naslednje telesne mase: 678 g (LB), 616 g (LSL), 685 g (BD) in 610 g (LHD). Izkoriščanje krme (poraba krme v kg za 1 kg prirasta telesne mase) je po skupinah znašalo: 2,43 (LB), 2,73 (LSL), 2,35 (BD) in 2,81 (LHD) (Koenig in sod. 2012a).
Na rast je bolj vplivala sestava krmne mešanice kot genotip živali, pri čemer so živali, ki so dobivale BD mešanico priraščale značilno bolje in porabile značilno manj krme za kilogram prirasta od tistih, ki so dobivale LHD mešanico. Proizvodni rezultati pridobljeni v raziskavi Koeniga in sod. (2012a) so primerljivi s proizvodnimi rezultati iz raziskave Dammeja in Rističa (2003), ki sta pri petelinčkih nesnega tipa v 70 dneh pitanja ugotovila povprečno izkoriščanje krme 2,8. Po mnenju Koeniga in sod. (2012a) bi lahko bili kokeleti pomemben nišni proizvod, pri čemer pa bi poleg proizvodnih morali analizirati tudi ekonomske rezultate pitanja petelinčkov na manjše telesne mase.
V eni od raziskav so Koenig in sod. (2012b) primerjali proizvodne rezultate pitovnih piščancev Ross 308 s proizvodnimi rezultati petelinov lahkega tipa, ki so pripadali štirim različnim genotipom: srednje težkima genotipoma Lohmann Brown (LB) in Hy-Line Brown (Hyline) ter lahkima genotipoma Lohmann Selected Leghorn (LSL) in Dekalb White
(Dekalb). Peteline so redili na globokem nastilu ter krmili po volji s komercialnimi krmnimi mešanicami. Pitovni piščanci Ross 308 so maso kokeletov (očiščen klavni trup 650 g) dosegli v 19. dneh pitanja, medtem, ko so petelini lahkega tipa za dosego enake mase potrebovali 47 dni (LB, Hy-Line) oziroma 49 dni (LSL, Dekalb). Po mnenju Koeniga in sod.
(2012b) je pri tej starosti smiselno končati s pitanjem. Izkoriščanje krme je znašalo 1,20 pri pitovnih piščancih in 2,45 pri petelinih lahkega tipa. Mase najpomembnejših klavnih kosov (prsi, bedra) so bile značilno večje pri pitovnih piščancih kot pri petelinih lahkega tipa (Koenig in sod. 2012b). Treba je izpostaviti, da se doslej pitanju petelinov lahkega tipa ni posvečalo veliko pozornosti, saj tako pitanje traja dokaj dolgo, poraba krme za kilogram prirasta telesne mase je velika pa tudi kakovost prsnega fileja, kot najvrednejšega klavnega kosa, se ne more primerjati s prsnim filejem pitovnih piščancev. Nadalje, klavni trupi petelinov lahkega tipa ne ustrezajo zahtevam sodobnih potrošnikov, niso dovolj »nabrekli«
in njihova priprava zahteva posebne postopke. Zato lahko pitanje petelinov lahkega tipa še vedno uvrščamo le med nišno rejo (Koenig in sod., 2010, 2012a,b).
V Nemčiji letno spitajo okrog 1 milijon petelinčkov lahkega tipa tako v klasičnih (cca 700.000/leto) kot v ekoloških rejah (cca. 270.000/leto) (Giersberg in Kemper, 2018). Ker njihovo pitanje traja dlje časa, je treba izvajati revakcinacije. Večinoma jih pitajo v pogojih talne reje na nastilu, v hlev dodajo grede, bale slame in druge materiale za obogatitev okolja (npr. bale sena, travno silažo, prašne kopeli, …) s čimer skušajo zmanjšati agresijo med petelini, ki se z njihovim staranjem stopnjuje. »Pitanje« traja od cca. 2 mesecev do cca. 4 mesecev, v času katerega petelini dobivajo standardne krmne mešanice za pitovne piščance (brojlerje) ali doma sestavljene krmne mešanice. S povprečnimi dnevnimi prirasti 9-13 g (ekološka reja) in 18-20 g (klasična reja) dosežejo petelini končno telesno maso 1,3 do 1,5 kg. Izkoriščanje krme (poraba krme v kg za 1 kg prirasta telesne mase) znaša od 4,0 do 10,0 (Kaufmann in Andersson, 2011; Giersberg in Kemper, 2018).
Za primerjavo, pitovni piščanec Ross 308, ki se največ pita v Sloveniji, doseže enako telesno maso (1,5 kg) v 28 dneh ob izkoriščanju krme 1,33 (Ross 308 Performance Objectives, 2019). Ker tudi cena 10 €/kg petelinjega mesa ne pokrije stroškov reje, se skuša večje stroške pitanja petelinov nadomestiti s prodajo jedilnih jajc po višjih cenah. Ta se prodaja pod posebnimi blagovnimi znamkami. Glavni izziv pri pitanju petelinov lahkega tipa je dolgo trajanje pitanja in velik strošek za krmo. Je pa to za ekološki sektor v Nemčiji, ki ne sprejema
»in ovo« seksiranja, praktično edina možnost uporabe petelinčkov nesnega tipa (Giersberg in Kemper, 2018).
2.5 REJA KOMBINIRANIH PASEM
V intenzivnem perutninarstvu obstajata dve specializirani proizvodni usmeritvi: prireja jajc in prireja mesa. Ker se pitanje petelinčkov lahkega tipa ekonomsko ne izplača, je ena od možnih rešitev reja kombiniranih pasem, ki bi bile približno enako primerne za prirejo jajc
in prirejo mesa. V ta namen na nekaterih večjih selekcijskih centrih v svetu (npr. Lohmann Tierzucht, Nemčija) že selekcionirajo tovrstne genotipe kokoši ( Giersberg in Kemper, 2018). Habig in sod. (2016) so primerjali rast treh genotipov kokoši: Lohmann Brown (LB -petelini nesnega tipa), Lohmann Dual (LD - petelini kombiniranega tipa) in Ross 308 (petelini in jarčke pitovnega-brojlerskega tipa). Pitanje je trajalo 11 tednov. Pri starosti 56 dni so živali tehtale 1080 g (LB), 1167 g (LD) in 4648 g (Ross 308), ob koncu pitanja, pri starosti 77 dni pa so živali v posameznih poskusnih skupinah dosegle naslednje telesne mase:
1577 g (LB), 1803 g (LD) in 5331 g (Ross 308). O izkoriščanju krme in ekonomskih kazalcih pitanja Habig in sod. (2016) ne poročajo. Po mnenju omenjenih avtorjev so petelinčki genotipov LB in LD enako primerni za pitanje, čeprav so prvi nesnega, drugi pa kombiniranega proizvodnega tipa.
Nesnice kombiniranega tipa Lohmann Dual zaužijejo dnevno do 30 g več krme kot komercialne nesnice lahkega tipa, zato so pri njih stroški krme računani za celotno obdobje nesnosti do 50 % večji kot pri nesnicah lahkega tipa. Nesnice kombiniranega tipa ne znesejo le manjšega števila jajc, ampak so ta jajca tudi lažja, kar pomeni manjšo količino prirejene jajčne mase (Krautwald-Junghanns in sod., 2018). Te ekonomske pomanjkljivosti kot tudi porabo večjih količin krme za prirejo manjše količine jajc je treba vzeti v zakup, da bi lahko s petelini kombiniranega tipa priredili večje količine mesa. Delež mesa prsi je pri petelinih kombiniranega tipa precej manjši od tistega pri pitovnih piščancih, je pa delež stegen večji.
Večji napredki na področju izboljšav v izkoriščanju krme doslej pri petelinih kombiniranega tipa niso bili realizirani (Preisinger in sod., 2014).
2.6 KASTRACIJA PETELINČKOV LAHKEGA TIPA
Kopunjenje je kirurški postopek, s katerim odstranimo moda pri 4 do 8 tednov starih petelinčkih. V nasprotju z nekastriranimi petelini so kopuni mirnejši in jih lažje vzrejamo v večjih skupinah. Glavni namen vzreje kopunov je prireja visoko kakovostnega mesa, ki je cenjeno kot specialiteta (Terčič, 2013). S kastracijo petelinčkov lahkega tipa bi se lahko izognili njihovi usmrtitvi v valilnicah, vendar se pri tem pojavljata dve oviri:
a.) Sam postopek kopunjenja je kljub določenim prednostim vzreje kopunov, v nekaterih evropskih državah prepovedan. Glavni razlog za prepoved je v izvedbi postopka, saj se intra- abdominalni kirurški poseg izvaja brez anestezije in analgezije. Z vidika dobrobiti živali je kopunjenje torej lahko sporno.
b.) Kopuni ne rastejo niti bistveno hitreje niti bistveno počasneje od nekastriranih petelinov.
To pomeni, da se tudi po kastraciji petelinčkov lahkega tipa srečujemo s težavo počasne rasti, dolgega trajanja pitanja in slabega izkoriščanja krme.
Terčič in sod. (2007) so proučevali rast, porabo krme in klavno kakovost pri kopunih treh genotipov: križancih prelux-G (kombinirani tip kokoši), pasmi štajerska kokoš (lahki tip kokoši) in pasmi sulmtaler (težki tip štajerske kokoši iz doline Sulm v Avstriji). Petelinčke
so kopunili pri 6. tednih starosti, do 84. dneva starosti so jih redili v zaprti reji nato pa v hlevu z izpustom, kjer so jih pitali po tehnologiji proste reje. Pri starosti 140 dni, kar je skladno z Uredbo komisije (ES) št. 543/2008 najmanjša starost pri pitanju kopunov so kopuni posameznih genotipov tehtali 1,93 kg (štajerska kokoš), 2,74 kg (prelux-G) in 2,61 kg (sulmtaler). Izkoriščanje krme je znašalo 5,38 (štajerska kokoš), 4,35 kg (prelux-G) in 4,69 (sulmtaler). Tako v hitrosti rasti kot tudi v učinkovitosti izkoriščanja krme so se za najboljše izkazali kopuni prelux-G, čeprav tudi slednji niti v telesni masi niti v učinkovitosti izkoriščanja ne dosegajo parametrov, ki so značilni za pitovne piščance (Terčič in sod., 2007).
3 RAZPRAVA
Evropska unija že več kot 40 let zagovarja dobrobit živali in je na tem področju postavila nekatere od najvišjih svetovnih standardov. Pravila EU obsegajo splošne zahteve za izboljšanje dobrobiti rejnih, laboratorijskih, hišnih in prostoživečih živali, hkrati pa se pod pritiskom organizacij za zaščito živali in tudi splošne javnosti vse bolj zaostruje zakonodaja, ki regulira izvajanje nekaterih spornih praks v živinoreji. Ena od teh praks, ki je sporna ne le z vidika dobrobiti živali, temveč tudi z gospodarskega in okoljskega vidika, je pobijanje en dan starih petelinčkov lahkega (nesnega) tipa. Vsako leto se iz gospodarskih razlogov usmrti cca 7 milijard teh živali. Ker sodišča v nekaterih državah že razsojajo, da ima dobrobit živali, prednost pred gospodarskimi interesi, je pričakovati, da bo tudi praksa pobijanja odvečnih petelinčkov kmalu dovoljena le še za določeno prehodno obdobje Zato raziskovalci po svetu pospešeno iščejo možne rešitve za problem usmrtitev enodnevnih petelinčkov lahkega (nesnega) tipa. Čeprav je bilo v preteklosti predstavljenih kar nekaj metod, po katerih lahko spol piščancem določimo že v fazi zarodka, se nobena ni izkazala za uporabno v vsakdanji praksi. Nekatere od doslej znanih metod niso praktično izvedljive v komercialni praksi bodisi zaradi ekonomskih razlogov, časovne potratnosti (npr. kariotipizacija, molekularno-genetske metode), nesprejemljivosti s strani potrošnikov (npr. reja kombiniranih pasem, pridobivanje transgenih živali) ali nezadostne natančnosti. Tako na primer je znano, da je lahko razmerje med spoloma porušeno, vendar nam mehanizmi, s katerimi bi vplivali na kokoši, da bi te nesle jajca z spolnim kromosomom W niso znani. Vse metode, s katerimi določamo spol piščancev po izvalitvi (npr. določanje spola na podlagi obnašanja, znakov v kloaki, steroidnih hormonov v iztrebkih, uporaba ultrazvoka, kirurško določanje spola,…) problematike pobijanja petelinčkov nesnega tipa ne rešujejo. Najbolje bi bilo, če bi lahko spol piščanca določili na podlagi lastnosti valilnega jajca (npr.: dimenzije in mase jajca, barve lupine,…), vendar to ni možno. Koncentracije hormonov (estrogenov, testosterona) v alantoisni tekočini lahko najprej merimo pri 9-10 dneh valjenja, to pa je že čas, ko zarodek občuti bolečino. Trenutno si največ obetamo od optične metode, ki je hitra in natančna, poleg tega jo lahko izvedemo že na tri dni starih zarodkih na osnovi genetske informacije prisotne v jedrih krvnih celic. Z usmeritvijo laserja na ožilje zarodka lahko
dosežemo več kot 95 % natančnost določitve spola. Da bi povečali natančnost spektroskopske metode so potrebne dodatne študije uporabe ramanske in fluorescenčne spektroskopije na različno velikih, različno starih in različno skladiščenih valilnih jajcih.
Slabost spektroskopskih metod je, da moramo za njihovo izvedbo v jajčno lupino narediti odprtino (okence), kar je v praktičnih razmerah težko izvesti, poleg tega to pogosto za seboj povleče tudi do 10 % slabšo valilnost, lahko pa tudi iztekanje vsebine jajca med valjenjem in posledičen pogin zarodka. V prihodnosti je treba to tehnologijo avtomatizirati, da bi lahko zaživela njena uporaba na komercialnem nivoju. Izločena jajca z moškimi zarodki se uporabi kot vir kakovostnih beljakovin za vključevanje v krmo za hišne živali ali ribe, lahko pa se jih izkoristi tudi v kemični industriji. Kastracija petelinčkov in njihovo kasnejše pitanje ni rešitev s katero bi rešili problem pobijanja petelinčkov, saj je kirurška kastracija brez predhodne anestezije/analgezije poseg, ki pri živalih sproži bolečino, če pa kastracijo izvedemo z anestezijo/analgezijo, se pojavi težava ostankov anestetikov/analgetikov v mesu in večji stroški, ki s povezani ne le s kastracijo, temveč tudi z daljšim pitanjem in slabšim izkoriščanjem krme pri kopunih. Na velikih selekcijskih centrih, kje poteka glavnina selekcijskega dela v perutninarstvu dajejo pri selekciji največji poudarek dvema gospodarsko najpomembnejšima lastnostma in sicer prirastom pri pitovnih piščancih in prireji jajc pri nesnicah. Ker med tema dvema lastnostma potekajo negativne genetske in fenotipske se selekcija kombiniranih pasem ne izplača. V novejšem času na selekcijskih centrih selekcionirajo tudi kombinirane pasme z namenom reševanja težave odvečnih petelinčkov. Problem reje kombinirani pasem se kaže v ekonomiki reje, kajti živali teh pasem ne dosegajo proizvodnih rezultatov (nesnost, prirast, izkoriščanje krme), ki so značilni za genotipe enostransko selekcioniranih bodisi na prirejo jajc ali prirejo mesa. V izogib pobijanja en dan starih petelinčkov torej trenutno največ obeta tehnologija določitve spola zarodkov kmalu po vlaganju jajc v valilnike torej v času, ko zarodek še ne čutijo bolečine.
4 SKLEPI
• Zaradi gospodarskih razlogov se takoj po izvalitvi petelinčke lahkega (nesnega) tipa v komercialnih valilnicah usmrti. Z dvigom standardov zaščite živali ter razvojem tehnologij, ki omogočajo določitev spola zarodkov še preden ti čutijo bolečino postaja omenjena praksa vse bolj nesprejemljiva.
• Piščancem lahko določimo spol na svežih (neinkubiranih) jajcih, lahko ga določimo na zarodkih v času valjenja (inkubiranih jajcih) ali na izvaljenih živalih. Določanje spola na jajcih pred vlaganjem v valilnike je drago in časovno zamudno, določanje spola po izvalitvi pa z vidika reševanja petelinčkov nima več nikakršnega smisla.
Zato se največ naporov znanstvenikov usmerja v razvoj za praktično uporabo primernih postopkov na inkubiranih jajcih pred 7. dnevom valjenja, to je pred dnevom ko zarodek občuti bolečino.
• Pitanje petelinov lahkih pasem zaradi visokih stroškov reje (daljše trajanje pitanja, slabše izkoriščanje krme) in slabše kakovosti klavnih trupov ni konkurenčno pitanju pitovnih piščancev (brojlerjev). Pri kastraciji petelinčkov in kasnejšem pitanju kopunov se visokim stroškom reje pridruži še skrb za dobrobit teh živali, kajti kirurško kastracijo se (povečini) izvaja na živo, torej brez predhodne uporabe anestetikov ali analgetikov.
• Reja kombiniranih pasem bi lahko bila rešitev problema, v kolikor bi pri njih izboljšali izkoriščanje krme, s tem skrajšali obdobje pitanja in povezane proizvodne stroške.
5 VIRI
Aleksandrowicz E., Herr I. 2015. Ethical euthanasia and shortterm anesthesia of the chick embryo. Molecular OncoSurgery. Altex, 32, 2: 143–147
Badyaev A. V., Seaman D. A., Navara K. J., Hill G. E., Mendonca M. T. 2006. E volution of sex-biased maternal effects in birds: III. Adjustment of ovulation order can enable sex- specific allocation of hormones, carotenoids, and vitamins. Journal of Evolutionary Biology, 19: 1044–1057
Badyaev A. V., Young R. L., Hill G. E., Duckworth R. A. 2008. Evolution of sex-biased maternal effects in birds. IV. Intra-ovarian growth dynamics can link sex determination and sex-specific acquisition of resources. Journal of Evolutionary Biology, 21: 449–460
Boersma P. D., Davies E. M. 1987. Sexing Monomorphic Birds by Vent Measurements. The Auk, 104, 4: 779-783
Bramwell R. K. 2003. Sexing chicks in the backyard flock. Avian Advice, 5: 4-5 Carr S. M. 2008. A molecular test for bird gender. Figure & text material.
https://www.mun.ca/biology/scarr/Bird_sexing.html (18. avgust. 2021)
Cerit H., Avanus K. 2007. Sex identification in avian species using DNA typing methods.
World’s Poultry Science Journal, 63: 91-99
Damme K., Ristič M. 2003. Fattening performance, meat yield and economic aspects of meat and layer type hybrids. World's Poultry Science Journal, 59: 50–51
Emlen S. T. 1997. When mothers prefer daughters over sons. Trends in Ecology & Evolution, 12: 291–292
Galli R., Preusse G., Uckermann O., Bartels T., Krautwald Junghanns M. E., Koch E., Steiner G. 2016. In ovo sexing of domestic chicken by Raman spectroscopy. Analitical Chemistry, 88: 8657–8663
Galli, R., Koch E., Preusse G., Schnabel C., Bartels T., Krautwald-Junghanns M. E., Steiner G. 2017. Contactless in ovo sex determination of chicken eggs. Current Directions in Biomedical and Engineering, 3, 2: 131–134
Giersberg M. F., Kemper N. 2018. Rearing Male Layer Chickens: A German Perspective.
Agriculture, 8, 11: 176, doi: 10.3390/agriculture8110176: 4 str.
Goerlich-Jansson V. C., Muller M. S., Groothuis T. G. G. 2013. Manipulation of Primary Sex Ratio in Birds: Lessons from the Homing Pigeon (Columba livia domestica). Integrative and Comparative Biology, 53, 6: 902–912
Habig C., Beyerbach M., Kemper N. 2016. Comparative analyses of layer males, dual purpose males and mixed sex broilers kept for fattening purposes regarding their floor space covering, weight-gain and several animal health traits. European Poultry Science, 80: 1612-9199
Heinsohn R., Legge S., Endler J. A. 2005. Extreme reversed sexual dichromatism in a bird without sex role reversal. Science, 309, 5734: 617–619
Hendrix Genetics. 2020. In-Ovo sexing technologies in hatching eggs.
https://layinghens.hendrix-genetics.com/en/articles/in_ovo_sexing-egg_sexing- sexing_day_old_chicks-male_chicks-sexing_chicks-vent_sexing-in_ovo_sexing-
culling_male_chicks-brown_chickens-black_chickens-white_chickens-poultry/ (25. jun.
2021)
Imholt D. 2010. Morphometrische Studien an Eiern von Hybrid- und Rassehuhnern mit Versuchen zur Detektion einer Beziehung zwischen der Form von Eiern und dem Geschlecht der darin befindlichen Kuken. Giessen, VVB Laufersweiler Verlag: 155 str.
http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2010/7760/pdf/ImholtDirk_2010_07_05.pdf (18.
avg. 2021)
Jodice P. G. R., Lanctot R. B., Gill V. A., Roby D. D., Hatch S. A. 2000. Sexing adult black- legged kittiwakes by DNA, behavior, and morphology. Waterbirds, 23: 405–415
Jones D. M., Samour J. H., Knight J. A., Finch J. M. 1984. Sex determination of monomorphic birds by fiberoptic endoscopy. Veterinary record, 115: 596-598
Kahn, N. W., John J., Quinn, T. 1998. Chromosome-specific intron size differences in the Avian CHD gene provide an efficient method for sex identification in birds. The Auk, 115:
1074-1078
Kaufmann F., Andersson R. 2011. Eignung Männlicher Legehybriden zur Mast. Research Report.
https://opus.hsosnabrueck.de/frontdoor/deliver/index/docId/10/file/Report_Kaufmann_Ander ss on.pdf (22. avg. 2021)
Kiuchi T., Koga H., Kawamoto M., Shoji K., Sakai H., Arai Y., Ishihara G., Kawaoka S., Sugano S., Shimada T., Suzuki Y., Suzuki M. G., Katsuma S. 2014. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature, 509: 633–636
Kramar S. 2014. Preiskave mineralnih materialov z ramansko mikrospektroskopijo. Univerza v Ljubljani, Naravoslovnotehniška fakulteta, Oddelek za geologijo: 48 str
Krautwald-Junghanns M. E., Cramer K., Fischer B. Forster A., Galli R., Kremer F., Mapesa E.
U., Meissner S., Preisinger R., Preusse G., Schnabel C., Steiner G., Bartels T. 2018. Current approaches to avoid the culling of day-old male chicks in the layer industry, with special reference to spectroscopic methods. Poultry Science, 97, 3: 749–757
Koenig M., Hahn G., Damme K., Schmutz M. 2010. Utilization of laying type cockerels as coquelets - growth performance and carcass quality. Fleischwirtschaft, 90, 2: 92–94
Koenig M., Hahn G., Damme K., Schmutz M. 2012. Utilization of laying type cockerels as
“coquelets”: influence of genotype and diet characteristics on growth performance and carcass composition. Archiv für Geflügelkunde, 76, 3: 197–202
Koenig M., Hahn G., Damme K., Schmutz M. 2012. Untersuchungen zur Mastleistung und Schlachtkörperzusammensetzung von Stubenküken aus Masthybriden und verschiedenen Legehybridherkünften. Züchtungskunde, 84, 6: 511–522
Kuroiwa A. 2018. Sex determination and differentiation in birds. V: Reproductive and Developmental Strategies. Kobayashi K., Kitano T., Iwao Y., Kondo M. (ur.). Springer: 391- 405
Makovec D. 2016. Določanje povezav med zunanjimi lastnostmi valilnih jajc in spolom piščancev. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko: 48 str.
Mank J. E. 2012. Small but mighty: the evolutionary dynamics of W and Y sex chromosomes.
Chromosome Research, 20, 1: 21–33
McMillan M. 1988. Imaging of avian urogenital disorders. AAV Today, 2, 2: 74-82
Morinha F., Cabral J. A., Bastos E. 2012. Molecular sexing of birds: A comparative review of polymerase chain reaction (PCR)-based methods. Theriogenology, 4, 1: 703–714
Nakamura D., Tiersch T. R., Douglass M., Chandler R. W. 1990. Rapid identification of sex in birds by flow cytometry. Cytogenetics and Cell Genetics, 53: 201-205
Pike T. W., Petrie M. 2003. Potential mechanisms of avian sex manipulation. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society, 78, 4: 553–74
Preisinger R., Icken W., Schmutz M. 2014. Breeding dual purpose chicken opposed to specialised hybrids. V: XIVth European Poultry Conference, Stavangen, 23.- 27. junij 2014.
European Federation of WSPA: 468
Randall I. 2016. Laser spectroscopy determines sex of a chicken egg. Physics World.
https://physicsworld.com/a/laser-spectroscopy-determines-sex-of-a-chicken-egg/ (20. avg 2021)
Ross 308 performance objectives. 2019. Aviagen: 16 str.
https://en.aviagen.com/assets/Tech_Center/Ross_Broiler/Ross308-308FF-BroilerPO2019- EN.pdf (22. maj 2021)
Saitoh Y., Saitoh H., Ohtomo K., Mizuno S. 1991. Occupancy of the majority of DNA in the chicken W-chromosome by bent-repetitive sequences. Chromosoma, 101: 32-40
