UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NINA HRVATIČ
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NINA HRVATIČ
RAZVOJ IN VREDNOTENJE LIOTROPNIH TEKOČIH KRISTALOV NA OSNOVI KONOPLJINEGA ALI LANENEGA OLJA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE
DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF HEMPSEED OR FLAXSEED OIL-BASED LYOTROPIC LIQUID CRYSTALS
UNIFORM MASTER'S STUDY PROGRAMME PHARMACY
Ljubljana, 2022
Magistrsko nalogo sem opravljala na Univerzi v Ljubljani, Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom doc. dr. Mirjam Matjaž Gosenca, mag. farm. in somentorstvom asist. Mercedes Vitek, mag. farm.
Zahvala
Iskreno se zahvaljujem mentoricama doc. dr. Mirjam Matjaž Gosenca, mag farm. in asist.
Mercedes Vitek, mag. farm za vso posredovano znanje, strokovno pomoč, potrpežljivost in usmeritve pri pisanju magistrske naloge. Za pomoč pri laboratorijskem delu se zahvaljujem tudi strokovnima sodelavkama Tatjani Hrovatič, ing. kem. teh. in Mojci Kržan ing. kem. teh.
Najlepša hvala tudi prijateljem, ki so me spremljali, bodrili in vselej priskočili na pomoč.
Hvala vam za nepozabna študentska leta.
Posebna zahvala gre mojima staršema za vso podporo in spodbude tekom študija, ter sestri Anji in njenemu znanju programiranja.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr. Mirjam Matjaž Gosenca, mag. farm. in somentorstvom asist. Mercedes Vitek, mag. farm.
Nina Hrvatič
Predsednica komisije: prof. dr. Marija Sollner Dolenc, mag. farm.
Članica komisije: asist. dr. Meta Kokalj Ladan, mag. farm., univ. dipl. fiz.
i
KAZALO VSEBINE
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ... 1
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ... 2
POVZETEK ... vii
ABSTRACT ... ix
SEZNAM OKRAJŠAV ... xi
1. UVOD ... 1
1.1. ATOPIJSKI DERMATITIS ... 1
1.1.1. Nega atopične kože ... 3
1.1.2. Zdravljenje atopijskega dermatitisa ... 4
Lokalni kortikosteroidi ... 4
Lokalni zaviralci kalcinevrina ... 5
Podporna terapija ... 5
Sistemske oblike zdravljenja ... 5
1.2. TEKOČI KRISTALI ... 6
1.2.1. Delitev tekočih kristalov ... 6
1.2.2. Razvoj in vrednotenje tekočih kristalov ... 7
1.2.2.1. Vrednotenje tekočih kristalov ... 8
Reološko vrednotenje tekočih kristalov ... 10
1.2.2.2. Tekoči kristali kot dostavni sistemi v farmaciji... 12
Tekoči kristali za transdermalno uporabo ... 12
Tekoči kristali za dermalno uporabo ... 13
2. NAMEN DELA ... 17
3. MATERIALI IN METODE ... 19
3.1. MATERIALI ... 19
3.1.1. Sestavine za izdelavo liotropnih tekočih kristalov ... 19
ii
3.1.2. Aparature in laboratorijska oprema ... 23
3.2. METODE ... 23
3.2.1. Izdelava (psevdo)trikomponentnih faznih diagramov ... 23
3.2.2. Priprava izbranih vzorcev ... 24
3.2.3. Fotonska korelacijska spektroskopija ... 25
3.2.4. Polarizacijska mikroskopija ... 26
3.2.5. Določanje reoloških lastnosti... 27
4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 30
4.1. IZDELAVA (PSEVDO)TRIKOMPONENTNIH FAZNIH DIAGRAMOV... 30
4.2. VREDNOTENJE IZBRANIH VZORCEV IZ IZBRANE RAZREDČITVENE PREMICE ... 34
Makroskopski videz in mikrostruktura vzorcev s Tween 80 ... 34
Makroskopski videz in mikrostruktura vzorcev z Montanov 68 ... 35
4.2.1. Vrednotenje reoloških lastnosti ... 37
Rotacijska viskozimetrija ... 37
Oscilacijska reometrija ... 41
4.2.2. Vrednotenje izbranih vzorcev pri različnih temperaturah ... 42
Makroskopski videz in mikrostruktura vzorcev s Tween 80 ... 42
Makroskopski videz in mikrostruktura vzorcev z Montanov 68 ... 56
5. SKLEP ... 69
6. VIRI ... 71
7. PRILOGE ... 79
7.1. Priloga I ... 79
7.2. Priloga II ... 97
7.3. Priloga III ... 110
iii
KAZALO SLIK
Slika 1: Značilni klinični znaki AD pri A – dojenčkih; B – otrocih; C – odraslih (2). ... 3
Slika 2: Fazni prehodi liotropnih TK v odvisnosti od deleža PAS in lipofilnosti topila in/ali PAS. Povzeto po: (17). ... 7
Slika 3: Vzorci tekočih kristalov posnetih s polarizacijskim mikroskopom: A – lamelarne mezofaze zznačilnimi malteškimi križi; B – heksagonalne mezofaze s pahljačasto strukturo (25). ... 9
Slika 4: Kemijska stuktura fosfatidilholina: R1 in R2 predstavljata maščobni kislini (52).19 Slika 5: Kemijska struktura Tween® 80 (53). ... 20
Slika 6: Kemijski strukturi A - cetearil alkohola in B - cetearil glukozida (60, 61). ... 21
Slika 7: Kemijski strukturi A - α-linolenske kislin in B - linolne kisline, kot najbolj zastopani maščobni kislini v lanenem olju (61, 62). ... 21
Slika 8: Kemijska struktura betametazodiproprionata (67). ... 23
Slika 9: Polarizacijski mikroskop (Olympus). ... 27
Slika 10: Reometer Anton Paar Physica MCR 301. ... 29
Slika 11: (Psevdo)trikomponentni fazni diagrami za sisteme A – (L/T)Lo; B – (L/T)Ko; C – (L/M)Lo; D – (L/M)Ko pri različnih vsebnostih vode. Točke predstavljajo področja, nastanka TK na podlagi organoleptične ocene, s kvadratki so dodatno označena področja, kjer smo s preliminarnim vrednotenjem s polarizacijsko mikroskopijo potrdili nastanek TK. ... 32
Slika 12: Viskoznost v odvisnosti od strižne hitrosti za vzorce z zmesjo lecitin in Tween 80, lanenim ali konopljinim oljem, ter primerjalno z in brez ZU. Posamezna krivulja predstavlja različen delež vode v vzorcu (0 – 90 %). Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD). ... 39
Slika 13: Viskoznost v odvisnosti od strižne hitrosti za vzorce z zmesjo lecitin in Montanov 68, z lanenim ali konopljinim oljem, ter primerjalno z in brez ZU. Posamezna krivulja predstavlja različen delež vode v vzorcu (0 – 90 %). Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD)... 40
Slika 14: Elastični (G') in plastični (G'') modul v odvisnosti od strižne deformacije za vzorce (L/T)Ko + ZU z 10 in 50 % vode, ter (L/M)Ko + ZU z 50 in 90 % vode. Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 1). ... 41
iv
Slika 15: Izbrani vzorci, ki kot zmes PAS vsebujejo zmes lecitina in Tween 80. A – (L/T)Lo30 + ZU; B – (L/T)Lo50 + ZU; C – (L/T)Ko30 + ZU; D – (L/T)Ko50 + ZU. .... 43 Slika 16: Izbrani vzorci s sestavo lecitin/ Tween 80/ laneno ali konopljino olje/ voda/
(betametazondiproprionat) pod polarizacijskim mikroskopom. Vzorci so prikazani pod 40 × povečavo. ... 45 Slika 17: Odvisnost viskoznosti od strižne hitrosti in vgradnje ZU za vzorce pripravljene s Tween 80, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 30 % ali 50 %. Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD). ... 46 Slika 18: Odvisnost viskoznosti od strižne hitrosti in temperature za vzorce pripravljene s Tween 80, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 30 %.
Meritve so bile izvedene pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 48 Slika 19: Odvisnost viskoznosti od strižne hitrosti in temperature za vzorce pripravljene s Tween 80, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 50 %.
Meritve so bile izvedene pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 49 Slika 20: Elastični in plastični modul v odvisnosti od strižne deformacije za vzorca (L/T)Ko + ZU s 30 in 50 % vode, izmerjeni pri 25 °C (n = 1). ... 50 Slika 21: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence in vgrajene ZU za vzorce s Tween 80, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 30 % ali 50 %. Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD). ... 52 Slika 22: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence in temperature za vzorce s sestavo Tween 80, lecitin, konopljino ali laneno oljem, z ZU ali brez in deležem vode 30 %.
Meritve so bile izvedene pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 54 Slika 23: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence in temperature za vzorce s sestavo Tween 80, lecitin, konopljino ali laneno olje, z ZU ali brez in deležem vode 50 %.
Meritve so bile izvedene pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 55 Slika 24: Izbrani vzorci, ki kot zmes PAS vsebujejo zmes lecitina in Montanov 68. A – (L/M)Lo60 + ZU; B – (L/M)Lo80 + ZU; C – (L/M)Ko60 + ZU; D – (L/M)Ko80 + ZU. 56 Slika 25: Izbrani vzorci s sestavo lecitin/ Montanov 68/ laneno ali konopljino olje/ voda/
(betametazondiproprionat) pod polarizacijskim mikroskopom. Vzorci so prikazani pod 40 × povečavo. ... 58 Slika 26: Odvisnost viskoznosti od strižne hitrosti in vgradnje ZU. Vzorci pripravljeni z Montanov 68, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 60
% ali 80 %. Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD). ... 59
v
Slika 27: Odvisnost viskoznosti od strižne hitrosti in temperature za vzorce pripravljene z Montanov 68, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 60%.
Meritve smo izvedli pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 61 Slika 28: Odvisnost viskoznosti od strižne hitrosti in temperature za vzorce s sestavo Montanov 68, lecitin, konopljino ali laneno olje, z ZU ali brez in deležem vode 80 %.
Meritve smo izvedli pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 62 Slika 29: Elastični in plastični modul v odvisnosti od strižne deformacije za vzorce (L/T)Ko + ZU z 30 in 50 % vode, ter (L/M)Ko + ZU s 60 in 80 % vode izmerjena pri 25 °C (n = 1).
... 63 Slika 30: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence in vgrajene ZU. Vzorci pripravljeni z Montanov 68, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 60 % ali 80 %. Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD). ... 65 Slika 31: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence in temperature za vzorce pripravljene z Montanov 68, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 60 %. Meritve smo izvedli pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 67 Slika 32: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence in temperature za vzorce pripravljene z Montanov 68, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in deležem vode 80 %. Meritve smo izvedli pri temperaturah 25 °C, 32 °C in 37 °C (n = 2 ± SD). ... 68 Slika 33: Vzorci izbrane razredčitvene premice pod polarizacijskim mikroskopom. Sistem lecitin/Tween 80/laneno ali konopljino olje, pri različnih deležih vode in z/brez ZU. Imena vzorcev in povečave so zapisane nad fotografijami. ... 103 Slika 34: Vzorci pod polarizacijskim mikroskopom s sestavo lecitin/Montanov 68/laneno ali konopljino olje, z različnimi deležih vode in z/brez ZU. Imena vzorcev in povečave so zapisane nad fotografijami. ... 109 Slika 35: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence za vzorce izbrane razredčitvene premice iz Tween 80, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in različnimi deleži vode (0 – 90 %). Mertive smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD). ... 110 Slika 36: Odvisnost dinamičnih modulov od kotne frekvence za vzorce izbrane razredčitvene premice iz Montanov 68, lecitinom, konopljinim ali lanenim oljem, z ZU ali brez in različnimi deleži vode (0 – 90 %). Meritve smo izvedli pri T = 25 °C (n = 2 ± SD).
... 111
vi
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Sestave izbranih vzorcev, deleži posamezne sestavine so podane v %. ... 25 Preglednica II: Rezultati polarizacijske mikroskopije: DA – v vzorcih smo našli značilne strukture za lamelarne TK; NE – značilnih struktur nismo našli; opis vidnih struktur, v kolikor niso bile značilne za lamelarne TK. ... 33 Preglednica III: Sestava in opredelitev nastalih sistemov izdelanih s titracijsko metodo. 79
vii
POVZETEK
Atopijski dermatitis je kronična, nenalezljiva vnetna bolezen kože, ki jo spremljajo srbečica in ponavljajoče ekcematozne lezije. Za bolnike je pomembna redna in pravilna nega kože, ključnega pomena pa je ustrezno zdravljenje, usmerjeno v obvladovanje in preprečevanje vnetja in srbenja. Prvo izbiro v okviru lokalnega zdravljenja atopijskega dermatitisa predstavljajo lokalni kortikosteroidi, vgrajeni v klasične farmacevtske oblike kot so kreme in mazila. Z raziskovalnim delom smo želeli doprinesti k izboljšanemu zdravljenju atopijskega dermatitisa z vgradnjo betametazondipropionata v sodobne dostavne sisteme, in sicer liotropne tekoče kristale. Slednji so izredno ugodni za dermalen nanos zaradi svoje specifične mikrostrukture. Obenem je bil ključnega pomena tudi izbor pomožnih snovi, pri čemer smo kot oljno fazo izbrali laneno ali konopljino olje zaradi visoke vsebnosti esencialnih maščobnih kislin s protivnetnim delovanjem, kar je ugodno za atopično kožo, emulgatorska faza je bila sestavljena iz biokompatibilnih površinsko aktivnih snovi, ki spodbujajo nastanek liotropnih tekočih kristalov, in sicer iz lecitina v kombinaciji s Tween 80 ali Montanov 68, hidrofilno fazo pa je predstavljala voda.
V okviru eksperimentalnega dela smo z izdelavo (psevdo)trikomponentnih diagramov na podlagi organoleptičnih lastnosti opredelili področja nastanka tekočih kristalov za štiri različne kombinacije oljne faze in zmesi površinsko aktivnih snovi. Za nadaljnje vrednotenje smo izbrali vzorce na razredčitveni premici (tj. pri različnih deležih vode) s konstantnim razmerjem površinsko aktivnih snovi in olja 6/4 in jih z in brez vgrajenega betametazondiproprionata ovrednotili s polarizacijsko mikroskopijo. Za vzorce s Tween 80 smo po celotni razredčitveni premici potrdili nastanek lamelarnih tekočih kristalov, medtem ko smo pri Montanov 68 nastanek lamelarnih mezofaz potrdili zgolj pri določenih vzorcih v odvisnosti od deleža vodne faze. Oljna faza in tudi vgradnja zdravilne učinkovine ni vplivala na nastanek lamelarnih tekočih kristalov. V okviru nadaljnje reološke analize pa smo ugotovili, da se vgradnja zdravilne učinkovine odraža v spremenjenih vrednosti viskoznosti in dinamičnih modulov v primeru vzorcev s Tween 80, v vzorcih z Montanov 68 pa ni prišlo do bistvenih sprememb. Vrednotenje mikrostrukture smo izvedli pri sobni temperaturi (25
°C), pri temperaturi kože (32 °C) in telesni temperaturi (37 °C), pri čemer smo s polarizacijsko mikroskopijo potrdili, da se mikrostruktura ohranja tudi pri višjih temperaturah, medtem ko smo v primeru določenih vzorcev zaznali temperaturno odvisne spremembe viskoznosti.
viii
Zaključili smo, da so novo razviti liotropni tekoči kristali primerni za vgradnjo betametazondiproprionata in predstavljajo obetaven dostavni sistem za zdravljenje atopijskega dermatitisa.
Ključne besede: atopijski dermatitis, liotropni tekoči kristali, laneno olje, konopljino olje, betametazondiproprionat
ix
ABSTRACT
Atopic dermatitis is a chronic, non-infectious inflammatory skin disease accompanied by itching and recurrent eczematous lesions. Treatment is aimed at controlling and preventing inflammation and itching of the skin, also, regular, and proper skin care is of key importance.
The first choice for the local treatment of atopic dermatitis are corticosteroids incorporated into classic pharmaceutical dosage forms such as creams and ointments. Therefore, the objective of our study was to contribute to the improved treatment of atopic dermatitis by incorporating betamethasone dipropionate into modern delivery systems, namely lyotropic liquid crystals. The latter are extremely favorable for dermal application due to their specific microstructure. In addition, the choice of excipients was crucial, with flaxseed or hemp oil being chosen as the oil phase due to its high content of essential fatty acids with anti- inflammatory action being beneficial for atopic skin, while the emulsifier phase consisted of biocompatible surfactants that promote the formation of lyotropic liquid crystals, namely lecithin in combination with Tween 80 or Montanov 68. Water was chosen as the hydrophilic phase. Within the experimental work, the areas of liquid crystal were determined based on organoleptical evaluation for four different combinations of oil phase and mixtures of surfactants by (pseudo)ternary phase diagrams construction. Selected samples (with and without incorporated betamethasone diproprionate) on the dilution line (i.e., at different water proportions) with a constant ratio of surfactants and oil phase 6/4 were used for further microstructure evaluation by polarization microscopy. For samples with Tween 80, the formation of lamellar liquid crystals was confirmed along the entire dilution line, while for Montanov 68 the formation of lamellar mesophases was confirmed only for specific samples depending on the proportions of the aqueous phase. The oil phase as well as the incorporation of the active substance did not affect the formation of lamellar liquid crystals. In the framework of further rheological analysis, we found that the incorporation of the active substance is reflected in the changed values of viscosity and dynamic modules in the case of samples with Tween 80. However, there were no significant changes in the samples with Montanov 68. Evaluation of the microstructure was performed at room temperature (25 °C), skin temperature (32 °C) and body temperature (37 °C), and the microstructure was maintained even at higher temperatures as confirmed by polarization, while temperature- dependent changes in viscosity were detected in case of certain samples.
x
To conclude, the newly developed lyotropic liquid crystals are suitable for the incorporation of betamethasone diproprionate and represent a promising drug delivery system for the treatment of atopic dermatitis.
Key words: atopic dermatitis, lyotropic liquid crystals, betamethasone diproprionate, flaxseed oil, hempseed oil
xi
SEZNAM OKRAJŠAV
AD atopijski dermatitis
DSC dinamična kalorimetrija (ang. differential scanning calorimetry) FO farmacevtska oblika
G' elastični modul G'' plastični modul
KMK kritična micelarna koncentracija
NMR jedrska magnetna resonanca (ang. nuclear magnetic resonance) PAS površinsko aktivna snov
PDI polidisperzni indeks
SAXS ozkokotna rentgenska difrakcija (ang. small-angle X-ray scattering) SMES samomikroemulgirajoči sistem
TEM transmisijska elektronska mikroskopija (ang. transmission electron microscopy)
TGA termogravimetrična analiza (ang. thermogravimetric analysis) TK tekoči kristali
ZU zdravilna učinkovina
1
1. UVOD
1.1. ATOPIJSKI DERMATITIS
Atopijski dermatitis (AD) je kronična kožna bolezen, ki jo spremljajo srbečica in ponavljajoče se ekcematozne lezije. Dermatitis pomeni vnetje kože, atopija pa je neobičajen odgovor na običajne snovi iz okolja. Večinoma se pojavlja pri otrocih, lahko pa tudi pri odraslih. V 60 % primerov se AD pojavi v prvem letu življenja, prva znaka pa sta suha in hrapava koža. V 70 % primerov se stanje bolezni v poznem otroštvu izboljša ali celo popolnoma izgine. Na pojav AD vpliva tudi dednost, pogosto so v družini že prisotne določene alergije (1, 2).
Razlikujemo nealergijski (intrinzični) AD, ki se pojavlja pri približno 10 % bolnikov, in alergijski (ekstrinzični) AD, ki je bistveno pogostejši in se pojavlja pri 90 % bolnikov. V primeru alergijskega AD se sočasno pojavlja alergija na različne inhalacijske alergene (živalski epitelij, pršice, plesni, pelodi trav, dreves …) ali alergija na alimentarne alergene (mleko, ribe, školjke, žitarice …) (3). Do bolezni pride zaradi nepravilnosti v strukturi ureditvi in funkciji epidermisa oz. povrhnjice, ter pridruženega vnetja zaradi neprimernega imunskega odziva na alergene, ki pridejo v stik z imunskimi celicami kože. V imunski odziv se vključujejo Langerhansove celice v povrhnjici, ter mastociti, makrofagi in limfociti v dermisu oz. usnjici. Langerhansove celice predstavijo antigen limfocitom, ki izzovejo lasten imunski odgovor (2). Preobčutljivostna reakcija poteka v akutni fazi po mehanizmu takojšnje, z imunoglobulini E posredovane preobčutljivosti, v kateri pride do aktivacije mastocitov in eozinofilcev. Pomembno vlogo pri vnetnem procesu imajo tudi limfociti, ki so prisotni v koži. T-limfociti aktivirani v akutni fazi izločajo interlevkina 4 in 5, le-ta sta značilna za preobčutljivostne reakcije, v katerih sodelujejo T celice pomagalke tipa 1. Pri drugem tipu reakcij sodelujejo T celice pomagalke tipa 2, ki v kroničnih žariščih sproščajo interferon gama, kar je značilno za preobčutljivostne reakcije kasnega tipa. Za nastanek AD so pomembne tudi genetske motnje, ki vodijo npr. v zmanjšano sintezo ceramidov kot ključnih lipidov v roženi plasti. Zaradi pomanjkanja ceramidov je kožna bariera okrnjena, kar vodi v povečano transepidermalno izgubo vode. Koža postane suha in občutljiva, zaradi oslabljene barierne funkcije je vdor alergenov iz zunanjega okolja olajšan in koža je tako veliko bolj dovzetna tudi za okužbe (2). Še ena pomembna genetska motnja je mutacija v genih za profilagrin in encime, ki sodelujejo pri njihovi razgradnji, kar prav tako vodi v
2
okrnjeno kožno bariero. Z encimsko razgradnjo profilagrina nastane beljakovina filagrin, ki ima v roženi plasti nalogo omreženja keratinskih niti, kar prispeva k čvrstosti beljakovinske strukture znotraj korneocitov. Sposobnost korneocitov za vezavo vode je odvisna od vsebnosti aminokislin, ter njihovih metabolitov in prostih ionov, ki skupaj tvorijo naravni vlažilni faktor in nastanejo v procesu razgradnje filagrina. Naravni vlažilni faktor skupaj z medceličnimi lipidi omogočajo vzdrževanje primerne hidratacije kože in optimalne transdermalne izgube vode. Napake v sintezi filagrina in posledično pomanjkanju naravnega vlažilnega faktorja vodijo do višjega pH kože in večjim izgubam vode. Preplet teh dejavnikov, sprememb v lipidni sestavi rožene plasti, spremenjene mikrobiote kože, vpliva dejavnikov okolja in vnetnih procesov kože povzročijo poškodbe kožne bariere (4).
Glavni znaki AD so srbečica, značilna razporeditev in morfologija izpuščajev, kot je prikazano na sliki 1. Pridruženi znaki so suha koža po celem telesu, ponavljajoča vnetja kože, ki je pordela, lahko se delajo mehurji, bunčice, nastajajo kraste, kronični dermatitis dlani in podplatov. Bolniki z AD so tudi nagnjeni h glivičnim, bakterijskim kot virusnim infekcijam. Znaki in simptomi bolezni so pogojeni tudi s starostnim obdobjem bolnika (5).
Pri dojenčkih se AD prične s prizadetostjo kože po licih, lahko pa tudi na čelu, lasišču, zgornjem delu trupa in po okončinah. Pri otrocih do četrtega leta so žarišča značilna po distalnih delih okončin, pri starejših otrocih in odraslih pa so značilne spremembe v komolčnih in kolenskih pregibih, na vratu, ter med prsti rok in nog (3). Za AD je značilno, da se pojavlja v zagonih, izmenjujejo se obdobja izbruhov in izboljšanj (6).
3
Slika 1: Značilni klinični znaki AD pri A – dojenčkih; B – otrocih; C – odraslih (2).
Zdravljenje AD je usmerjeno v obvladovanje in preprečevanje vnetja in srbenja kože, redno in pravilno nego kože, ter izogibanje alergenom in sprožilcem, ki poslabšajo stanje kože (7).
Z zdravljenjem želimo obnoviti barierno funkcijo povrhnjice, je pa bolezen kronična. V osnovno preventivo AD tako pri otrocih kot pri odraslih spadajo tudi osveščanje in izobraževanje bolnikov o pravilni negi kože (2, 7).
1.1.1. Nega atopične kože
Suha koža je značilen znak AD, ki je povezan z nefunkcionalnostjo povrhnjice. Redno vlaženje kože izboljša barierno funkcijo kože, ki jo v prvi vrsti zagotavlja ustrezna strukturna urejenost najbolj zunanje plasti povrhnjice, tj. rožene plasti, ter preprečuje izbruhe AD.
Vlažilne kreme in losjoni so formulacije za dermalno uporabo, ki skrbijo za hidratacijo kože, preprečujejo izgubo vode v koži, obnavljajo kožno bariero, ter tako ohranjajo celovitost in ustrezen videz kože. V splošnem bolnikom priporočajo redno uporabo vlažilnih krem ali losjonov. Ključne sestavine teh izdelkov, ki poskrbijo za vlažilni učinek, lahko glede na mehanizem delovanja razdelimo na okluzive, humektante, in emoliente (8). Okluzivi so lipofilne spojine, ki ustvarijo zaščitno hidrofobno plast na koži in zadržijo vodo v koži. med katere spadajo voski in ogljikovodiki (npr. vazelin). Prvenstveno pa se za nego atopične kože uporabljajo humektanti in emolienti. Humektanti oz. vlažilci so hidrofilne in higroskopne spojine, ki vežejo vodo iz nižjih plasti kože ali iz okolice in s tem navlažijo kožno bariero,
4
ter zmanjšajo izgubo vode. Med najpogosteje uporabljene humektante sodijo glicerol, dekspanenol, sečnina, hialuronska kislina, sorbitol, glikolna kislina, propilenglikol (9). Pri novorojenčkih lahko sečnina povzroči draženje in disfunkcijo ledvic, tudi po dermalnem nanosu zaradi sistemske absorpcije, zato je pri njih uporaba kontraindicirana, pri dojenčkih pa uporabimo nižjo koncentracijo kot pri odraslih. Pri otrocih mlajših od dveh let ne uporabljamo propilenglikola zaradi toksičnosti in draženja, zelo pogosto pa se uporablja glicerol. Emolienti so lipofilne spojine, ki nadomestijo manjkajoče naravne lipide v roženi plasti kože, hkrati pa zmanjšajo izgubo vode. Mednje sodijo lipidi, ki jih predstavljajo (naravna) olja in proste maščobne kisline (stearinska, linolenska, oleinska, lavrinska kislina) (6, 9). Zelo ugodno sestavo imata laneno in konopljino olje, ki sta bogata z omega-3 maščobnimi kislinami, predvsem z α-linolensko kislino, ki dokazano zmanjša vnetje. V kozmetiki se laneno olje uporablja za vlaženje, mehčanje in nego kože in je primerno za uporabo pri suhi in občutljivi koži (10). Konopljino olje vsebuje tudi γ-linolensko kislino, ki ima prav tako močan protivnetni učinek, hkrati pa spodbuja proliferacijo kožnih celic (11).
S konopljinim oljem so izvedli študijo pri bolnikih z AD, ki so osem tednov uživali 30 mL konopljinega olja dnevno. Ugotovili so, da redno jemanje olja izboljša stanje kože in izboljša simptome AD (12). Bolniki z AD se morajo sicer izogibati sestavinam kot so natrijev lavrilsulfat, dišave, eterična olja, saj lahko dražijo kožo in povzročijo izbruh AD (13).
1.1.2. Zdravljenje atopijskega dermatitisa
Lokalni kortikosteroidi
V okviru osnovnega zdravljenja AD se uporabljajo lokalni kortikosteroidi, ki so prvi izbor za protivnetno zdravljenje kože. Na področju Evrope so kortikosteroidi razvrščeni v štiri razrede: v prvi spadajo šibki kortikosteroidi (npr. hidrokortizon), v drugi srednje močni (npr.
hidrokortizonbutirat), v tretji razred močni kortikosteroidi (npr. betametazondiproprionat, metilprednizolonaceponat) ter v četrti najmočnejši (npr. klobetazolproprionat). Prvi trije razredi kortikosteroidov se uporabljajo v dermalnih farmacevtskih oblikah (FO) za lokalno zdravljenje. Nizko potentni lokalni kortikosteroidi se uporabljajo kratkotrajno, s premori in so učinkoviti za zdravljenje lezij. Z njihovo uporabo se zmanjša tudi tveganje za poslabšanje oz. ponovitve bolezni. Nanašati jih je potrebno izključno na področja lezij v majhnih količinah, da se izognemo neželenim učinkom. Pogosta uporaba sicer lahko vodi do atrofije kože, strij, aken ter perioralnega dermatitisa. Pomembno je, da se lokalni kortikosteroidi kombinirajo s primerno količino indiferentnega mazila. Lokalni kortikosteroid izberemo
5
glede na mesto in prizadeto površino telesa, starost bolnika ter glede na stopnjo suhosti kože.
Posebna previdnost je potrebna pri uporabi na tanjših predelih kože, saj lahko pride do sistemskega delovanja zaradi povečane dermalne absorpcije (2, 6).
Lokalni zaviralci kalcinevrina
Poleg kortikosteroidov v prvo linijo zdravljenja AD spadajo tudi lokalni zaviralci kalcinevrina. Uporabljata se dva dermalna inhibitorja kalcinevrina: mazilo s takrolimusom (1 %) in krema s pimekrolimusom (0,03 % in 1 %), ki zavirata transkripcije vnetnih citokinov. Pimekrolimus se kratkotrajno uporablja pri ob zagonih bolezni pri bolnikih z blagim do zmerno hudim AD. Takrolimus se uporablja pri srednje hudih do hudih oblikah AD. Obe učinkovini sta varni in učinkoviti tako pri otrocih kot pri odraslih in zmanjšujeta srbenje, blažita potek ter zagone AD. Inhibitorja kalcinevrina sta primarno namenjena občutljivim delom kože (obraz, območje genitalij …), saj ne povzročata atrofije kože in sistemskih neželenih učinkov (1, 2).
Podporna terapija
Naslednja skupina učinkovin, ki se lahko predpisujejo v kombinaciji z lokalnimi kortikosteroidi ali imunomodulatorji, so antihistaminiki. Slednji sicer niso primerni za monoterapijo, saj histamin ni poglavitni mediator vnetja, ki sproži srbenje. Zato samo z antihistaminiki srbeža kože ne moremo preprečiti ali umiriti. Sistemski antihistaminiki se uporabljajo pri bolnikih, ki imajo pridruženo koprivnico, dermografizem ali alergijski rinitis.
V primeru infekcij atopične kože uporabljamo tudi antibiotike, antimikotike ali virostatike (5).
Sistemske oblike zdravljenja
V primeru hude oblike je bolnik hospitaliziran in ga zdravimo s sistemskimi imunosupresivi, ko so izčrpane vse druge oblike zdravljenja. Najpogosteje se uporabljata ciklosporin A, ter kratkotrajno, za akutno terapijo sistemski kortikosteroidi. Zdravljenje s ciklosporinom A navadno traja od tri do dvanajst mesecev, vendar ima veliko neželenih učinkov in so zato potrebne redne kontrole krvnega tlaka in krvi (5).
Pri različnih kožnih vnetnih boleznih se kot standardna terapija uporablja tudi fototerapija, ki deluje protivnetno in protimikrobno. Fototerapija se uporablja za kronično obliko AD pri odraslih in ni primerna za uporabo v akutni fazi bolezni. Prav tako metoda ni primerna za bolnike, ki slabo reagirajo na sončno svetlobo (14).
6
Leta 2019 je zavod za zdravstveno zavarovanje Slovenije (ZZZS) na listo zdravil razvrstil prvo biološko zdravilo za bolnike z AD: dupilumab. Primerno je za odrasle in mladostnike z zmernim do hudim AD, ki potrebujejo sistemsko zdravljenje. ZU se veže na alfa podenoto receptrojev interlevkina 4 in s tem prepreči vezavo interlevkinov 3 in 4 na celične receptorje, ki pomagajo vzdrževati imunski odziv T celic pomagalk tipa 2 (15).
1.2. TEKOČI KRISTALI
Tekoči kristali (TK) predstavljajo vmesno stanje snovi med trdnim in tekočim. Zanje so značilne specifične mikrostrukture oz. mezofaze, med katerimi lahko prehajajo v specifičnem zaporedju. TK izkazujejo lastnosti trdne kristalinične snovi (anizotropnost, dvolomnost, urejenost, mehanska stabilnost) in značilnosti tekočin (tok) (16, 17).
1.2.1. Delitev tekočih kristalov
Glede na to, ali je za nastanek TK potrebna povišana temperatura ali dodatek topila, jih delimo na termotropne in liotropne. Termotropni TK nastanejo s segrevanjem trdne snovi, za katero so značilne podolgovate molekule ali molekule v obliki diska, s togim osrednjim delom in gibljivimi stranskimi verigami. Liotropni TK so sestavljeni iz vodne in oljne faze ter površinsko aktivnih snovi (PAS). Pri kritični micelarni koncentraciji (KMK) se PAS spontano urejajo v micele, in sicer se v odsotnosti oljne faze hidrofilni deli obrnejo navzven in hidrofobni navznoter, v odsotnosti vodne pa ravno obratno (tvorijo se reverzni miceli). Z naraščanjem koncentracije PAS nad KMK se izotropna micelarna raztopina spremeni v anizotropno, viskoznost se poveča in nastanejo liotropni TK. Glede na obliko hidratiranih molekul PAS se TK urejajo v lamelarne, heksagonalne in kubične mezofaze. Lamelarne mezofaze nastajajo pri višjih koncentracijah PAS kot heksagonalne in imajo nižjo viskoznost. Nižja viskoznost je posledica debeline plasti, ki je enaka eni do dvema dolžinama molekule PAS, plasti lahko ena ob drugi drsijo, gibanje pa je omejeno le z ravnino plasti.
Glede na urejanje molekul delimo lamelarne mezofaze na tri podstrukture: Lα, Lβ in Lc. Tekoče lamelarne faze Lα so najmanj urejene, Lc pa najbolj urejene, saj so verige
»zmrznjene« v rešetko. S povečanjem količine topila oz. debeline lamelarnih mezofaz, se lahko molekule topila začnejo vključevati med posamezne molekule PAS in povzročijo spremembo oblike iz valjaste v stožčasto (topilo je voda) oz. v obrnjen stožec (lipofilno topilo). Pride do spremembe asociacijskih struktur iz lamelarnih v heksagonalne oz. reverzne heksagonalne mezofaze. Med lamelarnimi in heksagonalnimi mezofazami lahko nastaneta
7
kubični fazi tipa II in III glede na topilo. Z nadaljnjim dodajanjem topila nastaneta ali kubična mezofaza tipa I ali tipa IV. Prehodi med posameznimi fazami so predstavljeni na sliki 2 (16, 18). Pri koncentracijah PAS med 30 in 50 %, ter širokim temperaturnem območju nastanejo heksagonalne mezofaze. Kubične faze edine ne izkazujejo dvolomnosti, zanje je značilna visoka viskoznost, ki je posledica tridimenzionalne ureditve agregatov (17).
Slika 2: Fazni prehodi liotropnih TK v odvisnosti od deleža PAS in lipofilnosti topila in/ali PAS. Povzeto po: (17).
1.2.2. Razvoj in vrednotenje tekočih kristalov
Liotropni TK so multifunkcionalni dostavni sistemi in se uporabljajo za subkutano, intravensko, oralno, peroralno, vaginalno, predvsem pa za dermalno in transdermalno dostavo ZU. Predstavljajo dostavni sistem tako za majhne klasične molekule kot za peptide in proteine. Vanje lahko vgrajujemo lipofilne, hidrofilne ali amfifilne ZU, nudijo pa tudi zaščito ZU, podvrženih encimski razgradnji. Izzivi pri formulaciji TK so priprava stabilnega sistema z definirano mikrostrukturo tako pred kot po vgradnji ZU (19, 20).
TK se kot dostavni sistem uporabljajo ali kot poltrdni sistemi (t.i. »bulk« faza) ali kot koloidne disperzije nanodelcev s strukturo TK (ang. lyotropic liquid crystal nanoparticles) Kot poltrdni sistemi so viskozni, bistri, z makroskopskim videzom hidrogela. Na mestu aplikacije se skoncentrirajo, visoka koncentracija pomožnih snovi, ki je potrebna za njihov nastanek, pa lahko vodi do draženja kože in neželenih učinkov. V primerjavi s koloidnimi disperzijami nanodelcev so enostavnejši za izdelavo, saj posamezne sestavine v pravilnem razmerju samo zmešamo med seboj, do nastanka homogenega sistema. Med koloidne
8
disperzije nanodelcev s strukturo TK spadajo kubosomi in heksosomi, ki so koloidne disperzije inverzne kubične ali heksagonalne mezofaze.
V farmacevtski industriji so pogost izziv v vodi slabo topne ZU. Yasser in sodelavci so izdelali kubosome in vanje vgradili telmisartan. Telmisartan je antihipertenziv, ki je sicer slabo topen v vodi in sodi v II. razred biofarmacevtskega klasifikacijskega sistema z visoko permeabilnostjo in nizko topnostjo. TK so pripravili z raztapljanjem Poloxamera 407 in gliceril monooleata na vodni kopeli, dodali telmisartan in mešali do nastanka homogene zmesi. Disperzijo so nato po kapljicah dodajali vodi, segreti na enako temperaturo, ob močnem mešanju na magnetnem mešalu. Zmes so dva dni pustili mirovati, da se je vzpostavilo ravnotežje. Kasneje so disperziji dodali še ostale pomožne snovi za izdelavo granulata, iz katerega so nato izdelali neobložene tablete. Vsebnost Poloxamera 407 je imela direkten vpliv na razpadnost tablet s kubosomi, in sicer je večja vsebnost vodila do višjih trdnosti (pri enakih parametrih tabletiranja). To bi lahko razložili z lipidno naravo sestavin, ki so tvorile kubosome (predvsem Poloxamer 407) in močnimi vezmi z drugimi pomožnimi snovmi v neobloženih tabletah. Poloxamer je neionska PAS in je kopolimer sestavljen iz dveh hidrofilnih etilenoksidnih verig in sredinskega propilenoksidnega centra. Ugotovili so, da se ZU sprošča počasneje, 35 % v prvi uri (do 85 % v 24 urah) v primerjavi z originatorjem (tablete z nadzorovanim sproščanjem), kjer se je sprostilo 66 % ZU v prvi uri. Z nadzorovanim sproščanjem so tako dosegli, da se večina ZU sprosti v tankem črevesu (čas zadrževanja osem do dvanajst ur), kjer se tudi absorbira v sistemski krvni obtok. (21, 22).
1.2.2.1. Vrednotenje tekočih kristalov
Liotropne TK vrednotimo z različnimi analiznimi metodami. Vsaka mezofaza ima različne fizikalno-kemijske lastnosti, med seboj se razlikujejo tudi po strukturni urejenosti, tj.
velikosti in obliki specifičnih struktur, ki pomembno vplivajo na delovanje po aplikaciji.
(22).
Enostavna metoda za neposredno določitev liotropnih TK je polarizacijska mikroskopija, ki omogoča potrditev heksagonalne in lamelarne mezofaze. Kubične mezofaze ne moremo določiti, saj edina ne izkazuje dvolomnosti. Če skozi vzorec pošiljemo belo svetlobo, TK izkazujejo tipično črno – belo teksturo. Za lamelarne TK (slika 3A) so značilne oljne proge z malteškimi križi, ki se pojavijo zaradi koncentričnih razporeditev vodoravnih plasti. Oblika
9
ventilatorja (ang. fan-like texture) je značilna za heksagonalne TK (slika 3B), ki je posledica stožčaste oblike PAS (23, 24).
Slika 3: Vzorci tekočih kristalov posnetih s polarizacijskim mikroskopom: A – lamelarne mezofaze zznačilnimi malteškimi križi; B – heksagonalne mezofaze s pahljačasto strukturo (25).
Fizikalne in/ali kemijske lastnosti snovi v odvisnosti od temperature določamo z termičnimi analizami kot sta diferenčna dinamična kalorimetrija (DSC) in termogravimetrična analiza (TGA). Spremljamo lahko temperaturo tališča, obnašanje pri taljenju, čistost, polimorfizem, fazne prehode, interakcije v zmesi, termično in oksidativno stabilnost. Pri TK pride med faznimi prehodi do spremembe v prosti energiji, ki jo zaznamo z merilno napravo (23, 26).
Mikrostrukturo TK lahko proučujemo tudi s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM).
Metoda zahteva posebno tehniko priprave vzorcev, saj pride v visokem vakuumu elektronskega mikroskopa do izgube vode in s tem do sprememb v mikrostrukturi. Uporablja se tehnika zamrzovalnega lomljenja, s katero pripravimo repliko vzorca, ki jo opazujemo pod mikroskopom. Natančno lahko določimo prehode med različnimi liotropnimi TK. Za nadgradnjo informacij o strukturi, ki jih dobimo z ostalimi metodami, uporabljamo tehniko ozkokotne rentgenske difrakcije (SAXS), s katero zaznamo večje razdalje med plastmi glede na urejenost na dolge razdalje (17, 27). Z metodo jedrske magnetne resonance (NMR) dobimo informacije za določitev ureditvenega parametra S, saj lahko jasno ločimo med različnimi molekularnimi segmenti. Uporabljamo 1H NMR, 2H NMR in 13C NMR za katere se odločimo na podlagi lastnosti sistema (npr. glede na vgrajeno ZU, sestavine TK) in glede na to kakšno informacijo želimo pridobiti (npr. fazni prehodi, orientacijska ureditev, določitev faznega ravnotežja) (17, 28).
10 Reološko vrednotenje tekočih kristalov
V osnovi reološke sisteme delimo na Newtonske oz. idealne sisteme in ne-Newtonske oz.
realne sisteme. Newtonske snovi izkazujejo konstantno viskoznost pri danem tlaku in temperaturi, ne glede na smer, jakost in čas delovanja striga. Pri povišani temperaturi viskoznost pada, ker je Brownovo gibanje osnovnih molekul povečano. Bolj kot je tekočina viskozna, bolj je občutljiva na temperaturo. Veliko realnih snovi kaže idealne lastnosti samo v določenem temperaturnem intervalu. Viskoznost realnih snovi pri določenem tlaku in temperaturi ni konstanta in se lahko spreminja glede na jakost in smer delovanja strižne sile ter čas delovanja striga (29).
Realne kapljevine, trdni in poltrdni sistemi se večinoma obnašajo ne-Newtonsko in so kompleksnejši. Ločimo tiksotropne, reopeksne, plastične, dilatantne, psevdoplastične in viskoelastične sisteme. Tiksotropni sistemi so tisti, katerih viskoznost pri danih strižnih pogojih upada s časom delovanja striga, dokler se osnovne strukture v zmesi ne uredijo v smeri toka. Po prenehanju delovanja sile na sistem je viskoznost po določenem času enaka začetni. Reopeksni sistemi izkazujejo obraten pojav od tiksotropnih. Viskoznost s časom delovanja striga pri določenih strižnih pogojih narašča. Prav tako gre lahko za reverzibilen proces, ko se ob razbremenitvi viskoznost ponovno zniža do začetnega stanja. Za plastične sisteme je značilno, da je potrebna določena sila, da snovi stečejo. To je strižna napetost, ko je strižna hitrost enaka nič. Imenujemo jo mejna ali plastična napetost. Snov steče, ko je zunanja sila večja od znotraj delujoče sile strukture. Pri psevdoplastičnih sistemih viskoznost z naraščajočo strižno obremenitvijo pada. Strukturni elementi se uredijo v smeri toka in preidejo v bolj urejeno stanje. Obratni sistemi od psevdoplastičnih so dilatantni, pri katerih viskoznost z večanjem strižne obremenitve narašča. Tu se zaradi obremenitve strukturni elementi premaknejo in med njimi se pojavi večje število medsebojnih reakcij.
Reološko najzahtevnejši sistemi so viskoelastični. Izkazujejo tako viskozne kot elastične lastnosti in so odvisne od strižnih pogojev in časa delovanja striga. To pomeni, da lahko snovi del energije, ki deluje nanje, shranijo in po razbremenitvi del deformacije povrnejo.
Opredelitev odziva snovi na strižno silo opisuje Deborahovo število (De), ki predstavlja količnik karakterističnega časa (lk) in časa trajanja eksperimenta (t) (enačba 1).
𝐷𝑒 =lk
𝑡 Enačba (1)
11
Karakteristični čas predstavlja merilo viskoznega oziroma elastičnega odziva snovi na delovanje strižne sile in je lastnost snovi. Pri De = 1 se snov odziva viskoelastično, pri De
>> 1 se snov odziva elastično in pri De << 1 viskozno. Če dovolj dolgo izvajamo poskus, bo snov imela bolj viskozne lastnosti – tudi steklo. Če ga izvajamo dovolj hitro, bo imela bolj elastične lastnosti (30–32).
Različni tipi TK izkazujejo različne reološke lastnosti. Tako se viskoznost TK povečuje z večanjem urejenosti mikrostrukture. Heksagonalne in kubične mezofaze so zaradi dvo- in trodimenzionalne urejenosti bolj viskozne od lamelarnih mezofaz, ki so na dolge razdalje urejene enodimenzionalno (17).
Aytekin in sodelavci so izdelali in ovrednotili dermalne TK za zdravljenje aken z azelaično kislino. Uporabili so tekoči parafin kot lipofilno sestavino, mešanico dveh PAS (Brij 721P in Brij 72), ter vodo. Izdelali so dva (psevdo)trikomponentna fazna diagrama z različnimi razmerji PAS in s pomočjo polarizacijske mikroskopije in SAXS metodo definirali področja nastanka lamelarnih TK, deformiranih lamelarnih TK in emulzij. Za lamelarne TK so potrdili značilne malteške križe in oljne proge, ter ugotovili, da sistemi izkazujejo bolj elastične kot viskozne lastnosti, saj je bil elastični modul (G') vedno višji kot plastični modul (G''). Elastični modul se je z naraščajočo frekvenco spreminjal, in sicer je naraščal, kar lahko nakazuje na prisotnost lamelarnih mezofaz (33). G' karakterizira upiranje sistema preoblikovanju in je merilo elastičnega obnašanja sistema. Z njim dobimo informacijo o shranjeni energiji med obremenitvijo vzorca, ki je po obremenitvi v celoti na razpolago za vzpostavitev prvotne oblike vzorca. Nasprotno G'' opisuje viskozno obnašanje sistema. Del energije se med procesom deformacije ne ohrani, saj se porabi za preoblikovanje notranje strukture vzorca ali pa se izgubi v obliki toplote, ki nastane zaradi trenja med molekulami oz. delci (34). Azelaična kislina ima v strukturi dve hidroksilni skupini, ki tvorita vodikove vezi z vodo v lamelarnih TK, hkrati pa reagira z vodo v mediju za sproščanje in se zato hitreje sprošča iz formulacije. Pokazali so, da je sproščanje vgrajene iz deformiranih TK počasnejše, saj ne vsebujejo vode in predstavljajo pravzaprav samomikroemulgirajoči sistem (SMES), ter bi bili lahko primeren dostavni sistem za nadzorovano sproščanje vgrajene azelaične kisline (33).
12
1.2.2.2. Tekoči kristali kot dostavni sistemi v farmaciji
Tekoči kristali za transdermalno uporabo
Največji izziv transdermalne dostave je ustrezna dermalna absorpcija ZU v in skozi kožo, kar so Kozaka in sodelavci rešili z izdelavo liotropnih TK. V nedavnem članku so predstavili liotropne TK za transdermalno dostavo ZU v vlogi cepiva, kjer so kot glavno prednost izpostavili neinvazivno aplikacijo in enostavnost za uporabo. Izdelali so kubične mezofaze iz 1-monolinoleina kot oljne faze in vanje vgradili modelno peptidno učinkovino TRP-2 (ang. tyrosinase related protein 2), ki se pretirano izraža na melanomskih celičnih linijah.
TRP-2 peptid aktivira močno melanomsko specifično imunost v celotnem telesu, preko različnih podskupin dendritičnih celic, kot so na primer kožne dendritične celice in Langerhansove celice, ko ga apliciramo dermalno. Izdelali so vzorce z različnimi deleži vodne faze, ki jo je predstavljala zmes etanola in vode, in jih ovrednotili s polarizacijsko mikroskopijo, SAXS, FTIR in reološkimi meritvami. S SAXS analizo so ugotovili, da so glede na uporabljeno hidrofilno fazo nastale kubične ali lamelarne mezofaze, kar so kasneje potrdili tudi s polarizacijskim mikroskopom. Z reološkimi meritvami so želeli najti formulacijo z ustrezno viskoznostjo, ki bo zagotovila optimalen čas zadrževanja na koži.
Svojo raziskavo so nadaljevali z vrednotenjem in vitro dermalne absorpcije na mišji koži s Franz-ovimi difuzijskimi celicami in ugotovili, da je ZU iz kubičnih mezofaz najučinkoviteje prehajala roženo plast v nižje plasti kože. Do tega je prišlo zaradi močnih interakcij med kubično strukturo in intracelularnimi lipidi v povrhnjici. Učinek izdelanih liotropnih TK je bil podoben cepivom apliciranih subkutano z injekcijo, brez draženja kože ali citotoksičnosti (35).
Namen izdelave liotropnih TK v okviru študije Berko in sodelavcev je bila prav tako izdelava dostavnega sistema za lažjo aplikacijo, s katerim bi dosegli boljšo komplianco bolnikov. Za zdravljenje erektilne disfunkcije se namreč uporabljajo injekcije papaverina hidroklorida, katerih stranski učinki so bolečina, brazgotinjenje in priapizem. Alternativo injekcijam predstavljajo liotropni TK izdelani iz Kolliphora RH 40, izopropilmiristata, Tween 80, vode in različnih koncentracij ZU. Formulacije so ovrednotili s polarizacijsko mikroskopijo, reološkimi metodami, prehajanje ZU skozi kožo pa s Franzovimi difuzijskimi celicami ter Ramansko mikroskopijo. Pri ex vivo študiji so uporabili človeško kožo, medtem ko so za in vitro študijo uporabili umetno membrano. S polarizacijskim mikroskopom so ugotovili, da so izdelali lamelarne TK, saj so vzorci brez ZU in z 2,5 ter 3 % (m/m) ZU
13
izkazovali značilne malteške križe. V vzorcih s 4 % (m/m) ZU pa malteški križi niso bili več razvidni. Domnevajo, da je višji odstotek ZU povzročil fazni prehod TK. Izvedli so tudi oscilacijske reološke meritve pri 32 °C (temperatura kože) in odkrili, da se elastični in plastični modul povečuje z naraščajočo koncentracijo ZU, ter da sta modula višja pri sistemih z vgrajeno ZU kot pri vzorcih brez vgrajene ZU. Pri vzorcu s 4 % (m/m) ZU so tudi pri reoloških meritvah ugotovili, da je prišlo do sprememb. Sistem je bil bolj viskozen, oba modula pa sta še dodatno narasla, s čimer so potrdili strukturne spremembe pri tem vzorcu.
Domnevajo, da so se ob zvišanju koncentracije ZU lamelarne mezofaze preoblikovale v kubične, saj je za njih značilno, da so najbolj viskozne. S študijo so pokazali, da so lamelarni TK primerni za transdermalno dostavo ZU kot alternativo parenteralni in peroralni aplikaciji.
Najbolje se je izkazala formulacija z 2,5 % (m/m) ZU, za katero so v ex vivo in in vitro pogojih potrdili ustrezen obseg dermalne absorpcije ZU v usnjico, kjer nato pride do nadaljnje sistemske absorpcije (36).
Tekoči kristali za dermalno uporabo
V primerjavi z drugimi dermalnimi FO omogočajo TK večjo permeabilnost in stabilnost vgrajene ZU. Prednost dermalne aplikacije je enostaven, neinvaziven nanos, izognemo se metabolizmu prvega prehoda, s čimer se izognemo sistemskim neželenim učinkom, sproščanje in absorpcija učinkovine pa sta hitra. Pomembna lastnost, ki jo izkoriščamo za dermalno dostavo ZU, je podobnost strukturne urejenosti TK medceličnim lipidom rožene plasti kože in celičnim membranam. V TK lahko vgrajujemo tako lipofilne kot hidrofilne ZU, ugodni za uporabo so tudi zaradi biokompatibilnosti in biorazgradljivosti lipidov (22, 23). TK kot dermalni dostavni sistemi se raziskujejo za zdravljenje dermatitisa in revmatskih bolezni (37), kemičnih opeklin oči (38), psoriaze, glivičnih obolenj (39), AD (40–42), in zaščito pred UV žarki (43).
S ciljem izdelave FO, ki bi izboljšala učinkovitost obstoječih zdravil, so Nesseem in sodelavci izdelali in ovrednotili liotropne TK z vgrajenim itrakonazolom za dermalno uporabo, za zdravljenje glivičnih obolenj. Na slovenskem trgu se itrakonazol uporablja v obliki kapsul ali peroralne raztopine za sistemsko zdravljenje (44). Za izdelavo so uporabili polioksietilen stearileter v vlogi emulgatorja, cetostearil alkohol kot koemulgator, silikonsko olje kot lipofilno fazo in vodo kot hidrofilno fazo. Najprej so formulacijo ocenili organoleptično, nato so nadaljevali s testom senzitivnosti na treh ljudeh, kjer so na kožo nanesli kapljico razredčene kreme in kapljico fiziološke raztopine, ter opazovali ali se na
14
koži po 10 minutah pojavi reakcija (nastanek eritrema, alergijske reakcije). Določili so pH zmesi pred in po dodatku ZU, nadaljevali s pregledom FO s polarizacijskim mikroskopom, ter potrdili nastanek lamelarnih TK. Izvedli so tudi meritve z DSC, TGA in infrardečo spektroskopijo s Fourierjevo transformacijo, določili viskoznost sistema in izvedli in vitro antimikotično študijo. Viskoznost so najprej izmerili z Brookfieldovim viskozimetrom s sistemom koaksialnih valjev, kasneje še s sistemom stožec – plošča. Z Brookfieldovim viskozimetrom so izvedli meritve na vzorcih po izdelavi, po enem tednu, po enem mesecu in po dveh mesecih po izdelavi. Viskoznost je bila v vsaki časovni točki višja, kar nakazuje na časovno odvisno vzpostavitev ravnotežja oz. mikrostrukture sistema. Z merilnim sistemom stožec – plošča izdelana krema izraža plastične reološke lastnosti, saj krivulja navzgor ne sovpada s krivuljo navzdol, prisotna je tudi široka histerezna zanka, ki nakazuje na tiksotropne lastnosti vzorcev. Z in vitro testom so dokazali tudi učinkovitost kreme z vgrajenim 0,1 % itrakonazolom (39).
Mahmood in sodelavci so za zdravljenje glivičnih obolenj ubrali drugačen pristop in izdelali kubosome z lulikonazolom za dermalno uporabo. Lulikonazol je slabo topen v vodi in ima slabo biološko razpoložljivost. Ugotovili so, da TK predstavljajo obetaven in učinkovit sistem za dostavo antimikotičnih ZU, predvsem ker omogočajo povečano penetracijo teh ZU v kožo. Klasične kreme, mazila in geli so neprimerni, saj lulikonazol slabo prehaja roženo plast kože, tako so potrebni visoki odmerki in pogosta aplikacija, kar vodi do slabe kompliance bolnikov in ponovnih poslabšanj bolezni. FO so začeli razvijati po pristopu ''Quality by Design'' (QbD), definirali kritične atribute kakovosti, pripravili oceno tveganja in načrt eksperimentov (DoE). Vodno disperzijo nanodelcev s strukturo TK so izdelali iz gliceril monooleata, PEG 200, Polaxomera 407 in vode. TK so z dodatkom Carbopol 974P vgradili v hidrogel in ga ovrednotili rotacijskimii in oscilacijskimi reološkimi testi. Uporabili so sistem stožeč-plošča, ki zagotovi konstanten strig na vzorec. Viskoznost je bila z višanjem obremenitve ves čas linearna, ker se kubosomom minimalno podre zunanja struktura, ki se hitro povrne v prvotno stanje. Elastični modul je bil višji od plastičnega, formulacija je izkazovala lastnosti gela oz. viskoelastične lastnostni (45).
Zdravljenje aken z uporabo formulacije na osnovi TK so raziskovali Khan in sodelavci.
Izdelali so kubosome za dermalno dostavo eritromicina. Uporabili so Poloxamer 407 in gliceril monooleat za izdelavo kubosomov v oljni disperziji, kasneje pa dodali še Carbopol 934 in izdelali gel. Težava klasičnih mazil in krem predstavlja majhen odmerek ZU, ki
15
doseže želeno mesto delovanja, hkrati pa je njihova aktivnost omejena. Eritromicin v že znanih pripravkih lahko povzroča neželene stranske učinke kot so srbečica, rdečica, edem in razdraženost kože. S kubosomi so ohranili učinkovitost ZU, dosegli podaljšano sproščanje in tako zmanjšali neželene učinke. Ko so povečali koncentracijo gliceril monooleata, sta se povečali povprečna velikost delcev in učinkovitost vgradnje ZU v kubosomih, ravno nasprotni učinek je bil dosežen s povečevanjem koncentracije Poloxamera. Z reološkimi meritvami so ugotovili, da je viskoznost obratno sorazmerna s strižno hitrostjo, ob povečanju hitrosti, viskoznost pada, kar pomeni, da vzorec kaže psevdoplastične značilnosti. Zanimiva je ugotovitev, da se najprej sprosti del ZU, ki je v vodnih kanalih vrhnjih plasti kubosomov, nato pa se z difuzijo sprošča še preostanek iz notranjosti (19). Kubični TK omogočajo nadzorovano sproščanje zaradi različnih velikosti vodnih kanalov, na katere lahko vplivamo z izbiro lipida (npr. monooleat) ali polimera namenjenega nadzorovanemu sproščanju (46).
Pri izdelavi lamelarnih TK za dermalno aplikacijo je pomembna izbira sestavin, biti morajo biorazgradljive, biokompatibilne in netoksične. Gosenca in sodelavci so uporabili lecitin, ki je naravnega izvora, Tween 80, ki je nizko toksičen, ter izopropil miristat, ki je biokompatibilno in biorazgradljivo olje. Lecitin je fosfolipid naravnega izvora (rastlinskega in živalskega), ki v farmaciji služi kot PAS. Tween 80 je amfifilna neionska PAS, ki se pogosto uporablja kot pomožna snov v farmacevtski industriji. V TK so vgradili askorbilpalmitat, ki je antioksidant in se uporablja za preprečevanje staranja kože. Najprej so izdelali (psevdo)trikomponentni diagram s katerim so s polarizacijskim mikroskopom določili področja nastanka lamelarnih TK. Nadalje so lamelarne TK ovrednotili s SAXS in DSC metodo, ter reološkimi meritvami. Pri reoloških meritvah so teste izvedli s sistemom stožec – plošča, pri treh različnih temperaturah: 25 °C, 32 °C in 37 °C. Najprej so izvedli rotacijske teste, nato še oscilacijske (amplitudne in frekvenčne). Ugotovili so, da sistemi izkazujejo strižno odvisno upadanje viskoznosti oziroma ti. ''shear thinning'', kar je značilno za ne-Newtonske sisteme. Izkazujejo plastično in elastično obnašanje. Lamelarna mezofaza je ostala organizirana tudi pri temperaturi kože in telesni temperaturi (47–49).
Voda v lamelarnih TK je ujeta med hidrofilnimi in hidrofobnimi plastmi, zato izhlapeva počasneje kot v konvencionalnih olje/voda kremah. Ravno zato so iz vidika zdravljenja AD, TK primerni sistemi, ker zadržijo vodo in dlje časa vlažijo kožo (33). Jong Im in sodelavci so izdelali TK za zdravljenje AD z oregoninom in hirsutanololom, ki delujeta kot selektivna inhibitorja 5-lipoksigenaze v koži in imata terapevtski učinek na vnetje kože. Pripravili so
16
kubične mezofaze jih primerjali s kubičnimi nanodisperzijami in vodno raztopino. Za vrednotenje prehajanja ZU v kožo so uporabili Franzove difuzijske celice in delipidizirano kožo (ang. delipidazed skin), ki posnema stanje atopične kože, ter rezultate primerjali s prehajanjem ZU na normalni koži. Nalaganje ZU v zdravi koži je bilo 2-3 × manjše kot na modelu atopične kože, kar je najverjetneje posledica oslabljene barierne funkcije, zaradi česar je obseg absorpcije ZU večji. V okviru študije so potrdili, da je dermalna absorpcija iz monooleinskih sistemov povečana. Kot najboljši sistem, ki je omogočal največjo penetracijo ZU v kožo, se je izkazal sistem disperzije z nanodelci s strukturo TK (40).
17
2. NAMEN DELA
Namen magistrske naloge bo razviti in ovrednotiti dermalne dostavne sisteme s strukturo tekočih kristalov, izdelane iz lanenega ali konopljinega olja, lecitina, Tween 80 ali Montanov 68 in vode, v katere bomo vgradili betametazondipropionat. Z izbiro pomožnih snovi, ki krepijo okrnjeno barierno funkcijo kože, in specifično mikrostrukturo tekočih kristalov kot dermalnih nosilnih sistemov, želimo doprinesti k izboljšanemu zdravljenju atopijskega dermatitisa.
Laneno in konopljino olje predstavljata oljno fazo tekočih kristalov. Vsebujeta visok delež esencialnih maščobnih kislin s protivnetnim delovanjem, kar je ugodno za kožo bolnikov z atopijskim dermatitisom. Glavno vodilo pri izbiri površinsko aktivnih snovi bosta njihova netokičnost in sposobnost tvorbe mezofaz. Lecitin in Montanov 68 sta naravnega izvora in biorazgradljiva, Tween 80 je nizko toksičen in se tudi sicer uporablja v farmacevtskih pripravkih za intravensko aplikacijo, vsi trije pa zaradi svoje specifične molekularne strukture omogočajo nastanek tekočih kristalov.
V prvem sklopu magistrske naloge bomo s titracijsko metodo izdelali štiri (psevdo)trikomponentne fazne diagrame in določili področja nastanka tekočih kristalov glede na organoleptične lastnosti (bistrost/motnost in viskoznost). Za vsak fazni diagram bomo pripravili devet samomikroemulgirajočih sistemov v različnih masnih razmerjih (od 1/9 do 9/1) med lanenim ali konopljinim oljem kot oljno fazo ter zmesjo lecitina in Tween 80 ali Montanov 68 kot emulgatorsko fazo. V vseh sistemih bomo ohranjali razmerje med površinsko aktivnimi snovmi, tj. lecitin/Tween 80 oz. lecitin/Montanov 68 v razmerju 1/1.
Primerjalno bomo za izbrane samomikroemulgirajoče sisteme razvili še sisteme z vgrajeno zdravilno učinkovino betametazondiproprionat (0,64 mg na 1 g zmesi). Ta učinkovina je na slovenskem trgu na voljo v obliki mazil in krem različnih proizvajalcev. Vse oblike imajo enako jakost, in sicer 1 g mazila ali kreme vsebuje 0,5 mg betametazona v obliki 0,64 mg betametazondiproprionata.
V drugem sklopu naloge bomo na posameznih razredčitvenih premicah (psevdo)trikomponentnih faznih diagramov izbrali optimalne sisteme s potencialno strukturo tekočih kristalov, ki jih bomo nadalje strukturno ovrednotili. Mikrostrukturo sistemov bomo določili s polarizacijsko mikroskopijo, pri čemer nas bo prvenstveno zanimala struktura lamelarnih tekočih kristalov, ki so zlasti primerni za dermalno uporabo.
18
Nadalje bomo z rotacijsko in oscilacijsko reometrijo proučevali reološke lastnosti, ki so ključnega pomena pri dermalnih dostavnih sistemih. Spremljali bomo odvisnost viskoznosti, elastičnega in plastičnega modula glede na sestavo, vgradnjo zdravilne učinkovine in temperaturo. Izbrane vzorce bomo spremljali pri temperaturi 25 °C (temperatura shranjevanja nosilnega sistema), 32 °C (temperatura na površini kože) in 37 °C (telesna temperatura), s čimer želimo ovrednotiti mikrostrukturo in reološke značilnosti pri vseh temperaturah, ki so relevantne za dermalno dostavo.
19
3. MATERIALI IN METODE 3.1. MATERIALI
3.1.1. Sestavine za izdelavo liotropnih tekočih kristalov
Lipoid S-100® (Lipoid GmbH, Nemčija)
Lipoid S-100® oz. lecitin je amfifilna molekula, ki predstavlja kompleksno zmes fosfolipidov. Najbolj zastopana sestavina lecitina je fosfatidilholin (slika 4), ostale sestavine so fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitol in različne količine maščobnih kislin, trigliceridov in ogljikovih hidratov. Vsebnost fosfatidilholina v Lipoidu S-100® znaša več kot 94 %. Je prečiščena vrsta sojinega lecitina in vsebuje tudi fosfatidiletanolamin, lizofosfatidilholin, trigliceride, D1-α-tokoferol in vodo. Sicer je delež sestavin odvisen od izvora lecitina in stopnje čistote (55, 56).
Lecitin je sestavina celičnih membran in ga večinoma pridobivamo iz sojinih semen in jajčnega rumenjaka(55, 56). Široko se uporablja v farmacevtski, prehrambni in kozmetični industriji, saj je biokompatibilen in biorazgradljiv. Lecitin ima v farmacevtskih izdelkih predvsem vlogo solubilizatoja, emulgatorja in stabilizatorja. Uporablja se v parenteralnih in dermalnih FO. Ne povzroča draženja kože in deluje vlažilno. Po izgledu je rumena lepljiva snov voskaste konsistence z značilnim vonjem. Shranjujemo ga v zmrzovalniku (52).
Slika 4: Kemijska stuktura fosfatidilholina: R1 in R2 predstavljata maščobni kislini (52).
Tween® 80 (Merck, Nemčija)
Tween 80 ali polisorbat 80 je rumena, viskozna, higroskopna tekočina, ki ima značilen vonj.
Kemijsko je polioksietilen (20) sorbitan monooleat, struktura je prikazana na sliki 5. Topen je v vodi, etanolu, etilacetatu, metanolu in toluenu, medtem ko v mineralnih oljih ni topen.
Je hidrofilen, neionski emulgator z vrednostjo hidrofilno-lipofilnega ravnotežja 15. Potrebno ga je shranjevati zaščitenega pred zrakom, saj v prisotnosti kisika oksidira. Velja za
20
netoksično snov, ki ne povzroča draženja. Pogosto se uporablja za izdelavo peroralnih in dermalnih FO, ter v prehrambni in kozmetični industriji kot emulgator, solubilizator in močljivec (55, 57).
Slika 5: Kemijska struktura Tween® 80 (53).
MontanovTM 68 (Tovarna Organika)
Montanov 68 je emulgirajoči vosek tipa O/V na osnovi cetearilnega alkohola (angl. Cetearyl alcohol) (slika 6A) in cetearilnega glukozida (angl. Cetearyl glucoside) (slika 6B), ki ju pridobivajo iz kokosovega olja in kasave (lat. Manihot esculenta). Spada med neionske emulgatorje in se lahko uporablja samostojno ali v kombinaciji z drugimi emulgatorji. Ne povzroča draženja kože, je nekomedogen in biorazgradljiv. Zlasti v zadnjem času se zaradi naravnega izvora široko uporablja v naravni in ekološki kozmetiki. Montanov 68 je bele barve, nahaja se v trdnem agregatnem stanju v obliki peletk (54).
Kombinacijo cetearil alkohola in cetearil glukozida imenujemo alkil poliglukozid. Alkil poliglukozidi so večinoma stabilni pri visokih pH in občutljivi na nizek pH, kjer hidrolizirajo do sladkorja in maščobnega alkohola. Višje koncentracije alkil poliglukozidov neodvisno od temperature omogočajo nastanek TK. Z dodatkom topil (na primer vode) lahko nastanejo liotropni TK, v kolikor jih segrevamo tvorijo termotropne TK. Obnašanje termotropnih ali liotropnih TK je odvisno od strukture alkil poliglukozida, daljša kot je alkilna veriga, večja je toplotna stabilnost obeh faz. Pri tvorbi liotropnih TK daljša alkilna veriga vodi k destabilizaciji heksagonalne faze v prid lamelarni. V kombinaciji z dolgoverižnimi maščobnimi alkoholi in vodo se alkil poliglikozidi tako uporabljajo za tvorbo lamelarnih TK (55).
21
Slika 6: Kemijski strukturi A - cetearil alkohola in B - cetearil glukozida (60, 61).
Laneno olje (A.C.E.F., Italija)
Laneno olje pridobivamo iz lanenega semena (NCC lat. Linum usitattissimum), je bistra, zelenorumena tekočina s specifičnim vonjem in okusom. Glavne maščobne kisline v trigliceridih lanenega olja so linolenska, linolejska, oleinska, stearinska in palmitinska kislina. Kljub prisotnosti α-tokoferola, je olje zelo dovzetno za oksidacijo, zlasti zaradi visokega deleža α-linolenske kisline (slika 7A) (predstavlja približno 60 % vseh maščobnih kislin). Gre za trikrat nenasičeno maščobno kislino omega-3 z 18 ogljikovimi atomi, ki hitro oksidira. 14 % maščobnih kislin v olju predstavlja linolna kislina (slika 7B), ki je prav tako nenasičena omega-6 maščobna kislina z 18 ogljikovimi atomi. Za izboljšanje oksidativne stabilnosti se olju lahko doda antioksidante, kot so askorbilpalmitat, askorbinska kislina, etoksiliran glikol, α-tokoferol in njihove mešanice (50, 62).
Laneno olje ima nizko stabilnost, saj hitro oksidira in polimerizira, ter razvije neprijeten vonj, ki spominja na ribe. Uporablja se za nego atopijske in k alergijam nagnjene zrele kože.
Novejše raziskave kažejo, da laneno olje spodbuja rast in obnovo poškodovanega epitelija in pospešuje celjenje ran. V kozmetiki se uporablja predvsem hladno stiskano olje, ki ga shranjujemo zaščiteno pred zrakom in svetlobo (50, 63) .
Slika 7: Kemijski strukturi A - α-linolenske kislin in B - linolne kisline, kot najbolj zastopani maščobni kislini v lanenem olju (61, 62).
22 Konopljino olje (A.C.E.F., Italija)
Konopljina semena vsebujejo 23-25 % proteinov, 31-35 % olja, 28-34 % ogljikovih hidratov in 6 % pepela. Evropska unija omejuje količino tetrahidrokanabinola, ki je lahko prisoten v industrijski konoplji, na 0,3 % (m/m). Semena vsebujejo vse esencialne aminokisline in so bogata z argininom in glutaminsko kislino. Ne vsebujejo glutena ali ostalih znanih alergenov (58).
Konopljino olje vsebuje 72-83 % polinenasičenih maščobnih kislin v obliki trigliceridov, med njimi je visok delež esencialnih maščobnih kislin kot sta linolenska in linolejska kislina.
Vsebuje tudi fitosterole, najpogostejša sta β-sitosterol in campesterol. Več študij je pokazalo, da uživanje rastlinskih sterolov znižuje koncentracijo lipoproteina nizke gostote v krvi.
Dolgoverižni primarni alkoholi zmanjšujejo agregacijo trombocitov, poškodbe endotelija in znižujejo holesterol. Olje vsebuje tudi fitol (NCC ang. phytol), ki deluje antikancerogeno in antioksidativno, ter tokoferole, ki so naravni antioksidanti (58).
Prečiščena voda
Prečiščena voda je pridobljena z reverzno osmozo na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Uporabili smo jo kot hidrofilno fazo TK.
Betametazondiproprionat (Fagron, Nizozemska, čistota 98,6 %)
Betametazondiproprionat (slika 8) je ZU, ki spada v skupino sintetičnih glukokortikoidov.
Ima močan antiproliferativni, imunosupresivni in protivnetni učinek. Kortikosteroidi zmanjšujejo sintezo, sproščanje in aktivnost kemičnih mediatorjev vnetja, inhibirajo migracijo celic na mesto poškodbe, zmanjšujejo vazodilatacijo in permeabilnost žil na tem področju (63). Sintezno pridobljeni kortikosterodi so eksogeni analogi naravno prisotnih gluko in mineralkortikosteroidov, ki jih proizvaja nadledvična žleza. Zdravljenje mora biti premišljeno, saj z vnosom zunanjih kortikosteroidov naše telo proizvede manj lastnih kortikosteroidov. Betametazon lahko vgradimo v različne dermalne farmacevtske oblike kot so kreme, mazila in dermalne raztopine. Jakost in vrsto FO prilagodimo glede na vrsto kožne bolezni, trajanje zdravljenja in mesto pojava (64).
Strukturne modifikacije betametazona vplivajo na jakost delovanja ZU. Tako je betametazondiproprionat bolj potenten zaradi dveh estrskih skupin v primerjavi z betametazonvaleratom, ki vsebuje le eno (65). Kombinacija betametazon natrijevega fosfata in betametazonacetata se v obliki parenteralne vodne suspenzije injicira v sklep za
23
zdravljenje vnetja, oteklin, močnih alergijskih reakcij, težav z dihanjem, sistemskega eritematoznega lupusa, izbruhov multiple skleroze, resnih kožnih bolezni, artritisa in težav z ledvicami (66).
Slika 8: Kemijska struktura betametazodiproprionata (67).
3.1.2. Aparature in laboratorijska oprema
→ Analitska tehtnica AG (Mettler Toledo, Švica)
→ Tehtnica AJ – 1200CE (Shinko Denshi, Japonska)
→ Magnetno mešalo Rotamix 560 MMH (Rotamix, Slovenija)
→ Reometer Anton Paar Physica MCR 301 (Anton Paar, Avstrija)
→ Suhi sterilizator FN 500 (Nüve, Turčija)
→ Mikroskop Olympus CX31 (Olympus, Japonska)
→ Fotoaparat Canon DC 7.4V (Canon, Japonska)
→ Zetasizer Ultra (Malvern, Velika Britanija)
3.2. METODE
3.2.1. Izdelava (psevdo)trikomponentnih faznih diagramov
(Psevdo)trikomponentni fazni diagrami so pomembno orodje za razvoj FO, saj omogočajo prikaz obnašanja različnih faz za izbrani sistem pri konstantni temperaturi in tlaku. Na diagramu lahko prikažemo vse možne zmesi treh sestavin npr.: PAS, oljno in vodno fazo, v obliki enakostraničnega trikotnika (68–70).
Izdelali smo štiri različne (psevdo)trikomponentne fazne diagrame, pri čemer smo uporabili metodo titracije. Začetni brezvodni zmesi površinsko aktivnih snovi in oljen faze , ti. SMES,
