UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ŽIVA TURŠIČ MAGISTRSKA NALOGA ENOVIT MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA Ljubljana, 2022

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ŽIVA TURŠIČ MAGISTRSKA NALOGA

ENOVIT MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

Ljubljana, 2022

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ŽIVA TURŠIČ

SINTEZA N-ACIL-N-(PIPERIDIN-4-ILMETIL)AMINSKIH ZAVIRALCEV IMUNOPROTEASOMA

SYNTHESIS OF N-ACYL-N-(PIPERIDIN-4-YLMETHYL)AMINE IMMUNOPROTEASOME INHIBITORS

FACULTY OF PHARMACY

Ljubljana, 2022

(3)

Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo, na Katedri za farmacevtsko kemijo, pod mentorstvom prof. dr. Aleša Obreze, mag. farm. ter somentorstvom doc. dr.

Izidorja Sosiča, mag. farm. Eksperimentalno delo sem izvajala na fakulteti, v laboratoriju Katedre za farmacevtsko kemijo.

ZAHVALA

Za vso pomoč, nasvete in usmeritve med eksperimentalnim delom magistrske naloge se iskreno zahvaljujem prof. dr. Alešu Obrezi, mag. farm., in somentorju, doc. dr. Izidorju Sosiču, mag. farm.

Posebna zahvala gre tudi Vidu, ki me je razumel v najtežjih trenutkih, me motiviral in vzpodbujal.

Zahvala gre tudi sošolkam in prijateljem, ki so mi bili v času študija v podporo in pomoč.

IZJAVA

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom prof. dr.

Aleš Obreza, mag. farm.

Ljubljana, 2022 Živa Turšič

DIPLOMSKA KOMISIJA

Predsednik: prof. dr. Robert Roškar Mentor: prof. dr. Aleš Obreza Somentor: doc. dr. Izidor Sosič Član: asist. dr. Jasna Omersel

(4)

I

KAZALO VSEBINE

I POVZETEK ... IV II ABSTRACT ... V III SEZNAM OKRAJŠAV ... VI

1. UVOD ... 1

1.1. UBIKVITIN-PROTEASOMSKI SISTEM ... 1

1.2. PROTEASOM ... 2

1.3. IMUNOPROTEASOM ... 3

1.4. IMUNOPROTEASOM IN Z NJIM POVEZANA BOLEZENSKA STANJA ... 4

1.4.1. VNETNE IN AVTOIMUNE BOLEZNI ... 4

1.4.2. RAKAVA OBOLENJA ... 4

1.4.3. BOLEZNI CENTRALNO ŽIVČNEGA SISTEMA IN STARANJE ... 5

1.5. ZAVIRALCI IMUNOPROTEASOMA ... 5

1.5.1. NESELEKTIVNI ZAVIRALCI ... 6

1.5.2. SELEKTIVNI ZAVIRALCI ... 9

2. NAMEN IN NAČRT DELA ... 11

3. MATERIALI IN METODE ... 15

3.1. MATERIALI ... 15

3.1.1. REAGENTI IN TOPILA ... 15

3.1.2. APARATURE IN LABORATORIJSKA OPREMA ... 15

3.2. METODE ... 15

3.2.1. KROMATOGRAFSKE METODE ... 15

3.2.2. SPEKTROSKOPSKE METODE ... 16

3.2.3. DOLOČANJE TEMPERATURE TALIŠČA ... 16

3.2.4. OSTALO ... 16

4. EKSPERIMENTALNI DEL ... 17

4.1. SINTEZA terc-butil 4-(((4-morfolinobenzil)amino)metil)piperidin-1-karboksilata ... 17

4.2. Sinteza derivatov terc-butil 4-(((4-morfolinobenzil)amino)metil)piperidin-1-karboksilata 19 4.2.1. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 19

4.2.2. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)propionamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 21

4.2.3. Sinteza terc-butil 4-((2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 23

4.2.4. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)-4-nitrobenzamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 25

(5)

II

4.2.5. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)butiramido)metil)piperidin-1-

karboksalata ... 27

4.2.6. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)akrilamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 29

4.3. Odstranjevanje zaščitne skupine ... 31

4.3.1. Sinteza N-(4-morfolino benzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida ... 31

4.3.2. Sinteza N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)propionamida diklorida ... 33

4.3.3. Sinteza 2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida 35 4.3.4. Sinteza N-(4-morfolinobenzil)-4-nitro-N-(piperidin-4-ilmetil)benzamida diklorida 37 4.3.5. Sinteza N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)butiramida diklorida ... 39

4.3.6. Sinteza N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4ilmetil)akrilamida diklorida ... 41

5. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 43

5.1. REDUKTIVNO AMINIRANJE ... 43

5.2. N-ACILIRANJE ... 45

5.3. ODSTRANJEVANJE TERC-BUTILKARBAMATNE ZAŠČITNE SKUPINE ... 46

5.4. REZULTATI BIOKEMIJSKEGA OVREDNOTENJA SINTETIZIRANIH SPOJIN .... 47

5.5. IZKORISTKI ... 50

6. SKLEP ... 52

7. LITERATURA ... 53

(6)

III

KAZALO SLIK

Slika 1: Shema delovanja ubikvitin-proteasomskega sistema (prirejeno po 12). ... 2

Slika 2: Struktura jedrnega dela proteasoma in imunoproteasoma (prirejeno po 8). ... 4

Slika 3: Strukturna formula bortezomib ... 6

Slika 4: Strukturna formula karfilzomiba ... 7

Slika 5: Strukturna formula iksazomiba ... 7

Slika 6: Strukturna formula delanzomiba ... 8

Slika 7: Strukturna formula oprozomiba ... 8

Slika 8: Strukturna formula marizomiba ... 9

Slika 9: Strukturna formula ONX 0914 ... 10

Slika 10: Poenostavitev psoralenskega skeleta in shema že sintetiziranih spojin (prirejeno po 5). . 12

Slika 11: Struktura N-(4.morfolinobenzil)-1-(piperidin-4-il)metanamina ... 12

Slika 12: Strukturne formule načrtovanih končnih spojin ... 13

Slika 13: Shema sinteze terc-butil 4-(((4-morfolinobenzil)amino)metil)piperidin-1-karboksilata .. 17

Slika 14: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 19

Slika 15: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)propionamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 21

Slika 16: Shema sinteze terc-butil 4-((2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 23

Slika 17: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)-4-nitrobenzamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 25

Slika 18: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)butiramido)metil)piperidin-1- karboksalata ... 27

Slika 19: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)akrilamido)metil)piperidin-1- karboksilata ... 29

Slika 20: Shema sinteze N-(4-morfolino benzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida ... 31

Slika 21:Shema sinteze N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)propionamida diklorida ... 33

Slika 22: Shema sinteze 2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida ... 35

Slika 23: Shema sinteze N-(4-morfolinobenzil)-4-nitro-N-(piperidin-4-ilmetil)benzamida diklorida ... 37

Slika 24: Shema sinteze N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)butiramida diklorida ... 39

Slika 25: Shema sinteze N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4ilmetil)akrilamida diklorida ... 41

Slika 26: Mehanizem reduktivnega aminiranja (prirejeno po 17, 18). ... 44

Slika 27: Shema mehanizma reakcije N-aciliranja (prirejeno po 20). ... 45

Slika 28: Shema mehanizma rekacije odstranjevanja terc-butilkarbamatne zaščitne skupine (prirejeno po 21). ... 47

KAZALO TABEL

Preglednica I: Rezultati biokemijskega ovrednotenja ... 48

(7)

IV

I POVZETEK

Ubikvitin-proteasomski sistem je v evkariontskih celicah odgovoren za razgradnjo znotrajceličnih proteinov in vzdrževanje njihove homeostaze. Poleg konstitutivnega proteasoma, ki je odgovoren za regulacijo celičnih procesov s selektivno razgradnjo proteinov, poznamo tudi imunoproteasom, ki se nahaja v celicah imunskega izvora in nastane pri vnetju, stresnih in imunskih odzivih. Imunoproteasom ima pomembno vlogo pri razgradnji proteinov, ki so nastali zaradi oksidativnega stresa in vnetnega odziva, ter tako predstavlja pomembno terapevtsko tarčo za zdravljenje vnetnih, rakavih, avtoimunih in nevrodegenerativnih bolezni.

Na trgu je že nekaj zaviralcev proteasoma, ki se uporabljajo za zdravljenje, nekateri pa so v postopku kliničnega preizkušanja. Večina izmed njih je neselektivnih in zavirajo več katalitičnih podenot obeh proteasomov, kar je vzrok za številne neželene učinke. Razvoj zaviralcev imunoproteasoma gre v smer sinteze selektivnih nepeptidnih zaviralcev β5i katalitične podenote imunoproteasoma, saj bi se s tem zmanjšala pojavnost neželenih učinkov, povečala metabolna stabilnost zaviralcev, povečala njihova biološko uporabnost in izboljšale fizikalno-kemijske lastnosti.

V magistrski nalogi smo načrtovali in sintetizirali N-(4-morfolinobenzil)-1-(piperidin-4- il)metanaminske zaviralce, ki so imeli v strukturi elektrofilno »bojno glavo«, namenjeno zaviranju imunoproteasoma preko tvorbe kovalentne vezi s katalitičnim treoninom v β5i podenoti imunoproteasoma.

Po reduktivnem aminiranju ustrezno izbranega amina in aldehida smo dobili vmesni produkt, na katerega smo s postopkom N-aciliranja na nastalo sekundarno aminsko skupino pripenjali različne fragmente, ki so se razlikovali po velikosti in terminalni funkcionalni skupini. Na koncu smo spojinam pod kislimi pogoji odstranili še terc-butilkarbamatno zaščitno skupino. Istovetnost končnih spojin smo potrdili z metodami ¹H NMR, HRMS, IR in z ¹³C NMR. Tako smo uspešno sintetizirali šest končnih spojin, ki smo jih na koncu biokemijsko ovrednotili z merjenjem rezidualne aktivnosti β5i aktivnosti imunoproteasoma v prisotnosti zaviralcev. Nobena od sintetiziranih spojin ni zavirala imunoproteasoma, vendar rezultati pomembno prispevajo k boljšemu razumevanju strukturnih lastnosti zaviralcev tega kemijskega razreda in vplivu strukture na njihovo zaviranje katalitične podenote β5i imunoproteasoma.

Ključne besede: imunoproteasom, elektrofilna »bojna glava«, UPS, zaviralci, podenota β5i

(8)

V

II ABSTRACT

Ubiquitin-proteasome system in eukaryotic cells is the main system responsible for the degradation of intracellular proteins and maintaining their homeostasis. In addition to the constitutive proteasome, which is responsible for regulation of cell processes with selective degradation of proteins, immunoproteasome has also been characterized. It is mainly located in cells of immune origin however, its expression can be induced when inflammation, stressful or autoimmune situations occur. Immunoproteasome has important role in degradation of proteins, which have been modified because of oxidative stress and inflammatory responses, and therefore represents an important therapeutic target for the treatment of inflammatory, cancerous, autoimmune, and neurodegenerative diseases.

There are three proteasome inhibitors present on the market and few additional inhibitors are undergoing clinical trial procedures. Most of them do not distinguish between catalytically active subunits of both proteasomes and this lack of selectivity is the main reason for many side effects of currently available proteasome targeting drugs. Development of immunoproteasome-selective inhibitors is oriented to preparation of non-peptide inhibitors of β5i subunit of immunoproteasome, as this would reduce the incidence of side effects, increase metabolic stability of compounds, increase their bioavailability and improve physicochemical properties.

In the master´s thesis, we designed and synthesized N-(4-morpholinobenzyl)-1-(piperidin-4- yl)methanamine-based inhibitors, which possessed an electrophilic »warhead« in their structure, aimed to form a covalent bond with the catalytic threonine β5i subunit and thus to contribute to inhibition of immunoproteasome significantly.

After reductive amination of the appropriately-substituted amine and aldehyde we obtained the main secondary amine intermediate, which was further N-acylated by attaching various fragments that differed in size and terminal functional group. Finally, tert-butylcarbamate protecting group was removed under acidic conditions. The final compounds were characterized by means of ¹H NMR, HRMS, IR and ¹³C NMR methods. To assess inhibitory activities, we biochemically evaluated six successfully synthesized compounds by measuring the residual β5i activity of the enzyme in the presence of inhibitors. None of the synthesized compound inhibited the immunoproteasome however, the results will contribute to the understanding of structure- activity relationship of this compound class immunoproteasome inhibitors.

Key words: immunoproteasom, electrophilic “warhead”, UPS, inhibitors, β5i subunit

(9)

VI

III SEZNAM OKRAJŠAV

CDCl3 devteriran kloroform

d dublet

DIPEA diizopropiletilamin DMSO dimetilsulfoksid DUB encim deubikvitinaza E1 ubikvitin-aktivirajoči encim E2 ubikvitin-konjugirajoči encim E3 ubikvitin ligaza

ESI elektronrazprševalna ionizacija

FDA Ameriška agencija za hrano in zdravila HR-MS masna spektrometrija visoke ločljivosti IFN-γ interferon γ

IL-23 interlevkin-23 IL-6 interlevkin-6

IR infrardeča spektroskopija IκB zaviralni protein NF-κ J sklopitvena konstanta m multiplet

MF mobilna faza

MHC I poglavitni kompleks tkivne skladnosti MHz megahertz

MS masna spektrometrija

NF-κB transkripcijski jedrni dejavnik κb NMR jedrska magnetna resonanca RA rezidualna aktivnost

s singlet

t triplet

TLC tankoplastna kromatografija TNF-α dejavnik tumorske nekroze alfa Tt temperatura tališča

UPS ubikvitin-proteasomski kompleks

(10)

VII δ kemijski premik

η izkoristek reakcije

(11)

1

1. UVOD

1.1. UBIKVITIN-PROTEASOMSKI SISTEM

Proteostaza ali homeostaza proteinov je proces vzdrževanja ustreznih koncentracij in aktivnosti znotrajceličnih in zunajceličnih funkcionalnih proteinov. Preko različnih mehanizmov se zagotavlja pravilno zvijanje proteinov, razpiranje in razgradnja napačno zvitih ter poškodovanih proteinov. Poznamo dva glavna sistema za razgradnjo proteinov:

razgradnja z lizosomi in z ubikvitin-proteasomskim sistemom (UPS). Proteini z avtofagijo vstopijo v lizosome, kjer se s pomočjo katepsinov razgradijo (1).

UPS je zadolžen za razgradnjo kratko živečih, poškodovanih ali nepravilno zvitih znotrajceličnih proteinov in je sestavljen iz dveh delov. Prvi del zajema ubikvitinacijo oz.

označitev tarčnega proteina z ubikvitinom (slika 1). Pri tem se prek kaskade encimsko kataliziranih reakcij na tarčni protein veže ubikvitinska veriga. Ubikvitin je protein, sestavljen iz 76 aminokislin, ki se lahko kovalentno veže na druge proteine prek lizinskih ostankov (2). V kaskadi pripenjanja ubikvitina na proteine sodelujejo ubikvitin-aktivirajoči encim (E1), ubikvitin-konjugirajoči encim (E2) in ubikvitin-ligaza (E3). Končni produkt prvega dela UPS je tarčni protein, označen s poliubikvitinsko verigo. Nato 26S proteasom prepozna tarčni protein preko poliubikvitinske verige in ga veže na regulatorni 19S del, ki je znan tudi kot Pa700. 19S pomaga tarčnemu proteinu vstopiti v proteolitično mesto proteasoma prek vezave, deubikvitinacije oz. odstranjevanja ubikvitina z encimom deubikvitinazo (DUB) in razvitja. Razvit tarčni protein se premesti v notranjost proteasoma (20S), kjer poteče razgradnja proteina na manjše peptide, velike od tri do 15 aminokislin, ki se sprostijo v citosol za nadaljnjo uporabo ali razgradnjo (1, 3).

(12)

2

20S predstavlja osrednji del UPS in je odgovoren za vzdrževanje homeostaze proteinov, regulacijo različnih celičnih procesov, kot so prevajanje signalov, delovanje celičnega cikla, celična diferenciacija, vnetni odziv, predstavitev antigenov in apoptoza. Najpomembnejša povezava med UPS in vnetjem je povezana s transkripcijskim jedrnim dejavnikom kappa B (NF-κB) (4, 5).

1.2. PROTEASOM

Konstitutivni 26S proteasom je proteolitični kompleks, ki se nahaja v citoplazmi in jedru celic. Sodeluje pri uravnavanju selektivne razgradnje proteinov v evkariontskih celicah.

Njegova proteolitična funkcija je del UPS, ki razgradi poliubikvitinirane substrate v kratke peptide (3,6).

26S je zgrajen iz 20S jedra v obliki sodčka in iz dveh 19S regulatornih delov na vsakem koncu 20S. 20S je katalitični kompleks, v katerem poteka razgradnja tarčnih proteinov in je sestavljen iz štirih podenot, razporejenih v obliki štirih obročev. Zunanja obroča α sta sestavljena iz sedmih podenot α, ki so zadolžene za interakcijo z regulatornim delom, vezavo substratov in njihovo premestitev v katalitično jedro. N-terminalni konci obročev α tvorijo ozek prehod, ki nadzoruje vstop substratov v jedro. Katalitično jedro se nahaja v notranjih dveh obročih β, sestavljenih iz sedmih podenot β, ki so oštevilčene glede na njihov položaj v obroču. Izmed sedmih podenot β vsebujejo tri podenote katalitične treoninske ostanke, ki so odgovorni za nukleofilni napad v aktivnem mestu, in sicer podenota β1 ima kaspazi

Slika 1: Shema delovanja ubikvitin-proteasomskega sistema (prirejeno po 12).

(13)

3

podobno, podenota β2 ima tripsinu podobno in podenota β5 kimotripsinu podobno katalitično delovanje (1, 3, 6, 7).

Regulatorni del 19S prepozna poliubikvitinirane proteinske substrate in je odgovoren za njihovo deubikvitinacijo, razvijanje in premestitev v katalitično jedro za razgradnjo (3).

Proteasomska aktivnost je glede na celične potrebe dinamično regulirana (2).

1.3. IMUNOPROTEASOM

Imunski ali stresni odziv z vnetnimi citokini, kot sta interferon γ (INF-γ) in dejavnik tumorske nekroze (TNF-α), spodbudi zamenjavo podenot β 20S z inducibilnimi podenotami β1i (LMP-2), β2i (MECL-1) in β5i (LMP-7) (slika 2). β2i in β5i imata podobno delovanje kot β2 in β5 pri konstitutivnemu proteasomu, β1i pa ima namesto kaspazi podobne katalitične aktivnosti kimotripsinu podobno aktivnost. Regulatorni del 19S je sestavljen iz PA28-α in PA28-β. Tako spremenjenemu proteasomu pravimo imunoproteasom (1, 8).

Spremembe v podenotah β vodijo do sprememb v proteolitični specifičnosti oz. do povečane kimotripsinske aktivnosti. Imunoproteasom tako povzroči nastanek več peptidov s hidrofobnim C-terminalnim ostankom, ki jih kot antigene lahko predstavi molekulam MHC razreda I. Molekule MHC razreda I lahko naprej predstavijo antigenske peptide citotoksičnim limfocitom T in tako sprožijo imunski odziv (1, 4). Poleg predstavitve antigenov ima dodatno funkcijo pri širjenju in preživetju limfocitov T, pri diferenciaciji celic pomagalk, nastajanju vnetnih citokinov in avtoimunih boleznih (9).

V primerjavi s konstitutivnim proteasomom se imunoproteasom hitreje odzove na vnetje in bolj učinkovito razgradi poliubikvitinirane proteine med vnetnim odzivom in oksidativnim stresom. Z učinkovitejšim delovanjem prepreči celično smrt, saj prepreči akumuliranje proteinskih agregatov. Konstitutivni proteasom je v vseh evkariontskih celicah, imunoproteasom pa predvsem v celicah hematopoetskega izvora. V ostalih celicah nehematopoetskega izvora se imunoproteasom lahko pojavi zaradi indukcije z INF-γ ali TNF-α (1, 3, 4).

(14)

4

Slika 2: Struktura jedrnega dela proteasoma in imunoproteasoma (prirejeno po 8).

1.4. IMUNOPROTEASOM IN Z NJIM POVEZANA BOLEZENSKA STANJA

Zvišana imunoproteasomska aktivnost in povečano izražanje imunoproteasoma v celicah sta značilni za nekatera bolezenska stanja, kot so avtoimune bolezni, nevrodegenerativne bolezni in rakava obolenja. Vnetje je del mehanizma razvoja avtoimunih in nevrodegenerativnih bolezni, zato sta povečano izražanje in spremenjena aktivnost imunoproteasoma verjetno posledica vnetja. Vpletenost imunoproteasoma v bolezenske procese tako predstavlja pomembno terapevtsko tarčo za zdravljenje (1, 5, 8).

1.4.1. VNETNE IN AVTOIMUNE BOLEZNI

Vpletenost UPS v različne celične procese, kot so celična regulacija, apoptoza in predstavitev antigenov, predstavlja pomembno vlogo pri razvoju in napredovanju vnetnih in avtoimunih bolezni. Dlje časa povišane vrednosti vnetnih citokinov vodijo v kronično vnetje, prav tako pa prispevajo k nastanku imunoproteasoma. Povečana ekspresija imunoproteasoma je prisotna pri ulceroznem kolitisu, Crohnovi bolezni, kronični vnetni črevesni bolezni, revmatoidnem artritisu, hepatitisu, multipli sklerozi in sistemskem eritematoznem lupusu. Zaradi tega se pojavlja vprašanje, ali je povečana ekspresija imunoproteasoma vzrok za vnetne bolezni ali posledica velike sinteze citokinov in celičnega stresa. Raziskava na miših je sicer pokazala, da ima imunoproteasom obrambno vlogo pri razvoju avtoimunosti, saj ima večjo katalitično aktivnost kot konstitutivni proteasom in s tem pripomore k preprečevanju akumuliranja razgrajenih substratov ter agregaciji proteinov (5, 10).

1.4.2. RAKAVA OBOLENJA

Rakave celice imajo zvišano proteasomsko aktivnost v primerjavi z zdravimi celicami zaradi hitre celične proliferacije, zvišanega oksidativnega stresa in zvišanih vrednosti vnetnih

(15)

5

citokinov. Med različnimi vrstami raka obstajajo odstopanja v ekspresiji imunoproteasoma.

Ekspresija imunoproteasoma je povečana pri multiplem mielomu, raku prostate in raku pljuč. Raziskave kažejo, da selektivni zaviralci imunoproteasoma pomagajo pri zdravljenju bolje kot neselektivni, kar nakazuje na pomembno vlogo imunoproteasoma pri razvoju rakavih obolenj (5).

1.4.3. BOLEZNI CENTRALNO ŽIVČNEGA SISTEMA IN STARANJE

Bolezni centralno živčnega sistema povezujemo z nabiranjem proteinskih agregatov zaradi neravnovesja med proteinsko sintezo in razgradnjo. Ekspresija imunoproteasoma je pri teh boleznih povišana. Na živalskih modelih nevrodegenerativnih bolezni, kot so Alzheimerjeva bolezen, Huntingtonova bolezen in amiotrofična lateralna skleroza, so študije potrdile povišano ekspresijo podenot β1i in β5i. Zaradi kroničnega vnetja se povečuje tudi ekspresija imunoproteasoma s starostjo. Imunoproteasom ter konstitutivni proteasom imata sicer ključno vlogo pri odstranjevanju oksidiranih in poškodovanih proteinov, kar potrjuje njuni vlogi pri staranju in nevrodegenerativnih boleznih (5).

Vnetje lahko privede do motenj v homeostazi proteinov, indukcije reaktivnih kisikovih zvrsti, oksidativnih modifikacij in napačnega zvijanja proteinov. Dlje trajajoče vnetje lahko privede do kroničnih vnetnih bolezni. V centralno-živčnem sistemu so astrociti in mikroglia glavni vir vnetja. Zaradi vnetja lahko pride do nevrotoksičnega okolja. Nevroni so nedeleče celice in imajo omejeno regenerativno sposobnost, zato lahko povečano odmiranje nevronov v centralno-živčnem sistemu privede do motoričnih, kognitivnih in spominskih motenj, ki jih tipično vidimo pri pacientih s Parkinsonovo in Alzheimerjevo boleznijo.

1.5. ZAVIRALCI IMUNOPROTEASOMA

Povečano ekspresijo imunoproteasoma povezujemo z nevrodegenerativnimi boleznimi, rakavimi obolenji ter vnetnimi in avtoimunimi boleznimi, zato zaviranje imunoproteasoma predstavlja možnost za zdravljenje naštetih bolezni (1). Razvite so bile številne majhne molekule zaviralcev proteasoma, vključno z bortezomibom, iksazomibom in karfilzomibom, ki so bili odobreni s strani Ameriške agencije za hrano in zdravil (FDA). Večina teh molekul je modificiranih peptidov z vezano elektrofilno »bojno glavo« na C-terminalnem koncu.

Mehanizem zaviranja razložimo tako, da nukleofilni N- terminalni treonin, ki je sestavni del aktivnega mesta proteasoma, napade elektrofilni del zaviralca in z njim tvori kovalentno vez (5). Zaviralce lahko glede na elektrofilni del razdelimo v sedem skupin: aldehide, vinil sulfone, vinilamide, boronate, epoksiketone, α-ketoaldehide in β-laktone (10). Kljub

(16)

6

boljšemu prileganju aktivnemu mestu peptidna struktura zaviralcev predstavlja težavo, saj imajo zaradi nje te molekule majhno biološko razpoložljivost in slabo metabolično stabilnost. Zaradi tega se je razvoj zaviralcev usmeril v nepeptidne strukture, saj tako lahko izboljšamo farmakokinetične in farmakodinamične lastnosti (4).

1.5.1. NESELEKTIVNI ZAVIRALCI

Neselektivni zaviralci zavirajo tako imunoproteasom kot konstitutivni proteasom in zaradi tega lahko povzročajo številne neželene učinke (4).

1.5.1.1. Bortezomib

Bortezomib (slika 3) je FDA leta 2003 odobrila za zdravljenje multiplega mieloma in trdnih tumorjev. Je boronski dipeptid in reverzibilno zavira proteasomski podenoti β5 in β1 ter tudi imunoproteasomski β5i in β1i (5, 8). Bortezomib zmanjša proliferacijo, inducira apoptozo in izboljša delovanje kemoterapije preko zaviranja NF- κB. Zaradi delovanja na NF-κB ima

neposreden vpliv na vnetno pot, saj z regulacijo IκB, ki zavira pretvorbo NF-κB iz neaktivne v aktivno obliko, vplivamo na NF-κB in patološke procese, ki so s tem povezani (8).

Slabost bortezomiba so številni neželeni učinki, kot na primer periferna nevropatija, pancitopenija, pljučni edem, gastrointestinalne težave (diareja), trombocitopenija (10). Poleg številnih neželenih učinkov je problematičen tudi pojav rezistence na bortezomib (11).

Celice, ki so rezistentne na bortezomib, imajo lahko povečano ekspresijo proteasomskih podenot β5. Drugi možni mehanizem nastanka rezistence je povezan z mutacijo gena PSBM5. Mutacija privede so spremembe aminokislinskega zaporedja v vezavnem žepu in bortezomib se tako ne more več vezati vanj (12). Apliciramo ga intravensko (10).

Slika 3: Strukturna formula bortezomib

(17)

7 1.5.1.2. Karfilzomib

Karfilzomib (slika 4) je tetrapeptidni zaviralec proteasoma in je glede na »bojno glavo«

derivat epoksiketona, ki je bil leta 2012 odobren s strani FDA za zdravljenje multiplega mieloma.

Delovanje proteasoma zavira ireverzibilno s tvorbo morfolinskega obroča med C- terminalnim koncem epoksiketona

in treoninskim ostankom proteasoma. Zavira proteasomsko podenoto β5 in imunoproteasomsko podenoto β5i (5). Apliciramo ga intravensko (10).

1.5.1.3. Iksazomib ali MLN9708 Iksazomib (slika 5) je odobren kot zdravilo in se uporablja kot predzdravilo v obliki estra (iksazomibcitrat), ki v telesu hidrolizira do aktivnega derivata boronske kisline MLN2238, ki se veže reverzibilno na proteasom. Močno zavira podenoto β5, v višjih odmerkih pa tudi β1 in β2.

Uporablja se v kombinirani terapiji za

zdravljenje multiplega mieloma. Aplicira se peroralno, za razliko od bortezomiba in karfilzomiba, ki ju apliciramo intravensko (5, 12).

Slika 4: Strukturna formula karfilzomiba

Slika 5: Strukturna formula iksazomiba

(18)

8 1.5.1.4. Delanzomib

Delanzomib (slika 6) je ireverzibilni zaviralec proteasoma, ki se na tarčo veže s pomočjo boronatne skupine.

Trenutno je v kliničnih preizkušanjih za zdravljenje multiplega mieloma. Ima manj neželenih učinkov kot

bortezomib, primeren je za peroralno aplikacijo, deluje na celice, ki so razvile odpornost na bortezomib, deluje na osteoklaste in tako zavira kostno razgradnjo pri multiplem mielomu (5). Apliciramo ga peroralno (10).

1.5.1.5. Oprozomib ali ONX 0912 Oprozomib (slika 7) je tripeptidni

epoksiketonski zaviralec proteasoma, ki ga apliciramo peroralno. Trenutno je v kliničnih preizkušanjih za zdravljenje hematoloških rakavih obolenj in trdnih tumorjev. Zavira proteasomsko podenoto β5 in imunoproteasomsko podenoto β5i. Zaradi svoje metabolične

nestabilnosti, slabe biološke razpoložljivosti in majhne permeabilnosti čez biološke membrane je karfilzomib služil kot spojina vodnica za sintezo oprozomiba (5).

Slika 6: Strukturna formula delanzomiba

Slika 7: Strukturna formula oprozomiba

(19)

9 1.5.1.6. Marizomib ali NPI-0052

Marizomib (slika 8) je ne-peptidni zaviralec z β-laktonskim elektrofilnim fragmentom. Zaradi bicikličnega obroča ima edinstven mehanizem ireverzibilnega zaviranja in je zaradi tega tudi močnejši zaviralec od bortezomiba. Deluje na podenoti β2 in β5. Trenutno je v kliničnih testiranjih za zdravljenje levkemij, multiplega mieloma in trdnih tumorjev (5). Apliciramo ga peroralno (10).

1.5.2. SELEKTIVNI ZAVIRALCI

Številni neželeni učinki pri hkratnem zaviranju katalitičnih podenot konstitutivnega proteasoma in imunoproteasoma so privedli do sinteze zaviralcev, ki selektivno zavirajo samo katalitične podenote imunoproteasoma. Večina selektivnih zaviralcev ima peptidno strukturo in zmanjšajo nastanek provnetnih citokinov, kot so IL-6, INF-γ, TNF-α in IL-23.

Razdelimo jih lahko v dve kategoriji, in sicer v selektivne zaviralce β1i in β5i (4, 5).

1.5.2.1. UK-101

UK-101 je bil prvi selektivni zaviralec podenote β1i s peptidno epoksiketonsko strukturo, ki ne vpliva na aktivnost konstitutivnega proteasoma. Po strukturi je zelo podoben eponemicinu, ki je bolj lipofilen derivat epoksimicina. Inducira apoptozo celic pri raku prostate. Rezultati raziskav so pokazali, da je pri različnih tipih raka povečana ekspresija podenot β1i v rakavih celicah (5).

1.5.2.2. IPSI-001

IPSI-001 je selektivni zaviralec podenote β1i. Ima kar 100-krat večjo selektivnost vezave na β1i kot na β1. Deluje na maligne celice hematološkega izvora in inducira apoptozo v celicah multiplega mieloma, akutne mieloblastne levkemije in kronične limfocitne levkemije, vključno s tistimi celicami, ki so razvile rezistenco na bortezomib. Prav tako je tudi manj toksičen za ne-maligne celice v primerjavi z bortezomibom (5, 13).

1.5.2.3. YU-102

YU-102 je tetrapeptidni zaviralec z epoksiketonsko strukturo in zavira delovanje podenote β1i. Strukturno se razlikuje od drugih selektivnih zaviralcev β1i, saj ima v svoji strukturi aminokislino prolin, ki s svojo rigidnostjo vpliva na geometrijo molekule (5).

Slika 8: Strukturna formula marizomiba

(20)

10 1.5.2.4. ONX 0914 (PR-957)

ONX 0914 (slika 9) je tripeptid z epoksiketonsko strukturo in je bil prvi znani selektivni zaviralec podenote β5i. Na podenoto β5i se veže z 20- do 40-krat večjo jakostjo kot na podenoto β5.

Predstavlja obetavno molekulo za zdravljenje

vnetnih in avtoimunih bolezni, saj prepreči nastajanje vnetnih citokinov, kot sta TNF-α, IFN- γ in IL-23 v aktiviranih monocitih, zavre napredovanje bolezni in razvoj številnih simptomov. Izkazalo se, da je bolj učinkovit za zdravljenje revmatoidnega artritisa kot etanercept, zaradi blokade nastajanja IL-23 in sekrecije TNF-α. Je enako učinkovit kot bortezomib in karfilzomib, a z manj sistemsko izraženimi neželenimi učinki od njiju. Zaradi vseh naštetih ugotovitev podenota β5i predstavlja obetavno strategijo zdravljenja vnetnih in avtoimunih bolezni, kot so revmatoidni artritis, kronična vnetna črevesna bolezen, sistemski eritromatozni lupus in Hashimotov tiroiditis (5, 9). Apliciramo ga intravensko (10).

1.5.2.5. PR-924

PR-924 je tripeptidni selektivni zaviralec β5i z epoksiketonsko skupino, ki je strukturno podoben ONX 0914. Selektivnost do podenote β5i je kar 100-krat večja kot do podenote β5.

Je v fazi kliničnih testiranj za zdravljenje multiplega mieloma in deluje tako, da povzroči apoptozo celic (5). Lahko povzroči smrt v celicah mieloma, ki so odporne na doksorubicin in deksametazon (13). Apliciramo ga intravensko (10).

Slika 9: Strukturna formula ONX 0914

(21)

11

2. NAMEN IN NAČRT DELA

Namen magistrske naloge je na podlagi že znanih in sintetiziranih spojin načrtovati in pripraviti novo serijo selektivnih zaviralcev katalitične podenote β5i imunoproteasoma.

Izhajali smo iz spojin, ki so že bile sintetizirane na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo v Ljubljani, kjer se že nekaj let ukvarjajo s sintezo selektivnih zaviralcev imunoproteasoma z nepeptidnim skeletom. Namen takšnega pristopa je odkriti spojine z dobrimi fizikalno-kemijskimi in farmakokinetičnimi lastnostmi, saj so spojine s peptidno strukturo metabolno nestabilne, imajo kratek razpolovni čas in slabo biološko uporabnost.

Poleg tega želimo sintetizirati selektivne zaviralce in s tem zmanjšati verjetnost pojava neželenih učinkov, ki jih imajo neselektivni zaviralci.

Najprej so s pomočjo molekulskega modeliranja in virtualnega rešetanja prišli do psoralenskega skeleta (4), na katerega so pripenjali različne elektrofilne »bojne glave«. Ker je imel psoralen določene slabosti, so skelet spojin tega razreda želeli poenostaviti. S pomočjo programske opreme BROOD in s pomočjo računalniško podprtega načrtovanja molekul s sidranjem spojin v aktivno mesto posameznih podenot imunoproteasoma so kot možno zamenjavo identificirali substituiran piperidinski skelet (slika 10) (15). Namen naše magistrske naloge je bil na podlagi že sintetiziranih spojin načrtovati in optimizirati zaviralno aktivnost novih spojin s piperidinskim strukturnim skeletom. Osnovni skeleti že sintetiziranih spojin so prikazani na sliki 10.

(22)

12

Odločili smo se za sintezo spojin s strukturo N-(4-morfolinobenzil)-1-(piperidin-4- il)metanamina (slika 11). Morfolinski obroč, s katerim smo zamenjali monosubstituiran benzen, ohranja podobno prostorsko zgradbo, sočasno pa lahko kisik ter dušik tvorita vodikove vezi z molekulami vode, kar izboljša vodotopnost.

Slika 10: Poenostavitev psoralenskega skeleta in shema že sintetiziranih spojin (prirejeno po 5).

Slika 11: Struktura N-(4.morfolinobenzil)-1-(piperidin-4- il)metanamina

(23)

13

V prvem koraku eksperimentalnega dela bomo z reduktivnim aminiranjem pripravili terc- butil 4-(((4-morfolinobenzil)amino)metil)piperidin-1-karboksilat, ki nam bo služil kot sekundarni amin, na katerega bomo z nukleofilno substitucijo pripeli različne stranske skupine preko tvorbe amidne vezi ter s tem dobili različne spojine. Ta del molekule bo v več primerih služil kot elektrofilna »bojna glava«, saj je znano, da je tovrstna podstruktura pomembna za interakcijo s treoninom v aktivnem mestu katalitičnih podenot imunoproteasoma. Za sintezo stranskih skupin bomo uporabili acetanhidrid, propionil klorid, cianoocetno kislino, 4-nitrobenzoil klorid, butiril klorid in akriloil klorid (slika 12).

Spremembe stranskih skupin bodo lahko vplivale na jakost vezave v aktivno mesto ustrezne podenote imunoproteasoma in učinkovitost njegovega zaviranja. S tem bomo lahko dobili vpogled v odnos med strukturo in delovanjem sintetiziranih spojin ter ocenili ustreznost

»bojnih glav« v sami strukturi spojin.

V zadnjem koraku eksperimentalnega dela bomo z acidolizo odstranili Boc zaščitno skupino iz piperidina, ter tako dobili načrtovane spojine (slika 12).

Slika 12: Strukturne formule načrtovanih končnih spojin

(24)

14

V sodelovanju s Katedro za klinično biokemijo na Fakulteti za farmacijo bomo sintetizirane končne spojine biokemijsko ovrednotili in jim določili rezidualno aktivnost. S tem bomo določili, ali naše spojine zavirajo katalitično podenoto β5i humanega imunoproteasoma.

Naša delovna hipoteza je, da bodo z upoštevanjem računalniškega načrtovanja pripravljene spojine z N-(4-morfolinobenzil)-1-(piperidin-4-il)metanaminskim skeletom imele večjo jakost in selektivnost delovanja na podenoti β1i in β5i imunoproteasoma.

(25)

15

3. MATERIALI IN METODE 3.1. MATERIALI

3.1.1. REAGENTI IN TOPILA

Pri izvedbi eksperimentalnega dela smo uporabljali reagente, topila in kemikalije proizvajalcev Acros Organics in Sigma-Aldrich. Uporabili smo tudi prečiščeno in demineralizirano vodo na Fakulteti za farmacijo.

3.1.2. APARATURE IN LABORATORIJSKA OPREMA

Uporabljali smo laboratorijsko opremo: rotavapor Büchi Waterbath B-480, tehtnico Kern EG220-3NM, UV-detektor CAMAG UV-cabinet II, magnetna mešala in steklovino.

3.2. METODE

3.2.1. KROMATOGRAFSKE METODE

3.2.1.1. TANKOPLASTNA KROMATOGRAFIJA (TLC)

Sintetizirane spojine smo identificirali s tankoplastno kromatografijo. Prav tako smo TLC uporabili za spremljanje poteka reakcij, spremljanje čiščenja s kolonsko kromatografijo, spremljanje izolacije in za iskanje primerne mobilne faze za kolonsko kromatografijo. Za stacionarno fazo naših TLC-analiz smo uporabili TLC-plošče Silica gel 60 F254 proizvajalca Merck z 0,2 mm nanosom silikagela na aluminijastem nosilcu. Silikagelu je dodan fluorescentni indikator. Plošče smo razvijali v različnih mobilnih fazah, ki so navedene ob posamezni spojini. Največkrat uporabljena kombinacija je bila CH2Cl2 in MeOH. Spojine smo zaznali pod UV-svetilko CAMAG UV-cabinet II, pri valovni dolžini 254 nm. Kot orositveni reagent smo uporabili ninhidrin.

3.2.1.2. KOLONSKA KROMATOGRAFIJA

Spojine vmesnih stopenj in končne spojine smo čistili z uporabo kolonske kromatografije.

Pri tem smo uporabili različne velikosti in debeline steklenih kolon. Izbira velikosti kolone je bila odvisna od količine vzorca, ki smo ga čistili. Silica Gel 20 proizvajalca Merc, z velikostjo por 0,04-0,063 mm nam je služil kot stacionarna faza v vseh primerih. Izbrane mobilne faze so navedene pri posamezni spojini. Največkrat uporabljena kombinacija je bila CH2Cl2 in MeOH. S TLC smo preverjali čistost zbranih frakcij. Primerne frakcije smo združili in topilo uparili pod znižanim tlakom na rotavaporju.

(26)

16 3.2.2. SPEKTROSKOPSKE METODE

3.2.2.1. JEDRSKA MAGNETNA RESONANCA (NMR)

Spojinam smo posneli ¹H in ¹³C spektre na spektrometru Bruker Avance III 400 na Fakulteti za farmacijo. Vzorce smo raztopili v devteriranih topilih DMSO-d6 in CDCl3. Kot interni standard smo uporabili TMS. Za procesiranje posnetih spektrov smo uporabili računalniški program MestRec-C. Sklopitvene konstante (J) so podane v Hz, kemijski premiki spojin (δ) pa v ppm.

3.2.2.2. MASNA SPEKTROMETRIJA (MS, HR-MS)

Meritve so bile opravljene na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani. Na spektrometru Advion expression CMLS smo z Esi tehniko posneli masne spektre spojin (MS). Na spektrometru Exactive^TM Plus Orbitrap MassSpectrometer smo posneli masne spektre visoke ločljivosti (HR-MS) spojin.

3.2.2.3. INFRARDEČA SPEKTROSKOPIJA (IR)

Spojinam smo posneli IR-spektre na spektrometru PerkinElmer Spectrum BX System FT- IR z uporabo ATR-tehnike. Meritve so bile posnete na Fakulteti za farmacijo.

3.2.3. DOLOČANJE TEMPERATURE TALIŠČA

Sintetiziranim končnim spojinam smo določili temperaturo tališč s Kofflerjevim mikroskopom z ogrevalno mizico, proizvajalca Leica. Meritve so bile opravljene na Fakulteti za farmacijo.

3.2.4. OSTALO

3.2.4.1. RAČUNALNIŠKA PROGRAMSKA OPREMA

Za risanje struktur spojin, sinteznih shem in poimenovanje spojin po IUPAC-nomenklaturi smo uporabljali program proizvajalca CambridgeSoft ChemDraw Professional 16.0. Spektre smo obdelali s programom MestRec-C proizvajalca MestreclabResearch S.L. Literaturo in vire smo iskali v spletni bazi podatkov PubMed, SciFinder in ScienceDirect.

(27)

17

4. EKSPERIMENTALNI DEL

4.1. SINTEZA terc-butil 4-(((4-morfolinobenzil)amino)metil)piperidin- 1-karboksilata

Sintezni postopek

Najprej smo natehtali terc-butil 4-(aminometil)piperidin-1-karboksilat (1) (500 mg, 2,33 mmol). V suho bučko smo dali 10-odstotni presežek 4-morfolinobenzaldehida (2) (490,8 mg, 2,57 mmol) in dolili 30 mL MeOH. V bučko smo nato dodali predhodno natehtano spojino 1. Raztopina se je obarvala rumeno. Segrevali smo na oljni kopeli 2,5 ure pri 50 °C v argonovi atmosferi. Po 2,5 ure smo razvili TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 9:1) in orosili z ninhidrinom. Vsebino bučke smo ohladili na ledu in dodali 2 ekvivalenta NaBH4 (180 mg, 4,76 mmol). Rekcijo smo pustili mešati pri sobni temperaturi čez noč. Naslednji dan smo zmesi dodali 3 mL vode. Odstranili smo magnet in MeOH uparili pod znižanim tlakom.

Ostanek smo raztopili v 60 mL CH2Cl2 in nato ekstrahirali s 30 mL vode. Organsko fazo smo sprali z nasičeno raztopino NaCl (30 mL), sušili z Na2SO4 in topilo uparili pod znižanim tlakom. Produkt smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1). Dobili smo trdno, rahlo rumeno obarvano spojino.

SPOJINA 4

Ime: terc-butil 4-(((4-morfolinobenzil)amino)metil)piperidin-1-karboksilat Opis: trdna rahlo rumena snov

Slika 13: Shema sinteze terc-butil 4-(((4-morfolinobenzil)amino)metil)piperidin-1-karboksilata

(28)

18

Molekulska formula/molekulska masa: C22H35N3O3/389,54 g/mol Izkoristek reakcije: 97 %

TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1) Rf= 0,33, orositveni reagent: ninhidrin

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,02-1,15 (m, 2H, CH2), 1,45 (s, 9H, CH3), 1,50-1,63 (m, 1H, CH), 1,70 (d, 2H, J=4,2 Hz, CH2), 2,50 (d, 2H, J=4,2 Hz, CH2), 2,68 (t, 2H, J=12,0 Hz, CH2), 3,14 (t, 4H, J=4,2 Hz, CH2), 3,70 (s, 2H, CH2), 3,86 (t, 4H, J=4,2 Hz, CH2), 4,08 (m, 2H, CH2), 4,61 (m, 1H, NH), 6,88 (d, 2H, J=8,0 Hz, Ar-H), 7,22 (d, 2H, J=8,0 Hz, Ar-H) MS (ESI+): m/z: 390,2 ([M+H]⁺)

IR (cm^-1): 2982, 2965, 2921, 2856, 2827, 1677, 1614, 1513, 1448, 1421, 1376, 1364, 1332, 1305, 1282, 1258, 1236, 1212, 1165, 1141, 1120, 1092, 1083, 1054, 1010, 986, 969, 925, 864, 810, 791, 770, 631, 522

(29)

19

4.2. Sinteza derivatov terc-butil 4-(((4- morfolinobenzil)amino)metil)piperidin-1-karboksilata

4.2.1. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1- karboksilata

V bučko smo natehtali 150 mg spojine 4 (0,385 mmol) in jo raztopili v 5 mL CH2Cl2. Dodali smo 0,2 mL diizopropiletilamina (DIPEA) (1,15 mmol, 3 ekv.) in 0,1 mL acetanhidrida (5) (1,058 mmol, 2,75 ekv.). Reakcijsko zmes smo mešali 1 uro pri sobni temperaturi. Po 1 uri smo razvili TLC-kromatogram (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1) in orosili z ninhidrinom. Zmes v bučki smo dopolnili do 25 mL s CH2Cl2 in vse skupaj prenesli v lij ločnik. Nato smo ekstrahirali s 15 mL 10-odstotne citronske kisline. Organsko fazo smo sprali s 15 mL NaHCO3, 15 mL nasičene raztopine NaCl, sušili z Na2O4 in topilo uparili pod znižanim

Slika 14: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1-karboksilata

(30)

20

tlakom. Produkt smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1). Dobili smo viskozno tekočino bledo rumene barve.

SPOJINA 6

Ime: terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1-karboksilat Opis: viskozna tekočina bledo rumene barve

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,00-1,22 (m, 2H, CH2), 1,44 in 1,46 (2 s, 9H CH3), 1,51- 1,65 (m, 2H, CH, CH2), 1,70-1,89 (m, 1H, CH2), 2,13 in 2,15 (2 s, 3H, CH3), 2,51-2,70 (m, 2H, CH2), 3,15 (m, 4H, CH2), 3,49 (s, 2H, CH2), 3,86 (m, 4H, CH2), 3,92-4,20 (m, 2H, CH2), 4,46 in 4,54 (2s, 2H, CH2), 6,83-6,92 (2 m, 2H, Ar-H), 7,04-7,16 (2 m, 2H, Ar-H)

HR-MS: m/z za C24H37N3O4 ([M+H]⁺): izračunano 432.2857, izmerjeno 432.2853

IR (cm^-1): 2952, 2916, 2875, 2838, 1684, 1644, 1519, 1455, 1377, 1236, 1162, 973, 931, 809, 617, 557, 542

(31)

21

4.2.2. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)propionamido)metil)piperidin-1- karboksilata

V bučko smo natehtali 149 mg spojine 4 (0,382 mmol) in jo raztopili v 5 mL CH2Cl2. Dodali smo 0,2 mL DIPEA (1,15 mmol, 3 ekv.) in 0,1 mL propionil klorida (7) (1,15 mmol, 3 ekv.).

Reakcijsko zmes smo mešali 1 uro pri sobni temperaturi. Po 1 uri smo razvili TLC (MF=

CH2Cl2: MeOH= 9:1) in orosili z ninhidrinom. Zmes v bučki smo dopolnili do 25 mL s CH2Cl2 in vse skupaj prenesli v lij ločnik. Nato smo ekstrahirali s 15 mL 10-odstotne citronske kisline. Organsko fazo smo sprali s 15 mL NaHCO3, 15 mL nasičene raztopine NaCl, sušili z Na2SO4 in topilo uparili pod znižanim tlakom. Produkt smo očistili s kolonsko

Slika 15: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)propionamido)metil)piperidin-1-karboksilata

(32)

22

kromatografijo (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1). Dobili smo viskozno tekočino bledo rdeče barve.

SPOJINA 8

Ime: terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)propionamido)metil)piperidin-1-karboksilat Opis: viskozna tekočina bledo rdeče barve

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,02-1,26 (m, 5H, CH2, CH3), 1,44 in 1,46 (2 s, 9H, CH3), 1,56-1,65 (m, 2H, CH, CH2), 1,72-1,80 (m, 1H, CH2), 2,31-2,43 (m, 4H, CH2), 2,54-2,73 (m, 2H, CH2), 3,14 (m, 4H, CH2), 3,86 (m, 4H, CH2), 4,00-4,18 (m, 2H, CH2), 4,47 in 4,55 (2s, 2H, CH2), 6,84-6,90 (2 m, 2H, Ar-H), 7,00-7,04 in 7,13-7,16 (2 m, 2H, Ar-H)

IR (cm^-1): 2973, 2928, 2855, 1684, 1640, 1516, 1448, 1420, 1365, 1261, 1238, 1213, 1161, 1122, 1069, 1028, 967, 927, 863, 810, 770, 729, 645

(33)

23

4.2.3. Sinteza terc-butil 4-((2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin- 1-karboksilata

Najprej smo natehtali 201 mg spojine 4 (0,516 mmol). V bučko smo natehtali 10-% pribitek cianoocetne kisline 9 (48,3 mg, 0,568 mmol), TBTU (202 mg, 0,624 mmol), 0,25 mL DIPEA (1,44 mmol, 2,79 ekv.) in 10 mL CH2Cl2. Reakcijsko zmes smo mešali 1 uro pri sobni temperaturi. Po 1 uri mešanja smo v bučko dodali natehtano spojino 4, ki smo jo predhodno raztopili v 5 mL CH2Cl2. Pustili smo mešati čez vikend na sobni temperaturi. Po 2 dneh smo razvili TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 9:1) in orosili z ninhidrinom. Ostanek v bučki smo raztopili v 15 mL CH2Cl2 in dvakrat ekstrahirali s 15 mL 10-odstotne citronske kisline.

Organsko fazo smo nato sprali s 15 mL NaHCO3, 15 mL nasičene raztopine NaCl, sušili z Na2SO4 in topilo uparili pod znižanim tlakom. Produkt smo očistili s kolonsko

Slika 16: Shema sinteze terc-butil 4-((2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1- karboksilata

(34)

24

kromatografijo (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1). Dobili smo viskozno tekočino bledo rumene barve.

SPOJINA 10

Ime: terc-butil 4-((2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)acetamido)metil)piperidin-1-karboksilat Opis: viskozna tekočina bledo rumene barve

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,00-1,22 (m, 2H, CH2), 1,43 in 1,45 (2 s, 9H, CH3), 1,51- 1,73 (m, 2H, CH, CH2), 1,75-1,86 (m, 1H, CH2), 2,54-2,67 (m, 2H, CH2), 3,07 (s, 2H, CH2), 3,16 (m, 4H, CH2), 3,49 (s, 2H, CH2), 3,84 (m, 4H, CH2), 4,00-4,13 (m, 2H, CH2), 4,50-4,68 (m, 2H, CH2), 6,76-6,88 (m, 2H, Ar-H), 7,04-7,11 in 7,26-7,31 (2 m, 2H, Ar-H)

IR (cm^-1): 3388, 2969, 2855, 2817, 2727, 2523, 2450, 1749, 1684, 1604, 1519, 1426, 1364, 1268, 1240, 1164, 1122, 1066, 1030, 967, 925, 824, 766, 631, 521

(35)

25

4.2.4. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)-4-nitrobenzamido)metil)piperidin- 1-karboksilata

V bučko smo natehtali 200 mg spojine 4 (0,513 mmol) in jo raztopili v 5 mL CH2Cl2. Dodali smo 0,2 mL DIPEA (1,15 mmol, 2,24 ekv.). Glede na množino spojine 4 smo dodali 10- odstotni presežek 4-nitrobenzoil klorida 11 (105 mg, 0,566 mmol, 1,1 ekv.). Reakcijsko zmes smo mešali 2 uri pri sobni temperaturi. Po 2 urah smo razvili TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 9:1) in orosili z ninhidrinom. Reakcija še ni potekla, zato smo dodali še 100 mg reagenta 11 (0,539 mmol) in pustili, da reakcija poteče čez noč. Zmes v bučki smo dopolnili do 25 mL s CH2Cl2 in ekstrahirali s 15 mL 10-odstotne citronske kisline. Organsko fazo smo nato sprali s 15 mL NaHCO3, 15 mL nasičene raztopine NaCl, sušili z Na2SO4 in topilo

Slika 17: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)-4-nitrobenzamido)metil)piperidin-1-karboksilata

(36)

26

uparili pod znižanim tlakom. Produkt smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1). Dobili smo viskozno tekočino rumeno-rjave barve.

SPOJINA 12

Ime: terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)-4-nitrobenzamido)metil)piperidin-1-karboksilat Opis: viskozna tekočina rumeno-rjave barve

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,19-1,29 (m, 2H, CH2), 1,41 in 1,46 (2 s, 9H, CH3), 1,64- 1,77 (m, 2H, CH, CH2), 1,93-2,06 (m, 1H, CH2), 2,50-2,77 (m, 2H, CH2), 3,00-3,16 (m, 4H, CH2), 3,25-3,46 (m, 2H, CH2), 3,86 (m, 4H, CH2), 3,98-4,22 (m, 2H, CH2), 4,38-4,72 (m, 2H, CH2), 6,86-6,92 (m, 2H, Ar-H), 6,97-7,00 in 7,26-7,28 (2 m, 2H, Ar-H), 7,51-7,57 (m, 2H, Ar-H), 8,22-8,29 (m, 2H, Ar-H)

IR (cm^-1): 2973, 2927, 2855, 1684, 1633, 1601, 1518, 1448, 1421, 1364, 1345, 1316, 1265, 1235, 1157, 1120, 1070, 968, 928, 862, 852, 809, 769, 731, 699, 629

(37)

27

4.2.5. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)butiramido)metil)piperidin-1- karboksalata

V bučko smo natehtali 194 mg spojine 4 (0,498 mmol) in jo raztopili v 5 mL CH2Cl2. Dodali smo 0,2 mL DIPEA (1,15 mmol, 3 ekv.) in 0,1 mL butiril klorida (13) (0,97 mmol, 1,9 ekv.).

Reakcijsko zmes smo mešali 3 ure pri sobni temperaturi. Po 3 urah smo razvili TLC (MF=

CH2Cl2: MeOH= 9:1) in orosili z ninhidrinom. Zmes v bučki smo dopolnili do 25 mL s CH2Cl2 in ekstrahirali s 15 mL 10-odstotne citronske kisline. Organsko fazo smo sprali s 15 mL NaHCO3, 15 mL nasičene raztopine NaCl, sušili z Na2SO4 in topilo uparili pod znižanim

Slika 18: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)butiramido)metil)piperidin-1-karboksalata

(38)

28

tlakom. Produkt smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF= CH2Cl2: MeOH= 14:1). Dobili smo viskozno tekočino temno rdeče barve.

SPOJINA 14

Ime: terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)butiramido)metil)piperidin-1-karboksalat Opis: viskozna tekočina temno rdeče barve

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 0,91-1,01 (m, 3H, CH3), 1,06-1,20 (m, 2H, CH2), 1,44 in 1,46 (2s, 9H, CH3), 1,56-1,75 (m, 4H, CH, CH2), 1,82-1,86 (m, 1H, CH2), 2,33 (m, 4H, CH2), 2,58-2,72 (m, 2H, CH2), 3,15 (m, 4H, CH2), 3,86 (m, 4H, CH2), 4,02-4,18 (m, 2H, CH2), 4,47 in 4,55 (2s, 2H, CH2), 6,83-6,90 (2 m, 2H, Ar-H), 7,03-7,05 in 7,13-7,15 (2 m, 2H, Ar- H)

IR (cm^-1): 2962, 2927, 2871, 1687, 1640, 1615, 1516, 1449, 1420, 1365, 1261, 1238, 1212, 1161, 1123, 1071, 968, 928, 864, 810, 769, 525, 505

(39)

29

4.2.6. Sinteza terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)akrilamido)metil)piperidin-1- karboksilata

V bučko smo natehtali 197 mg spojine 4 (0,506 mmol) in jo raztopili v 5 mL CH2Cl2. Dodali smo 0,2 mL DIPEA (1,15 mmol, 2,27 ekv.) in 0,1 mL akriloil klorida (15) (1,24 mmol, 2,5 ekv.). Reakcijsko zmes smo mešali 1,5 ure pri sobni temperaturi. Po 1,5 ure smo razvili TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 9:1) in orosili z ninhidrinom. Zmes v bučki smo dopolnili do 25 mL s CH2Cl2 in ekstrahirali s 15 mL 10-odstotne citronske kisline. Organsko fazo smo sprali s 15 mL NaHCO3, 15 mL nasičene raztopine NaCl, sušili z Na2SO4 in topilo uparili pod

Slika 19: Shema sinteze terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)akrilamido)metil)piperidin-1-karboksilata

(40)

30

znižanim tlakom. Produkt smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF= CH2Cl2: MeOH=

14:1). Dobili smo viskozno tekočino rumeno-rjave barve.

SPOJINA 16

Ime: terc-butil 4-((N-(4-morfolinobenzil)akrilamido)metil)piperidin-1-karboksilat Opis: viskozna tekočina rumeno-rjave barve

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,04-1,23 (m, 2H, CH2, CH3), 1,44 in 1,45 (2s, 9H, CH3), 1,59-1,67 (m, 2H, CH, CH2), 1,71-1,97 (m, 1H, CH2), 2,58-2,71 (m, 2H, CH2), 3,12-3,18 (m, 4H, CH2), 3,32-3,35 (m, 2H, CH2), 3,86 (m, 4H, CH2), 4,02-4,18 (m, 2H, CH2), 4,55 in 4,61 (2s, 2H, CH2), 5,66-5,75 (m, 1H, CH2), 6,37-6,46 (m, 1H, CH2), 6,54-6,62 (m, 1H, CH), 6,84-6,89 (m, 2H, Ar-H), 7,04-7,07 in 7,16-7,18 (2 m, 2H, Ar-H)

IR (cm^-1): 2971, 2941, 2856, 1692, 1637, 1606, 1578, 1518, 1448, 1420, 1364, 1331, 1277, 1263, 1242, 1213, 1193, 1157, 1125, 1087, 1054, 1002, 978, 965, 951, 926, 866, 830, 807, 790, 769, 635, 579, 526

(41)

31

4.3. Odstranjevanje zaščitne skupine

4.3.1. Sinteza N-(4-morfolino benzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida

Celotno količino spojine 6 (135 mg) smo raztopili v 2 mL CH2Cl2 in dodali 3 mL 4 M HCl v dioksanu. Pustili smo mešati 2 uri na sobni temperaturi. Po 2 urah smo s TLC (MF=

CH2Cl2: MeOH= 9:1) in z orositvijo z ninhidrinom preverili, ali je reakcija potekla. Topila smo uparili pod znižanim tlakom na rotavaporju in dodali 20 mL dietiletra, ki se zmeša s topilom in omogoči njegovo odstranitev. Po mešanju smo dietileter odlili in nalili svežega.

Ta postopek smo ponovili trikrat. Spojino z dietiletrom smo nato pustili zaprto v bučki čez noč v hladilniku. Naslednji dan smo odlili dietileter in preostanek sušili pod znižanim tlakom. Dobili smo trden produkt bele barve.

SPOJINA 17

Ime: N-(4-morfolino benzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamid diklorid

Slika 20: Shema sinteze N-(4-morfolino benzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida

(42)

32 Opis: oranžno-roza trdna snov

Molekulska formula/molekulska masa: C19H31N3O2 2+ Cl2-/404,46 g/mol Izkoristek reakcije: 97 %

Celokupni izkoristek: 86 %

TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 9:1) Rf= 0,0, orositveni reagent: ninhidrin Tt= 109,5-111°C

1H NMR (400 MHz, DMSO): δ= 1,29-1,44 (m, 2H, CH2), 1,64-1,74 (m, 2H, CH, CH2), 1,86-1,99 (m, 1H, CH2), 2,02 in 2,08 (2 s, 3H, CH3), 2,70-2,84 (m, 2H, CH2), 3,12-3,39 (m, 8H, CH2), 3,86-3,97 (m, 4H, CH2), 4,48 in 4,52 (2s, 2H, CH2), 7,18-7,28 (2 m, 2H, Ar-H), 7,33-7,43 (2 m, 2H, Ar-H), 7,90 (m, 2H, NH2+), 8,97-9,17 (m, 1H, NH⁺)

IR (cm^-1): 3361, 2957, 2853, 2634, 2476, 2371, 1630, 1514, 1452, 1366, 1314, 1292, 1255, 1210, 1119, 1066, 1039, 1018, 912, 890, 874, 813, 616, 536

13C NMR (101 MHz, DMSO): δ= 22,0, 26,6, 32,2, 33,1, 43,3, 47,7, 49,7, 51,3, 52,6, 65,2, 65,5, 66,8, 118,6, 128,0 (2×), 129,1 (2×), 170,5, 170,9

(43)

33

4.3.2. Sinteza N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)propionamida diklorida

Celotno količino spojine 8 (100 mg) smo raztopili v 2 mL CH2Cl2 in dodali 3 mL 4 M HCl v dioksanu. Pustili smo mešati 2 uri na sobni temperaturi. Po 2 urah smo s TLC (MF=

CH2Cl2: MeOH= 9:1) in z orositvijo z ninhidrinom preverili, ali je reakcija potekla. Topila smo uparili pod znižanim tlakom na rotavaporju in dodali 20 mL dietiletra. Po mešanju smo dietileter odlili in nalili svežega. Ta postopek smo ponovili trikrat. Spojino z dietiletrom smo nato pustili zaprto v bučki čez noč v hladilniku. Naslednji dan smo odlili dietileter in preostanek sušili pod znižanim tlakom. Dobili smo trden produkt bele barve.

SPOJINA 18

Ime: N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)propionamid diklorid

Slika 21:Shema sinteze N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)propionamida diklorida

(44)

34 Opis: opečnata viskozna tekočina

Molekulska formula/molekulska masa: C20H33N3O22+ Cl2-/418,40 g/mol Izkoristek reakcije: 90 %

TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 9:1) Rf= 0,0 orositveni reagent: ninhidrin Tt = viskozna tekočina

1H NMR (400 MHz, DMSO): δ= 0,94-1,07 (2 t, 3H, J=8,0 Hz, CH3), 1,29-1,45 (m, 2H, CH2), 1,61-1,73 (m, 2H, CH, CH2), 1,85-2,02 (m, 1H, CH2), 2,28-2,42 (2 q, 2H, J=8,0 Hz, CH2), 2,72-2,81 (m, 2H, CH2), 3,12-3,25 (m, 4H, CH2), 3,28-3,36 (m, 4H, CH2), 3,86-4,00 (m, 4H, CH2), 4,50 in 4,54 (2s, 2H, CH2), 7,15-7,21 in 7,22-7,29 (2 m, 2H, Ar-H), 7,33-7,50 (2 m, 2H, Ar-H), 8,86 in 9,02 (2s, 2H, NH2+), 9,16-9,24 (m, 1H, NH⁺)

IR (cm-1): 3398, 2958, 2853, 2730, 2499, 2461, 1624, 1513, 1451, 1375, 1289, 1255, 1216, 1119, 1063, 1019, 975, 890, 871, 615, 586, 537

13C NMR (101 MHz, DMSO): δ= 10,0, 25,9, 26,6, 32,3, 33,4, 43,2, 47,9, 50,0, 51,4, 55,4, 65,1, 65,4, 66,8, 118,8, 127,9 (2×), 129,1 (2×), 173,7, 174,0

(45)

35

4.3.3. Sinteza 2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida

Celotno količino spojine 10 (149 mg) smo raztopili v 2 mL CH2Cl2 in dodali 3 mL 4 M HCl v dioksanu. Pustili smo mešati 2 uri na sobni temperaturi. Po dveh urah smo s TLC (MF=

CH2Cl2: MeOH= 9:1) in z orositvijo z ninhidrinom preverili, ali je reakcija potekla. Topila smo uparili pod znižanim tlakom na rotavaporju in dodali 20 mL dietiletra. Po mešanju smo dietileter odlili in nalili svežega. Ta postopek smo ponovili trikrat. Spojino z dietiletrom smo nato pustili zaprto v bučki čez noč v hladilniku. Naslednji dan smo odlili dietileter in preostanek sušili pod znižanim tlakom. Dobili smo trden produkt rumene barve.

SPOJINA 19

Ime: 2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamid diklorid

Slika 22: Shema sinteze 2-ciano-N-(4-morfolinobenzil)-N-(piperidin-4-ilmetil)acetamida diklorida

(46)

36 Opis: trdna rumena snov

Molekulska formula/molekulska masa: C20H30N4O22+ Cl2-/428,175 g/mol Izkoristek reakcije: 82 %

TLC (MF= CH2Cl2: MeOH= 9:1) Rf= 0,5 orositveni reagent: ninhidrin Tt = 140 °C

1H NMR (400 MHz, DMSO): δ= 1,18-1,48 (m, 2H, CH2), 1,63-1,78 (m, 2H, CH, CH2), 1,84-1,96 (m, 1H, CH2), 2,70-2,86 (m, 2H, CH2), 3,15-3,30 (m, 8H, CH2), 3,36-3,40 (s, 2H, CH2), 3,81-3,92 (m, 4H, CH2), 3,95 in 4,04 (2 s, 2H, CH2), 7,18-7,43 (2 m, 2H, Ar-H), 7,52- 7,73 (2 m, 2H, Ar-H), 8,89 in 9,20 (2 s, 2H, NH2+), 9,52 (s, 1H, NH⁺)

IR (cm-1): 3351, 2955, 2723, 2568, 2458, 2214, 1673, 1610, 1549, 1515, 1489, 1452, 1366, 1290, 1256, 1119, 1063, 1019, 890, 871, 731, 614, 570, 538

13C NMR (101 MHz, DMSO): δ= 25,1, 26,5, 30,9, 32,3, 33,8, 42,8, 43,0, 49,9, 50,7, 55,4, 65,8, 66,8, 110,3, 119,5, 124,9, 127,7, 130,6, 131,9, 143,2, 165,1, 166,1

(47)

37

4.3.4. Sinteza N-(4-morfolinobenzil)-4-nitro-N-(piperidin-4-ilmetil)benzamida diklorida

Celotno količino spojine 12 (233 mg) smo raztopili v 2 mL CH2Cl2 in dodali 3 mL 4 M HCl v dioksanu. Pustili smo mešati 2 uri na sobni temperaturi. Po dveh urah smo s TLC (MF=

CH2Cl2: MeOH= 9:1) in z orositvijo z ninhidrinom preverili, ali je reakcija potekla. Topila smo uparili pod znižanim tlakom na rotavaporju in dodali 20 mL dietiletra. Po mešanju smo dietileter odlili in nalili svežega. Ta postopek smo ponovili trikrat. Spojino z dietiletrom smo nato pustili zaprto v bučki čez noč v hladilniku. Naslednji dan smo odlili dietileter in preostanek sušili pod znižanim tlakom. Dobili smo trden produkt marelične barve.

SPOJINA 20

Ime: N-(4-morfolinobenzil)-4-nitro-N-(piperidin-4-ilmetil)benzamid diklorid Opis: trdna snov marelične barve

Molekulska formula/molekulska masa: C24H32N4O42+ Cl22+/510,180 g/mol Izkoristek reakcije: 49 %

Slika 23: Shema sinteze N-(4-morfolinobenzil)-4-nitro-N-(piperidin-4-ilmetil)benzamida diklorida