BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE študij

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE

Polona-Maja REPAR

KONJUGACIJA PLAZMIDA pOX38:Cm V IZBRANE SEVE BAKTERIJE ESCHERICHIA COLI

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija

Ljubljana, 2021

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE

Polona-Maja REPAR

KONJUGACIJA PLAZMIDA pOX38:Cm V IZBRANE SEVE BAKTERIJE ESCHERICHIA COLI

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija

CONJUGATION OF THE pOX38:Cm PLASMID INTO SELECTED BACTERIAL STRAINS OF ESCHERICHIA COLI

M. SC. THESIS

Master Study Programmes: Field Microbiology

Ljubljana, 2021

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Mikrobiologija na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno v laboratoriju Skupine za molekularno genetiko Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala prof. dr.

Marjanco Starčič Erjavec, za somentorja doc. dr. Andreja Kastrina in za recenzenta doc. dr.

Tomaža Accetta.

Mentorica: prof. dr. Marjanca STARČIČ ERJAVEC Somentor: doc. dr. Andrej KASTRIN

Recenzent: doc. dr. Tomaž ACCETTO

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednica: doc. dr. Jerneja AMBROŽIČ AVGUŠTIN

Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za biologijo

Članica: prof. dr. Marjanca STARČIČ ERJAVEC

Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za biologijo

Član: doc. dr. Andrej KASTRIN

Univ. v Ljubljani, Medicinska fak., Inštitut za biostatistiko in medicinsko informatiko

Član: doc. dr. Tomaž ACCETTO

Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za zootehniko

Datum zagovora:

Polona-Maja Repar

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2

DK UDK 579.25:577.2.083(043)=163.6

KG plazmidi, frekvenca konjugacije, pOX38:Cm, CRISPR-Cas, restrikcijsko- modifikacijski sistem, inkompatibilnost plazmidov, protimikrobno delovanje AV REPAR, Polona-Maja, dipl. mikrobiol. (UN)

SA STARČIČ ERJAVEC, Marjanca (mentorica), KASTRIN, Andrej (somentor), ACCETTO, Tomaž (recenzent)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije LI 2021

IN KONJUGACIJA PLAZMIDA pOX38:Cm V IZBRANE SEVE BAKTERIJE ESCHERICHIA COLI

TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija) OP X, 48 str., 17 pregl., 11 sl., 50 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Povečevanje števila proti antibiotikom odpornih bakterij postaja vedno večji problem. Geni za odpornost so pogosto zapisani na mobilnih genetskih elementih, ki se lahko s horizontalnim genskim prenosom hitro prenašajo med bakterijami. Med horizontalnimi genskimi prenosi velja konjugacija, genski prenos ob neposrednem stiku dveh bakterij, kot najpomembnejši dejavnik za širjenje odpornih bakterij.

Dobro poznavanje dejavnikov, ki vplivajo na frekvenco konjugacije, lahko vodi v odkritje novih strategij za borbo proti odpornim bakterijam. Med te dejavnike spadajo obrambni mehanizmi bakterij pred vdorom tuje DNA, kot sta na primer sistem CRISPR-Cas in restrikcijsko-modifikacijski (R-M) sistem. Cilj magistrskega dela je bil preveriti, ali obstaja povezava med frekvenco konjugacije plazmida pOX38:Cm in prisotnostjo genskih zapisov za sistem CRISPR-Cas in R-M sisteme v recipientskih sevih, inkompatibilnostjo plazmidov recipientskih in donorskih sevov ali pa s protimikrobnim delovanjem recipientskih sevov. CRISPR-Cas in R-M sisteme smo v posameznih sevih poiskali s prosto dostopnima računalniškima programoma (CRISPR-Cas++ in REBASE), vendar nismo dokazali nobene povezave s frekvenco konjugacije. Nato smo preverili še sposobnost recipienta za zaviranje rasti donorja (test za prisotnost bakteriocinov) in s programom BLAST preverili inkompatibilnost plazmidov v recipientskih sevih s plazmidom pOX38:Cm.

Nekateri recipientski sevi so sicer povzročili cono lize donorskega seva HB101 pOX38:Cm, a povezava s frekvenco konjugacije ni obstajala. Primerjava nukleotidnih zaporedij pOX38:Cm in plazmidov recipientskih sevov tudi ni razkrila morebitne inkompatibilnosti med plazmidi. Opaženih razlik v frekvencah konjugacije pOX38:Cm v različne recipientske seve tako nismo mogli povezati ne z sistemom CRISPR-Cas, ne R-M sistemi, ne protimikrobnim delovanjem in tudi ne z inkompatibilnostjo plazmidov.

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2

DC UDC 579.25:577.2.083(043)=163.6

CX plasmids, conjugation frequency, pOX38:Cm, CRISPR-Cas, restriction- modification system, plasmid incompatibility, antimicrobial production AU REPAR, Polona-Maja

AA STARČIČ ERJAVEC, Marjanca (supervisor), KASTRIN, Andrej (co-advisor), ACCETTO, Tomaž (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Microbiology PY 2021

TI CONJUGATION OF THE pOX38:Cm PLASMID INTO THE SELECTED BACTERIAL STRAINS OF ESCHERICHIA COLI

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Microbiology) NO X, 48 p., 17 tab., 11 fig., 50 ref.

LA sl AL sl/en

AB The growing number of antibiotic resistant bacteria is becoming an increasing problem. The genes for resistance are often carried on mobile genetic elements that can spread rapidly through bacterial populations by horizontal gene transfer.

Mechanisms of horizontal gene transfer include conjugation, the gene transfer between two bacteria that are in physical contact, which is considered the most important factor in the spread of resistant bacteria. A good characterisation of the factors that influence the conjugation frequency may lead to the discovery of new strategies to combat the resistant bacteria. These factors include bacterial defence mechanisms to control the entry of foreign DNA, such as CRISPR-Cas and restriction-modification (R-M) systems. The aim of this Master Theses was to determine whether there is a correlation between conjugation frequency of the plasmid pOX38:Cm and the presence of genes for CRISPR-Cas and R-M systems in recipient strains, incompatibility of plasmids in recipient and donor cell or antimicrobial production of recipient strains. CRISPR-Cas and R-M systems were determined using freely available computer programs (CRISPR-Cas++ and REBASE), but a correlation with the conjugation frequency was not discovered.

Therefore we investigated the ability of the recipient to inhibit the growth of the donor (bacteriocinogenity assay) and the incompatibility between the plasmids in recipient cells and plasmid pOX38:Cm (BLAST). Some recipient strains formed lysis zones of the donor strain, but a correlation with the conjugation frequency did not exist. Comparison of the plasmids revealed no incompatibility between them. The observed differences in conjugation frequencies could not be explained by CRISPR- Cas or R-M systems, antimicrobial production or plasmid incompatibility.

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORDS DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V

KAZALO SLIK VIII

KAZALO PREGLEDNIC IX

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X

1 UVOD 1

1.1 NAMEN RAZISKAVE 2

1.2 HIPOTEZE 2

2 PREGLED OBJAV 3

2.1 BAKTERIJA Escherichia coli 3

2.2 PLAZMIDI 4

2.2.1 Plazmid F 4

2.2.2 Plazmid pOX38 6

2.2.3 Konjugacija 6

2.2.4 Mehanizem konjugacije plazmida F 6

2.3 INKOMPATIBILNOST PLAZMIDOV 8

2.4 OBRAMBNI MEHANIZMI BAKTERIJ 8

2.4.1 Sistem CRISPR-Cas 9

2.4.2 Sistem CRISPR-Cas tipa I-E in I-F 11

2.4.3 Restrikcijsko-modifikacijski sistem 12

3 MATERIAL IN METODE 15

3.1 MATERIAL 15

3.1.1 Bakterijski sevi 15

3.1.2 Gojišča 15

3.1.2.1 Tekoče gojišče Luria-Bertani (LB) 15

3.1.2.2 Tekoče gojišče LB z antibiotiki 15

3.1.2.3 Trdno gojišče LB 16

3.1.2.4 Trdno gojišče LB z antibiotiki 16

3.1.2.5 Mehki agar LB 16

3.1.2.6 Tekoče gojišče LB z glicerolom 16

3.1.2.7 Trdno minimalno gojišče z glukozo (MG) 16

3.1.2.8 Trdno minimalno gojišče z glukozo z antibiotiki 16

3.1.2.9 Trdno gojišče MacConkey-agar (MAC) 17

3.1.2.10 Trdno gojišče MacConkey-agar z antibiotiki 17

3.1.3 Kemikalije 17

3.1.4 Reagenti za ERIC-PCR 18

3.1.5 Pufri in reagenti 19

3.1.5.1 Fiziološka raztopina 19

3.1.6 Laboratorijska oprema 19

3.2 METODE 20

3.2.1 Prekonočna kultura bakterijskih sevov 20

3.2.2 Ugotavljanje frekvence konjugacije na trdnem gojišču LB 20

3.2.3 Celični lizat celic za PCR 21

3.2.4 ERIC-PCR 21

3.2.5 Agarozna gelska elektroforeza 22

3.2.6 Test protimikrobnega delovanja recipientskih sevov 22

3.2.7 Shranjevanje bakterijske kulture 22

3.3 BIOINFORMACIJSKE METODE 23

3.3.1 Sekvenciranje in sestavljanje zaporedij 23

3.3.2 Iskanje sistema CRISPR-Cas 23

3.3.3 Iskanje restrikcijsko-modifikacijskih sistemov 24 3.3.4 Preverjanje inkompatibilnosti plazmida pOX38:Cm z domnevnimi

plazmidi v recipientskih sevih 24

4 REZULTATI 26

4.1 KONTROLE UPORABLJENIH SEVOV 26

4.1.1 Rast na trdnem gojišču MAC 26

4.1.2 Rast na trdnem gojišču MG 26

4.1.3 Preverjanje odpornosti proti streptomicinu 27 4.1.4 Preverjanje odpornosti proti ampicilinu 27 4.1.5 Preverjanje odpornosti proti kloramfenikolu 27

4.1.6 Preverjanje rasti na MAC Cm 27

4.1.7 Preverjanje rasti na plošči MAC Ap Cm 28

4.1.8 Preverjanje števila CFU/mL recipientskih sevov, ki zrastejo na

selekcijskih ploščah 28

4.1.9 Preverjanje stabilnosti plazmida pOX38:Cm v donorju 29

4.1.10 Kontrola nastalih mutacij uporabljenih sevov 29 4.2 FREKVENCA KONJUGACIJE PLAZMIDA pOX38:Cm IZ HB101 V

RECIPIENTSKE SEVE 30

4.3 POTRJEVANJE TRANSKONJUGANT 30

4.4 PROTIMIKROBNO DELOVANJE RECIPIENTSKIH SEVOV 31

4.5 KVALITETA SEKVENCIRANJA 32

4.6 ISKANJE SISTEMA CRISPR-Cas 33

4.7 ISKANJE RESTRIKCIJSKO-MODIFIKACIJSKIH SISTEMOV 34

4.8 PREVERJANJE INKOMPATIBILNOSTI PLAZMIDA pOX38:Cm Z

DOMNEVNIMI PLAZMIDI V RECIPIENTSKIH SEVIH 36

5 RAZPRAVA 37

5.1 FREKVENCA KONJUGACIJE PLAZMIDA pOX38:Cm iz HB101 V

RECIPIENTSKE SEVE 37

5.2 VPLIV SISTEMA CRISPR-Cas NA FREKVENCO KONJUGACIJE 37

5.3 VPLIV R-M SISTEMA NA FREKVENCO KONJUGACIJE 38

5.4 VPLIV INKOMPATIBILNOSTI DOMNEVNIH PLAZMIDOV RECIPIENTA

IN DONORJA NA FREKVENCO KONJUGACIJE 39

5.5 VPLIV PROTIMIKROBNEGA DELOVANJA RECIPIENTSKIH SEVOV NA

FREKVENCO KONJUGACIJE 39

6 SKLEPI 41

7 POVZETEK 42

8 VIRI 44

ZAHVALA

KAZALO SLIK

Slika 1: Plazmid F (Koraimann, 2018). ... 5

Slika 2: Mehanizem konjugacije plazmida F (Virolle in sod., 2020). ... 7

Slika 3: Stopnji delovanja sistema CRISPR-Cas (Maraffini in sod., 2015). ... 11

Slika 4: Delovanje restrikcijsko-modifikacijskega sistema (Sadykov, 2016). ... 13

Slika 5: Lestvica DNA »GeneRulerTM 1 kb DNA« ... 18

Slika 6: Shema delotoka. ... 25

Slika 7: Primer rasti recipientskih in donorskega seva na trdnem gojišču MAC. ... 26

Slika 8: Primer plošč LB (levo) in MG (desno) za potrjevanje transkonjugant. ... 31

Slika 9: Primer gela s produkti ERIC PCR... 31

Slika 10: Protimikrobno delovanje recipientskih sevov na donorski sev HB101 pOX38:Cm. ... 32

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Klasifikacija sistemov CRISPR-Cas . ... 10

Preglednica 2: Proteini Cas in njihova funkcija ... 12

Preglednica 3: Sevi E. coli, ki smo jih uporabili pri magistrski nalogi. ... 15

Preglednica 4: Založne in končne koncentracije antibiotikov. ... 15

Preglednica 5: Uporabljene kemikalije... 17

Preglednica 6: Reagenti za ERIC-PCR in njihove koncentracije in proizvajalci ... 18

Preglednica 7: Laboratorijska oprema ... 19

Preglednica 8: Selekcijske plošče za različne konjugacijske pare ... 20

Preglednica 9: Sestava reakcijske mešanice za ERIC-PCR ... 21

Preglednica 10: Protokol pomnoževanja za ERIC-PCR... 21

Preglednica 11: Število CFU/mL recipientskih sevov, ki so zrasli na selekcijski plošči (MG ali LB Ap) in na plošči LB. ... 28

Preglednica 12: Število CFU/mL donorja, ki je zrasel na trdnem gojišču LB Cm in LB. .. 29

Preglednica 13 Frekvenca konjugacije ... 30

Preglednica 14: Kvaliteta sekvenciranja... 32

Preglednica 15: Sistem CRISPR-Cas v preučevanih sevih ... 33

Preglednica 16: Restrikcijsko-modifikacijski sistemi v preučevanih sevih. ... 34

Preglednica 17: Število plazmidov v recipientskih sevih in morebitna prisotnost regije RepFIA ... 36

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

Ap Ampicilin

Sm Streptomicin

Cm Kloramfenikol

R-M sistem Restrikcijsko-modifikacijski sistem Podenota R, S, M Podenota za restrikcijo, prepoznavanje in

metilacijo

DNA Deoksiribonukleinska kislina

RNA ssDNA dsDNA

Ribonukleinska kislina Enoverižna DNA Dvoverižna DNA

HPG Horizontalni prenos genov

MGE Mobilni genetski elementi

Sistem TA Sistem toksin-antitoksin Sistem ABI Sistem abortivne okužbe

ATP Adenozin 5' trifosfat

GTP Gvanozin 5' trifosfat

LB Luria-Bertani

MAC MacConkey

MG Obr./min

Minimalno gojišče Obratov na minuto

1 UVOD

Antibiotiki so v sodobnem zdravstvu izjemno pomembni in odkar je Alexander Fleming leta 1928 odkril penicilin, so rešili že milijone življenj (Getino in de la Cruz, 2019). Veljajo za najpomembnejše medicinsko odkritje 20. stoletja, saj so poleg zdravljenja okužb omogočili tudi mnoge moderne medicinske postopke, kot so zdravljenje raka, presaditve organov in odprte operacije na srcu (Hutchings in sod., 2019).

Hkrati z začetkom uporabe antibiotikov pa se je začela razvijati tudi mikrobna odpornost proti njim, kar v sodobni medicini predstavlja izjemno veliko težavo. Mehanizmi odpornosti proti antibiotikom so izredno raznoliki. Predvidevajo, da je v bakterijskih genomih ogromno potencialnih genov za odpornost. Bakterije se hitreje prilagajajo na antibiotike, kot jih ljudje uspemo odkrivati oz. razvijati, kar potencialno vodi do smrtnih izidov zaradi okužb, povzročenih z bakterijami, ki bodo odporne proti vsem poznanim antibiotikom.

Znanstveniki poskušajo rešiti ta problem z iskanjem novih strategij, ki bi omejile širjenje odpornosti proti antibiotikom, vključno z inhibitorji bakterijske virulence, cepivi, fagno terapijo, predatorskimi bakterijami in protiplazmidno terapijo (Getino in de la Cruz, 2019).

Razlog, zakaj se bakterije z odpornostjo proti različnim antibiotikom tako hitro širijo, je zapis genov za odpornost na mobilnih genetskih elementih (MGE). Te si bakterije izmenjujejo med seboj ne le vertikalno, torej ob delitvi starševske celice na potomce, temveč tudi horizontalno. Različni MGE imajo različne spektre prenosa. Tako poznamo MGE z zelo ozkim spektrom prenosa - prenašajo se lahko samo med različnimi sevi iste vrste, preko takšnih, ki se prenašajo med različnimi vrstami in rodovi bakterij, do takšnih, ki se lahko prenašajo iz prokariontskih celic v enocelične evkarionte ter celo v večcelične evkarionte, na primer v rastlinske in človeške somatske celice (Soucy in sod., 2015). Geni za odpornost proti antibiotikom so lahko zapisani na različnih MGE, kot so plazmidi, transpozoni, bakteriofagi in genetske kasete (de la Cruz in Davies, 2000).

Horizontalni prenos genov (HPG) je izmenjava genetskega materiala med organizmi, ki niso v odnosu starševski organizem - potomec. Je zelo pomemben dejavnik, ki usmerja evolucijo bakterij in arhej kakor tudi evkariontskih organizmov. Geni, zapisani na MGE, so za bakterije lahko izredno pomembni in jim lahko omogočijo, da zasedejo nove ekološke niše.

S pridobitvijo MGE lahko nepatogena bakterija postane patogena, lahko se uvrsti celo v novo vrsto. Primer za to sta bakterijski vrsti Shigella spp. in Escherichia coli ⁽de la Cruz in Davies, 2000), med katerima je nukleotidna podobnost kar 80 %90 %. Filogenetsko (glede na gen za 16S rRNA) je Shigella spp. E. coli, vendar pa so ju zaradi različnih biokemijskih lastnosti in klinične pomembnosti, ki so posledica prisotnosti plazmida z zapisi za virulenco, razvrstili v različni vrsti (Devanga Ragupathi in sod., 2017).

Konjugacija je najbolj pogost mehanizem HPG in s tem tudi najpomembnejši dejavnik, ki prispeva k širjenju odpornih bakterij. Zanjo je potreben neposreden kontakt med donorjem in recipientom preko konjugacijskega pilusa. Konjugacija je proces, ki se odvija le med bakterijskimi celicami (z izjemo Agrobacterium spp., ki prenesejo genetski material v rastlinsko celico) (Soucy in sod., 2015).

Izjemno pomembno je, da mehanizem konjugacije in dejavnike, ki vplivajo na njeno frekvenco, čim bolje raziščemo in opredelimo. Pri tem je zelo uporaben konjugativni plazmid F in vsi njegovi različni derivati, saj plazmid F in njegov mehanizem konjugacije predstavlja paradigmo. Pri boju proti odpornim bakterijam bi lahko bili koristni tudi naravni mehanizmi bakterij, ki jih uporabljajo za zaščito pred vdorom tuje DNA in na ta način zmanjšujejo frekvenco konjugacije. Glavna obrambna mehanizma bakterij sta restrikcijsko- modifikacijski (R-M) sistem in sistem CRISPR-Cas, ki oba ščitita bakterijo pred vdorom fagov in plazmidov. Omogočata ločevanje svoje DNA od tuje ter uničenje tuje DNA. Na ta način omejujeta HPG in s tem tudi širjenje genov z odpornostjo proti antibiotikom. Na frekvenco konjugacije pa lahko vplivajo tudi inkompatibilnost plazmidov v recipientski in donorski celici ter protimikrobno delovanje recipientskih sevov (Buckner in sod., 2010).

1.1 NAMEN RAZISKAVE

Namen magistrske naloge je ugotoviti, kakšna je frekvenca konjugacijskega prenosa plazmida pOX38:Cm iz laboratorijskega seva bakterije Escherichia coli HB101 v različne seve bakterije Escherichia coli in v nadaljevanju preveriti ali so prisotnost R-M sistema, sistem CRISPR-Cas, protimikrobno delovanje recipientskih sevov in morebitna inkompatibilnost plazmida pOX38:Cm s plazmidi, prisotnimi v recipientskih sevih, povezani z uspešnostjo konjugacije pOX38:Cm.

1.2 HIPOTEZE

- Frekvence konjugacij iz enakega donorja v različne recipientske seve se bodo med seboj razlikovale.

- Sistem CRISPR-Cas zmanjša frekvenco konjugacije, v kolikor vmesnik sistema CRISPR-Cas nalega na plazmid pOX38:Cm.

- Restrikcijsko-modifikacijski sistemi zmanjšajo frekvenco konjugacije, v kolikor so prisotne vse podenote sistema brez delecij.

- V recipiente, ki imajo s plazmidom pOX38:Cm inkompatibilne plazmide, je frekvenca konjugacije plazmida pOX38:Cm nižja.

- V recipiente, ki delujejo protimikrobno na donorja, je frekvenca konjugacije plazmida pOX38:Cm nižja.

2 PREGLED OBJAV

2.1 BAKTERIJA Escherichia coli

Escherichia coli je paličasta, po Gramu negativna, nesporulirajoča bakterija, ki spada v razred Gammaproteobacteria, v družino Enterobacteriaceae. V dolžino zraste 2 do 3 µm, v širino pa do 0,5 µm. Spada med najbolj preučevane bakterije, saj jo je enostavno gojiti in v optimalnih pogojih raste zelo hitro. Njen podvojevalni čas je približno 20 minut na bogatem gojišču (Jang in sod., 2017). Primarni habitat bakterije E. coli je prebavni trakt človeka in ostalih živali s stalno telesno temperaturo ter tudi živali, ki nimajo stalne telesne temperature, če te živijo v dovolj toplem okolju (Conway in Cohen, 2015). E. coli lahko preživi tudi izven gostitelja, v vodi in v sedimentu. Ocenjeno je bilo, da približno polovica populacije E. coli živi v teh sekundarnih habitatih (Tenaillon in sod., 2010; Blount, 2013). Kar 90 % sevov E. coli je t. i. komenzalnih, ki živijo v mutualističnem odnosu z gostiteljem ter le redko povzročajo bolezni (Ramos in sod., 2020). Bakterija od svojega gostitelja pridobi hranila, stabilno okolje in zaščito pred določenimi stresnimi situacijami ter transport in širjenje.

Bakterije E. coli pa za gostitelja sintetizirajo vitamina K in B12 ter preprečuje kolonizacijo patogenov (Tenaillon in sod., 2010). Ocenjeno je, da je samo v človeški populaciji kar 10²¹ celic E. coli (Conway in Cohen, 2015). Vendar pa ta bakterija ostaja eden izmed najpogostejših povzročiteljev običajnih bakterijskih infekcij živali in ljudi, kot so enteritis, okužbe urinarnega trakta ter diareja. Skupaj z bakterijami vrste Salmonella in Campylobacter spada med najpomembnejše človeške patogene (Ramos in sod., 2020).

Escherichia coli je fakultativni anaerob in lahko uporablja alternativne elektronske akceptorje in pridobiva energijo s fermentacijo. Centralni metabolizem je sestavljen iz Embden-Meyerhof-Parnas glikolitične poti, pentoza fosfat poti, Entner-Doudoroff poti, Krebsovega cikla ter različnih fermentativnih poti. Najbolje uspeva na sladkorjih, vključno z različnimi mono- in disaharidi, ne more pa rasti na kompleksnih polisaharidih, saj nima hidrolaznih encimov. Raste lahko tudi na aminokislinah in dikarboksilatih, ki vstopajo v Krebsov cikel. Te centralne metabolne poti so zelo ohranjene in predstavljajo pomemben del jedrnega genoma bakterije E. coli (Conway in Cohen., 2015).

Genom E. coli je velik med 4.6 in 5.6 Mb. Ta razlika nakazuje, da je veliko informacije, ki je specifična za vsak sev posebej. Teh za sev specifičnih informacij je lahko kar 30 % celotnega genoma. Dosedanje raziskave nakazujejo, da je pangenom te bakterije odprt in da se vrsta še zmeraj razvija s pridobivanjem novih genov in spreminjanjem že pridobljenih.

Genom E. coli ima mozaično strukturo iz jedrnega genoma in fleksibilnega genskega bazena.

Slednji vsebuje mnoge tuje regije, tudi gene za virulenco, ki so jih bakterije pridobile s horizontalnim genskim prenosom. Geni, povezani z virulenco, so zelo pogosto prisotni na mobilnih genetskih elementih kot so genomski otoki, bakteriofagi, plazmidi in transpozoni (Dobrindt in sod., 2010).

2.2 PLAZMIDI

Plazmidi so izvenkromosomski elementi DNA, ki jih lahko najdemo med bakterijami ter tudi drugimi domenami življenja. Običajno so majhni, povprečna velikost je 80 kb. Sposobni so semi-avtonomnega podvojevanja z uporabo gostiteljevega replikacijskega mehanizma, v nekaterih primerih pa so lahko celo popolnoma avtonomni, kar jim omogoča zelo širok spekter gostiteljev (Timchenko in sod., 1990). Plazmidi običajno ne vsebujejo genov, ki so nujno potrebni za preživetje gostitelja, temveč vsebujejo gene za pomoč gostitelju, da se prilagodi na novo okolje. Vsebujejo lahko gene, ki zapisujejo odpornost proti antibiotikom, za razgradnjo alternativnih hranil, za virulenco, toleranco na težke kovine, fiksacijo dušika.

Vsi plazmidi vsebujejo gene za iniciacijo lastnega podvojevanja, poleg tega pa imajo lahko še gene za particijo in konjugativni prenos. Plazmidi lahko gostitelju predstavljajo energetsko breme, hkrati pa mu omogočajo preživetje v razmerah, v katerih sicer ne bi preživel. Pričakovali bi, da se plazmid izgubi, ko selekcijski pritisk ni prisoten, oziroma se sčasoma vgradi v kromosom, kadar pritisk vztraja več generacij, vendar nič od tega ni pravilo. Mehanizmi za tem še niso dobro raziskani (Carroll in Wong, 2018).

Plazmide lahko delimo v tri kategorije glede na njihovo mobilnost: konjugativni, plazmidi, ki se jih lahko mobilizira, in neprenosljivi. Konjugativni plazmidi vsebujejo vse gene, potrebne za prenos, plazmidom, ki se jih lahko mobilizira, pa manjkajo geni za sintezo konjugacijskega pilusa. Pri prenosu uporabijo pilus konjugativnega plazmida, ki se nahaja v isti celici, in se na ta način izognejo bremenu, ki ga predstavlja njegova sinteza. Običajno so konjugativni plazmidi veliki (< 30 kb) in se nahajajo v gostiteljski celici v majhnem številu kopij. Plazmidi, ki se jih lahko mobilizira, so manjši (> 15 kb) in se nahajajo v večjem številu kopij. Neprenosljivi plazmidi niso sposobni prenosa niti s pomočjo drugega konjugativnega plazmida. Edina možnost za prenos je neposredna povezava s plazmidom, ki je prenosa sposoben (Getino in de la Cruz, 2019).

2.2.1 Plazmid F

Plazmid F je konjugativni plazmid E. coli in je prvi plazmid, ki so ga odkrili. Leta 1946 so pokazali, da si bakterije lahko izmenjujejo genetsko informacijo z enosmernim prenosom DNA, posredovanim z dejavnikom F. Kasneje so ugotovili, da je dejavnik F izvenkromosomski genetski element in poimenovali so ga plazmid, proces prenosa DNA pa konjugacija (Virolle in sod., 2020).

Dejavnik F je 100 kb dolg dvoverižni plazmid z dvema regijama za podvojevanje (slika 1).

To sta RepFIA in RepFIB. Obe regiji imata mesto ori, kjer se začne podvojevanje. Poleg tega je prisotna še regija RepFII, ki pa je prekinjena s Tn1000 in zato nedelujoča. Dejavnik F ima še operon tra, na katerem so zapisani geni za konjugativni prenos plazmida, in štiri prenosljive genetske elemente: dve kopiji insercijskega zaporedja IS3, eno kopijo IS2 in en

transpozon Tn1000. Enaki elementi so lahko prisotni tudi v genomu E. coli in tako predstavljajo regije za homologno rekombinacijo in na ta način omogočajo, da se dejavnik F lahko vključi v gostiteljski kromosom in tako nastane sev, ki ga označimo kot Hfr. Na plazmidu F je regija, kjer so lahko dodatni geni (Koraimann, 2018). Insercija Tn1000 v gen finO povzroči, da se protein FinO ne sintetizira, kar vodi v povečano izražanje operona tra (Rosenberg in Hasting., 2001). Zgradba plazmida F je prikazana na sliki 1.

Slika 1: Plazmid F (Koraimann, 2018).

Plazmid F kodira tudi sistem Ccd, ki je sestavljen iz stabilnega toksina in nestabilnega antitoksina in tako predstavlja sistem, ki zagotavlja odvisnost celice od plazmida. Ko celica izgubi plazmid, se nestabilen antitoksin razgradi hitreje kot stabilen toksin in toksin tako lahko ubije celico (Rosenberg in Hasting, 2001).

oriV

2.2.2 Plazmid pOX38

Plazmid pOX38 je derivat plazmida F, ki je nastal iz največjega restrikcijskega fragmenta plazmida F po cepitvi z encimom HindIII. Vsebuje DNA od mesta oriV do konca regije za prenos plazmida. Velik je 55 kbp (Rosenberg in sod., 2001). V gostitelju se nahaja v majhnem številu kopij. Zapisuje odpornost proti kloramfenikolu in je Tra+ in RepFIA+

(Starčič Erjavec in sod., 2015).

2.2.3 Konjugacija

Konjugacija je izmenjava genetskega materiala med celicama, za katero je potreben neposreden kontakt med donorsko in recipientsko celico. Poleg tranformacije in transdukcije spada med mehanizme horizontalnega prenosa genov (de la Cruz in sod., 2000). Poznamo še druge konjugativne elemente, to so konjugativni transpozoni oz. integrativni konjugativni elementi (ICE). Konjugacija je zelo pogost proces v bakterijskih združbah in biofilmih v prsti, na površini rastlin, v vodi in v odpadnih voda ter v rastlinskih in živalskih gostiteljih.

Znotraj teh niš lahko konjugacija omogoči simbiotski način življenja, virulenco, odpornost proti težkim kovinam ter sintezo protimikrobnih spojih, ki pospešijo prilagajanje bakterijskega seva na novo okolje (Virolle in sod., 2020).

2.2.4 Mehanizem konjugacije plazmida F

Za uspešen začetek konjugacije se mora najprej v donorski celici izraziti gruča genov, ki se nahaja na regiji tra v plazmidu. Ta ima zapis za proteinske dejavnike, ki so potrebni za tvorbo konjugacijskega pilusa, sekrecijskega sistema tipa IV in relaksosoma. Izražanje operona tra regulira precej dejavnikov, med njimi so plazmidni in bakterijski proteini, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Proteini Tra lahko delujejo tudi na ostale bakterijske plazmide, med drugim tudi plazmide ColE1. Naslednja stopnja je iztegovanje konjugacijskega pilusa v okolico donorske celice. Ko zazna recipientsko celico, se prične konjugacijski pilus krčiti, donorska in recipientska celica se tako približata in tvorita konjugacijski par. Možno je tudi, da se enoverižna DNA plazmida prenese skozi pilus, vendar to ni potrjeno. Za iniciacijo konjugacije je potreben proteinski kompleks, poimenovan relaksosom, ki pripravi plazmid na prenos. Poskrbi za specifično cepitev plazmidne DNA na mestu nic, ki se nahaja na mestu začetka prenosa oriT, ter za ločitev dvoverižne plazmidne DNA. Ena veriga ostane v donorju in se podvoji z mehanizmom kotalečega se kroga, druga pa se veže na relaksosom in je skozi konjugacijsko poro, ki jo naredi sekrecijski sistem tipa IV, prenesena v recipientsko celico.

Ko sta oba konca mesta oriT v celici, ju relaksosom združi in nastane enoverižna krožna DNA. Najprej se začnejo izražati geni v tistem delu DNA, ki je prva vstopila v recipientsko celico (t. i. vodeča regija, ang. leading region). V vodeči regiji so zapisani geni za različne proteine, ki se nekateri vežejo na enoverižno DNA, drugi pa inhibirajo odziv SOS. Ti geni so izraženi, še preden je sintetizirana komplementarna veriga, kar omogoči regija Frpo. Ta

regija v enoverižni obliki tvori zanke, ki jih prepozna gostiteljeva RNA-polimeraza, in na ta način deluje kot promotor genov v vodeči regiji. Gostiteljeva DNA-polimeraza III prepozna dupleks RNA-DNA, ki nastane po prepisu iz regije Frpo in začne sintezo komplementarne verige (Virolle in sod., 2020).

Po koncu konjugacije imata donorska in recipientska celica vsaka svoj celoten plazmid, ki ga lahko preneseta drugim recipientskim celicam. Celoten postopek konjugacije je povzet v sliki 2.

Slika 2: Mehanizem konjugacije plazmida F (Virolle in sod., 2020). Okrajšava RCR stoji za podvojevanje z mehanizmom kotalečega se kroga.

Za uspešen zaključek konjugacije se mora plazmid izogniti oziroma preprečiti celični odziv, ki ga sproži ob vstopu v celico. Nenormalne količine ssDNA sprožijo odziv SOS, saj so običajno povezane s poškodbami kromosoma. Vezava proteina RecA na ssDNA sproži avtokatalitično cepitev proteina LexA, ki je represor regulona SOS. Ko se začnejo izražati geni SOS, to sproži filamentacijo oziroma smrt celice. Konjugativni plazmidi poskusijo to preprečiti s proteini, ki se vežejo na RecA. Ti proteini so med konjugativnimi plazmidi zelo dobro ohranjeni. Poleg tega imajo bakterije tudi posebne obrambne mehanizme, ki jih ščitijo pred vdorom tuje nukleinske kisline (Virolle in sod., 2020).

Procesiranje plazmida

Izražanje genov tra

Iniciacija prenosa Konjugacijski pilus

Faktorji za nastanek konjugacijskega para

Relaksosom

Izražanje plazmidnih genov Prenos + RCR

Fenotipska preobrazba Zaključek

RCR Vodilna regija

Vstop ssDNA

Zaokroževanje ssDNA

Podvojevanje ssDNA do dsDNA

Recipient Transkonjuganta

2.3 INKOMPATIBILNOST PLAZMIDOV

Inkompatibilnost plazmidov je definirana kot nesposobnost dveh plazmidov, da se stabilno ohranjata v isti celici. Posledica je izguba enega izmed dveh inkompatibilnih plazmidov v hčerinski celici (Rozwandowicz, 2020). Plazmidi, ki so med seboj inkompatibilni, spadajo v isto inkompatibilno skupino (skupina Inc), sicer pa v različno. To določa njihov replikacijski mehanizem. Če imata dva plazmida enak replikacijski mehanizem, spadata v isto inkompatibilnostno skupino. Za opis plazmidnega tipa lahko enakovredno uporabimo pojma tip Inc ali tip Rep (Johnson in Nolan, 2009).

Predvidevajo, da je razlog za inkompatibilnost tekmovanje za dejavnike podvojevanja.

Plazmid, ki se hitreje podvaja ali pa je manj toksičen za gostiteljsko celico, preraste plazmid iste inkompatibilnostne skupine. To je še posebej pomembno pri plazmidih, ki se nahajajo v majhnem številu kopij, kot na primer plazmid F (Velappan in sod., 2007).

Plazmid F spada v inkompatibilnostno skupino FI (incFI) (Tolun in Helinski, 1981). Glavna replikacijska regija je RepFIA, sekundarna pa RepFIB. RepFIB omogoča podvojevanje plazmida tudi v odstotnosti RepFIA. Plazmid F je nekompatibilen s plazmidi, ki imajo enako replikacijsko regijo (Lane, 1981).

2.4 OBRAMBNI MEHANIZMI BAKTERIJ

Na novo pridobljena ssDNA konjugativnega plazmida je v recipientski celici obravnavana kot tuja DNA, ki jo je potrebno uničiti (Virolle in sod., 2020). Obrambni mehanizmi, ki ščitijo bakterijo pred okužbo s plazmidom, so v veliki meri podobni tistim, ki bakterijo ščitijo pred vdorom virusov. V naravi se ves čas odvija bitka med virusi in njihovimi gostitelji, in domnevno je to najpomembnejša sila v evoluciji bakterijskih obrambnih sistemov. Posledica tega so številni in raznoliki protivirusni obrambni sistemi, ki zasedajo velik del genoma prostoživečih arhej in bakterij (Makarova in sod., 2013).

Obrambne sisteme lahko delimo v dve široki skupini glede na način delovanja. Prva skupina deluje po načelu ločevanja svojega od ne-svojega. Sem uvrščamo vsaj tri tipe sistemov. Prvi je restrikcijsko-modifikacijski (R-M) sistem, ki je izjemno številčen in zelo dobro karakteriziran. Temelji na metilaciji svoje genomske DNA in cepitvi nemetilirane tuje DNA.

Drugi tip je fosforilacija DNA, ki temelji na fosforilaciji svoje genomske DNA in cepitvi tuje nefosforilirane DNA. Tretji tip je sistem CRISPR-Cas, ki si je za razliko od prvih dveh tipov sposoben zapomniti, s katerimi genetskimi elementi je že prišel v stik. Pogosto je prikazan kot pridobljeni imunski sistem prokariontov. Druga skupina temelji na programirani celični smrti, kamor spadajo sistemi toksin-antitoksin (TA) in sistemi abortivne okužbe (ABI). Ti sistemi iz druge skupine predstavljajo obrambo pred virusi, ne

pa tudi plazmidi. Pogosto ravno plazmidi nosijo zapis za sistem TA, ki jim omogoča ohranjanje v populaciji, saj celica brez plazmida propade (Makarova in sod., 2013).

Odstotek genoma, ki ga zasedajo do sedaj karakterizirani sistemi TA, ABI, R-M in CRISPR-Cas, je lahko od 0 do 10 %, zagotovo pa veliko obrambnih sistemov še ni bilo odkritih in se bo sčasoma delež povečeval. Različni obrambni sistemi delujejo usklajeno in njihovi geni so zapisani v skupnih regijah, ki jih imenujemo obrambni otoki (Makarova in sod., 2013). Ti imajo visok delež obrambnih genov in genov, ki pripadajo različnim transpozonom in profagom (Makarova in sod., 2011). Tudi do 30 % vseh prokariontskih genov se lahko nahaja v obrambnih otokih (Makarova in sod., 2013).

2.4.1 Sistem CRISPR-Cas

Sistem CRISPR-Cas (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats), ki so ga prvič zaznali leta 1987 kot nenavadna ponavljajoča zaporedja (Ishino in sod., 1987), je edinstven obrambni mehanizem prokariontov, ki zagotavlja hitro in robustno prilagoditev na viruse in plazmide. Sestavljajo ga zaporedje CRISPR in geni cas. (Maraffini, 2015).

Zaporedje CRISPR je sestavljeno iz vodilnega zaporedja in neposredno ponavljajočih se regij, delno palindromskih, med katerimi so variabilna zaporedja (vmesniki). Slednja izvirajo iz preteklih okužb s tujo DNA, katere deli so bili vključeni v kromosom kot vmesniki in zagotavljajo odpornost proti ponovni okužbi z istim genetskim elementom in so iz tega vidika podobni pridobljenemu imunskemu sistemu (Al-Attar in sod., 2011). Našli so jih v 45 % sekvenciranih genomov bakterij in 84 % posekvenciranih genomov arhej (Gatino in de la Cruz, 2018).

Zaradi stalne koevolucije s fagi in drugimi genetskimi elementi so sistemi CRISPR-Cas izredno raznoliki. Delimo jih v dva razreda (1 in 2), ki sta razdeljena na 6 tipov (IVI) in 33 podtipov (na primer tip I-A do I-F). Bakterije in arheje, ki vsebujejo sistem CRISPR-Cas, imajo v 90 % sistem CRISPR-Cas iz razreda 1 (Xue in Sashital, 2019).

Geni cas se nahajajo le v genomih, ki vsebujejo zaporedja CRISPR in so običajno v njihovi bližini. Poznamo 45 genskih družin cas, ki sestavljajo različne podtipe mehanizma CRISPR-Cas. Genski družini cas1 in cas2 sta prisotni v vseh podtipih, nekatere pa so specifične za določen podtip in imajo oznako 'cs', ki ji sledi prva črka imena podtipa in številka. Proteine Cas lahko razdelimo v štiri različne module, ki se med seboj delno prekrivajo. Klasifikacija mehanizmov CRISPR-Cas je predstavljena v preglednici 1 (Makarova in sod., 2020).

Preglednica 1: Klasifikacija sistemov CRISPR-Cas (povzeto po Makarova in sod., 2020).

Razred

Modul^a Tip

Adaptacija Izražanje Interferenca Prenos signala

Razred 1 I Cas1, Cas2,

(Cas4)

Cas6 Cas7, Cas5, SS*, Cas8 ali LS III Cas1. Cas2,

(RT)

(Cas6) Cas7, Cas5, SS, Cas10 ali LS

(CARF#), (HEPN#) IV (Cas1), (Cas2) (Cas6) Cas7, Cas5,

(SS), Csf1 ali LS

(DinG)

Razred 2 II Cas1, Cas2,

(Cas4)

RNaza III Cas9 (Csn2)

V (Cas1), (Cas2), (Cas4)

Cas12 Cas12

VI (Cas1), (Cas2) Cas13 Cas13

aČe je protein zapisan znotraj oklepaja, pomeni, da ni prisoten pri vseh podtipih. Znak *: domnevna enota SS (majhna podenota sistema CRISPR-Cas) je v mnogih podtipih tipa I lahko združena z veliko podenoto. Znak

#: lahko so prisotni še drugi, neznani proteini, ki so vključeni v pot prenosa signala.

Glede na funkcijo so proteini Cas nukleaze, helikaze, integraze in polimeraze. Sodelujejo pri vključevanju in izključevanju vmesnikov, pri obdelavi prepisanih zaporedij CRISPR in pri uničenju tuje DNA (Al-Attar in sod., 2011).

Neposredno ponavljajoče regije so dolge 2840 baznih parov, njihovo število v zaporedju CRISPR je zelo spremenljivo, od nekaj do nekaj sto. Ko so prepisani v RNA, tvorijo sekundarne strukture, ki jih specifično prepoznajo določeni proteini Cas. Vmesniki med ponovitvami so zelo variabilni. Dolgi so lahko 2672 baznih parov, v istem zaporedju CRISPR pa so podobne dolžine. Izvirajo iz tujih mobilnih genetskih elementov, vendar pa jih le malo nalega na znana izvenkromosomska zaporedja fagov in plazmidov. Vodilno zaporedje je prisotno na 5'-koncu zaporedja CRISPR. Vsebuje stotine nukleotidov, vendar nima potenciala za kodiranje. Znotraj iste prokariontske vrste so si vodilna zaporedja zelo podobna, sicer pa ne. V vodilnem zaporedju E. coli K12 je promotor za prepis zaporedja CRISPR. Poleg tega bi to zaporedje lahko služilo kot podlaga za vezavo proteinov Cas pri vklapljanju vmesnikov (Al-Attar in sod., 2011).

Sistem CRISPR-Cas ima dve glavni stopnji, ki sta prikazani na sliki 3: i) CRISPR-adaptacija, pri kateri je tuja DNA vključena v zaporedje CRISPR kot nov vmesnik in ii) izvedba imunosti CRISPR. Slednja se deli na dve podstopnji. Najprej je zaporedje CRISPR prepisano, nastane pre-CRISPR RNA (pre-crRNA). Ta je potem obdelana in nastane CRISPR RNA (crRNA), poimenovana tudi vodeča RNA, ki se poveže s proteini Cas. Potem kompleks Cas-crRNA prepozna in uniči tujo DNA (Maraffini, 2015).

Slika 3: Stopnji delovanja sistema CRISPR-Cas (Maraffini in sod., 2015).

2.4.2 Sistem CRISPR-Cas tipa I-E in I-F

Člani družine Enterobacteriaceae, kamor spada tudi E. coli, običajno vsebujejo sistem CRISPR-Cas tipa I-E ali I-F, ki oba spadata v razred 1. Oba imata večproteinski kompleks, ki se pri tipu I-E imenuje Cascade (ang. CRISPR-associated complex for antiviral defence), pri tipu I-F pa Csy (ang. CRISPR system Yersinia). Za razgradnjo tarčne DNA je nujna nukleaza/helikaza Cas3, ki ni del kompleksa Cascade oziroma Csy, kar je edinstvena lastnost sistemov CRISPR-Cas tipa I. Preglednica 2 prikazuje proteine Cas sistema CRISPR-Cas tipa I in njihovo funkcijo.

Adaptacija

Kompleks Cas

Neposredno ponavljajoča se zaporedja

Vmesniki

Vodeča RNA (crRNA)

Imunost Zaporedje, homologno

vmesniku Geni cas

Preglednica 2: Proteini Cas in njihova funkcija (Xue in Sashital, 2019).

Ime proteina Cas

Posebnost podtipa^a

Funkcija I-E I-F

Cas1 Cas1 Cas1 Integrazna podenota adaptacijskega kompleksa Cas2 Cas2 Cas2/3 Strukturna podenota adaptacijskega kompleksa Cas3 Cas3 Nukleaza/helikaza, ki odvije in razgradi tarčno dsDNA

Cas5 Cas5

(CasD)

Cas5 (Csy2)

Podenota Cascade/Csy, ki prepozna 5' konec crRNA

Cas6 Cas6

(Cse3) (CasE)

Cas6f (Csy4)

Podenota Cascade/Csy, ki je potrebna za zorenje crRNA

Cas7 Cas7

(Cse4) (CasC)

Cas7 (Csy3)

Podenota Cascade/Csy, ki tvori hrbtenico kompleksa in je v kompleksu prisotna v šestih kopijah

Cas8 Cas8e

(Cse1) (CasA)

Cas8f (Csy1)

Podenota Cascade/Csy, ki prepozna zaporedje PAM in vpokliče Cas3 oziroma Cas2/3.

Cas11 Cas11 (SS) (Cse2) (CasB)

Majhna podenota Cascade, ki stabilizira netarčno verigo v R-zanki in je v kompleksu prisotna v dveh kopijah

a V oklepajih so napisane sopomenke.

Pri sistemu CRISPR-Cas tipa I sodelujeta kompleks Cascade in nukleaza Cas3. Podenota kompleksa Cas6e je endoribonukleaza, ki prepozna specifično ponovitev na prekurzorski crRNA, ki nastane po prepisu celega zaporedja CRISPR, in jo cepi. Kratke crRNA ostanejo povezane s kompleksom Cascade in ga vodijo do komplementarne tarčne DNA. Druga podenota, Cas8, prepozna kratek motiv, ki se nahaja zraven tarčnega zaporedja, ki ga prepozna crRNA. Ta motiv se imenuje PAM in je nujno potreben za delovanje sistema CRISPR-Cas tipa I. Odsotnost motiva PAM v kromosomu prepreči avtoimunsko delovanje sistema CRISPR-Cas. Kompleks Cascade se veže na tarčno dsDNA in med crRNA in tarčno dsDNA nastane R-zanka. To povzroči prihod nukleaze Cas3, ki naredi enoverižne lome v tarčni DNA virusa ali plazmida (Maraffini, 2015).

2.4.3 Restrikcijsko-modifikacijski sistem

Zaradi zelo razširjene uporabe restrikcijskih endonukleaz v molekularni biologiji so R-M sistemi najbolje preučeni obrambni mehanizmi bakterij pred vdorom tuje DNA. Razdeljeni so v 4 glavne tipe glede na razporeditev podenot, potrebe po ATP oziroma GTP in mehanizem cepitve. Vsi tipi imajo enak osnovni mehanizem, ki temelji na dveh encimih (slika 4). To sta metiltransferaza, ki metilira kromosomsko DNA, in restriktaza, ki cepi nemetilirano tujo DNA (Makkarova, 2013). Gene, odgovorne za restrikcijo in metilacijo, lahko najdemo na fagih, plazmidih in bakterijskih kromosomih (Loenen in Raleigh, 2014).

Slika 4: Delovanje restrikcijsko-modifikacijskega sistema (Sadykov, 2016). Kratica SAM stoji za S- adenozilmetionin.

Restrikcijski encimi tipa I so veliki pentamerni proteini z ločenimi podenotami za restrikcijo (podenota R), metilacijo (podenota M) in prepoznavo zaporedij DNA (podenota S).

Podenota R ima tudi helikazno aktivnost. Odkrili so jih v začetku 60. let 20. stoletja in to so bile prve restriktaze, ki so jih odkrili (Dussoix in Arber, 1962). Za razliko od restriktaz tipa II jih v molekularni biologiji ne uporabljajo. Najbolj raziskani restriktazi sta EcoKI in Eco124. Za delovanje potrebujejo ATP, Mg²⁺ in S-adenozilmetionin. Cepijo naključno, vsaj 1000 bp od prepoznavnega zaporedja. Restriktaze in metiltransferaze R-M sistema tipa I so sposobne usklajeno spreminjati prepoznavno zaporedje s prerazporeditvami in zamenjavami domen. To je možno, ker uporabljajo skupno podenoto za prepoznavanje zaporedja (podenota S). Lahko imajo več genov z zapisom za podenoto S, ki jih lahko kombinirajo med sabo. Na ta način dobijo veliko različnih kombinacij za prepoznavanje tarčnega zaporedja, in tudi če ga MGE spremenijo, da bi ušli R-M sistemu, podenota S le pridobi novo prepoznavno zaporedje. Z njim prepozna drugo tarčno zaporedje MGE in restriktaze lahko MGE uničijo (Loenen in Raleigh, 2014).

Najbolje raziskane in najbolj pogosto uporabljene restriktaze spadajo v tip II R-M sistema.

Primera sta EcoRI in HindIII. So najbolj enostavne, sestavljene so iz para restriktaza- metiltransferaza, ki sta običajno zapisani na istem operonu (Makarova, 2013). Imajo homodimerno strukturo. Prepoznajo palindromsko sekvenco dolžine 48 bp. Za delovanje ne potrebujejo ATP ali GTP, potrebujejo pa Mg²⁺. Cepijo na točno določenem mestu v prepoznavnem zaporedju ali njegovi neposredni bližini in naredijo tope ali pa lepljive konce z največ 5 bp previsa (Sistla in Rao, 2004).

Restriktaza

Metiltransferaza

Metilirana DNA gostitelja Plazmid

Nemetilirana tuja DNA

R-M sistem tipa III je sestavljen iz dveh podenot, iz restriktaze in metiltransferaze, s tem da ima podenota R tudi helikazno aktivnost. Za aktivnost potrebuje ATP, Mg²⁺ in S- adenozilmetionin. DNA cepijo 2527 bp od prepoznavnega zaporedja. Najbolj preučena sta EcoP1 in EcoP15 (Rao in sod., 2013).

R-M sistem tipa IV je sestavljen iz dveh različnih podenot z endonukleazno in GTPazno aktivnostjo. Za delovanje potrebuje Mg²⁺ in GTP. Za razliko od ostalih tipov R-M sistema prepozna metilirano DNA in jo cepi na več pozicijah med metiliranimi bazami. Ta sistem je obramba pred fagi, ki so se R-M sistemu poskusili izogniti z metilacijo lastne DNA. R-M sistem ne cepi kromosomske DNA, ker ta ne vsebuje tarčnega zaporedja, ki ga prepozna restriktaza tipa IV (Loenen in Raleigh, 2014).

3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL

3.1.1 Bakterijski sevi

V nalogi smo uporabili seve E. coli, katerih lastnosti so povzete v preglednici 3.

Preglednica 3: Sevi E. coli, ki smo jih uporabili pri magistrski nalogi.

Sev E. coli ^a Genotip, fenotip Vir

Nissle 1917 Prototrof, Sm^s, Cm^s, Ap^s Jerneja Ambrožič Avguštin

MG1655 Prototrof, Sm^s, Cm^s, Ap^s Christophe Beloin

RIS41 Prototrof, Sm^s, Cm^s, Ap^r Marina V. Kuznetsova

RIS52 Prototrof, Sm^s, Cm^s, Ap^r Marina V. Kuznetsova

RIS28 Prototrof, Sm^r, Cm^s, Ap^r Marina V. Kuznetsova

RIS12 Prototrof, Sm^r, Cm^s, Ap^r Marina V. Kuznetsova

RIS49 Prototrof, Sm^r, Cm^s, Ap^r Marina V. Kuznetsova

HB101 pOX38:Cm F–, thi-1, hsdS20 (rB–, mB–), supE44, recA13, ara-14, leuB6, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Sm^r), xyl-5, mtl-1, s plazmidom pOX38:Cm (Tra⁺, RepFIA⁺, Cm^r)

Živa Petkovšek

aPri bioinformacijski analizi smo uporabili zaporedje plazmida pOX38, saj plazmid pOX38:Cm ni bil sekvenciran.

3.1.2 Gojišča

3.1.2.1 Tekoče gojišče Luria-Bertani (LB)

V erlenmajerici smo v 0,5 L destilirane vode raztopili 12,5 g osnove za gojišče LB do koncentracije 25 g/L. Po 5 mL gojišča smo odpipetirali v epruvete in jih avtoklavirali 15 minut pri 121 °C. Do uporabe smo jih hranili pri sobni temperaturi.

3.1.2.2 Tekoče gojišče LB z antibiotiki

Gojišče smo pripravili po enakem postopku kot tekoče gojišče LB brez antibiotikov. Pred uporabo smo dodali ustrezno količino antibiotika in dobro premešali. Koncentracije so navedene v preglednici 4.

Preglednica 4: Založne in končne koncentracije antibiotikov.

Antibiotik Založna koncentracija [mg/mL]

Končna koncentracija [µg/mL]

Ampicilin 100 100

Kloramfenikol 50 50

Streptomicin 200 50

3.1.2.3 Trdno gojišče LB

V erlenmajerici smo v 0,5 L destilirane vode raztopili 7,5 g agarja do koncentracije 15 g/L in 12,5 g osnove za gojišče LB do koncentracije 25 g/L. Premešali smo na magnetnem mešalu in avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Ohladili smo na 55 °C in razlili v sterilne plastične petrijevke. Do uporabe smo plošče hranili pri temperaturi 4 °C

3.1.2.4 Trdno gojišče LB z antibiotiki

Gojišče smo pripravili po enakem postopku kot trdno gojišče LB brez antibiotika, le da smo pred razlivanjem, ko se je gojišče ohladilo na 55 °C, dodali ustrezno količino antibiotika (navedeno v preglednici 4) in dobro premešali. Do uporabe smo pripravljene plošče hranili pri temperaturi 4 °C.

3.1.2.5 Mehki agar LB

V stekleni čaši smo v 0,5 L destilirane vode raztopili 12,5 g osnove za gojišče LB do koncentracije 25 g/L in 3,75 g agarja do koncentracije 7,5 g/L. V mikrovalovni pečici smo segrevali, dokler se agar ni raztopil. Potem smo 4 mL gojišča odpipetirali v male epruvete in jih sterilizirali z avtoklaviranjem 15 min pri 121 °C. Hranili smo jih pri temperaturi 4 °C.

3.1.2.6 Tekoče gojišče LB z glicerolom

Pripravili smo 70 mL tekočega gojišča LB brez antibiotikov in dodali 30 mL glicerola.

Dobro smo premešali in shranili pri temperaturi 4 °C.

3.1.2.7 Trdno minimalno gojišče z glukozo (MG)

Najprej smo pripravili 250 mL 50×E. To smo naredili tako, da smo v infuzijsko stekleničko natehtali 2,5 g MgSO4 × 7 H2O, 25 g citronske kisline, 125 g K2HPO4 in 43,75 g NaNH4HPO4 × 4 H2O ter dolili destilirano vodo do 250 mL. Potem smo mešali na mešalu, dokler se ni vse raztopilo. Za pripravo 0,5 L gojišča smo v erlenmajerico nalili 10 mL 50×E in 200 mL destilirane vode. V drugi erlenmajerici smo raztopili 7,5 g agarja v 290 mL destilirane vode. Obe erlenmajerici smo avtoklavirali 15 min pri 121 °C in ju v vodni kopeli ohladili do 55 °C. Vsebino obeh erlenmajeric smo potem združili, dodali 2,5 mL 40-odstotne raztopine glukoze, dobro premešali in razlili v sterilne plastične petrijevke. Glukozo smo sterilizirali s filtriranjem. Do uporabe smo plošče hranili pri temperaturi 4 °C.

3.1.2.8 Trdno minimalno gojišče z glukozo z antibiotiki

Trdno minimalno gojišče z glukozo z antibiotiki smo pripravili po enakem postopku kot minimalno gojišče z glukozo brez antibiotika. Pred razlivanjem smo gojišče ohladili na

55 °C, dodali ustrezno količino antibiotika (koncentracije so navedene v preglednici 4) in dobro premešali. Do uporabe smo plošče hranili pri temperaturi 4 °C.

3.1.2.9 Trdno gojišče MacConkey-agar (MAC)

V erlenmajerico smo natehtali 25 g osnove za trdno gojišče MacConkey-agar in dolili 0,5 L destilirane vode do koncentracije 50 g/L. Premešali smo na magnetnem mešalu s segrevanjem do 100 °C in avtoklavirali 15 min pri 121 °C. Potem smo gojišče ohladili v vodni kopeli do temperature 55 °C in ga razlili v sterilne plastične petrijevke. Do uporabe smo plošče hranili pri temperaturi 4 °C.

3.1.2.10 Trdno gojišče MacConkey-agar z antibiotiki

Gojišče smo pripravili po enakem postopku kot trdno gojišče MacConkey-agar brez antibiotikov, le da smo pred razlivanjem dodali ustrezno količino antibiotika (koncentracije so navedene v preglednici 4) in dobro premešali. Do uporabe smo plošče hranili pri temperaturi 4 °C.

3.1.3 Kemikalije

Pri delu za magistrsko nalogo smo uporabljali v preglednici 5 naštete kemikalije.

Preglednica 5: Uporabljene kemikalije.

Kemikalija Proizvajalec

6 × nanašalni pufer Thermo Scientific, Velika Britanija

agar VWR Chemicals, Italija

agaroza Sigma Chemicals, ZDA

amonij natrij hidrogenfosfat (NaNH4HPO4× 4 H2O) Sigma Chemicals, ZDA

ampicilin Sigma Chemicals, ZDA

citronska kislina Sigma Chemicals, ZDA

dH2O Pralnica oddelka za biologijo, BF

dikalijev hidrogen fosfat (K2HPO4) Sigma Chemicals, ZDA

glicerol Carlo Erba, Italija

glukoza anhidrid Sigma Chemicals, ZDA

gojišče LB LLG-LABware, Nemčija

gojišče MacConkey-agar Merck, Nmečija

kanamicin Sigma Chemicals, ZDA

kloramfenikol Sigma Chemicals, ZDA

kloroform Carlo Erba, Italija

0,5 × TBE Pripravljalnica oddelka za biologijo, BF

magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO4 × 7 H2O) Acros Organics, Belgija

natrijev klorid (NaCl) Thermo Fisher Scientific, ZDA

3.1.4 Reagenti za ERIC-PCR

Za reakcijo ERIC-PCR smo uporabili v preglednici 6 navedene reagente in začetne nukleotide.

Preglednica 6: Reagenti za ERIC-PCR in njihove koncentracije in proizvajalci.

Reagent Založna

koncentracija

Proizvajalec

voda MQ - Pralnica oddelka za biologijo, BF

pufer za Taq-polimerazo brez MgCl2 10× Thermo Fisher Scientific, ZDA

MgCl2 25 mM Thermo Fisher Scientific, ZDA

začetni oligonukleotid ERIC1R (5'- ATGTAAGCTCCTGGGGAT TCAC-3')

20 pmol/µL Integrated DNA Technologies, ZDA začetni oligonukleotid ERIC2 (5'-

AAGTAAGTGACTGGG GTGAGCG-3')

20 pmol/µL Integrated DNA Technologies, ZDA

Mešanica dNTP 10 mM Thermo Fisher Scientific, ZDA

Taq-polimeraza 5 U/µL Thermo Fisher Scientific, ZDA

Lestvica DNA

Uporabili smo lestvico DNA »GeneRulerTM 1 kb DNA«, proizvajalca Thermo Scientific, ki je prikazana na sliki 5.

Slika 5: Lestvica DNA »GeneRulerTM 1 kb DNA«.

3.1.5 Pufri in reagenti 3.1.5.1 Fiziološka raztopina

V infuzijsko stekleničko smo natehtali 0,9 g NaCl in dolili 100 mL destilirane vodo, tako da je bila končna koncentracija NaCl 0,9 %. Dobro smo premešali na magnetnem mešalu in shranili pri sobni temperaturi.

3.1.6 Laboratorijska oprema

Pri delu za magistrsko nalogo smo uporabili v preglednici 7 našteto laboratorijsko opremo.

Preglednica 7: Laboratorijska oprema.

Laboratorijska oprema in pribor Proizvajalec

aparatura za gelsko elektroforezo LKB Bromma, Švedska

aparatura za PCR Bio-Rad, ZDA

avtoklav Kambič, Slovenija

avtomatske pipete z nastavki Eppendorf, Nemčija

kuhalna plošča Clatronic, Nemčija

laboratorijska steklovina DWK Life Sciences in Isolab, Nemčija

laminarij Waldner Electronics, Nemčija

magnetno mešalo Ika, Kitajska

mikrocentrifugirke Eppendorf, Nemčija

mikrovalovna pečica Gorenje, Slovenija

namizna centrifuga 5418R Eppendorf, Nemčija

namizna tehtnica Sartorius, Nemčija

plastične petrijevke Golias, Slovenija

plinski gorilnik TLOS, Hrvaška

rotacijski stresalnik IKA ® VORTEX 2 Ika, Kitajska

termoblok Constantemp Technilab, ZDA

UV presvetljevalnik G-BOX Syngene, Velika Britanija

vodna kopel Fisher Scientific, ZDA

3.2 METODE

3.2.1 Prekonočna kultura bakterijskih sevov

Eno kolonijo bakterijskega seva smo s sterilno cepilno zanko prenesli v tekoče gojišče LB z dodanimi ustreznimi antibiotiki in stresali preko noči na stresalniku (180 obr./min) pri 37 °C.

3.2.2 Ugotavljanje frekvence konjugacije na trdnem gojišču LB

Pripravili smo prekonočne kulture donorskega seva HB101 pOX38:Cm (tekoči LB s kloramfenikolom) in recipientskih sevov Nissle 1917 (tekoči LB), RIS52, RIS41, RIS28, RIS12 in RIS49 (tekoči LB z ampicilinom). Naslednji dan smo prenesli 50 µL premešane prekonočne kulture vseh sevov v 5 mL svežega predogretega tekočega gojišča LB brez antibiotika in inkubirali 2 h na stresalniku (180 obr./min) pri 37 °C. Po inkubaciji smo 1 mL recipientske kulture centrifugirali 10 min pri 2000 rcf, zavrgli supernatant in pelet celic resuspendirali v 400 µL donorske bakterijske kulture. Celotno zmes smo prenesli na ploščo LB brez antibiotikov in inkubirali 24 h pri 37 °C. Po inkubaciji smo na ploščo dodali 1 mL fiziološke raztopine, dobro premešali s stekleno Drigalski spatulo, izvedli redčitveno vrsto in prenesli 100 µL dobro premešane redčene kulture na selekcijske plošče, kot je navedeno v preglednici 8. Plošče smo inkubirali preko noči pri 37 °C. Če so bile kolonije premajhne, smo plošče pustili še 24 h, v nekaterih primerih še dodatnih 48 h.

Na selekcijskih ploščah (navedene v preglednici 8) smo prešteli število CFU donorja, recipienta in transkonjugant in izračunali frekvenco konjugacije po enačbi 1:

Frekvenca konjugacije: (število CFU transkonjugant/mL) / (število CFU recipienta/mL) …(1) Poskus smo ponovili dvakrat in izračunali aritmetično sredino in standardno napako frekvence konjugacije.

Preglednica 8: Selekcijske in diferencialne plošče za različne konjugacijske pare.

Konjugacijski par Selekcijske plošče^a

HB101 pOX38:Cm × Nissle 1917 LB Sm, MG, MAC Cm

HB101 pOX38:Cm × RIS12 LB Ap, MAC Ap Cm

HB101 pOX38:Cm × RIS28 LB Ap, MAC Ap Cm

HB101 pOX38:Cm × RIS41 LB Sm, LB Ap, MAC Ap Cm

HB101 pOX38:Cm × RIS49 LB Ap, MAC Ap Cm

HB101 pOX38:Cm × RIS52 LB Sm, LB Ap, MAC Ap Cm

aNa ploščah LB Ap in MG, ki smo jih uporabili za ugotavljanje števila CFU recipienta, zrastejo tudi transkonjugante, vendar je le-teh veliko manj in jih lahko zanemarimo (razlika za več velikostnih razredov).

3.2.3 Celični lizat celic za PCR

Iz nekaterih kolonij na selekcijskih ploščah za transkonjugante ter s plošč s čisto kulturo recipienta in donorja smo pripravili celični lizat. Domnevne transkonjugante smo nacepili v tekoče gojišče LB s kloramfenikolom in ampicilinom (vsi sevi RIS) oziroma samo s kloramfenikolom (Nissle 1917), recipientske seve smo nacepili v tekoče gojišče LB z ampicilinom (vsi sevi RIS) oziroma brez antibiotika (Nissle 1917 in MG1655), donorski sev pa v tekoče gojišče LB s kloramfenikolom. Preko noči smo jih inkubirali na stresalniku (180 obr./min) pri 37 °C. Naslednji dan smo epruvete s prekonočno kulturo premešali na rotacijskem stresalniku, odpipetirali 1 mL kulture v mikrocentrifugirko in jo centrifugirali 1 min pri 16 000 rcf. Potem smo popolnoma odstranili supernatant in celični pelet resuspendirali v 200 µL sterilne destilirane vode. Suspenzijo smo inkubirali 10 min pri 100 °C. Po inkubaciji smo mikrocentrifugirko centrifugirali 10 min pri 16000 rcf ter nato prenesli 150 µL supernatanta v svežo mikrocentrifugirko. Do uporabe smo jo shranili pri

20 °C.

3.2.4 ERIC-PCR

V preglednici 9 je zapisana sestava reakcijske mešanice, v preglednici 10 pa protokol pomnoževanja za ERIC-PCR.

Preglednica 9: Sestava reakcijske mešanice za ERIC-PCR.

Reakcijska zmes za ERIC-PCR Skupni reakcijski volumen:

25 µL

Destilirana voda 13,375 µL

Pufer za Taq-polimerazo brez MgCl2 2,5 µL

MgCl2 s koncentracijo 25 mM 2,5 µL

Začetni oligonukleotid ERIC1R s koncentracijo 20 pmol/µL 0,5 µL Začetni oligonukleotid ERIC2 s koncentracijo 20 pmol/µL 0,5 µL

Mešanica dNTPjev s koncentracijo 10 mM 0,5 µL

Taq-polimeraza (5 U/µL) 0,125 µL

Celični lizat 5 µL

Preglednica 10: Protokol pomnoževanja za ERIC-PCR.

Korak Temperatura Trajanje Število ciklov

Začetna denaturacija 94 °C 4 min 1×

Denaturacija 94 °C 30 sek

35×

Prileganje začetnih nukleotidov 40 °C 15 sek

Sinteza 72 °C 5 min

Končna sinteza 72 °C 7 min 1×

3.2.5 Agarozna gelska elektroforeza

Agarozni gel smo pripravili tako, da smo natehtali 0,3 g agaroze v erlenmajerico, dolili 40 mL 0,5 × TBE in postavili v mikrovalovno pečico, dokler se agaroza ni raztopila. Potem smo jo ohladili v vodni kopeli do 55 °C in dodali 2 µL etidijevega bromida. Dobro smo premešali, razlili v nosilec za gel in vstavili glavniček. Po 30 min smo glavniček odstranili in dali v elektroforezno banjico. Vse skupaj smo prelili s pufrom 0,5 × TBE. Vzorce smo zmešali s 6 × nanašalnim pufrom in 6 µL vzorca nanesli v jamice. Poleg tega smo dodali še standardno lestvico DNA »GeneRulerTM 1 kb DNA«. Elektroforezno banjico smo priključili na napetost 120 V in pustili približno 30 min, da so se fragmenti DNA lepo ločili po gelu.

3.2.6 Test protimikrobnega delovanja recipientskih sevov

Kolonije recipientskih sevov (Nissle 1917, RIS12, RIS28, RIS41, RIS49 in RIS52) ter negativno kontrolo MG1655 smo s sterilnim zobotrebcem prenesli na ploščo LB (vse seve na eno ploščo) in jo inkubirali preko noči pri 37 °C. Donorski sev HB101 pOX38:Cm smo nacepili v tekoče gojišče LB s kloramfenikolom in inkubirali preko noči na stresalniku (180 obr./min) pri 37 °C.

Naslednji dan smo kolonije, zrasle na plošči, lizirali s kloroformom. Na približno deset lističev staničevine, nameščenih v stekleni petrijevki, smo v laminariju nakapljali kloroform in čez njih za 15 min poveznili ploščo s kolonijami. Po 15 min smo ploščo z liziranimi kolonijami obrnili okrog in jo za 15 min pustili nepokrito, da je kloroform izhlapel. 4 mL mehkega agarja smo inkubirali v vodni kopeli pri 100 °C, dokler se ni raztopil. Nato smo ga inkubirali 10 min pri 46 °C. Po 10 minutah smo v mehki agar odpipetirali 200 µL prekonočne kulture donorja. Dobro smo premešali in prelili ploščo z liziranimi kolonijami. Ploščo smo inkubirali preko noči pri 37 °C. Naslednji dan smo preverili, če so okrog liziranih kolonij nastale cone lize.

3.2.7 Shranjevanje bakterijske kulture

Vse transkonjugante, ki smo jih pridobili v tej raziskavi, smo shranili pri 80 °C. Kolonijo transkonjugante smo nacepili v tekoče gojišče LB z ustreznimi antibiotiki (Nissle 1917 pOX38:Cm s kloramfenikolom, RIS sevi s pOX38:Cm z ampicilinom in kloramfenikolom) in jo pustili preko noči na stresalniku (180 obr./min) pri 37 °C. Naslednji dan smo iz prekonočne kulture odpipetirali 750 µL v kriovialko in dodali 750 µL tekočega LB s 30 % glicerola. Premešali smo na rotacijskem mešalniku in shranili pri 80 °C.