UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Žiga NOLDE DREV
RAZNOLIKOST GENSKIH VIROV GRAHORJA (Lathyrus sp.)
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Žiga NOLDE DREV
RAZNOLIKOST GENSKIH VIROV GRAHORJA (Lathyrus sp.) DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
VARIABILITY OF GRASS PEA (Lathyrus spp.) GENETIC RESOURCES
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Vladimirja Megliča, za somentorja pa dr. Lovra Sinkoviča.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: izr. prof. dr. Vladimir MEGLIČ
Kmetijski inštitut Slovenije, Oddelek za poljedelstvo, vrtnarstvo, genetiko in žlahtnjenje
Član: dr. Lovro SINKOVIČ
Kmetijski inštitut Slovenije, Oddelek za poljedelstvo, vrtnarstvo, genetiko in žlahtnjenje
Član: doc. dr. Polonca ŠTEFANIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum predstavitve: 6. 9. 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 582.736.310:601.4:575.22:581.4(043.2)
KG grahor, rastlinski genski viri, Lathyrus sp., deskriptor, morfološka raznolikost, genetske analize, akcesija
AV NOLDE DREV, Žiga
SA MEGLIČ, Vladimir (mentor), SINKOVIČ, Lovro (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN RAZNOLIKOST GENSKIH VIROV GRAHORJA (Lathyrus sp.) TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)
OP VI, 20 str., 2 pregl., 2 sl., 41 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Grahor (Lathyrus sp.) je manj znan rod stročnic, ki sodi v družino metuljnic. Najbolj razširjen predstavnik je navadni grahor (Lathyrus sativus L.), ki ga odlikujejo visoka vsebnost proteinov v semenih. Navadni grahor je odporen na neugodne okoljske pogoje kot so suša, visoka vlažnost in slanost, ter škodljivce in bolezni, ki pestijo druge kulturne rastline. Semena navadnega grahorja se uporabljajo predvsem za krmo živali, v nekaterih predelih sveta pa tudi za prehrano ljudi. Ker pa vsebujejo semena te rastline toksično aminokislino β-ODAP, ki lahko ob pogostem uživanju povzroča hudo živčno obolenje, je grahor do sedaj relativno slabo raziskana vrsta. V diplomski nalogi smo skušali proučiti morfološko in genetsko raznolikost genskih virov navadnega grahorja. Ugotovil smo, da so morfološke značilnosti grahorja dobro raziskane, manj pa njegova genetska raznolikost. Šele v zadnjih letih se pojavljajo študije, ki se ukvarjajo z genetskimi in molekularnimi markerji, ki omogočajo hitrejšo in učinkovitejšo selekcijo rastlin navadnega grahorja. V okviru praktičnega dela smo na podlagi različnih morfoloških deskriptorjev za semena (npr. dolžina in širina semen, masa 100-semen, barva in vzorec na plašča) ocenjevali raznolikost genskih virov grahorja iz južne in jugovzhodne Evrope. Rezultati so pokazali, da je raznolikost na tem območju v primerjavi z drugimi raziskavami manjša. Pridobljene informacije bodo osnova za opis preučevanih genskih virov navadnega grahorja in uporabni v nadaljnjih raziskavah ter programih žlahtnjenja.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 582.736.310:601.4:575.22:581.4(043.2)
CX grass pea, plant genetic resources, Lathyrus spp., descriptor, morphological diversity, genetic analysis, accession
AU NOLDE DREV, Žiga
AA MEGLIČ, Vladimir (supervisor), SINKOVIČ, Lovro (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI VARIABILITY OF GRASS PEA (Lathyrus spp.) GENETIC RESOURCES DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)
NO VI, 20 p., 2 tab., 2 fig., 41 ref.
LA sl AL sl/en
AB Grass pea (Lathyrus spp.) is a less known genus of legumes, that belongs to the Fabaceae family. The most widespread member is common grass pea (Lathyrus sativus L.), which is characterized by high protein content in the seed. Grass pea is tolerant to several traits, such as drought resistance, high humidity and salinity resistance, and many common pests and diseases that affect other crops. The grass pea seeds are mainly used as animal feed, and in some parts of the world also for human consumption. However, because the seeds of this plant contain a toxic amino acid known as β-ODAP, which causes a severe neurological disease if consumed frequently in high quantities, grass pea has so far been a less researched species. Within the bachelor's thesis, the morphological and genetic variability of grass pea genetic resources were studied. The morphological properties of grass pea are much more researched than its genetic variability. Over recent years more studies regarding genetic and molecular markers that allow faster, and more efficient selection of grass pea plants have been implemented. As part of the bachelor's thesis’ practical work, morphological seed diversity of pea genetic resources from the south and south- eastern Europe was measured. Several morphological descriptors for seeds (e.g., seed length and width, 100-seed weight, colour and pattern of seed coat) were used. The obtained information will be the basis for the description of the studied grass pea genetic resources and useful in further research studies and breeding programs.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IVV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VII
KAZALO SLIK VII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VII
1 UVOD 1
1.1 NAMEN IN POVOD DELA 1
2 PREGLED OBJAV 1
2.1 TAKSONOMIJA IN OPIS RASTLINE 1
2.1.1 Taksonomija 1
2.1.2 Opis rastline 2
2.1.3 Ekonomski in kmetijski pomen 2
2.1.4 Latirizem in β-ODAP 3
2.2 MORFOLOŠKA RAZNOLIKOST 4
2.3 GENETSKA RAZNOLIKOST 7
3 VREDNOTENJE SEMEN Z MORFOLOŠKIMI DESKRIPTORJI 12
3.1 MATERIALI IN METODE 12
3.2 VREDNOTENJE NUMERIČNIH DESKRIPTORJEV 13
3.3 VREDNOTENJE OPISNIH DESKRIPTORJEV 14
3.4 SKLEPI 15
4 ZAKLJUČEK 16
5 VIRI 16
ZAHVALA 20
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Zbirka preučevanih 25 genskih virov navadnega grahorja (Lathyrus sativus L.)
12 Preglednica 2: Numerični deskriptorji na semenih v zbirki grahorja iz južne in jugovzhodne Evrope
14
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Dolžina, širina in debelina semen grahorja 13
Slika 2: Barvni deskriptorji na semenih v zbirki grahorja iz južne in jugovzhodne Evrope
15
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
bp bazni par
IPGRI mednarodni inštitut za rastlinske genske vire (angl. International Plant Genetic Resources Institute)
ITAP intronski ciljno pomnoženi polimorfizmi (angl. Intron Targeted Amplified Polymorphism)
PCR verižna reakcijo s polimerazo (angl. Polymerase Chain Reaction)
RAPD naključno pomnožena polimorfna DNK (angl. Random Amplified Polymorphic DNK)
RFLP polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (angl. Restriction Fragment Length Polymorphism)
SSR enostavna sekvenčna ponovitev (angl. Simple Sequence Repeat) β-ODAP 3-(b-N-oksalna)-L-2,3 diaminopropionska kislina
1 1 UVOD
1.1 NAMEN IN POVOD DELA
Grahor (Lathyrus sp.) je stročnica, ki sodi v družino metuljnic (Fabaceae) in obsega okoli 160 znanih vrst. Rastline so dvokaličnice, večina vrst je enoletnih rastlin, nekatere med njimi pa so trajnice. Najbolj razširjena vrsta je navadni grahor (Lathyrus sativus L.), ki se zaradi visoke vsebnosti proteinov uporablja predvsem kot krma za živali, v nekaterih predelih sveta pa tudi za prehrano ljudi. Največ navadnega grahorja pridelajo v Indiji, Pakistanu, Bangladešu in Etiopiji (Polignano in sod., 2005). Kljub visoki vsebnosti proteinov in odpornosti na sušo je grahor v Evropi manj poznana in slabo razširjena vrsta, ki se relativno redko uporablja za prehrano ljudi in živali. To je posledica nekaterih antinutritivnih snovi v semenu, kot je 3-(b- N-oksalna)-L-2,3 diaminopropionska kislina (β-ODAP), ki lahko ob dolgotrajnem uživanju povzroči razvoj nevroloških bolezni tako pri ljudeh kot pri živalih (Barpete, 2015).
V zadnjem času se zaradi ohranjanja genetske raznovrstnosti, anotiranja genomov in žlahtnjenja rastlinskih vrst z novimi metodami pojavlja potreba po natančnejšem pregledu genskih virov grahorja, ki so shranjeni v genskih bankah. Ti genski viri iz rodu Lathyrus sp.
so slabo opisani in še ne povsem raziskani. V okviru diplomskega seminarja smo pregledali dostopno literaturo v povezavi z omenjeno vrsto, pri čemer je glavni poudarek na morfološki in genetski raznolikosti genskih virov navadnega grahorja, ki so shranjeni v genskih bankah južne in jugovzhodne Evrope.
2 PREGLED OBJAV
2.1 TAKSONOMIJA IN OPIS RASTLINE 2.1.1 Taksonomija
Metuljnice so taksonomska družina kritosemenk, ki obsega 700 rodov in več kot 17000 vrst rastlin. Mnoge med njimi so ekonomsko pomembne kulturne rastline. Kulturne rastline, ki sodijo v družino metuljnic pokrivajo med 12 in 15 % vseh svetovnih obdelovalnih površin in predstavljajo približno 27 % letnega svetovnega pridelka. Številne pomembne vrste iz družine metuljnic sodijo v družino Fabaceae, ki obsega več kot 380 različnih rastlinskih vrst, v katero spadajo številne kulturne rastline kot so grašica (Vicia L.), grahor (Lathyrus L.), leča (Lens Mill.), grah (Pisum L.) in Vavilovia Fed. Najbolj znani predstavniki rodu Fabaceae so fižol, grah, leča in bob. V to družino spadajo tudi manj pomembne stročnice, kot so Lathyrus sativus L., Lathyrus sphaericus Retz., Lathyrus odoratus L., Vicia sativa L. in Vicia villosa L.
Rastline iz te taksonomske družine uspevajo tako rekoč po celem svetu, najdemo jih v vzhodnem Sredozemlju in vzhodni Evropi, Aziji, severni in tropski/centralni Afriki, Južni Ameriki, Polineziji in na Havajih pa tudi na številnih srednje atlantskih otokih (Schaefer in sod., 2012).
2
Vrsta Lathyrus sp. obsega okoli 160 znanih vrst, ki so razširjene po južni Aziji, na Bližnjem vzhodu, v severni in centralni Afriki, južni Ameriki ter južni, jugovzhodni in vzhodni Evropi (Barpete, 2015). Najpomembnejši predstavniki rodu so Lathyrus sativus, Lathyrus cicera, Lathyrus tingitanus, Lathyrus ochrus, Lathyrus latofolius in Lathyrus sylvestris (Campbell, 1997).
2.1.2 Opis rastline
Navadni grahor (Lathyrus sativus L.) je močno razvejana ali plezajoča enoletna rastlina. Iz glavnega korena, iz katerega izraščajo stranske korenine in koreninski laski, prekriti z noduli, raste več tankih stebel v obliki manjšega grma. Steblo rastline je štirikotno, ovenčano s pernatimi listi. Listi so suličasti in izraščajo v parih, navadno po en ali dva para skupaj. Dolgi so med 5 in 7,5 cm, široki pa približno 1 cm. Pecelj je trikotne oblike. Cvetovi grahorja so metuljaste oblike, ki je značilna za družino metuljnic. Lahko so različnih barv, najpogosteje so beli, živo modri, rdeče vijolični ali rdeči, in imajo deset prašnikov (Xu in sod., 2017).
Stroki so ovalni, ploščati in se rahlo bočijo preko semen. Dolgi so med 2,5 in 4,5 cm, široki od 0,6 do 1 cm in rahlo zakrivljeni. Vsak strok vsebuje tri do pet semen, redkeje do sedem.
Oblika semen se lahko med rastlinami razlikuje, večinoma pa so semena oglata in nekoliko klinaste ali trikotne oblike. Premer semen je med 5 in 10 mm, čeprav pri mnogih udomačenih kultivarjih semena dosežejo precej večje premere, tudi do 15 mm (Campbell, 1997).
Semenska ovojnica je lahko različnih barv, največkrat pa je bela, siva, rumena, rjava, rožnata ali zelena. Pogosto se pojavljajo različni mozaični vzorci na plašču semena (Descriptors …, 2000). Višina rastlin močno variira, saj je pogojena z mnogimi genetskimi in okolijskimi faktorji. V primeru manj ugodnih pogojev je višina rastlin le okrog 25 cm, kadar so razmere za rast zelo primerne, pa lahko rastline dosežejo tudi do 170 cm (Grela in sod., 2012).
2.1.3 Ekonomski in kmetijski pomen
Zaradi visoke vsebnosti proteinov v semenih so rastline iz rodu Lathyrus sp. primerne tako za človeško prehrano (Lathyrus cicera, Lathyrus sativus), kot tudi za pridobivanje krme (Lathyrus ochrus, Lathyrus articulatus) (Ben Brahim in sod., 2001). Dober dokaz za to je dejstvo, da segajo prve sledi pridelave grahorja v sam začetek kmetijstva. Na najdišču Santa Maria v današnji Španiji so arheologi našli shranjena semena iz rodu Lathyrus sp., ki so stara med 9000 in 12000 let (Aura in sod., 2005).
Kot omenjeno, so semena grahorja zelo hranljiva in vsebujejo veliko proteinov. Študija srbskih raziskovalcev je pokazala, da je vsebnost proteinov v semenih navadnega grahorja okoli 290 g/kg suhe mase, kar je nekoliko več kot pri grahu (267 g/kg suhe mase) in precej manj kot pri soji (553 g/kg suhe mase). Poleg visoke vsebnosti proteinov vsebujejo semena
3
grahorja tudi primerljive ali višje vrednosti nekaterih pomembnih aminokislin, kot so cistein, lizin in alanin (Mihailović in sod., 2007). Ob optimalnih pogojih lahko dosežejo pridelki grahorja letne donose, ki so okoli 3,3 t užitnih semen/ha, 45,3 t/ha zelene krme in 13,9 suhe krme/ha (Mikić in sod, 2011).
Zaradi relativno visoke vsebnosti toksičnih snovi pridelovalci grahor pogosteje uporabljajo za krmo živali, kot za prehrano ljudi. Krma z visoko vsebnostjo proteinov je najpogosteje uporabljena za laktirajoče krave in mlade bike v času težkega fizičnega dela. V nekaterih predelih sveta pa ljudje uživajo semena različnih barv in prav barva semen je pogosto indikator vsebnosti nekaterih antinutritivnih snovi. Bolj obarvana semena so na primer povezana z višjo vsebnostjo čreslovin. Priprava jedi iz semen grahorja v različnih kulturah po svetu poteka na različne načine. V Indiji semena jedo kot kuhano prilogo, z njimi pripravijo juho ali pa jih zmeljejo v moko. V Etiopiji jih zmeljejo v moko skupaj z drugimi semeni in iz nje pripravijo kruh iz slanega testa. V južni Aziji stroke prekuhajo in jedo kot zelenjavo ali prilogo mesu (Campbell, 1997). Poleg velike hranilne vrednosti je grahor odporen na manj ugodne pridelovalne pogoje kot so suša, poplave in zasoljenost tal. Prav tako je rastlina odporna na nekatere škodljivce in pogoste bakterijske ter glivične okužbe, kot je peronospora (McCutchan, 2003). Vrsta Lathyrus odoratus je pogosto uporabljena in cenjena kot okrasna rastlina (Razdan in sod., 1980).
2.1.4 Latirizem in β-ODAP
Kljub želenim lastnostim, ki jih posedujejo rastline iz rodu Lathyrus sp., je njihova uporaba še vedno dokaj omejena. To je predvsem posledica dejstva, da te rastline vsebujejo nekatere antinutritivne snovi, ki ob prevelikem vnosu povzročajo živčno obolenje, znano kot latirizem oziroma nevrolatirizem. To obolenje se pokaže kot šibkost in otrplost mišic, v hujših primerih kot paraliza nog pri ljudeh, zadnjih nog pri živalih in v najhujšem primeru smrt (Rao in sod., 1964). Simptomi so posledica poškodbe spodnjega in zgornjega dela motoričnega nevrona, potek bolezni pa spominja na amiotrofično lateralno sklerozo (Spencer in sod., 1986). Glavni povzročitelj bolezni je aminokislina 3-(b-N-oksalna)-L-2,3 diaminopropionska kislina ali krajše β-ODAP (Tiwari in Campbell, 1996). Omenjena spojina se v naravi pojavlja v dveh izomerskih oblikah, α in β, pri čemer je slednja bolj toksična in pogostejšPredtavlja namreč okoli 95 % omenjene aminokisline prisotne v naravi (Kumar in sod., 2011). β-ODAP se akumulira v celi rastlini, na človeka pa najbolj vpliva njena prisotnost v semenih, ki predstavljajo del rastline, ki se uporablja za prehrano. Študije so pokazale, da se največ β- ODAP akumulira v mladih semenih in mladih listih. Ni še povsem znano, ali je to posledica de novo sinteze v teh organih ali gre za translokacijo iz drugih delov rastline. Večje količine antinutrientne spojine β-ODAP so pogosto povezane s povečano prisotnostjo prostih z dušikom bogatih snovi (Jiao in sod., 2006).
Zaradi možnih negativnih posledic pogostega uživanja semen rastlin rodu Lathyrus sp. je bilo opravljenih več študij na temo zmanjšanja vsebnosti antinutritivnih snovi (Tiwari in sod.,
4
1995). Grela in sod. (2001) so dokazali, da lahko namakanje in stiskanje semen zmanjšata vsebnost β-ODAP in nekaterih drugih snovi kot so čreslovina, tanini in inhibitorji tripsina.
Rezultati študije so pokazali, da ima na zmanjšanje vsebnosti β-ODAP v semenih, velik vpliv vsebnost vode in temperatura med stiskanjem. Neobdelana semena so vsebovala v povprečju 984 mg β-ODAP/kg semen, stisnjena 694 mg/kg, predhodno namočena in z večjo vsebnostjo vode pa 558 mg/kg. Učinkovitost postopka je bila večja pri višjih temperaturah stiskanja (Grela in sod., 2001). To zmanjšanje potrjujejo študije, ki podpirajo hipotezo, da toplotna obdelava in namakanje semen grahorja v vodi pred uživanjem zmanjšata vsebnost toksičnih spojin (Keseg, 2020).
Žlahtniteljski programi težijo k razvoju novih sort z nizko vsebnostjo β-ODAP (Jiao in sod., 2011). Znanstveniki z Bangladeškega kmetijskega raziskovalnega inštituta (Bangladesh Agricultural Research Institute – BARI) že od leta 1996 raziskujejo možnosti pridobivanja novih sort z želenimi lastnostmi. Med svojimi raziskavami so ugotovili, da je barva cvetov rastline povezana z vsebnostjo β-ODAP. Več študij je pokazalo, da je nižja vsebnost neželenih snovi pogosto povezana z modrimi cvetovi, medtem ko imajo rastline z belimi in rdečimi cvetovi v poprečju večje količine antinutrientov. So pa ti rezultati dokaj variabilni, zato je potrebno stabilne linije še vzpostaviti (Rahman in sod., 2001).
2.2 MORFOLOŠKA RAZNOLIKOST
Morfološko raznolikost grahorja ocenjujemo z uporabo morfoloških deskriptorjev. Rastlinski deskriptor je definiran kot merljiva lastnost rastline, ki je opazovana na akcesiji iz genske banke. Posamezne deskriptorje uporabljamo za lažje določanje, shranjevanje, izmenjavo in uporabo rastlinskih akcesij. Ločimo več vrst rastlinskih deskriptorjev: identifikacijske – potni list (ang. passport), upravljalne (ang. management), deskriptorje okolja/lokacije, karakterizacijske in ocenjevalne (ang. evaluation) (Biodiversity international, 2007). Za opisovanje morfološke raznolikosti so najbolj primerni karakterizacijski deskriptorji, ki definirajo morfološke in fenotipske lastnosti opazovane rastline. Najpogosteje uporabljeni morfološki deskriptorji za grahor so morfološke lastnosti semen (npr. barva semenskega plašča, oblika in velikost semen), višina rastline, barva cvetov in število strokov na rastlino ter število semen na strok. Na podlagi morfoloških deskriptorjev lahko med seboj ločimo različne vrste iz rodu Lathyrus sp. in primerjamo različne genske vire oziroma akcesije znotraj istih vrst. Zbirko deskriptorjev za opisovanje genskih virov iz rodu Lathyrus spp. je leta 2000 izdal International Plant Genetic Resources Insitute – IPGRI iz Italije (Descriptors for Lathyrus spp., 2000).
Z razvojem novih biotehnoloških tehnik so znanstveniki mnoge morfološke značilnosti uspeli povezati z geni, ki nanje vplivajo, ne smemo pa zanemariti vpliva okolja na izražanje mnogih izmed njih. Morfološka raznolikost rastlin je torej kombinacija vplivov genetske raznolikosti in fenotipskih značilnosti.
5
V Indiji je skupina znanstvenikov opravila obsežno študijo morfoloških značilnosti semen navadnega grahorja (Barpete, 2015). Raziskovalci so na semenih 53 akcesij ovrednotili štiri kvalitativne in dva kvantitativna deskriptorja. To so oblika semen, barva semenskega plašča, vzorec semenskega plašča, velikost semena, masa 100-semen in vsebnost proteinov v semenih. Deskriptorje so ocenjevali po IPGRI (Descriptors for Lathyrus spp., 2000), proteine pa so izolirali po metodi, ki so jo opisali Sammour in sod. (2007). Proteine so kvantitativno določili tako, da so moko iz zmletih semen raztopili v ekstrakcijskem pufru in določili njihovo koncentracijo po Bradfordovi metodi. Rezultati ocene morfoloških deskriptorjev so pokazali veliko variabilnost pri vseh štirih morfoloških deskriptorjih. Kvalitativne deskriptorje so določili na podlagi ocenjevanja 100 semen vsake akcesije. Rezultati so pokazali, da je najpogostejša oblika semena romboidna, sledijo ovalna, podolgovata trikotna in trikotna, najmanj semen je bilo kvadratnih. Semenski plašči so bili najpogosteje črni, sivi, sivobeli in rumeni, le redko rumenorjavi in rjavi, še redkeje pa rožnati in rdeče vijolični.
Opazovanje vzorca semenskega plašča je razkrilo, da je bilo semen s semenskim plaščem brez vzorca najmanj, največ je bilo semen z marmoriranim vzorcem, po pogostosti pa so jim sledila semena z mešanim vzorcem in semena s pikčastim vzorcem. Po velikosti so bila semena dokaj enakomerno uvrščena v tri kategorije. Največ je bilo majhnih semen, nekoliko manj pa srednje velikih in velikih. To je v skladu z nekaterimi drugimi študijami, ki nakazujejo, da so semena rastlin, ki izhajajo iz jugozahodne Azije večinoma manjša, rastline z največjimi semeni pa se pojavljajo bolj na območju Sredozemlja. Povprečna masa 100-semen je bila okoli 6 g, vsebnost skupnih proteinov pa je znašala 26 %. Študija variabilnosti je pokazala visok koeficient variabilnosti pri vseh kvalitativnih deskriptorjih, pri barvi semen 65–90 %, obliki semen 58–99 %, vzorcu semenskega plašča 51–71 % in velikosti semen 50–
55 %. Kvantitativni lastnosti sta bili precej manj variabilni, saj je koeficient variabilnosti za maso 100-semen znašal 16 %, za vsebnost proteinov pa le 9 %. Na podlagi koeficientov variabilnosti so znanstveniki zaključili, da je genetska variabilnost akcesij velika, kar je dober pokazatelj možnih napredkov na področju pridobivanja novih sort grahorja z ugodnimi lastnostmi. Rezultati so pokazali tudi statistično značilno pozitivno korelacijo med velikostjo semen in vsebnostjo proteinov v semenu, zato je velikost semen dokazano pomembna lastnost pri selekciji rastlin za nadaljnje žlahtnjenje (Barpete, 2015).
Grela in sod. (2010) so obravnavali morfološke in fenotipske lastnosti rastlin ter nutritivne lastnosti semen 31 akcesij Lathyrus sativus iz Italije, Španije, severne Francije, Nemčije in Poljske. Višina rastlin je variirala med 37 in 64 cm, pri čemer so bile rastline iz zahodne centralne Evrope v povprečju približno 10 cm višje od tistih, ki so izvirale iz južne Evrope.
Cvetovi skoraj vseh akcesij iz zahodne centralne Evrope in Italije so bili bele barve, nekaj pa jih je bilo krem barve. Ostale akcesije iz Italije in Španije so cvetele v različnih odtenkih modre, ena sama akcesija iz Nemčije pa je razvila rožnate cvetove. To se ujema z ugotovitvami Campbella (1997), ki poročata, da so v Sredozemlju najpogostejše belo cvetoče populacije grahorja. Z njunimi ugotovitvami se skladajo tudi podatki o velikosti in masi 1000- semen. Večja semena in večja masa semen sta vezani predvsem na akcesije iz Sredozemskega
6
bazena. Povprečna masa 1000-semen teh akcesij je bila 386 g, kar je več kot dvakrat več od mase 1000-semen pri akcesijah iz Nemčije. Vsebnost osnovnih hranilnih snovi v semenih grahorja je bila primerljiva z drugimi stročnicami, ki se uporabljajo za prehrano, kot sta leča in grah. Rezultati so pokazali pozitivno korelacijo med velikostjo semen in vsebnostjo proteinov. Manjša semena iz Poljske, Nemčije in Francije so v povprečju vsebovala 1 % manj proteinov kot semena akcesij iz Italije in Španije. Semena so imela nizke vsebnosti toksične aminokisline β-ODAP, v povprečju manj kot 1 g/kg suhe mase semen. Ta koncentracija je opazno nižja kot koncentracije iz drugih študij (Sammour in sod., 2007) in dovolj nizka za varno uživanje semen v prehrani človeka. Raziskovalci so dokazali zanimivo povezavo med morfološkim in biokemijskim deskriptorjem. Rezultati so pokazali pozitivno korelacijo med barvo cvetov in vsebnostjo čreslovine, antinutritivne snovi, ki veže in obarja proteine ter s tem onemogoča njihovo prebavo. Rastline z bolj intenzivno obarvanimi cvetovi so imele v semenih večje vsebnosti čreslovine, pri rastlinah z belimi in kremastimi cvetovi pa je bila vsebnost le-te manjša. Opažena je bila tudi negativna korelacija med vsebnostjo čreslovine in vsebnostjo β-ODAP v semenih. Podatki, zbrani v študiji se skladajo in potrjujejo hipotezo Campbella iz leta 1997, ki predpostavlja, da so genski viri navadnega grahorja v Evropi razdeljeni na dva centra, in sicer Sredozemski in srednjeevropski. Za slednjega so značilna manjša in lažja semena, kar kaže na vpliv bližnjevzhodnih in južnoazijskih populacij Latyrus sativus, ki imajo prav tako značilno drobna semena.
Ista skupina znanstvenikov (Grela in sod., 2012) je v nadaljevanju raziskovala morfološke in nutritivne lastnosti 54 akcesij navadnega grahorja (Lathyrus sativus) iz Češke, Rusije, Slovaške, Madžarske, Ukrajine in Poljske. Na semenih so določili več fenotipskih, morfoloških in biokemijskih faktorjev. Povprečna višina rastlin je bila v primerjavi s prejšnjo študijo višja. Rastline so dosegle višino okoli 85 cm, pri čemer je bila variabilnost akcesij iz južne centralne Evrope nekoliko večja kot variabilnost akcesij iz vzhodne centralne Evrope.
28 akcesij je imelo bele cvetove, 26 pa modre ali belo-modre. Beli cvetovi so se pogosteje pojavljali pri akcesijah iz Ukrajine, Rusije in Poljske. Semena so bila večinoma robata, večja semena pa so bila pogosto bolj oglate oblike. Največja variabilnost morfoloških faktorjev se je pokazala pri masi 1000-semen. Povprečna vrednost je bila 203 g, najvišja in najnižja vrednost pa sta bili 366 g in 86 g . Rezultati so pokazali, da so imele akcesije iz južne centralne Evrope v povprečju večjo maso 1000-semen. Vsebnost osnovnih hranilnih snovi je bila med akcesijami iz južne in vzhodne centralne Evrope primerljiva. Povprečna masa proteinov je bila 309 g/kg pri akcesijah iz južne in 296 g/kg pri akcesijah iz vzhodne centralne Evrope. Študija je pokazala povezavo med maso 1000-semen, številom strokov na rastlino in številom semen na strok. Akcesije iz južne centralne Evrope so imele praviloma večjo maso 1000-semen, hkrati pa manjše število strokov na rastlino in manj semen na strok. Semena akcesij iz južne centralne Evrope so bila v povprečju tudi večja. Rezultati so pokazali, da so manjša semena kljub manjši masi zaradi večjega števila semen na rastlino povezana z večjim donosom, zato so za pridelovalce verjetno bolj zanimive akcesije z manjšimi semeni kljub
7
temu, da imajo večja semena v povprečju nekoliko večjo vsebnost proteinov, preračunano na suho maso semen.
Na Petrovem Polju v Srbiji je skupina raziskovalcev (Gatarić in sod., 2009) na tradicionalen način pridelala navadni grahor in ovrednotila njegove morfološke ter agronomske lastnosti s ciljem utrjevanja kvalitativnih in kvantitativnih lastnosti rastline. Na tem območju prebivalci grahor gojijo že več desetletij. Zaradi relativno majhnega geografskega območja gojenja in zanemarljivih vplivov tujih populacij so morfološke ter biološke lastnosti rastlin dokaj uniformne, kar se izraža v le malo različnih fenotipih. Višina rastlin je variirala med 30 in 55 cm, kar je v skladu z ugotovitvami Campbella (1997). Rezultati študije so pokazali, da ima populacija grahorja s tega območja visoko kalivost, kar nakazuje na visoko stopnjo prilagoditve populacije na tamkajšnje razmere, visok biološki in genetski potencial semen ter njihovo kakovost. Povprečna velikost semen je bila 9,2 mm×8,3 mm×5,4 mm, masa 1000- semen pa 248 g, kar je nekoliko manj kot masa semen akcesij z drugih geografskih območij.
Večina semen (85 %) v populaciji je imela semenski plašč rumeno-bele barve, 10 % semen je bilo zeleno-rjavih, 5 % pa rjavih, kar potrjuje relativno majhno fenotipsko variabilnost. Zaradi majhnih vplivov drugih populacij in relativno majhne genetske variabilnosti je donos grahorja z območja Petrovega Polja majhen v primerjavi s pridelki drugih populacij. V primerjavi z donosnejšimi populacijami pri katerih so pridelki tudi do 3 t semen/ha, je donos omenjene populacije le 1–1,3 t semen/ha. Zaradi edinstvene lege in tradicionalnega načina pridelave je navadni grahor s Petrovega Polja odličen kandidat za pridobivanje statusa nove ekološke sorte.
2.3 GENETSKA RAZNOLIKOST
Pomemben faktor pri vrednotenju genetskega in agronomskega potenciala rastlinskih vrst je genetska raznolikost. To lahko ocenimo na podlagi morfoloških lastnosti, natančneje pa jo lahko določimo z uporabo novejših genetskih in biotehnoloških tehnik. V zadnjih desetletjih so znanstveniki razvili številne markerske sisteme, s pomočjo katerih lahko natančno raziskujemo genom rastlin in njegovo sestavo. Tako so za raziskovanje vrst iz tega rodu na voljo različni genetski in molekularni markerski sistemi, kot so izocimski polimorfizmi (Chowdhury in Slinkard, 2000), RAPD markerji (Barik in sod., 2007), SSR markerji (Aci in sod., 2020), SNP markerji in ITAP markerji (Almeida in sod., 2013). Nove metode nam omogočajo razumevanje odnosov med geni ter odnose med geni in izražanjem morfoloških lastnosti rastlin. Hkrati lahko z uporabo genskih markerjev ocenjujemo genetsko variabilnost populacij in sorodnost rastlin in natančno mapiramo genom. S pridobljenimi informacijami lahko nato z uporabo genskega inženiringa manipuliramo sestavo genoma in tako hitreje pridemo do izražanja želenih lastnosti.
Lathyrus sativus, ki je bil zaradi vsebnosti toksičnih spojin prej zapostavljen, postaja z uvedbo novih metod zanimivejši. Z novimi tehnologijami je mogoče locirati lokuse, ki vplivajo na
8
vsebnost β-ODAP in čreslovine ter jih inaktivirati ali izrezati, po drugi strani pa je mogoče najti tudi gene, ki kodirajo željene lastnosti. Navadni grahor je rastlina, ki je skozi leta nabrala mnogo takih lastnosti, npr. odpornost na sušo in visoko vlago, zasoljena tla, nekatere škodljivce in bolezni ter sposobnost uspevanja v revni prsti. Žal so mnoge izmed teh lastnosti poligenske, kar pomeni da nanje vpliva kombinacija več različnih lokusov (Güneş, 2013), zaradi česar je pomembno razumeti kompleksne odnose med njimi, preden lahko .z njimi obogatimo druge rastlinske vrste.
Eno izmed žarišč raziskav na temo genetske in morfološke raznolikosti Laltyrus sativus v zadnjih letih je Balkanski polotok. Na tem območju je rod Lathyrus sp. močno razširjen, zato ponuja potencialno alternativo tradicionalnim kulturnim rastlinam kot so fižol, leča in grah.
Območje Balkanskega polotoka je bogato z več vrstami iz rodu Lathyrus sp., v Srbiji lahko na primer najdemo okrog 30 različnih vrst (Mikić in sod., 2011), med katerimi je tudi navadni grahor. Le-ta je ohranjen kot kulturna rastlina, ki se uporablja za prehrano ljudi in krmo živali, občasno pa lahko najdemo tudi divje populacije. Leta 2002 je skupina znanstvenikov v okolici Beograda in Novega sada pridobila nove akcesije te rastlinske vrste in jih shranila v zbirki Annual Forage Legume Collection (AFLCNS) za nadaljnje raziskave (Ćupina in sod., 2006).
Konec leta 2009 je zbirka AFLCNS vsebovala 2300 akcesij iz 16 rodov in 70 vrst. Med njimi je bilo 16 vrst iz rodu Lathyrus sp in več kot 30 akcesij vrste Latyrus sativus.
Eden od načinov za ocenjevanje sorodnosti rastlin je preučevanje polimorfizma izocimov, tj.
encimov, ki imajo različno aminokislinsko strukturo, vendar katalizirajo isto reakcijo.
Chowdhury in Slinkard (2000) sta pridobila 220 akcesij Latyrus sativus iz 28 držav, ki sta jih glede na geografsko bližino razdelila na 10 območij, in sicer južno Azijo, Bližnji vzhod, območje nekdanje Sovjetske Zveze, južno, severozahodno, centralno in vzhodno Evropo, severno Afriko, Sudan–Etiopijo ter severno in južno Ameriko. Ker so bile številne akcesije heterozigotne, sta jih razdelila v podakcesije in tako dobila 384 vzorcev. Ti so predstavljali vzorec celotne svetovne genetske populacije vrste Lathyrus sativus. Iz kotiledonov petih mladih rastlin vsake akcesije sta izolirala proteine in jih ločila s škrobno elektroforezo.
Preučevala sta 20 encimov iz 13 encimskih sistemov. Ker takega poskusa na vrsti Latyrus sativus pred njima ni opravljal še nihče, sta za kontrolo vzela encime iz grahorju zelo sorodne leče, ki sta jih izolirala in karakterizirala Vaillancourt in Slinkard (1992). Dendrogram je kazal, da so najbolj sorodne akcesije iz severne Afrike in Bližnjega vzhoda, akcesije iz južne Amerike pa so bile z evolucijsko vejo ločene od vseh ostalih. Rezultati študije so pokazali, da je največja genetska raznolikost prisotna na območjih severne Afrike in Bližnjega vzhoda. To je močen dokaz, da sta ti dve regiji centra izvora in biodiverzitete navadnega grahorja. Poleg velike genetske raznolikosti so akcesije iz teh območij izražale tudi največjo morfološko raznolikost. Rastline iz teh dveh regij so poleg geografske bližine izpostavljene tudi podobnemu podnebju, kar je verjetno še dodatno prispevalo k njihovi podobnosti. Kot sorodne so se pokazale rastline iz južne Azije in regije Sudan-Etiopija. Poleg izocimske podobnosti so imele večinoma vse modre cvetove in pikčasta semena. S svojo študijo sta
9
Chowdury in Slinkard (2000) na široko odprla vrata nadaljnjim genetskim študijam in dobro predstavila genetsko raznolikost vrste Lathyrus sativus.
Randomly amplified polymorphic DNK ali krajše RAPD markerji so pomnožki celične DNK, ki nastane z uporabo kratkih do 10 bp dolgih sekvenc kot oligonukleotidnih začetnikov (primerjev) pri postopku verižne reakcije s polimerazo (PCR) (Bardakci, 2000). Za razliko od standardnega postopka PCR ne potrebujemo predhodnega znanja o sekvenci raziskovane DNK. Postopek poteka tako, da izolirani DNK dodamo oligonukleotidne začetnike in na primerni temperaturi izvedemo PCR reakcijo. Če se kakšen del sekvence raziskovane DNK ujema z oligonukleotidnimi začetniki in pride do vezave dveh nasprotno orientiranih različnih začetnikov dovolj blizu, bo med njima poteklo podvojevanje fragmenta DNK. Po končani reakciji pomnožke naložimo na gel in izvedemo elektroforezo. Glede na homologijo raziskovane DNK in dodanih oligonukleotidnih začetnikov dobimo različno dolge podvojene fragmente, ki so glede na svojo dolžino različno daleč potovali na gelu. Z analizo gela lahko med seboj ločimo različne sorte in populacije, saj imajo različna zaporedja DNK, kar pomeni, da se nanjo različno vežejo oligonukleotidni začetniki in na gelu dobimo različne rezultate (Bardakci, 2000). Na ta način lahko zaznamo tudi morebitne mutacije znotraj sorte, če se pojavijo na mestu vezave naših kratkih sekvenc.
Znanstveniki iz Indije so izvedli študijo (Barik in sod., 2007), v kateri so z uporabo RAPD markerjev ocenili sorodnost genskih virov grahorja. V študiji so uporabili semena štirih sort navadnega grahorja (IC-120451, IC-120453, IC-120478 in IC-120487) in semena lokalnega genotipa iz pokrajine Nayagarh. Med vsemi akcesijami so bile opazne morfološke razlike.
Celično DNK so izolirali iz mladih svežih listov rastlin, RAPD analizo pa izvedli s 30 standardnimi 10 bp dolgimi olgonukleotidi, od katerih jih je 20 tvorilo ponovljive pomnožke.
Prvi cikel PCR reakcije je bil sestavljen iz 5 min denaturacije matrične DNK pri 94 °C, 1 min vezave primerjav na matrično DNK pri 37 °C in 2 min podaljševanja pri 72 °C. Cikel so ponovili 42-krat, pri čemer so fazo denaturacije pri sledečih ciklih zmanjšali za 1 min. Pri zadnjem ciklu so fazo podaljševanja podaljšali na 7 min. Produkte PCR reakcije so ločili na gelski elektroforezi in z uporabo dolžinskih standardov ocenili dolžino dobljenih pomnožkov.
Skupno je bilo pomnoženih 257 lokusov, od katerih je bilo 97 monomorfnih in 159 polimorfnih. Med temi je bilo 57 pomnožkov specifičnih za en sam genotip. Pomnožki so bili dolgi med 100 in 3000 bp. Največ in najmanj specifičnih pomnožkov sta pokazali sorti IC-120478 in IC-120453. Največ polimorfnih pomnožkov se je pomnožilo z matrične DNK akcesije IC-120453, najmanj pa z matrične DNK lokalne sorte. Na podlagi pridobljenih podatkov so zrisali dendrogram in ocenili koeficient podobnosti. Največjo podobnost so zaznali med akcesijama IC-120478 in IC-120487, pri katerih je bil koeficient podobnosti 84,6 %. Lokalna sorta Nayargh je bila najbolj sorodna z akcesijo IC-120451. Pet genotipov so na podlagi rezultatov RAPD analize razdelili v dve skupini, v prvi sta bili IC-120478 in IC- 120487, v drugi pa lokalni genotip Nayargh ter genska vira IC-120451 in IC-120453. Ti rezultati se skladajo z dejstvom, da so bolj sorodni genski viri izražali več podobnih
10
morfoloških značilnosti kot manj sorodni. Študija je predstavila nekaj novih učinkovitih RAPD markerjev za zaznavanje polimorfizmov, ki bodo lahko uporabni v nadaljnji selekciji (Barik in sod., 2007).
RFLP (angl. Restriction fragment length polymorphisms) so razlike v dolžini fragmentov DNK, ki so razrezani s specifičnimi restrikcijskimi encimi. Restrikcijski encimi so encimi, ki DNK režejo ob kratkih specifičnih zaporedjih nukleotidov, ki jim pravimo restrikcijska mesta.
Če se zaporedji DNK dveh organizmov med seboj razlikujeta na restrikcijskem mestu, tam restrikcija ne bo potekla in dobili bomo različno dolge fragmente DNK. Fragmente glede na dolžino ločimo z gelsko elektroforezo, nato pa jih s Southern-ovim prenosom fiksiramo na sintetično membrano in jim dodamo označene hibridizacijske sonde. To so enoverižni fragmenti nukleinskih kislin, ki so komplementarni določeni sekvenci matrične DNK. Če se ta sekvenca pojavi med razrezanimi fragmenti, pride do vezave (hibridizacije) s sondo in tako potrdimo prisotnost določenega zaporedja DNK. RFLP analiza je uporabna za filogenetske študije in študije raznolikosti pa tudi za mapiranje genomov (Hashim in Al-Shuhaib, 2019).
Chtouruou-Ghorbel in sod. (2001) so z uporabo RAPD in RFLP markerjev preučevali genetsko raznolikost devetih populacij in petih vrst iz rodu Lathyrus sp. z različnih geografskih območij. Skupaj z oceno sorodnosti uporabljenih rastlin so avtorji med seboj primerjali uporabnost obeh vrst markerskih sistemov. V študiji so obravnavali vrste: Lathyrus sativus, Lathyrus cicera, Lathyrus ochrus, Lathyrus sylvestris in Lathyrus latifolius. Uporabili so po dve akcesiji vseh vrst razen Lathyrus ochrus, ki je bila samo ena. Akcesije so izhajale iz Tunizije, Etiopije, Portugalske, Francije in Madžarske. Na podlagi rezultatov RFLP analize so akcesije razdelili v dve skupini. V prvi je bila akcesija Lathyrus ochrus, v drugi pa vse ostale, kar pomeni, da je omenjena akcesija od vseh ostalih genetsko najbolj oddaljena. S pomočjo rezultatov, pridobljenih analizo RAPD, so izrisali ločen dendrogram, s katerim so preučevane akcesije ločili v tri skupine. V prvi so bile akcesije populacij Lathyrus sativus in Lathyrus cicera, v drugi akcesije Lathyrus sylvestris in Lathyrus latifolius, v tretji pa akcesija Lathyrus ochrus. Obe metodi sta dali podobne rezultate, saj sta ločili vrsto Lathyrus ochrus kot najbolj evolucijsko izolirano izmed preučevanih vrst. Raziskovalci so zaključili, da sta obe metodi enako uporabni na področju ocenjevanja genetske raznolikosti predstavnikov iz rodu Lathyrus spp., ker pa je metoda RAPD preprostejša in cenejša, je pogosto boljša izbira (Chtorou-Ghorbel in sod., 2001).
Shiferaw in sod. (2011) so z uporabo mikrosatelitnih markerjev raziskovali genetsko raznolikost 240 rastlin navadnega grahorja iz 20 akcesij, ki so izvirale iz različnih regij Etiopije. Rezultati so pokazali zmerno stopnjo variabilnosti, večino katere (84 %) so predstavljale razlike med akcesijami, manjši del pa razlike med rastlinami znotraj akcesij.
Akcesije iz posameznih regij so pokazale podobno stopnjo genetske variabilnosti. Študija je potrdila uporabnost mikrosatelitnih markerjev za raziskovanje genetske variabilnosti vrste Lathyrus sativus. Wang in sod. (2015) so z mikrosatelitnimi markerji prav tako preučevali
11
genetsko raznolikost 283 rastlin rodu Lathyrus sp. iz Afrike, Evrope, Azije in akcesij z raziskovalnega inštituta ICARDA (International Center for Agricultural Research in the Dry Areas). Preučevani genski viri so bili akcesije iz različnih genskih bank in predstavniki divjih populacij. Rezultati genetske analize so pričevane genske vire razdelili v dve skupini, in sicer na akcesije vrste Lathyrus sativus ter na akcesije ostalih vrst iz rodu Lathyrus sp. Akcesije vrste Lathyrus sativus so se delile naprej v dve podskupini. Prva je vsebovala 79 akcesij, ki so izvirale večinoma iz Azije, druga pa 187 akcesij iz Afrike in Evrope. Študija je pokazala, da so druge vrste iz rodu Lathyrus sp. bolj sorodne akcesijam navadnega grahorja iz Azije kot tistim, ki izvirajo iz Afrike in Evrope.
Aci in sod. (2020) so ocenjevali genetsko raznolikost treh vrst grahorja (Lathyrus sativus, Lathyrus cicera, Lathyrus ochrus) na podlagi njihovih agronomskih lastnosti in z uporabo mikrosatelitnih markerjev. Želeli so identificirati akcesije, ki bi bile najbolj uporabne za nadaljnje žlahtnjenje. Ena izmed agronomskih lastnosti, ki so jo raziskovali je bila masa 1000-semen, rezultati pa so pokazali relativno majhno variabilnost med akcesijami Lathyrus sativus v primerjavi z akcesijami Lathyrus cicera in Lathyrus ochrus. Rezultati genetske analize so največjo raznolikost pokazali med akcesijami Lathyrus sativus, ki se je od ostalih vrst močno razlikovala, saj se je manj kot 50 % vseh alelov, detektiranih pri tej vrsti, pojavilo tudi pri ostalih raziskovanih vrstah.
Ambade in sod. (2015) so z uporabo 24 SSR markerjev ocenjevali genetsko raznolikost 48 genotipov navadnega grahorja. 12 SSR markerjev je skupaj pokazalo 118 različnih polimorfizmov. Na podlagi rezultatov so genotipe razdelili v dve skupini. Prva je vsebovala 46 genotipov, ki so se nadalje delili v dve podskupini s po 4 in 42 genotipi Drugo skupino sta sestavljala dva med seboj zelo sorodna genotipa, ki sta kazala relativno veliko genetsko oddaljenost od ostalih akcesij. Genetska raznolikost preučevanih genotipov je bila dovolj velika, da so jih lahko uporabili v nadaljnjih procesih žlahtnjenja in pridobivanja kakovostnejših sort Lathyrus sativus.
Znanstveniki iz Indije so preučevali genetsko raznolikost 32 genotipov navadnega grahorja z uporabo 20 mikrosatelitskih ali SSR markerjev. 11 izmed njih se je izkazalo za polimorfne pri vseh 32 genotipih, skupaj pa so razkrili 21 polimorfnih lokusov. Preučevane genotipe so razdelili v tri skupine, rezultati pa so med akcesijami pokazali 29 % genetsko raznolikost.
Študija je pokazala uporabnost mikrosatelitnih markerjev za razvoj specifičnih genetskih prstnih odtisov (ang. fingerprint), ki omogočajo nadaljnje raziskave genetske raznolikosti in identifikacijo specifičnih genotipov Lathyrus sativus (Kumari in sod., 2019).
12
3 VREDNOTENJE SEMEN Z MORFOLOŠKIMI DESKRIPTORJI
Praktično delo v okviru diplomskega seminarja smo opravili v genetskem laboratoriju Oddelka za poljedelstvo, vrtnarstvo, genetiko in žlahtnjenje na Kmetijskem Inštitutu Slovenije. Vrednotenje semen z numeričnimi in opisnimi deskriptorji je potekalo z morfološkimi deskriptorji za semena povzetimi po IPGRI (Descriptors for Lathyrus spp., 2000). Z deskriptorji smo ocenili morfološko raznolikost semen različnih genskih virov navadnega grahorja.
3.1 MATERIALI IN METODE
Numerične in opisne morfološke deskriptorje smo vrednotili na semenih zbirke 25 akcesij navadnega grahorja (Lathyrus sativus L.), ki izvirajo iz južne in jugovzhodne Evrope (Preglednica 1). Zbirko sestavljajo akcesije pridobljene iz šestih genskih bank (Grčija, Portugalska, Bosna in Hercegovina, Romunija, Srbija, Bolgarija, Slovenija). Semena smo pridelali na poskusnem polju Kmetijskega inštituta v Jabljah. Vrednotenje morfoloških deskriptorjev je potekalo na več semenih vsake posamezne akcesije po IPGRI deskriptorjih (Descriptors for Lathyrus spp., 2000).
Preglednica 1: Zbirka preučevanih 25 genskih virov navadnega grahorja (Lathyrus sativus L.) Oznaka akcesije Geografski izvor Število akcesij Ime akcesije/genskega vira
KIS19_LS1 Grčija 1 GR1
KIS19_LS3
Portugalska 4
ISOP1189
KIS19_LS4 ISOP1176
KIS19_LS5 ISOP1177
KIS19_LS6 ISOP1190
KIS19_LS7
Bosna in Hercegovina 7
GB00999
KIS19_LS8 GB01002
KIS19_LS9 GB01003
KIS19_LS10 GB01001
KIS19_LS11 GB00954
KIS19_LS12 GB01000
KIS19_LS13 GB01004
KIS19_LS15 Romunija 2 SVGB19385
KIS19_LS16 SVGB20803
KIS19_LS17
Srbija 8
KL1
KIS19_LS18 KL2
KIS19_LS19 KL4
KIS19_LS20 KL5
KIS19_LS21 KL7
KIS19_LS22 KL8
KIS19_LS23 KL9
KIS19_LS24 KL10
KIS19_LS25 Bolgarija 2 BGR40415
KIS19_LS26 BGR43334
KIS19_LS27 Slovenija 1 SRGB5486
13
3.2 VREDNOTENJE NUMERIČNIH DESKRIPTORJEV
Numerični deskriptorji so zajemali merjenje dolžine, širine in debeline semen (Slika 1) ter maso 100-semen. Pri merjenju smo si pomagali z digitalnim kljunastim merilom natančnosti 0,1 mm in laboratorijsko tehtnico natančnosti 0,1 g. Meritve dolžine, širine in debeline semen smo opravili na 10 semenih vsake akcesije in iz podatkov izračunali povprečja. Pri deskriptorju masa 100-semen smo našteli po 100 semen vsake akcesije in jih stehtali.
Pridobljene podatke smo uredili s pomočjo programa Excel in izračunali povprečne vrednosti, koeficiente variacije ter standardne odklone.
Slika 1: Dolžina, širina in debelina semen grahorja
Rezultati numeričnih deskriptorjev na semenih preučevanih genskih virov navadnega grahorja so prikazani v Preglednici 2. Povprečna dolžina semen navadnega grahorja v zbirki je bila 9,3 mm, širina 8,6 mm in debelina 5,4 mm. Povprečna masa 100-semen je bila 25,4 g. Iz rezultatov je razvidno, da je bil koeficient variacije največji pri masi 100-semen (18,9 %), najmanjši pa pri debelini semen (5,8 %). Pri dolžini in širini semen je koeficient variacije primerljiv (10,4 % in 12,4 %). Akcesija KIS19_LS1 je imela najmanjša semena in posledično najmanjšo maso, akcesija KIS19_LS20 pa največja. Zanimivo je, da se pri obeh skrajnostih največja oziroma najmanjša debelina semena ni pojavila v kombinaciji z ostalimi tremi lastnostmi. Največjo povprečno debelino semen (6,0 mm) smo določili pri akcesiji KIS19_LS19. Ostali trije deskriptorji so le malo odstopali od skupnega povprečja. Najmanjšo povprečno debelino semen v zbirki smo izmerili pri akcesiji KIS19_LS27. Tudi pri tej akcesiji je bilo odstopanje od povprečja pri ostalih deskriptorjih majhno. Rezultati so pokazali, da ima debelina semen majhen vpliv na maso semen. Koeficient variacije je bil pri
14
vseh numeričnih deskriptorjih pod 20 %, kar pomeni, da je bila morfološka variabilnost semen v zbirki manjša v primerjavi s raziskavo Barpete (2015), ki je poročal o precej višjih koeficienti variacije za iste morfološke deskriptorje.
Preglednica 2: Numerični deskriptorji na semenih v zbirki grahorja iz južne in jugovzhodne Evrope Oznaka akcesije Dolžina semena
(mm) Širina semena
(mm) Višina/debelina semena
(mm) Masa 100-
semen (g)
KIS19_LS1 7,6 ± 0,8 6,7 ± 1,0 5,1 ± 0,3 14,1
KIS19_LS3 8,6 ± 0,4 8,1 ± 0,5 5,3 ± 0,4 22,4
KIS19_LS4 9,0 ± 0,4 8,5 ± 0,6 5,8 ± 0,5 24,2
KIS19_LS5 8,4 ± 0,3 8,0 ± 0,3 5,1 ± 0,2 20,9
KIS19_LS6 9,2 ± 0,5 8,7 ± 0,3 5,9 ± 0,6 24,6
KIS19_LS7 10,5 ± 0,5 10,0 ± 0,6 5,7 ± 0,5 33,5
KIS19_LS8 9,9 ± 0,6 9,1 ± 0,8 5,3 ± 0,6 29,1
KIS19_LS9 8,4 ± 0,5 7,3 ± 0,5 5,2 ± 0,6 20,0
KIS19_LS10 9,6 ± 0,3 9,0 ± 0,5 5,8 ± 0,5 29,5
KIS19_LS11 10,0 ± 0,4 9,4 ± 0,5 5,8 ± 0,7 30,2
KIS19_LS12 10,5 ± 0,4 10,0 ± 0,4 5,4 ± 0,5 28,2
KIS19_LS13 9,7 ± 0,5 8,7 ± 0,5 5,8 ± 0,4 27,8
KIS19_LS15 7,9 ± 0,4 7,1 ± 0,5 5,1 ± 1,0 20,3
KIS19_LS16 10,0 ± 0,3 9,5 ± 0,4 5,5 ± 0,4 28,6
KIS19_LS17 8,4 ± 0,6 7,7 ± 0,7 5,4 ± 0,4 21,9
KIS19_LS18 10,2 ± 0,5 9,5 ± 0,5 5,3 ± 0,4 27,6
KIS19_LS19 10,0 ± 0,3 8,8 ± 0,5 6,0 ± 0,4 27,1
KIS19_LS20 11,4 ± 0,4 10,8 ± 0,8 5,6 ± 0,5 34,4
KIS19_LS21 9,8 ± 0,4 9,3 ± 0,2 5,2 ± 0,6 28,8
KIS19_LS22 10,0 ± 0,6 9,3 ± 0,2 5,2 ± 0,3 28,1
KIS19_LS23 8,1 ± 0,3 7,0 ± 0,6 5,2 ± 0,4 19,6
KIS19_LS24 9,4 ± 0,5 8,2 ± 0,5 5,8 ± 0,4 28,6
KIS19_LS25 7,6 ± 0,3 6,7 ± 0,5 5,4 ± 0,4 18,5
KIS19_LS26 9,2 ± 0,6 8,4 ± 0,7 5,0 ± 0,5 22,9
KIS19_LS27 8,8 ± 0,3 8,0 ± 0,5 4,9 ± 0,5 24,0
Povprečje 9,3 8,6 5,4 25,4
Standardni odklon 1,0 1,1 0,3 4,8
Minimum 7,6 6,7 4,9 14,1
Maximum 11,4 10,8 6,0 34,4
Koeficient variacije (%) 10,4 12,4 5,8 18,9
3.3 VREDNOTENJE OPISNIH DESKRIPTORJEV
Opisni deskriptorji so zajemali ocenjevanje števila barv na plašču semena, barvo semena, prisotnost in vrsto vzorca na plašču semena ter barvo vzorca na plašču semena. Rezultati opisnih deskriptorjev so prikazani na Sliki 2. Največ različnih kombinacij rezultatov smo opazili pri barvi semena. Med 25 akcesijami v zbirki smo dobili sedem različnih barvnih kombinacij semenske ovojnice, ki so se pojavile v različnem številu. Barvna kombinacija oziroma barva, ki se je pojavila le pri eni akcesiji je rumeno-bela, rumeno-zelena in zelena.
Najpogostejša barvna kombinacija semena v zbirki je bila kombinacija rumeno-bele in rumeno-zelene barve, ki se je pojavila pri sedmih akcesijah. Največ akcesij (44 %) je imelo dvobarven plašč semena, po 28 % akcesij pa eno- ali tri-barvnega.
15
Več kot polovica akcesij je imela semenski plašč na vseh semenih brez vzorca, pri ostalih se je pojavljal pikčast ali marmoriran vzorec. Pri eni akcesiji smo opazili pikčaste in marmorirane semenske plašče pa tudi semenske plašče brez vzorca, pri dveh pikčaste plašče in plašče brez vzorca, osem akcesij pa je imelo kombinacijo pikčastih plaščev in plaščev brez vzorca. Tudi barve vzorcev na semenskih plaščih so se med različnimi akcesijami razlikovale.
Izmed 11 akcesij, ki so izražale vzorčaste semenske plašče, jih je imelo šest zelen, rjav in črn vzorec, tri so imele rjav in črn vzorec, dve pa zelen in rjav vzorec. Barva in vzorec semenskega plašča je dober pokazatelj genetske variabilnosti. Glede na relativno veliko raznolikost barvnih kombinacij sklepamo, da je variabilnost v zbirki precej velika, Pri istih akcesijah so se pojavljali različni vzorci na plašču semena, zato je le na podlagi tega deskriptorja težko sklepati o genski variabilnosti.
Slika 2: Barvni deskriptorji na semenih v zbirki grahorja iz južne in jugovzhodne Evrope
3.4 SKLEPI
Podatke za morfološke deskriptorje smo pridobili za 25 akcesij navadnega grahorja iz sedmih genskih bank iz južne in jugovzhodne Evrope. Glede na geografsko razpršenost smo pričakovali, da bo raznolikost teh akcesij velika. Pri tem moramo upoštevati dejstvo, da lahko nekateri genski viri že predstavljajo populacije ali selekcije z nekaterimi izraženimi lastnostmi. Zaradi relativno podobnih klimatskih pogojev so bile akcesije podvržene podobnim okoljem, zato ni nič nenavadnega, da so si morfološko podobne. Kljub temu je
16
raznolikost genskih virov navadnega grahorja na območju južne in jugovzhodne Evrope velika. Poleg tega so še neraziskani genski viri kot so divje populacije grahorja, lahko potencialen vir genetske variabilnosti. V okviru diplomskega seminarja smo ocenjevali le nekatere morfološke deskriptorje na semenih. Za bolj natančne analize bi morali raziskati tudi druge morfološke in predvsem genetske faktorje, kar je predlog za bodoče raziskave. Kot zapostavljena kulturna rastlina ima grahor namreč veliko potenciala za pridelavo in uporabo ter številne dobre lastnosti, ki bi se jih dalo v prihodnje bolje izkoristiti ter popularizirati omenjeno rastlinsko vrsto.
4 ZAKLJUČEK
Navadni grahor (Lathyrus sativus L.) je stročnica iz družine metuljnic in tista vrsta iz rodu Lathyrus sp., ki ima z velik agronomski potencial. Visoka vsebnost proteinov v semenih in odpornost na škodljivce ter neugodne pogoje ponujata potencial za širjenje pridelave. Kljub temu je bila ta vrsta v preteklosti kot kulturna rastlina zapostavljena, saj vsebuje nekatere škodljive snovi. V zadnjih letih je z napredkom na področju genetike navadni grahor ponovno postal ekonomsko in agronomsko zanimiv tako za pridelovalce kot potrošnike. Z novimi spoznanji in tehnikami je namreč mogoče hitreje kot kadarkoli prej pridobiti znanja o genih ter njihovi povezanosti z želenimi ali neželenimi lastnostmi. Poznavanje genetske variabilnosti in raznovrstnosti sta predpogoja za žlahtnjenje rastlin ter pridobivanje novih sort.
V diplomskem delu smo pokazali, da so preučevani genski viri navadnega grahorja iz genskih bank raznoliki. Z nadaljnjim raziskovanjem in proučevanjem lahko navadni grahor v bodoče postane kulturna rastlina, ki bo človeštvu predstavljala dodaten vir hrane.
5 VIRI
Aci M. M., Lupini A., Badagliacca G., Mauceri A., Lo Presti E., Preiti G. 2020. Genetic diversity among Lathyrus ssp. based on agronomic traits and molecular markers.
Agronomy, 10, 1182, doi:10.3390/agronomy10081182: 15 str.
Almeida N. F., Leitão S. T., Caminero C., Torres A. M., Rubiales D., Vaz Patto M. C. 2013.
Transferability of molecular markers from major legumes to Lathyrus spp. for their application in mapping and diversity studies. Molecular Biology Reports, 41, 1, doi:10.1007/s11033-013-2860-4: 15 str.
Ambade R. L., Verma S. K., Nanda H. C., Nair S. K., Verulkar S. B. 2015. Genetic diversity based on molecular markers in grasspea (Lathyrus sativus L.). Legume Research - An International Journal, 38, 1: 43-46
Aura J. E., Carrión Y., Estrelles E., Jordà G. P. 2005. Plant economy of hunter-gatherer groups at the end of the last Ice Age: plant macroremains from the cave of Santa Maira
17
(Alacant, Spain) ca. 12000–9000 BP. Vegetation History and Archaeobotany, 14, 4, doi:10.1007/s00334-005-0002-1: 9 str.
Bardakci F. 2000. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Turkish Journal of Biology, 25: 185-196
Barik D. P., Acharya L., Mukherjee A. K., Chand P. K. 2007. Analysis of genetic diversity among selected grasspea (Lathyrus sativus L.) genotypes using RAPD markers. Zeitschrift Für Naturforschung C, 62, 11-12: 869-874
Barpete S. 2015. Genetic associations, variability and diversity in biochemichal and morphological seed characters in Indian grass pea (Lathyrus sativus L.) accessions.
Fresenius Environmental Bulletin, 24, 2: 492-497
Ben Brahim N. B., Combes D., Marrakchi M. 2001. Autogamy and allogamy in genus Lathyrus. Lathyrus Lathyrism Newsletter, 2: 21-26
Campbell C. G. 1997. Grass pea (Lathyrus sativus L.) promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops. Vol. 18. Rome, Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben/International Plant Genetic Resources Institute: 91 str.
Chowdhury M. A., Slinkard A. E. 2000. Genetic diversity in grasspea. Genetic Resources and Crop Evolution, 47, 2: 163-169
Chtourou-Ghorbel N., Lauga B., Combes D., Marrakchi M., 2001. Comparative genetic diversity studies in the genus Lathyrus using RFLP and RAPD markers. Lathyrus Sativus Newsletter, 2: 62-68
Ćupina B., Mihailović V., Mikić A., Tomić Z., Vasiljević S., 2006. Genetic resources of annual forage legumes in Serbia. IPGRI Newsletter for Europe, 33: 1-16
Descriptors for Lathyrus spp. 2000. Rome, International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI): 60 str.
Developing crop descriptor lists. Bioversity Technical Bulletin Series, 13. 2007. Rim International Plant Genetic Resources Institute, Rome (IPGRI): 72 str.
Gatarić Đ., Radić V., Đurić B, Kovacevic Z., Lakić Ž. 2009. Morfološko–biološke osobine sjemena eko-tipa graha poljaka. Agro-Knowledge Journal, 10: 31-38
Grela E. R., Rybiński W., Klebaniuk R., Matras J. 2010. Morphological characteristics of some accessions of grass pea (Lathyrus sativus L.) grown in Europe and nutritional traits of their seeds. Genetic Resources and Crop Evolution, 57, 5, doi:10.1007/s10722-009- 9505-4: 9 str.
Grela E. R., Rybiński W., Matras J. 2012. Variability of phenotypic and morphological characteristics of some Lathyrus sativus L. and Lathyrus cicera L. accessions and nutritional traits of their seeds. Genetetic Resources and Crop Evolution, 59, doi:10.1007/s10722-011-9791-5: 17 str.
18
Grela E. R., Studziñski T., Matras J. 2001. Antinutritional factors in seeds of Lathyrus sativus cultivated in Poland. Lathyrus Lathyrism Newsletter, 2: 101-104
Güneş F. 2013. Seed characteristics and testa textures of Pratensis, Orobon, Lathyrus, Orobastrum and Cicercula sections from Lathyrus (Fabaceae) in Turkey. Plant Systematics and Evolution, 299, 10. doi:10.1007/s00606-013-0849-z: 19 str.
Hashim H. O., Al-Shuhaib M. B. S. 2019. Exploring the potential and limitations of PCR- RFLP and PCR-SSCP for SNP detection: A review. Journal of Applied Biotechnology Reports, 6, 4, doi: 10.29252/JABR.06.04.02: 8 str.
Jiao C. J., Jiang J. L., Ke L. M., Cheng W., Li F. M., Li Z. X., Wang C. Y. 2011. Factors affecting β-ODAP content in Lathyrus sativus and their possible physiological mechanisms. Food and Chemical Toxicology, 49, 3, doi: 10.1016/j.fct.2010.04.050: 7 str.
Jiao, C. J., Xu, Q. L., Wang, C. Y., Li F. M., Li Z. X., Wang Y. F. 2006. Accumulation pattern of toxin β-ODAP during lifespan and effect of nutrient elements on β-ODAP content in Lathyrus sativus seedlings. The Journal of Agricultural Science, 144, 4, doi:10.1017/S0021859606006265: 7 str.
Keseg A. 2020. Uticaj vremena natapanja i uslova kuvanja na fizičko-hemijske karakteristike sastrice (Lathyrus sativus). Master rad. Novi Sad, Univerzitet u Novom Sadu. Tehnološki Fakultet Novi Sad: 52 str.
Kumar S., Bejiga G., Ahmed S., Nakkoul H., Sarker A. 2011. Genetic improvement of grass pea for low neurotoxin (β-ODAP) content. Food and Chemical Toxicology, 49, 3, doi:10.1016/j.fct.2010.06.051: 12 str.
Kumari S., Kumar J., Kumar R.R., Kumar A., Nimmy M. S., Ranjan T., Kumar V. 2019.
Genetic diversity analysis in grasspea (Lathyrus sativus L.) using SSR molecular markers.
Current Journal of Applied Science and Technology, 33, 3, doi:
10.9734/CJAST/2019/v33i330070: 7 str.
McCutchan J. S. 2003. Review: A brief history of grasspea and its use in crop improvement.
Lathyrus Lathyrism Newsletter, 3: 18-23
Mihailović V., Mikić A., Ćupina B. 2007. Potential of annual legumes for utilization in animal feeding. Biotechnology in Animal Husbandry, 23: 573-581
Mikić A., Mihailović V., Ćupina B., Đurić B., Krstić Đ., Vasić M., Đorđević V. 2011.
Towards the re-introduction of grass pea (Lathyrus sativus) in the West Balkan Countries:
The case of Serbia and Srpska (Bosnia and Herzegovina). Food and Chemical Toxicology, 49, 3, doi:10.1016/j.fct.2010.07.052: 6 str.
Polignano G. B., Uggenti P., Alba V., Bisignano V., Della Gatta C. 2005. Morpho-agronomic diversity in grasspea (Lathyrus sativus L.). Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 3, doi:10.1079/PGR200455: 6 str.
19
Rahman M., Rahman M., Sarkar M. 2001. Progress in isolation and purification of Lathyrus sativus breeding lines. Lathyrus Lathyrism Newsletter, 2: 39-40
Rao S. L. N., Adiga P. R., Sarma P. S. 1964. The Isolation and Characterization of β-N- Oxalyl-L-α,β-Diaminopropionic Acid: A Neurotoxin from the Seeds of Lathyrus sativus.
Biochemistry, 3: 432-436
Razdan M. K., Cocking E. C., Power J. B. 1980. Callus regeneration from mesophyll protoplasts of sweet pea (Lathyrus odoratus L.). Zeitschrift Für Pflanzenphysiologie, 96, 2:
181-183
Sammour R., Mustafa A. E., Badr S., Tahr W. 2007. Genetic variations in accessions of Lathyrus sativus L. Acta Botanica Croatica, 66, 1: 1-13
Schaefer H., Hechenleitner P., Santos-Guerra A., Menezes de Sequiera M., Pennington T., Kenicer G., Carine A. M. 2012 Systematics, biogeography, and character evolution of the legume tribe Fabeae with special focus on the middle-Atlantic island lineages. BMC Evolutionary Biology 12, 250, doi:10.1186/1471-2148-12-250: 19 str.
Shiferaw E., Pè M. E., Porceddu E., Ponnaiah M. 2011. Exploring the genetic diversity of Ethiopian grass pea (Lathyrus sativus L.) using EST-SSR markers. Molecular Breeding, 30, 2, doi: 10.1007/s11032-011-9662-y: 9 str.
Spencer P., Ludolph A., Dwivedi M. P., Roy D., Hugon J., Schaumburg H. H. 1986.
Lathyrism: evidence for role of the neuroexcitatory aminoacid BOAA. The Lancet, 328, 8515: 1066-1067
Tiwari N., Bansal K. C., All K., Sachdev A., Santha I. M., Mehta S. L. 1995. Physiological and biochemical analysis of somaclones derived from leaf explants of Lathyrus sativus.
Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 4, 2: 85-89
Tiwari K. R., Campbell C. G. 1996. Inheritance of neurotoxin (ODAP) content, flower and seed coat colour in grass pea (Lathyrus sativus L.). Euphytica, 91: 195-203
Vaillancourt R. E., Slinkard A. E. 1992. Inheritance of new genetic markers in lentil (Lens Miller). Euphytica, 64, 3: 227-236
Wang F., Yang T., Burlyaeva M., Li L., Jiang J., Fang L., Redden R., Zong X. 2015. Genetic diversity of grasspea and its relative species revealed by SSR markers. PloS One, 10, 3:
e0126453, doi:10.1371/journal.pone.0118542, 14 str.
Xu Q., Liu F., Chen P., Jez J., Krishnan H. 2017. β-N-Oxalyl-l-α,β-diaminopropionic acid (β- ODAP) content in Lathyrus sativus: The integration of nitrogen and sulfur metabolism through β-cyanoalanine synthase. International Journal of Molecular Sciences, 18, 3: 526, doi:10.3390/ijms18030526: 14 str.
20
ZAHVALA
Zahvaljujem se mentorju izr. prof. dr. Vladimirju Megliču in somentorju dr. Lovru Sinkoviču za strokovno pomoč in nasvete, potrpežljivost in podporo pri nastajanju diplomskega dela.
Zahvaljujem se Kmetijskemu inštitutu Slovenije na katerem sem izvajal praktično delo v okviru diplomske naloge in genskim bankam za poslane genske vire navadnega grahorja.
Zahvaljujem se tudi staršema, ki sta mi med študijem in pisanjem diplomske naloge nudila finančno ter moralno podporo.
