BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE Špela Univerzitetni študij

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Špela ROZMAN

STRATEGIJE ISKANJA KANDIDATNIH EFEKTORJEV PRI GLIVAH IZ RODU Verticillium

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij - 1. stopnja

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Špela ROZMAN

STRATEGIJE ISKANJA KANDIDATNIH EFEKTORJEV PRI GLIVAH IZ RODU Verticillium

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja

STRATEGIES FOR FINDING CANDIDATE EFFECTORS IN Verticillum FUNGI

B. SC. THESIS Academic Study Programmes

Ljubljana, 2021

(3)

Rozman Š. Strategije iskanja kandidatnih efektorjev pri glivah iz rodu Verticillium.

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, 2021

II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.

Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Jerneja Jakšeta.

Komisija za oceno in predstavitev:

Predsednik: prof. dr. Polona JAMNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Jernej JAKŠE

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Minja ZORC

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko

Datum predstavitve: 3.9.2021

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 582.282:601.4:575.111(043.2)

KG primerjalna genomika, efektorji, strategija iskanja, Verticilium AV ROZMAN, Špela

SA JAKŠE. Jernej (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija

LI 2021

IN STRATEGIJE ISKANJA KANDIDATNIH EFEKTORJEV PRI GLIVAH IZ RODU Verticillium

TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 18 str., 2 pregl., 9 sl., 31 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Glive rodu Verticillium so rastlinski patogeni, ki povzročajo bolezni pri velikem številu rastlin. Naravno odpornost na seve tipa 1 V. dahliae so odkrili v paradižniku Solanum lycopersicum (gen Ve1) na seve tipa 2 pa v paradižniku Solanum neorickii (gen V2). Glivne efektorje, ki jih prepoznata te dva gena so odkrili šele leta 2012 (Ave1) in 2020 (Av2). Metode uporabljene za identifikacijo efektorjev so bile DNA sekvenciranje, primerjalna genomika, transkriptomika, funkcionalne analize s koekspresijo, trasnformacijo in delecijo genov. Na podlagi podatkov o sekvenci gena so naredili tudi filogenetske študije, s katerimi so identificirali evolucijski izvor genov za efektorje. Ave1 so identificirali s primerjavo več genomov sevov V. dahliae tipa 1 in tipa 2 ter se osredotočili na dele genoma, ki so skupni vsem sevom tipa 1 in so odsotni v vseh sevih tipa 2. S transkriptomiko so določili, kateri geni znotraj te regije genoma se izražajo tekom okužbe rastline in nato s tarčno delecijo gena potrdili, da je res Ave1 gen, ki ga prepozna Ve1 in sproži rezistenco. Identifikacija Av2 je potekala po dveh scenarijih, saj ni bilo znano, ali sevi tipa 1 vsebujejo ta gen ali ne. Primerjali so genome sevov tipa 1 in 2 z genomi tipa 3, ki gena za Av2 nimajo. Tako so določili kandidatne gene in nato s koekspresijo in delecijo genov identificirali, kateri gen je V2.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 582.282:601.4:575.111(043.2)

CX comparative genomics, effectors, strategies for finding, Verticillium AU ROZMAN, Špela

AA JAKŠE. Jernej (supervisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology

PY 2021

TI STRATEGIES FOR FINDING CANDIDATE EFFECTORS IN Verticillum FUNGI DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)

NO VI, 18 p., 2 tab., 9 fig., 31 ref.

LA sl AL sl/en

AB Fungi Verticillium are plant pathogens that cause disease in a large number of hosts.

Natural resistance to race 1 strains of V. dahliae was found in tomato Solanum lycopersicum (gene Ve1) and to race 2 strains in tomato Solanum neorickii (gene V2).

The fungal effectors recognized by these two genes were not discovered until 2012 (Ave1) and 2020 (Av2). The methods used to identify effectors were DNA sequencing, comparative genomics, transcriptomics, functional analyses by co- expression, transformation, and gene deletion. Based on genome sequence data, phylogenetic studies have also been done to identify the evolutionary origin of genes for effectors. Ave1 was identified by comparing several genomes of V. dahliae strains of race 1 and race 2 and focused on parts of the genome that are common to all strains of race 1 and absent in all strains of race 2. Transcriptomics were used to determine which genes within this region of the genome are expressed during the infection of the plant and then targeted gene deletion was used to confirm that it is indeed the recognition of Ave1 gene by Ve1 that triggers resistance. Identification of Av2 was performed according to two scenarios, as it was not known whether race 1 strains contained this gene or not. They compared the genomes of race 1 and 2 strains with race 3 genomes that do not have the Av2 gene. Thus, candidate genes were determined and then, by gene expression and deletion, they identified which gene is V2.

(6)

V

KAZALO VSEBINE

Str.

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORDS DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VI KAZALO SLIK VI

1 UVOD 1

2 GLIVE RODU Verticillium 2

3 VIRULENTNI EFEKTORJI 3

3.1 OBRAMBNI MEHANIZEM RASTLIN 3

3.2 PREMAGOVANJE RASTLINSKEGA OBRAMBNEGA SISTEMA 4

3.3 Ave1 5

3.4 Av2 7

4 STRATEGIJE ISKANJA EFETORJEV 8

4.1 DNA SEKVENCIRANJE 8

4.2 RNA SEKVENCIRANJE 8

4.3 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR) V REALNEM ČASU

ZA SPREMLJANJE IZRAŽANJA GENOV 9

4.4 FUNKCIONALNE ANALIZE 9

4.5 VIZUALNE OCENE 9

5 IDENTIFIKACIJA Ave1 EFEKTORJA 10

6 IDENTIFIKACIJA Av2 VIRULENTNEGA EFEKTORJA 12

6.1 DOLOČITEV VRSTE 12

6.2 DOLOČITEV KANDIDATNIH GENOV ZA Av2 S PRIMERJALNO GENOMIKO

12

6.3 POTRDITEV GENSKEGA MODELA XLOC_00170 KOT Av2 14

7 ZAKLJUČEK 15

8 VIRI 16

ZAHVALA

(7)

VI

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Sevi V. dahliae in kateremu tipu pripadajo ... 2 Preglednica 2: Scenarija primerjalne genomike za identifikacijo kandidatnih genov za Av2 . 13

KAZALO SLIK

Slika 1: Ilustracija strategij premagovanja rastlinskega obrambnega sistema (prirejeno po Luis Rodriguez-Moreno in sod., 2018). ... 4 Slika 2: Shema gena Ave1 (de Jonge in sod., 2012).. ... 5 Slika 3: Filogenetska razmerja med Ave1 iz V. dahliae, C. beticola, F. oxysporum, X.

axonopodis in 50 najbolj sorodnih rastlinskih proteinov (de Jonge in sod., 2012).. ... 6 Slika 4: Shema gena Av2 (prirejeno po Chavarro‐Carrero in sod., 2020). ... 7 Slika 5: Polimorfizem posameznega nukleotida Av2 V. dahliae. 10 sevov ima na mestu polimorfizma adenozin, 7 sevov ima na tem mestu timin (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).. .. 8 Slika 6: Primeri hipersenzitivnega odziva, nekroze tkiva (de Jonge in sod., 2012). ... 9 Slika 7: Primer upočasnjene rasti rastlin (A) in grafični prikaz odstotka prizadetosti rastlin glede na kontrolo (B) (prirejeno po Chavarro‐Carrero in sod., 2020). ... 10 Slika 9: Koekspresija genov v N. tabacum (de Jonge in sod., 2012). ... 11 Slika 8: Izražanje kandidatnih genov za virulentni efektor. A: Ekspresija genov v sevu JR2. B:

Ekspresija genov v sevu TO22. dpi- dnevi po inokulaciji. PDA- kontrola, gliva je rastla na krompirjevem dekstroznem agarju (prirejeno po Chavarro‐Carrero in sod., 2020). ... 14

(8)

1

1 UVOD

Patogene glive vsako leto povzročajo veliko škode na poljščinah, kar je spodbudilo znanstvenike v raziskave teh gliv in iskanje potencialnih rešitev. Najbolj pogosti rešitvi sta uporaba rezistentnih genov in uporaba fungicidov. Geni za odpornost na Verticillium dahliae so bili že odkriti in gen za odpornost na seve tipa 1 je že v komercialni rabi, vendar so se kmalu po razširitvi kultivarjev z rezistenco pojavili sevi, na katere rastline niso bile več rezistentne. Problem kemičnih fungicidov je, poleg negativnega vpliva na človeško zdravje in negativnega vpliva na okolje, da glive hitro razvijejo rezistenco na njih (Van de Wouw in sod., 2014). Poleg tega so glive iz rodu Verticillium talni patogeni in uporaba fungicidov v tleh je izredno omejena oz. nemogoča.

Ob okužbi rastlina z receptorji prepozna glivne molekule, kar sproži rastlinski obrambni sistem, katerega vloga je preprečiti širjenje okužbe in povzročiti propad patogena. Glive so razvile veliko različnih načinov za premagovanje rastlinskega obrambnega sistema in so pokazale sposobnost premagovanja rezistenc z razvojem novih efektorjev. Identifikacija glivnih efektorjev je otežena, saj klasične metode niso uspešne zaradi nespolnega razmnoževanja gliv obravnavanega rodu. Prvi glivni efektor V. dahliae je bil identificiran šele leta 2012, medtem ko je bil prvi bakterijski efektor identificiran že leta 1984 (Staskawicz in sod., 1984; de Jonge in sod., 2012). Razvoj novih metod sekvenciranja je omogočil nove pristope za identifikacijo efektorjev, ki temeljijo na primerjalni genomiki in transkriptomiki. S pomočjo teh metod so identificirali glivna efektorja Ave1 in Av2. Identifikacije efektorjev in razumevanje interakcije med rastlino in glivo ter vloga efektorjev tekom okužbe rastline so podatki, ki bodo lahko pomagali v razvoju bolj efektivnih načinov zaščite poljščin pred patogeni.

V diplomskem delu bom predstavila rod gliv Verticillium, podrobneje V. dahliae, v kateri so odkrili gena za efektorja Ave1 in Ae2 in metode s katerimi so efektorja identificirali.

Podrobneje bom predstavila postopek identifikacije efektorja Ave1 z uporabo primerjalne genomike sevov tipa 1 s sevi tipa 2, RNA sekvenciranja in funkcionalnih analiz ter postopek identifikacije Av2 z uporabo primerjalne genomike sevov tipa 1 in tipa 2 s sevi tipa 3, PCR v realnem času in funkcionalnih analiz.

(9)

2 2 GLIVE RODU Verticillium

Glive iz rodu Verticillium so askomicete, v rodu je več različnih rastlinskih patogenov (Subbarao, 2009). Glive lahko v zemlji preživijo več let in so sposobne okužiti veliko različnih gostiteljev, kar pomeni, da povzročajo velike ekonomske izgube v poljedelstvu.

Zaradi omejitve kemičnih fungicidov se za premagovanje bolezni poslužujejo tolerantnih rastlin (Subbarao, 2009). Z uporabo tolerantnih rastlin so odpravili problem glivnih okužb te vrste na bombažu in do neke mere na krompirju in paradižniku (Subbarao, 2009). Vendar prekomerna uporaba rezistentnih rastlin lahko vodi v nastanek novih sevov, za katere ni naravne rezistence oziroma jo je potrebno odkriti. Vrsti, ki povzročata največ škode na poljščinah, sta V. dahliae in V. nonalfalfae (Pegg in Brady, 2002).

V. dahliae je patogen, ki lahko okuži več kot 200 vrst dvokaličnic (Fradin in Thomma, 2006).

Gliva prodre v rastlino skozi korenine, nato vstopi v ksilem in začne delati kondije, ki se po ksilemu razširijo po rastlini (Fradin in Thomma, 2006). Okužbe rastlin z V. dahliae so najpogostejše v subtropskem podnebju (Subbarao, 2009). Zaradi visoke plastičnosti glive, se redno pojavljajo novi izbruhi okužb na novih gostiteljih. Prva naravna rezistenca na V.

dahliae je bila odkrita okoli leta 1930 v paradižniku (Schaible in sod., 1951). Gen za rezistenco v paradižniku so poimenovali Ve1. Nekaj let po odkritju rezistentnega gena in kultivaciji rastlin z rezistenco so začeli opažati seve V. dahliae, na katere paradižniki z genom Ve1 niso bili rezistentni (Pegg in Brady, 2002). Te seve so poimenovali tip 2, seve, na katere so bile rastline z Ve1 genom rezistentne, pa so klasificirali kot tip 1. Zaradi prekomerne rabe paradižnikov z rezistenco na tip 1 je glivni tip 2 v določenih regijah zamenjal tip 1, kar je pomenilo izgubo rezistence in ekonomsko škodo (Dobinson in sod,. 1996). Tipa 1 in 2 sta bila opažena tudi na solati (Hayes in sod., 2007). V paradižniku Solanum neorickii so odkrili rezistenco na tip 2 V. dahliae (Usami in sod., 2017). S pomočjo tega paradižnika so lahko razvili nove komercialne kultivarje z rezistenco na tip 2 V. dahliae (Usami in sod., 2017).

Rezistenco omogoča dominanten lokus V2. Kasneje so se pojavili sevi, na katere rastline z V2 in Ve1 genoma niso bile rezistentne - te seve so razvrstili v tip 3. Rezistentni gen na tip 3 zaenkrat še niso bili odkriti. V Preglednici 1 so predstavljeni najpogosteje raziskani sevi glive V. dahliae in kateremu tipu pripadajo.

Preglednica 1: Sevi V. dahliae in kateremu tipu pripadajo

Sev Tip Sev Tip

JR2 1 UD1-4-1 2

ST14.01 1 GF1207 2

CBS381.66 1 GF-CA2 2

VDLS16 1 GF-CB5 3

DVD-31 2 VT-2A 3

DVD-S26 2 GF1192 3

DVD-S29 2 HOMCF 3

DVD-S94 2 DVD-3 3

VDLS17 2 DVD-161 3

TO22 2

(10)

3 3 VIRULENTNI EFEKTORJI

Kot efektorje lahko označimo molekule, ki se tekom okužbe rastline izločajo izven glivne celice in pomagajo pri okužbi rastline z glivo (Luis Rodriguez-Moreno in sod., 2018).

Efektorji so običajno proteini, ki stimulirajo infekcijo gostitelja z manipulacijo gostiteljevega imunskega odziva (Sonah in sod., 2016). Proteinski efektorji so majhni, zunajcelični proteini, ki imajo v svoji sestavi veliko cisteina in se izražajo tekom okužbe (Stergiopoulos in de Wit, 2009). Glede na to, ali se efektorji lokalizirajo zunaj ali znotraj celic gostitelja, jih ločimo v dve skupini (Luis Rodriguez-Moreno in sod., 2018).

Kot efektorji lahko delujejo tudi sekundarni metaboliti, ki povečujejo virulentnost glive (Luis Rodriguez-Moreno in sod., 2018). Poznamo sekundarne metabolite, ki delujejo specifično na posamezne gostitelje, in sekundarne metabolite, ki delujejo na več različnih gostiteljev nespecifično (Wolpert in sod., 2002).

Pod netipične efektorje spadajo male RNA (sRNA), ki inducirajo prekinitev genov v rastlini z vezavo na Argonaute (AGO) proteine (Castel in Martienssen, 2013). sRNA v rastlinah igrajo pomembno vlogo kot del obrambnega sistema proti patogenom, patogeni pa uporabljajo sRNA za manipulacijo rastlinskega obrambnega sistema in za posredovanje virulence (Wang in sod., 2016). V. dahliae zavira rastlinsko obrambo preko vezave RNA na AGO protein (Wang in sod., 2016).

3.1 OBRAMBNI MEHANIZEM RASTLIN

Ob okužbi s patogenom rastlina skuša okužbo preprečiti ali pa povzročiti propad patogena.

Prva linija obrambe je prepoznava patogena. Rastline imajo receptorje, ki prepoznavajo molekule, značilne za patogene. Pogosto je to hitin ali pa glivni glukanski ostanki (Sonah in sod., 2016). Ko rastlinski receptorji prepoznajo glivne molekule, se sproži imunski odziv, rastlina začne sproščati protiglivne molekule, reaktivne kisikove molekule, inhibitorje proteaz, hitinaze, glukanaze in fitoaleksine (Sonah in sod., 2016). Da bi se glive izognile prepoznavi, izločajo efektorske molekule, ki pa lahko v rastlini sprožijo obrambo, če ima rastlina specifične receptorje za prepoznavo efektorjev (Jones in Dangl, 2006). Če rastlina ne prepozna efektorskih molekul, le-te omogočajo lažjo okužbo, večje sproščanje toksinov in virulentnih molekul (Jones in Dangl, 2006). Efektorje prepoznavajo specifični geni, ki posledično omogočajo rezistenco rastline na specifične patogene, torej so rezistentni geni.

Tekom evolucije se geni za efektorje v glivah spreminjajo in s tem pride do nastanka novih sevov, na katere rastline niso rezistentne, dokler ne pride tudi do evolucije rastlinskih rezistentnih genov in se tako vzpostavi nova rezistenca.

(11)

4

3.2 PREMAGOVANJE RASTLINSKEGA OBRAMBNEGA SISTEMA

Slika 1: Ilustracija strategij premagovanja rastlinskega obrambnega sistema (prirejeno po Luis Rodriguez-Moreno in sod., 2018)

Za uspešno okužbo rastlin morajo glive premagati rastlinski obrambni sistem, za kar so razvile veliko različnih strategij (Slika 1). Rastlinska celična stena je sestavljena iz ogljikovih hidratov. Za uspešno okužbo rastline mora gliva najprej prebiti celično steno. To doseže s pomočjo generiranja tarčnega turgorskega pritiska in sproščanjem encimov, ki razgradijo celično steno (Ryder in Talbot, 2015). Ko patogena gliva uspešno prodre v rastlinsko celico, mora gliva preprečiti prepoznavo, inhibirati rastlinske obrambne mehanizme ali pa spremeniti rastlinski obrambni mehanizem (Luis Rodriguez-Moreno in sod., 2018).

Rastline imajo receptorje, ki prepoznavajo patogene ligande in ob prepoznavi sprožijo obrambni odziv (Couto in Zipfel, 2016). Rastlina po zaznavi glivnega patogena začne sproščati hitinaze in glukanaze, ki razgradijo glivno celično steno (Sanchez-Vallet in sod., 2015). Kot obrambo pred razgraditvijo stene glive sproščajo efektorje, ki zaščitijo steno pred razgradnjo, preprečijo zaznavo patogena ali spremenijo sestavo celične stene in se tako izognejo prepoznavi (Sanchez-Vallet in sod., 2015). V. dahliae ob okužbi sprošča efektor LysM, ki se veže na hitin in ga s tem zaščiti pred encimsko hidrolizo (Kombrink in sod., 2017). Posledično hitinaze, ki jih sprošča rastlina, ne morejo razgraditi celične stene V.

dahliae in povzročiti propada patogena. Prav tako efektor veže vse morebitnbe proste molekule hitina, ki bi ga lahko rastlinske receptorske molekule prepoznale in sprožile obrambni mehanizem.

(12)

5

Ob zaznavi patogena rastlina odreagira na okužbo s spremembami pH, hitrim nihanjem koncentracije ionov, sproščanjem reaktivnih kisikovih radikalov in protiglivnih molekul (Luis Rodriguez-Moreno in sod., 2018). Patogeni so tekom evolucije razvili načine, kako preživeti te rastlinske obrambne mehanizme. Glive zavirajo delovanje reaktivnih kisikovih radikalov s sproščanjem efektorjev, ki zavirajo delovanje rastlinskih encimov, ki proizvajajo reaktivne kisikove radikale (Doehlemann in sod., 2009). Določeni patogeni ob okužbi povišajo ekstracelucarni pH iz 5 na 7, s čimer povzročijo alkalizacijo mesta okužbe in zaustavitev rastlinskega obrambnega sistema (Masachis in sod., 2016). Rastline kot del obrambe sproščajo proteaze, ki razgradijo glivne zunajcelične proteine in s tem zavrejo okužbo. Glive premagujejo to obrambo s sproščanjem efektorjev, ki inhibirajo delovanje proteaz (van der Hoorn, 2008). Hormonska signalizacija je pomemben del rastlinskega odziva na okolico in patogene, zato so glive razvile sisteme, kako vplivati na to signalizacijo (Luis Rodriguez- Moreno in sod., 2018). V. dahliae sprošča efektorje, ki vplivajo na biosintezo salicilne kisline in s tem podre hormonsko ravnovesje v rastlini (Liu in sod., 2014).

3.3 Ave1

Ave1 je gen za virulentni efektor glive V. dahliae in V. nonalfalfae tipa 1, gen ni prisoten v drugih tipih. Gen ima 582 baznih parov, sestavljen je iz 2 eksonov in enega introna (Slika 2).

Ave1 nosi zapis za 134 aminokislin velik protein, ki ga prepozna Ve1 in sproži rezistenco na tip 1 glive (de Jonge in sod., 2012). Okužba rastline s tipom 1 V. dahliae povzroči upočasnjeno rast, rezistenco pa je možno videti kot hipersenzitivni odziv, ki ga določa nekrozo tkiva zaradi močnega imunskega odziva (Takken in sod., 2000).

Slika 2: Shema gena Ave1 (de Jonge in sod., 2012).

Z BLAST analizo niso našli homologov Ave1 v glivah, so pa našli več kot 200 homologov tega gena v rastlinah. Poglobljene analize so odkrile homologe gena v patogenih glivah Fusarium oxysporum, Colletotrichum higginsianum in Cercospora beticola ter v patogeni bakteriji Xanthomonas axonopodis. Na podlagi teh variant gena in 50 najbolj homolognih proteinov v rastlih so izvedli filogenetsko analizo, ki je pokazala, da geni iz patogenih gliv in bakterije najverjetneje nimajo skupnega prednika (Slika 3). To vodi do zaključka, da je V.

dahliae pridobila gen s horizontalnim prenosom iz rastline. Našli so evolucijske sorodnosti med Ave1 variantami patogenov, ki imajo isto vrsto gostitelja. Ker so odkrili homologe gena v drugih patogenih vrstah, so testirali, če Ve1 prepozna tudi homologe Ave1 drugih vrst.

Posamična koekspresija Ave1 homologov C. beticola, F. oxysporum, V. nonalfalfae in Ve1 gena v N. tabacum je vodila do hipersenzitivnega odziva, ki so ga okarakterizirale nekroze na listu (de Jonge in sod., 2012).

(13)

6

Slika 3: Filogenetska razmerja med Ave1 iz V. dahliae, C. beticola, F. oxysporum, X. axonopodis in 50 najbolj sorodnih rastlinskih proteinov (de Jonge in sod., 2012).

Za oceno alelnih variant gena Ave1 so primerjali sekvence iz 85 sevov rodu Verticillium izoliranih iz različnih virov, geografskih lokacij in gostiteljev. Med testiranimi aleli niso našli nobenih polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Ave1 gen so našli v sevu VaMs102 V. nonalfalfae (Klosterman, 2011). Gena niso našli v sevih Verticillium vrste 2 in v sevih V.

nonalfalfae in V. dahliae, ki niso patogeni paradižnika (de Jonge in sod., 2012).

Sevi z Ave1 so bolj agresivni v primerjavi s sevi tipa 2, kar pomeni, da prisotnost Ave1 zviša virulenco seva in deluje kot pomemben del okužbe gostitelja. Sevi z delecijo gena Ave1 so

(14)

7

bili manj agresivni na rastlinah brez rezistence, okužba rastline povzroči manj upočasnjeno rast in manjšo kolonizacijo glive. Komplementacija vrste 2 V. dahliae s fragmentom, ki vsebuje Ave1, je vodila do povišanja virulence sevov do rastlin brez rezistence. Enake ugotovitve so potrdili tudi na transgenih rastlinah Arabidopsis (de Jonge in sod., 2012).

3.4 Av2

Gen je sestavljen iz štirih eksonov in treh intronov (Slika 4). Av2 kodira protein z 91 aminokislinami, po odstranitvi signalnega peptida ostane zrel protein s 73 aminokislinami.

Efektor Av2 prepozna gen V2 v paradižniku, kar sproži rezistenco na seve tipa 2 V. dahliae (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

Slika 4: Shema gena Av2 (prirejeno po Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

Gen Av2 ni specifičen samo za seve V. dahliae tipa 2, ampak je prisoten tudi v sevih tipa 1, vendar se v sevih tipa 1 ob prisotnosti Ave1 gena gen Av2 ne izraža (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

Homologi V. dahliae Av2 so bili odkriti tudi v drugih vrstah gliv iz rodu Verticillium: V.

nonalfalfae, V. longisporum, V. alfalfae (Shi-Kunne in sod. 2018) in v glivah rodu Fusarium:

Fusarium phyllophilum, Fusarium mundagurra, F. oxysporum f. sp. narcissi, Fusarium oxysporum NRRL32931, F. oxysporum f. sp. pisi in Fusarium sp. NRRL66182 (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

Med 17-imi Av2 aleli so identificirali samo dve alelni varianti polimorfizma posameznega nukleotida. 10 sevov je imelo na mestu 73 glutaminsko kislino, 7 pa jih je imelo valin (Slika 5) (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

(15)

8

Slika 5: Polimorfizem posameznega nukleotida Av2 V. dahliae. 10 sevov ima na mestu polimorfizma adenozin, 7 sevov ima na tem mestu timin (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

Za razliko od Ave1 so odkrili, da prisotnost oziroma delecija Av2 gena ne vpliva na virulentnost seva. Sevi tipa 1 so veliko bolj virulentni kot sevi tipa 2 in 3. Delecija Av2 gena iz sevov tipa 2 ni vodila do zmanjšanja virulence in komplementacija sevov tipa 3 z Av2 genom ni vodila do povečanja virulence (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

4 STRATEGIJE ISKANJA EFETORJEV 4.1 DNA SEKVENCIRANJE

Od začetka DNA sekvenciranja in do danes se je razvilo veliko novih metod, tehnik sekvenciranja, ki omogočajo zanesljive, hitre in relativno poceni rezultate. Napredek na področju sekvenciranja DNA omogoča nastanek podatkovnih baz z veliko podatki, ki so potrebni za študije na podlagi primerjalne genomike in filogenetske študije.

Obe raziskavi, ki sta vodili do odkritja efektorjev Ave1 in Av2, sta temeljili na primerjalni genomiki med različnimi tipi sevov V. dahliae (de Jonge in sod., 2012; Chavarro‐Carrero in sod., 2020). Poznavanje celotnih genomov je omogočilo primerjave in določanje sekvenc, ki so specifične za posamezne tipe sevov. Velike količine podatkov o genomih različnih vrst so omogočile določitve alelnih variant in homologov znotraj vrste in tudi zunaj nje (de Jonge in sod., 2012; Chavarro‐Carrero in sod., 2020). Filogenetske študije Ave1 gena so pokazale, da je bil gotovo horizontalno prenesen iz rastlin na glivo (de Jonge in sod., 2012). Za ugotovitev evolucijskih razmerij med različnimi homologi genov so izvedli poglobljene BLAST analize, ki temeljijo na iskanju podobnih sekvenc v velikih bazah podatkov.

4.2 RNA SEKVENCIRANJE

V genomu je več regij DNA, ki se ne prepisujejo, posledično te deli niso zanimivi za določanje genov za efektorje, zato je RNA sekvenciranje pomembno, saj nam da podatke o tem, kateri deli DNA se prepisujejo, izražajo. Po določitvi regije DNA, ki je specifična za vse seve tipa 1, so v tej regiji določili sekvence, ki imajo možnost translacije, nato so z RNA sekvenciranjem potrdili, kateri geni se dejansko prepisujejo tekom inokulacije rastline s sevom V. dahliae tipa 1 (de Jonge in sod., 2012).

(16)

9

4.3 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR) V REALNEM ČASU ZA SPREMLJANJE IZRAŽANJA GENOV

PCR v realnem času omogoča spremljanje izražanja določenega gena v določenem časovnem okvirju. Torej lahko spremljamo intenziteto izražanja gena po dnevih, urah. Po določitvi kandidatnih genov za Av2 so spremljali izražanje vseh kandidatnih genov v kontroli in 4, 8, 11 in 14 dni po inokulaciji (Chavarro‐Carrero in sod., 2020). S pomočjo dobljenih rezultatov so lahko videli kateri kandidatni geni V. dahliae se sploh izražajo v rastlinah (in-planta) tekom inokulacije, v kakšnih količinah in kdaj ter ali se ti geni izražajo tudi, ko gliva raste na gojitveni plošči. Ugotovili so, da se od šestih kandidatnih genov samo dva izražata tekom inokulacije (Slika 8) (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

4.4 FUNKCIONALNE ANALIZE

Za funkcionalne analize tekom identifikacije Av2 in Ave1 so uporabili transformacije, delecije in sočasno izražanje (koekspresije) posameznih genov (de Jonge in sod., 2012;

Chavarro‐Carrero in sod., 2020). Po določitvi potencialnih genov s PCR v realnem času ali RNA sekvenciranjem so morali potrditi, da res geni za rezistenco v rastlinah prepoznajo kandidatne gene za efektor. S to analizo so tako potrdili, da je kandidatni gen res gen za efektor. Funkcionalne analize so izvajali na nivoju posameznih genov, bodisi so gen prekinili ali pa dodali v sev, s tem so potrdili, da ima gen res to funkcijo, ki so mu jo določili. Na primer delecija Ave1 gena je povzročila, da rastline z Ve1 genom niso bile več rezistentne na ta sev (de Jonge in sod., 2012). Prav tako so s funkcionalnimi analizami dokazali, da Ave1 poveča virulenco sevov, saj so bili sevi tipa 2 s koekspresijo gena Ave1 bolj virulentni in sevi tipa 1 brez Ave1 gena manj virulentni v primerjavi z netransformiranimi sevi (de Jonge in sod., 2012). Delecije in koekspresija sevov z genom Av2 ni vplivala na virulenco, kar je pokazalo, da ta gen nima ključne vloge pri virulentnosti seva (Chavarro‐Carrero in sod., 2020). Koekspresija genov za efektor Ave1 in genov za rezistenco Ve1 in Av2 je pokazala interakcije med geni, torej koekspresija Ave1 in Ve1 res sproži rezistenco v rastlini (Slika 9) (de Jonge in sod., 2012).

4.5 VIZUALNE OCENE

Okužba s sevi z V. dahliae tipa 1 povzroča hipersenzitivni odziv, okužba s sevi tipa 2 pa upočasnjeno rasti. To so simptomi, ki jih raziskovalci lahko vidijo. Hipersenzitivni odziv se kaže v nekrozi tkiva, vidna nekroza pomeni, da je rastlina na sev rezistentna, če nekroze ni, to pomeni, da rastlina ni rezistentna in je patogen rastlino uspešno okužil (Slika 6) (de Jonge in sod., 2012).

Slika 6: Primeri hipersenzitivnega odziva, nekroze tkiva (de Jonge in sod., 2012)

(17)

10

Upočasnjeno rast rastline so Chavarro‐Carrero in sodelavci (2020) izražali v odstotkih, glede na površino listov kontrolnih rastlin, ki niso bile inokulirane, in rastlin, ki so bile inokulirane s sevi in transformanti V. dahliae (Slika 7). Upočasnjena rast je bil znak, da je gliva uspešno okužila rastlino, torej rastlina ni bila rezistentna. Če inokulacija z glivo ni vplivala na rast rastline, je to pomenilo, da je bila rastlina rezistentna (Chavarro‐Carrero in sod., 2020). Ker so upočasnjeno rast pretvorili v odstotke, so lahko podatke med seboj primerjali in jih uporabili tudi za primerjavo sevov med seboj glede na virulenco (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

Slika 7: Primer upočasnjene rasti rastlin (A) in grafični prikaz odstotka prizadetosti rastlin glede na kontrolo (B) (prirejeno po Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

5 IDENTIFIKACIJA Ave1 EFEKTORJA

Rezistentni gen Ve, ki prepozna efektor Ave1 nosi zapis za rastlinski celični receptor.

Ugotovili so, da je regija Ve v paradižniku dejansko sestavljena iz dveh tesno povezanih genov: Ve1 in Ve2, ki sta obrnjena eden proti drugemu (Kawchuk in sod., 2001). V

(18)

11

funkcionalnih analizah so kasneje odkrili, da je za prepoznavo glivnega efektorja Ave1 in rezistenco rastline na seve tipa 1 odgovoren le gen Ve1 (de Jonge in sod., 2012).

Za identifikacijo Ave1 so identificirali regije genomov sevov tipa 1, ki so bile specifične samo za ta tip in jih ni bilo v genomih tipa 2. Kot referenco so uporabili VdLs17 sev, ki pripada tipu 2. Nato so izvedli poravnavo genomov tipa 1 in tipa 2 ter obdržali regije, ki so bile prisotne samo v tipu 1. Po nadaljnji primerjavi sekvenc tipa 1 V. dahliae so ugotovili, da imajo vsi sevi tipa 1 skupno 50 kb regijo. Za boljše razumevanje te regije so izvedli RNA sekvenciranje rastline Nicotiana benthamiana med okužbo s sevom JR2, ki pripada tipu 1.

Sekvence, pridobljene z RNA sekvenciranjem, so mapirali na JR2 genom in tako odkrili visoko izražene transkripte glive v rastlini. Tekom okužbe z glivo se je izražalo več kot 8000 genov, vendar samo en v regiji, ki so jo določili kot specifično samo za tip 1. Ta gen so poimenovali Ave1, izražanje gena se inducira samo med okužbo gostitelja (de Jonge in sod., 2012).

De Jonge in sodelavci (2012) so izvedli funkcionalne analize in s tem dokazali, da je Ave1 res efektor, ki ga prepozna rezistentni gen Ve1 v paradižniku. Heterologno izražanje Ve1 z uporabo virusa krompirja X je povzročilo nekrozo, hipersenzitivno reakcijo samo na paradižnikih z genom Ave1. Koekspresija Ave1 in Ve1 v Nicotiana tabacum je vodila do nekroze tkiva, medtem ko koekspreija Ave1 in Ve2 ni kazala hipersensitivne reakcije (Slika 9). Tarčna delecija gena Ve1 iz seva JR2 (JR2ΔAve1) je vodila do uspešne okužbe paradižnika z rezistenco na tip 1. Komplementacija JR2ΔAve1 seva s fragmentom, ki vsebuje Ave1 gen in 1,5 kb obmejne sekvence, je povzročila odpornost Ve1 paradižnika na patogen.

Komplementacija fragmenta s sevi tipa 2 VdLs17 in Dvd-S26 je vodila do odpornosti Ve1 paradižnika na ta dva seva (de Jonge in sod., 2012).

Slika 8: Koekspresija genov v N. tabacum (de Jonge in sod., 2012).

(19)

12

6 IDENTIFIKACIJA Av2 VIRULENTNEGA EFEKTORJA 6.1 DOLOČITEV VRSTE

Za določitev vrste so Chavarro‐Carrero in sodelavci (2020) izvedli patagonske analize različnih sevov glive Verticillium dahliae. V poskusu so uporabili tri različne vire paradižnikov. Ena vrsta je služila kot kontrola, saj rastline niso imele genov za rezistenco na katero koli vrsto Verticillium dahliae. Druga vrsta paradižnikov je bila transformirana z Ve1 genom, kar ji je dalo rezistenco na tip 1 in ne na tip 2 V. dahliae. Tretja vrsta paradižnikov je imela gena Ve1 in V2, kar pomeni, da je bila rezistentna na tip 1 in tip 2, ne pa na tip 3. Tri tedne po inokulaciji so ocenili rezultate. Vse kontrolne rastline so kazale znake upočasnjene rasti, kar pomeni, da rastlina ni bila odporna na patogene. Vsi sevi razen JR2 so povzročili upočasnjeno rast na Ve1 transgenih rastlinah. To potrjuje, da je JR2 bil edini sev tipa 1 med testiranimi vzorci. Rastline z genoma Ve1 in V2 so kazale upočasnjeno rast samo pri sevih DVD161, DVD3, GF-CB5, VT-2A, GF1192, HOMCF, te sevi torej pripadajo tipu 3.

Transgen sev JR2ΔAve1, ki ima odstranjen gen Ave1, je povzročil upočasnjeno rast Ve1 transgenih rastlin, vendar ni imel učinka na rast rastlin z Ve1 in V2 genoma. Iz tega so sklepali, da bi sev JR2 lahko imel tudi gen Av2 (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

6.2 DOLOČITEV KANDIDATNIH GENOV ZA Av2 S PRIMERJALNO GENOMIKO Chavarro‐Carrero in sodelavci (2020) so izvedli analize na podlagi dveh možnih scenarijev (Preglednica 2). V prvem scenariju so predpostavili, da je Av2 gen specifičen samo za tip 2, v drugem scenariju pa, da je Av2 gen prisoten tako v tipu 1 kot v tipu 2. V prvem scenariju so za referenčni genom vzeli sev TO22, ki pripada tipu 2, v drugem scenariju pa so za referenco vzeli JR2, ki pripada tipu 1. V naslednjem koraku so genome tipa 3 sevov primerjali z referencami in obdržali regije, ki jih genomi tipa 3 niso pokrivali. Nato so genome tipa 2 primerjali z obdržanimi regijami iz prejšnjega koraka, regije, ki so se prekrivale z vsemi sevi tipa 2, so označili kot potencialne kandidate za Av2. Za scenarij 1 so identificirali 563 kb sekvence specifičnih regij, ki vsebujejo 110 genov, od tega 6 genov kodira zunajcelične proteine XLOC_00170, evm.model.contig1569.344, tig00000058:1 027 588–1 028 906, tig00000058:1 116 044–1 116 494, tig00000151:403362–404 089 in tig00017428:835657–

837 290. Za scenarij 2 so identificirali 222 kb sekvence, 40 genov, od tega naj bi samo 2 gena nosila zapis za zunajcelične proteine XLOC_00170 in evm.model.contig1569.344 (Chavarro‐Carrero in sod., 2020). V prejšnjih raziskavah so odkrili, da se oba gena izražata v rastlinah velikih količinah med inokulacijo Nicotiana benthamiana (de Jonge in sod., 2013).

(20)

13

Preglednica 2: Scenarija primerjalne genomike za identifikacijo kandidatnih genov za Av2

Scenarij 1 2

Referenca TO22 JR2

Tip 2

GF-CA2 GF-CA2

TO22 TO22

UD-1-4-1 UD-1-4-1

DVDS26 GF1207 DVDS26

GF1207

Tip 3

GF-1192 GF-1192

GF-CB5 GF-CB5

HOMCF HOMCF

DVD161 DVD161

DVD3 DVD3

VT-2A VT-2A

Potencialni geni

XLOC_00170 XLOC_00170

evm.model.contig1569.344 evm.model.contig1569.344 tig00000058:1 027 588–1 028

906

tig00000058:1 116 044–1 116

494

tig00000151:403362–404 089 tig00017428:835657–837 290

V naslednjem koraku so inokulirali rastlino paradižnika s sevom JR2 in s PCR v realnem času spremljali, kateri geni se izražajo tekom okužbe rastline (Slika 8). Ugotovili so, da se izražata gena XLOC_00170 in evm.model.contig1569.344. Največje izražanje teh dveh genov je bilo 7 dni po inokulaciji rastline, oba gena sta v tem sevu imela enako visoko ekspresijo. Med rastjo seva JR2 in vitro niso zaznali ekspresije genov XLOC_00170 in evm.model.contig1569.344. V sevu TO22 se gena tudi izražata, z vrhom ekspresije 11 dni po inokulaciji. V tem sevu je bila ekspresija gena evm.model.contig1569.344 višja kot ekspresija gena XLOC_00170. Med inokulacijo rastline s sevom TO22 niso zaznali ekspresije ostalih štirih potencialnih kandidatov določenih v scenariju 1, kar pomeni, da ne morejo biti gen Av2 (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

(21)

14

Slika 9: Izražanje kandidatnih genov za virulentni efektor. A: Ekspresija genov v sevu JR2. B: Ekspresija genov v sevu TO22. dpi- dnevi po inokulaciji. PDA- kontrola, gliva je rastla na krompirjevem

dekstroznem agarju (prirejeno po Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

6.3 POTRDITEV GENSKEGA MODELA XLOC_00170 KOT Av2

V prejšnjem koraku so Chavarro‐Carrero in sodelavci (2020) določili 2 gena kot potencialna kandidata za Av2. Posamezno so vsakega od teh dveh genov vstavili v seva glive tipa 3 GF- CB5 in HOMCF. Nato so s transformiranimi sevi inokulirali 3 tipe rastlin paradižnika - kontrola brez rezistence, paradižniki rezistentni na tip 1 in paradižniki rezistentni na tip 1 in tip 2. Kot rezultate so opazovali znake upočasnjene rasti in merili količino glivne biomase s

(22)

15

PCR v realnem času. V poskusu so uporabili transformirane in netransformirane seve tipa 3.

Vsi testirani sevi so povzročili upočasnjeno rast rastlin brez rezistence in rastlin z rezistenco na tip 1. Netransformirana seva in sev z genom evm.model.contig1569.344 so povzročili upočasnjeno rast rastlin z rezistenco na tip 1 in tip 2. Sev z genom XLOC_00170 pa ni povzročil upočasnjene rasti rastlin z rezistenco na obe vrsti V. dahliae. Rezultati PCR v realnem času so se skladali z znaki upočasnjene rasti, saj je bila izmerjena biomasa glive manjša v rastlini z rezistenco na obe vrsti okuženi s transformiranim sevom z genom XLOC_00170. S tem so potrdili, da je XLOC_00170 virulenčni gen Av2 (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

V sevih TO22 in JR2ΔAve1 so izvedli tarčno delecijo gena XLOC_00170 in nato inokulirali tri genotipe rastlin paradižnika. Rastline brez rezistence in rastline, rezistentne na tip 1, so kazale znake upočasnjene rasti pri obeh sevih. Na setu rastlin, rezistentnih na tip 1 in tip 2, sta seva s prekinjenim genom povzročila okužbo podobno sevom tipa 3. Vsi rezultati so se skladali tudi z analizam PCR v realnem času. Ta poskus je še dodatno potrdil, da je XLOC_00170 res virulentni efektor Av2 (Chavarro‐Carrero in sod., 2020).

7 ZAKLJUČEK

Z uporabo primerjalne genomike in transkriptomike so uspešno identificirali gene za efektorje Ave1 in Av2, funkcijo genov so potrdili s funkcionalnimi analizami. Ugotovili so, da Ave1 poveča virulenco sevov, medtem ko Av2 ne vpliva na njo, in da imata oba gena malo oziroma nič alelnih variant znotraj vrste in homologe zunaj vrste. Gen Ave1 so glive gotovo dobile od rastlin preko medvrstnega homolognega prenosa. Strategije za identifikacijo obeh efektorjev so temeljile na prepoznavi efektorskih genov s strani rezistentnih genov. To pomeni, da se lahko te strategija uporablja samo za identifikacijo efektorjev, za katere so znani rezistentni geni. V raziskavah so med seboj primerjali genome sevov iste vrste in samo različnih tipov ter tako identificirali regije DNA, ki so bile specifične za posamezne tipe. Metoda morda ne bi delovala na primerjavi manj sorodnih sevov med seboj.

Identifikacije efektorjev in raziskave na mehanizmih okužb rastlin z glivami lahko vodijo v razvoj bolj trajne rezistence rastlin proti glivam, kar pomeni manj ekonomske škode kot posledica okužb na poljščinah vsako leto. Identifikacija glivnih efektorjev je še vedno izziv, saj je zanjo potrebno imeti velike količine podatkov o sekvencah genomov, poleg tega za določitev s funkcionalnimi testi že moramo poznati rezistentni gen za ta efektor. Z večanjem dostopnih podatkov o glivnih genomih in o delovanju efektorjev se te strategije izboljšujejo.

Na področju interakcij med rastlino in glivo tekom okužbe in delovanja efektorjev je še veliko neznank, ki jih je potrebno bolj podrobno raziskati, saj je trenutno znanje in razumevanje na tem področju še omejeno.

(23)

16 8 VIRI

Castel S.E., Martienssen R.A. 2013. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nature Reviews Genetics,14: 100–112

Chavarro‐Carrero E. A., Vermeulen J. P., Torres D. E., Usami T., Schouten H. J., Bai Y., Seidl M. F., Thomma B. P. H. J. 2020. Comparative genomics reveals the in

planta‐secreted Verticillium dahliae Av2 effector protein recognized in tomato plants that carry the V2 resistance locus. Environmental Microbiology, doi: 10.1111/1462-

2920.15288: 18 str.

Couto, D., Zipfel, C. 2016. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants.

Nature Reviews Immunology, 16: 537–552

de Jonge R., van Esse H. P., Maruthachalam K., Bolton M. D., Santhanam P., Saber M.K., Zhang Z., Usami T., Lievens B., Subbarao K. V., Thomma B. P. H. J.. 2012. Tomato immune receptor Ve1 recognizes effector of multiple fungal pathogens uncovered by genome and RNA sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A, 109, 13: 5110–5115 Dobinson K.F., Tenuta G.K., Lazarovits G. 1996. Occurrence of race 2 of Verticillium

dahliae in processing tomato fields in southwestern Ontario. Can. J. Plant Pathol.-Rev.

Can. Phytopathol, 18: 55–58

Doehlemann G., van der Linde K., Assmann D., Schwammbach D., Hof A., Mohanty A., Jackson D., Kahmann R. 2009. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis, is required for successful invasion of plant cells. PLoS Pathogens, 5, 2: e1000290, doi:10.1371/journal.ppat.1000290: 17 str.

Fradin E.F., Thomma B.P.H.J. 2006. Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V. dahliae and V. albo-atrum. Molecular Plant Pathology, 7: 71–86 Hayes R.J., Vallad G.E., Qin Q.M., Grube R.C., Subbarao K.V. 2007. Variation for resistance

to Verticillium wilt in lettuce (Lactuca sativa L.). Plant Disease. 91: 439–45 Jones J.D., Dangl J.L. 2006. The plant immune system. Nature, 444, 7117: 323-329

de Jonge, R., Bolton, M.D., Kombrink, A., Van Den Berg, G.C.M., Yadeta, K.A., Thomma, B.P.H.J. 2013. Extensive chromosomal reshuffling drives evolution of virulence in an asexual pathogen. Genome Research, 23: 1271–1282

Kawchuk L.M., Hachey J., Lynch D.R., Kulcsar F., van Rooijen G., Waterer D.R., Robertson A., Kokko E., Byers R., Howard R.J., Fischer R., Prüfer D. 2001. Tomato Ve Disease Resistance Genes Encode Cell Surface-like Receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 98,1: 6511 -6515

Klosterman S.J., Atallah Z.K., Vallad G.E., Subbarao K.V. 2009. Diversity, pathogenicity, and management of verticillium species. Annual Review of Phytopathology, 47: 39–62 Klosterman S.J., Subbarao K.V., Kang S., Veronese P., Gold S.E., Thomma B.P.H.J., Chen

Z., Henrissat B., Lee Y.H., Park J., Garcia-Pedrajas M.D., Barbara D.J., Anchieta A., de Jonge R., Santhanam P., Maruthachalam K., Atallah Z., Amyotte S.G., Paz Z., Inderbitzin P., Hayes R.J., Heiman D.I., Young S., Zeng Q., Engels R., Galagan J., Cuomo C.A., Dobinson K.F., Ma L.J. 2011. Comparative Genomics Yields Insights into Niche

(24)

17

Adaptation of Plant Vascular Wilt Pathogens. PLoS Pathogens. 7,7: e1002137, doi:

10.1371/journal.ppat.1002137.g001: 20 str.

Kombrink A., Rovenich H., Shi-Kunne X., Rojas-Padilla E., van den Berg G.C., Domazakis E., de Jonge R., Valkenburg D.J., Sánchez-Vallet A., Seidl M.F., Thomma B.P. 2017.

Verticillium dahliae LysM effectors differentially contribute to virulence on plant hosts.

Molecular Plant Pathology, 18: 596–608

Liu T., Song T., Zhang X., Yuan H., Su L., Li W., Xu J, Liu S., Chen L., Chen T., Zhang M., Gu L., Zhang B., Dou D. 2014. Unconventionally secreted effectors of two filamentous pathogens target plant salicylate biosynthesis. Nature Communications, 5,1: doi:

10.1038/ncomms5686: 10str.

Masachis S., Segorbe D., Turrà D., Leon-Ruiz M., Fürst U., El Ghalid M., Leonard G., López-Berges M.S., Richards T.A., Felix G., Di Pietro A. 2016. A fungal pathogen secretes plant alkalinizing peptides to increase infection. Nature Microbiology, 1: doi:

10.1038/nmicrobiol.2016.43: 8 str.

Pegg G.F., Brady B.L. 2002. Verticillium wilts. New York, CABI Publishing: 432 str.

Rodriguez-Moreno L., Ebert M.K., Bolton M. D., Thomma B.P.H.J. 2018. Tools of the crook- infection strategies of fungal plant pathogens. The Plant Journal, 93: 664–674 Ryder L.S., Talbot N.J. 2015. Regulation of appressorium development in pathogenic fungi.

Current Opinion in Plant Biology, 26: 8–13

Sanchez-Vallet A., Mesters J.R., Thomma B.P. 2015. The battle for chitin recognition in plant-microbe interactions. FEMS Microbiology Reviews, 39: 171–183

Schaible L., Cannon O.S., Waddoups V. 1951. Inheritance of resistance to Verticillium wilt in a tomato cross. Phytopathology, 41: 986–990

Shi-Kunne X., Faino L., van den Berg G.C.M., Thomma B.P.H.J., Seidl M.F. 2018.

Evolution within the fungal genus Verticillium is characterized by chromosomal rearrangement and gene loss. Environmental Microbiology, 20: 1362–1373

Sonah H., Deshmukh R.K., Bélanger R.R. 2016. Computational Prediction of Effector Proteins in Fungi: Opportunities and Challenges. Frontiers in Plant Science, 7: doi:

10.3389/fpls.2016.00126: 14 str.

Staskawicz B.J., Dahlbeck D., Keen N.T. 1984. Cloned avirulence gene of Pseudomonas syringae pv. glycinea determines race-specific incompatibility on Glycine max (L.) Merr.

Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81: 6024–6028 Stergiopoulos I., de Wit P.J. 2009. Fungal effector proteins. Annual Review of

Phytopathology, 47: 233–263

Takken F.L., Luderer R., Gabriëls S.H., Westerink N., Lu R., de Wit P.J., Joosten M.H. 2000.

A functional cloning strategy, based on a binary PVX-expression vector, to isolate HR- inducing cDNAs of plant pathogens. The Plant Journal, 24: 275–283

Usami T., Momma N., Kikuchi S., Watanabe H., Hayashi A., Mizukawa M., Yoshino K., Ohmori Y.. 2017. Race 2 of Verticillium dahliae infecting tomato in Japan can be split into two races with differential pathogenicity on resistant rootstocks. Plant Pathology, 66: 230–

238

(25)

18

Van de Wouw A. P.,Marcroft S.J., Ware A., Lindbeck K., Khangura R., Howlett B.J.

2014.Breakdown of resistance to the fungal disease, blackleg, is averted in commercial canola (Brassica napus) crops in Australia. Field Crops Research, 166: 144-151 Van der Hoorn R.A. 2008. Plant proteases: from phenotypes to molecular mechanisms.

Annual Review of Plant Biology, 59: 191–223

Wang M., Weiberg A., Lin F.M., Thomma B.P., Huang H.D., Jin H. 2016. Bidirectional cross-kingdom RNAi and fungal uptake of external RNAs confer plant protection. Nature Plants, 19, 2, doi: 10.1038/nplants.2016.151: 10 str.

Wolpert, T.J., Dunkle, L.D., Ciuffetti, L.M. 2002. Host-selective toxins and avirulence determinants: what’s in a name? Annu. Rev. Phytopathol, 40: 251–285

ZAHVALA

Za strokovno vodstvo in pomoč bi se rada zahvalila mentorju prof. Jerneju Jakšetu. Rada bi se zahvalila tudi moji družini in bližnjim, ki so mi tekom študija stali ob strani. Prav tako bi se rada zahvalila vsem profesorjem, asistentov in vsem, ki so se, sploh v zadnjem letu trudili, da je študij potekal, kar se da nemoteno.