UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Sara MILAVEC
VPLIV MEŠANICE IZBRANIH PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA ALGO Pseudokirchneriella subcapitata
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija
Ljubljana, 2015
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Sara MILAVEC
VPLIV MEŠANICE IZBRANIH PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA ALGO Pseudokirchneriella subcapitata
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija
THE EFFECT OF THE SELECTED ANTI-CANCER DRUGS MIXTURE ON ALGA Pseudokirchneriella subcapitata
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Microbiology
Ljubljana, 2015
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje mikrobiologije na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Opravljeno je bilo na Nacionalnem inštitutu za biologijo, v laboratorijih Oddelka za gensko toksikologijo in biologijo raka.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala prof. dr.
Romano Marinšek Logar, za somentorico dr. Tino Elešek in za recenzentko prof. dr. Majo Čemažar.
Mentorica: prof. dr. Romana Marinšek Logar Somentorica: dr. Tina Eleršek
Recenzentka: prof. dr. Maja Čemažar
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Blagajana HERZOG VELIKONJA
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Članica: prof. dr. Romana MARINŠEK LOGAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Članica: dr. Tina ELERŠEK
Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za gensko toksikologijo in biologijo raka
Članica: prof. dr. Maja ČEMAŽAR
Onkološki inštitut Ljubljana, Oddelek za eksperimentalno onkologijo
Datum zagovora:
Podpisana izjavljam, da je naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je elektronski izvod identičen tiskanemu. Na univerzo neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno prenašam pravici shranitve avtorskega dela v elektronski obliki in reproduciranja ter pravico omogočanja javnega dostopa do avtorskega dela na svetovnem spletu preko Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete.
Sara Milavec
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 615.9:615.277:582.263(043)=163.6
KG enocelične zelene alge/Pseudokirchneriella subcapitata/protirakava zdravila/5- fluorouracil/imatinib mezilat/etopozid/toksičnost/test inhibicije rasti/neodvisno delovanje/seštevek koncentracij/vezava protirakavih zdravil/celična biomasa
AV MILAVEC, Sara, dipl. mikrobiol. (UN)
SA MARINŠEK LOGAR, Romana (mentorica)/ELERŠEK, Tina (somentorica)/
ČEMAŽAR, Maja (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije LI 2015
IN VPLIV MEŠANICE IZBRANIH PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA ALGO Pseudokirchneriella subcapitata
TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija) OP XI, 55 str., 11 pregl., 16 sl., 124 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Protirakava zdravila so skupina farmacevtskih učinkovin z velikim potencialom za negativen vpliv na netarčne organizme. Zaradi nepopolne razgradnje v postopku čiščenja na čistilnih napravah se pojavljajo v različnih naravnih (vodnih) okoljih, in sicer ne posamično, ampak v obliki kompleksnih mešanic, katerih vpliv na netarčne organizme je zaenkrat zelo slabo preučen. Iz obstoječih študij je razvidno, da je učinek protirakavih zdravil v kombinacijah lahko večji kot le seštevek učinkov posameznih protirakavih zdravil. Namen magistrske naloge je bil ugotoviti, kakšen je vpliv mešanice treh za kemoterapijo pogosto uporabljanih protirakavih zdravil (5-fluorouracil, imatinib mezilat, etopozid) na enocelično algo Pseudokirchneriella subcapitata. Spremljali smo inhibicijo rasti celičnih kultur alge P. subcapitata z dodano izbrano mešanico protirakavih zdravil v petih različnih efektivnih koncentracijah (EC). V koncentracijskem območju EC5-EC50 smo dokazali sinergističen učinek mešanice, pri najvišji EC (EC90) pa je bil učinek antagonističen. Predvidena toksičnost mešanice, izračunana po matematičnih modelih, osnovanih na konceptih neodvisnega delovanja (IA) in seštevka koncentracij (CA), se je razlikovala od eksperimentalno izmerjene. Izbrana napovedna modela sta se izkazala za nezanesljiva. Ugotovili smo tudi, da se testirana protirakava zdravila na in/ali v celično biomaso vežejo v zelo majhnem deležu (0,01-0,1 % od celotne uporabljene količine).
KEY WORDS DOCUMENTATION
ND Du2
DC UDC 615.9:615.277:582.263(043)=163.6
CX single-cell algae/Pseudokirchneriella subcapitata/anticancer drugs/5-fluorouracil/
imatinib mesylate/etoposide/toxicity/growth inhibition test/independent action/
concentration addition/anticancer drugs binding/cell biomass AU MILAVEC, Sara
AA MARINŠEK LOGAR, Romana (supervisor)/ELERŠEK, Tina (co-advisor)/
ČEMAŽAR, Maja (reviewer)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Microbiology PY 2015
TY THE EFFECT OF THE SELECTED ANTI-CANCER DRUGS MIXTURE ON ALGA Pseudokirchneriella subcapitata
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Microbiology) NO XI, 55 p., 11 tab., 16 fig., 124 ref.
LA sl Al sl/en
AB Anticancer drugs represent a group of pharmaceutical substances with great potential for a negative impact on non-target organisms. Anticancer drugs can be found in various natural (aquatic) environments as they are not completely removed during cleaning processes at wastewater treatment plants. They are not present as single substances but as complex mixtures the effect of which has been inadequately studied so far. The existing studies show that the effect of anticancer drugs in combinations can be bigger than a simple sum of the single anticancer drug effects. The aim of the thesis was to determine the effect of the mixture consisting of three anticancer drugs which are widely used in chemotherapy (5-fluorouracil, imatinib mesylate, etoposide) on single-cell alga Pseudokirchneriella subcapitata.
We monitored growth inhibition in P. subcapitata cell cultures with added selected mixture of anticancer drugs in five different effect concentrations (EC). In EC5- EC50 concentration range the effect of the mixture was shown to be sinergistic, and antagonistic in the case of the highest EC (EC90). Predicted toxicity of the mixture, calculated using mathematical model established on concepts of independent action (IA) and concentration addition (CA), differed from experimentally measured toxicity. Selected predictive models proved to be unreliable. We also established that only a small share of selected anticancer drugs binds to cell biomass (0,01-0,1
% of total used quantity).
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA II
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VIII
KAZALO SLIK IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
SLOVARČEK XI
1 UVOD 1
1.1 CILJI RAZISKOVALNE NALOGE 2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 PROTIRAKAVA ZDRAVILA 3
2.1.1 Klasifikacija protirakavih zdravil 3
2.1.2 Opis izbranih protirakavih zdravil 3
2.1.2.1 Fluorouracil 3
2.1.2.2 Imatinib 5
2.1.2.3 Etopozid 6
2.2 OKOLJSKA PROBLEMATIKA PROTIRAKAVIH ZDRAVIL 7
2.2.1 Farmacevtsko aktivne učinkovine v okolju 7
2.2.2 Protirakava zdravila v okolju 8
2.2.2.1 Vir in pojavnost protirakavih zdravil v okolju 8
2.2.2.2 Usoda protirakavih zdravil v okolju 10
2.2.3 Učinek protirakavih zdravil na netarčne organizme 11 2.2.3.1 Zelena alga Pseudokirchneriella subcapitata 13
2.3 PRETOČNA CITOMETRIJA 13
2.4 MODELI ZA NAPOVEDOVANJE IN ANALIZO TOKSIČNOSTI MEŠANIC 14 2.4.1 Modela seštevka koncentracij in neodvisnega delovanja 14
2.4.2 Kombinacijski indeks 15
3 MATERIALI IN METODE 17
3.1 MATERIALI 17
3.1.1 Protirakava zdravila 17
3.1.2 Testni organizem 18
3.1.3 Gojišče OECD 18
3.2 METODE 19 3.2.1 Merjenje celične gostote kulture za inokulum 19 3.2.2 Priprava testnih mešanic protirakavih zdravil 20
3.2.3 Testiranje inhibicije rasti 21
3.2.4 Štetje celic s pretočnim citometrom 22
3.2.5 Izračun stopnje in inhibicije rasti 23
3.2.5.1 Stopnja rasti 23
3.2.5.2 Inhibicija rasti 24
3.2.6 Statistična analiza podatkov 24
3.2.7 Izračuna predvidene toksičnosti mešanice 24
3.2.7.1 Model seštevka koncentracij 25
3.2.7.2 Model neodvisnega delovanja 25
3.2.8 Kvantitativna opredelitev interakcij med sestavinami mešanice 25 3.2.9 Opredelitev stabilnosti in analiza vstopa protirakavih zdravil v celice 26
3.2.9.1 Priprava vzorcev za analizo 26
3.2.9.2 Izvedba analize 27
3.2.10 Mikroskopiranje z vrstičnim elektronskim mikroskopom 27 3.2.10.1 Priprava vzorca za elektronsko mikroskopijo 27
4 REZULTATI 28
4.1 UČINEK MEŠANICE PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA TARČNI ORGANIZEM 28
4.1.1 Rast testnih kultur 28
4.1.2 Stopnje in inhibicije rasti 30
4.1.3 Rezultati statistične analize 32
4.1.4 Primerjava matematično predvidenih in dejanskih učinkov mešanice 33 4.1.5 Kvantitativna opredelitev interakcij med sestavinami mešanice 35
4.1.5.1 Kombinacijski indeksi 35
4.1.5.2 Razmerja odstopanja modela 35
4.1.6 Vpliv protirakavih zdravil na lastnosti celične površine 36
4.2 STABILNOST PROTIRAKAVIH ZDRAVIL 37
4.2.1 Supernatanti celičnih kultur 38
4.2.2 Založne raztopine protirakavih zdravil 38
4.3 VEZAVA PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA/V CELIČNO BIOMASO 39
5 RAZPRAVA 39
5.1 VPLIV MEŠANICE PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA RAST 40
5.2 NAPOVEDNA VREDNOST NAPOVEDNIH MODELOV TOKSIČNOSTI 41 5.3 VPLIV MEŠANICE PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA LASTNOSTI CELIČNE
POVRŠINE 42
5.4 STABILNOST PROTIRAKAVIH UČINKOVIN 42
5.5 VEZAVA PROTIRAKAVIH UČINKOVIN NA/V CELICE 43
6 SKLEPI 44
7 POVZETEK 45
8 VIRI 46
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Znani toksikološki podatki za izbrana protirakava zdravila. 10 Preglednica 2: Seznam spojin za pripravo založnih raztopin, potrebnih za pripravo
gojišča OECD, in končne koncentracije posamezne sestavine v vsaki
od založnih raztopin. 19
Preglednica 3: Koncentracija posameznega protirakavega zdravila v izbrani mešanici in skupna koncentracija protirakavih zdravil za vsako efektivno
koncentracijo mešanice. 21
Preglednica 4: Odstotek posameznega protirakavega zdravila v mešanici od skupne koncentracije za vsako efektivno koncentracijo mešanice. 21 Preglednica 5: Pregled izračunov stopenj rasti alge P. subcapitata za celoten čas
inkubacije (72 ur) in inhibicij rasti za vse efektivne koncentracije izbrane mešanice protirakavih zdravil za štiri veljavne ponovitve
testa (A, B, C, D). 31
Preglednica 6: Efektivne koncentracije izbrane mešanice protirakavih zdravil, izračunane oz. opredeljene na podlagi eksperimentalnih podatkov in
statistične analize, in napovedane po dveh napovednih modelih. 34 Preglednica 7: Kombinacijski indeksi za vse efektivne koncentracije izbrane
mešanice protirakavih zdravil za algo P. subcapitata. 35 Preglednica 8: Razmerja odstopanja modela, izračunana glede na napovedi po dveh
napovednih modelih, za vse efektivne koncentracije izbrane
mešanice protirakavih zdravil za algo P. subcapitata. 36 Preglednica 9: Pričakovane in izmerjene koncentracije posameznih protirakavih
zdravil na začetku in koncu testa (t0 in t3) za obe efektivni
koncentraciji, izračunana odstopanja od pričakovanih vrednosti in
razlike med koncentracijami na začetku in koncu testa. 38 Preglednica 10: Primerjava med predvidnimi in s kemijsko analizo ugotovljenimi
koncentracijami posameznih protirakavih zdravil v založnih
raztopinah. 39
Preglednica 11: Izračunana masa vsakega od protirakavih zdravil na gram končne liofilizirane biomase na začetku in koncu testa (t0 in t3) ter odstotek od celotne porabljene mase protirakavih zdravil, ki ga predstavlja
količina, prisotna ob času t3 (v in/ali na celicah). 39
KAZALO SLIK
Slika 1: Kemijska zgradba fluorouracila; ime po IUPAC: 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-
dion (ChEBI, 2014) 4
Slika 2: Kemijska zgradba imatiniba; ime po IUPAC: 4-[(4-metilpiperazin-1- il)metil]-N-{4-metil-3-{[4-(piridin-3-il)pirimidin-2-
il]amino]fenill}benzamid (ChEBI, 2014) 5
Slika 3: Kemijska zgradba etopozida; ime po IUPAC: 4'-demetilepipodofilotoksin 9- (4,6-O-(R)-etilidene-beta-D-glukopiranozid) (ChEBI, 2014) 6
Slika 4: Celice alge Pseudokirchneriella subcapitata 13
Slika 5: Shematski prikaz pretočnega citometra (Brown in Wittwer, 2000) 14
Slika 6: Hodogram poskusov 17
Slika 7: Števna komora (Veranič in sod., 2003) 20
Slika 8: Shematski prikaz mreže števne komore Bürker Türk 20 Slika 9: Primera točkovnih histogramov pretočnega citometra za algo P. subcapitata
(levo zgoraj = uporabljen laserski senzor FL3 (okvir R1); levo spodaj = uporabljen laserski senzor FL4 (okvir R2) in primera spektrov fluorescence za algo P. subcapitata (desno zgoraj = uporabljen laserski senzor FL3;
desno spodaj = uporabljen laserski senzor FL4, M1 = interval štetja). 23 Slika 10: Rastne krivulje testnih kultur alge P. subcapitata za vse efektivne
koncentracije (EC) izbrane mešanice protirakavih zdravil za vse tri ponovitve posamezne EC oz. kontrole (a, b, c) in štiri veljavne ponovitve
testa (A, B, C, D). 29
Slika 11: Odvisnost celične gostote testnih kultur alge P. subcapitata od efektivne koncentracije (EC) izbrane mešanice protirakavih zdravil za vse tri
ponovitve posamezne EC oz. kontrole (a, b, c), vse meritvene točke in štiri
veljavne ponovitve testa (A, B, C, D). 30
Slika 12: Inhibicija rasti alge P. subcapitata pri vseh efektivnih koncentracijah (EC) izbrane mešanice protirakavih zdravil za vse tri ponovitve posamezne EC (a,
b, c) in vse štiri ponovitve testa (A, B, C, D). 31
Slika 13: Učinek posameznih protirakavih zdravil in njihovih mešanic na rastno inhibicijo alge P. subcapitata. Prikazani sta tudi napovedi po dveh
napovednih modelih. 33
Slika 14: Shematski prikaz primerjave dejanskih učinkov mešanic protirakavih zdravil na inhibicijo rasti alge P. subcapitata z napovedanimi po dveh napovednih modelih, od leve proti desni za vseh pet efektivnih koncentracij
(EC5-EC90). 34
Slika 15: Makrostruktura liofilizirane biomase alge P. subcapitata 36 Slika 16: Mikrostruktura liofilizirane biomase alge P. subcapitata (posnetki z
vrstičnim elektronskim mikroskopom; belo merilo zgornjih slik predstavlja
10 µm, spodnjih pa 1 µm). 37
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ATP adenozin trifosfat (ang. Adenosine triphosphate)
CA model seštevka koncentracij (ang. Concentration addition)
CDDP cisplatin
CI kombinacijski indeks (ang. Combination index)
DMSO dimetil sulfoksid
DNK deoksiribonukleinska kislina
EC efektivna koncentracija (ang. Effective concentration)
ET etopozid
FDA Zvezni urad za hrano in zdravila (ang. Food and Drug Administration)
FSC fotodetektor iz smeri vira vpadne svetlobe (ang. Forward Scatter)
FU 5-fluorouracil
IA model neodvisnega delovanja (ang. Independent action)
IM imatinib mezilat
IUPAC Mednarodna zveza za čisto in uporabno kemijo (ang. International Union of Pure and Applied Chemistry)
KV koeficient variacije
MEE enačba za srednji učinek (ang. Median-effect equasion) MDR razmerje odstopanja modela (ang. Model deviation ratio) OECD Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (ang.
Organisation for Economic Co-operation and Development RNK ribonukeinska kislina
SEM vrstični elektronski mikroskop (ang. Scanning electron microscope) SD standardni odklon (ang. Standard deviation)
SSC fotodetektor pravokotno na vir vpadne svetlobe (ang. Side Scatter)
SLOVARČEK citotoksičen dejavnik, ki je strupen za celice (dejavnik)
efektivna koncentracija v mediju raztopljene testne učinkovine, ki povzroči x % koncentracija zmanjšanje rasti testnega organizma v določenem času izpostavitve
(npr. EC50 povzroči učinek, ki je natanko na sredini med največjim in najmanjšim možnim v določenem času)
evkariont organizem, zgrajen iz evkariontskih celic (v grobem rastline, živali, glive, praživali, alge) = celic z jedrom idr. značilnostmi, ki jih ločujejo od prokariontskih celic (ciano)bakterij in arhej fotoliza kemijska reakcija, pri kateri pride do razbitja molekule zaradi
vpliva fotonov
genotoksičen dejavnik, ki povzroči spremembo genske informacije (če se (dejavnik) ta sprememba ohrani, govorimo o mutagenem delovanju) karcinogen dejavnik, ki povzroči rakasto obolenje (izzove mutacijo
(dejavnik) ali pa spremeni izražanje genov brez poseganja v strukturo DNK) klastogen mutagen dejavnik, ki povzroči spremembe kromosomov
(dejavnik)
liofilizacija dehidracija z zamrzovanjem in nato znižanjem tlaka do te mere, da voda sublimira iz materiala
metabolit produkt v procesu metabolizma (presnove)
ozonacija proces uvajanja ozona v vodo (npr. z namenom dezinfekcije)
primarni organizem, ki proizvaja organski material (biomaso) iz anorganskega producent materiala
supernatant tekočina nad materialom, ki je sedimantiral (zaradi precipitacije, centrifugiranja, usedanja)
teratogen dejavnik, ki povzroča strukturne, funkcijske, presnovne (dejavnik) in vedenjske nepravilnosti pri zarodku
1 UVOD
Protirakava zdravila so učinkovine, ki jih uporabljajo za sistemsko zdravljenje rakavih obolenj. Po načinu delovanja se med seboj razlikujejo - nekatera odstranijo rakave celice preko vpliva na genski material, druga delujejo na celične encime ali aktivirajo imunski odziv. Mnoga protirakava zdravila delujejo neselektivno, kar pomeni, da so poleg tarčnih rakavih celic za njihov vpliv dovzetne tudi netarčne, zdrave celice. To vodi v številne nezaželene stranske učinke zdravljenja, med katere spadajo tudi mutagenost, kancerogenost in teratogenost (Chabner in Longo, 2001; Schimmer in Tannock, 2013). Za zdravljenje jih večinoma uporabljajo v kombinacijah, saj s tem povečajo uspešnost terapije (Chen, 2013; Kurkjian in Kummar, 2009; Ocvirk, 2009).
Poraba protirakavih zdravil se zaradi naraščajočega števila rakavih bolnikov povečuje, vendar je količinsko še vedno relativno majhna v primerjavi s porabo zdravil iz drugih skupin (Kovalova, 2009). To pa še ne pomeni, da so z okoljskega vidika neproblematična skupina farmacevtskih učinkovin. Vsaj nekateri imajo namreč lahko toksičen učinek že v majhnih koncentracijah (Johnson in sod., 2008). Še toliko bolj pa lahko pride njihov vpliv do izraza v primeru, ko delujejo v kombinacijah (Altenburger in Greco, 2009; Brezovšek in sod., 2014; Faust in sod., 2001; Silva in sod., 2002), kar se v naravnem okolju dogaja neprestano. Iz bolnikov, zdravljenih s kemoterapijo, se v odpadne vode (bolnišnične in gospodinjske) namreč kontinuirano izločajo različna protirakava zdravila in njihovi metaboliti, zaradi nepopolnega odstranjevanja med postopkom čiščenja na čistilnih napravah pa posledično v obliki kompleksnih mešanic (njihovih metabolitov in transformacijskih produktov ter drugih snovi) prehajajo v vodna telesa (Kümmerer in sod., 1997; Mahnik in sod., 2007; Yin in sod. 2010). Med vire onesnaženja spadajo tudi izpusti iz farmacevtskih proizvodnih obratov ipd., vendar je glavnina povezana z bolniki na kemoterapiji (Besse in sod., 2012; Mahnik in sod., 2007). Različni organizmi v okolju so posledično stalno izpostavljeni kompleksnim mešanicam protirakavih in drugih farmacevtskih učinkovin, katerih kemijska sestava in učinki so izredno slabo preučeni, še posebno kronični, zato je težko oceniti okoljsko tveganje, ki ga protirakava zdravila predstavljajo. Glede na njihov način delovanja (npr. nespecifičen vpliv na genski material) lahko predvidevamo, da imajo potencial za škodljiv vpliv vsaj na večino evkariontskih organizmov (Besse in sod., 2012; Fent in sod., 2006; Johnson in sod., 2008; Kümmerer in al-Ahmad, 2010), npr. tudi na enocelične alge. Le te kot ene od dominantnih primarnih producentov igrajo ključno ekološko vlogo v večini vodnih ekosistemov (Pfleeger in sod., 1991; Lewis, 1995), zato se vsak vpliv na njihove združbe odrazi na višjih trofičnih nivojih. Neravnovesje med populacijami alg in cianobakterij zaradi različne dovzetnosti za delovanje protirakavih zdravil (Pei in Ma, 2002) pa lahko vodi tudi v druge nezaželene pojave kot npr. v pretirano razrast cianobakterij v celinskih vodah (Ma in sod., 2008), ki ima prav tako negativne posledice (cianobakterijski toksini) za višje organizme in ljudi (Žegura in sod., 2011).
1.1 CILJI RAZISKOVALNE NALOGE
Cilj magistrske naloge je bil ugotoviti, kakšen učinek ima mešanica treh izbranih protirakavih zdravil na primarnega producenta, algo Pseudokirchneriella subcapitata (P.
subcapitata), in ga primerjati z učinkom, ki ga povzročijo izbrane učinkovine, če so dodane kulturi te alge posamezno ali v dvojicah. Eksperimentalno izmerjeno toksičnost mešanice smo primerjali s toksičnostjo, ki smo jo izračunali po matematičnimih modelih za napovedovanje toksičenga učinka mešanic. Poleg tega smo želeli ugotoviti, v kakšni meri se izbrana protirakava zdravila vežejo na ali v celice izbranega testnega organizma.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Delovne hipoteze magistrske naloge so bile:
mešanica treh izbranih protirakavih zdravil ima na algo P. subcapitata bolj toksičen učinek kot njene posamezne sestavine pri enakih efektivnih koncentracijah,
matematični modeli za izračun predvidene toksičnosti mešanic niso uporabna metoda za napovedovanje učinka mešanic (antagonističen, aditiven, sinergističen),
vezava citostatikov na oz. v algne celice je zanemarljiva.
2 PREGLED OBJAV
2.1 PROTIRAKAVA ZDRAVILA 2.1.1 Klasifikacija protirakavih zdravil
Protirakava zdravila so skupina zdravil, ki po Anatomsko-terapevtsko-kemičnem klasifikacijskem sistemu (ATC ang. Anatomical Therapeutic Chemical Classification System) spadajo v razred L01 (Zdravila z delovanjem na novotvorbe) (WHOCC, 2013).
Na podlagi kemijske zgradbe in mehanizma delovanja jih delimo na dve večji skupini:
citotoksike in citostatike (Besse in sod., 2012).
(I) Citotoksiki neposredno ali posredno vplivajo na DNK oz. RNK. (preprečujejo prepis ali podvojevanje DNK, lomijo enoverižno DNK, povzročijo nastanek lažne RNA ipd.;
blokirajo encime, potrebne za sintezo DNK, preprečujejo razhajanje kromosomov ipd.). S svojim delovanjem povzročijo metabolne in morfološke spremembe celice, ki vodijo v njeno smrt.
(II) Citostatiki, za razliko od citotoksikov, ne vplivajo na nukleinske kisline, a imajo na celico enak učinek. Delimo jih na inhibitorje proteinskih kinaz (encimov, ki sodelujejo pri regulaciji večine celičnih poti) in monoklonska protitelesa. S svojim delovanjem npr.
blokirajo celične rastne faktorje in s tem neposredno vplivajo na celično rast, ali pa npr.
aktivirajo citotoksične celice (makrofage, monocite), ki posredno pripomorejo k odstranitvi rakavih celic.
Velika večina protirakavih zdravil deluje neselektivno, torej na vse rastoče celice in ne izključno na rakave, zaradi česar prihaja pri zdravljenju z njimi do številnih nezaželenih stranskih učinkov. Mnoga med njimi so genotoksična, mutagena, karcinogena, citotoksična, ali teratogena (Chabner in Longo, 2001; Schimmer in Tannock, 2013;
Zounkova in sod., 2007).
2.1.2 Opis izbranih protirakavih zdravil 2.1.2.1 Fluorouracil
Fluorouracil (FU; sinonimi: 5-fluorouracil, 5-FU, NSC-19893) je citotoksik, ki ga je kot protirakavo učinkovino razvil in patentiral Charles Heidelberger leta 1957 (Chu, 2007), v široki uporabi za zdravljenje številnih vrst raka pa je še danes. Kot antimetabolit spada v ATC skupino L01B, natančneje v podskupino pirimidinskih analogov (L01BC; oznaka L01BC02) (WHOCC, 2013).
Po zgradbi je analog pirimidina uracila (Slika 1) in deluje kot pirimidinski antagonist.
Možni so trije mehanizmi delovanja (BC Cancer Agency, 2012):
fluorouracilov metabolit fluorodeoksiuridin monofosfat (FdUMP) z uracilom tekmuje za vezavo s timidilat sintetazo (TS) in kofaktorjem folatom. Posledica tega je zmanjšana produkcija timidina in s tem okrnjena sinteza DNK in njeno popravljanje, kar v končni fazi omeji celično delitev.
fluorouracilov metabolit fluorodeoksiuridin trifosfat (FdUTP) se vključi v DNK in s tem ovira njeno podvojevanje.
fluorouracilov metabolit fluorouridin-5-trifosfat (FUTP) se vključi v RNA namesto uridin trifosfata (UTP), kar vodi v nastanek lažne RNA, ovirano procesiranje RNA ter posledično ovirano sintezo proteinov.
Slika 1: Kemijska zgradba fluorouracila; ime po IUPAC: 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-dion (ChEBI, 2014)
Fluorouracil primarno uporabljajo za zdravljenje raka debelega črevesa in danke, mehurja, dojke, želodca, glave, vratu, jajčnikov, trebušne slinavke in prostate, pa tudi za zdravljenje Bowenove bolezni (kožni rak), raka nožnice, požiralnika in ledvic (BC Cancer Agency, 2012). Uporaba je lahko parenteralna (vnos v žilo ali trebušno votlino; komercialno ime Adrucil®) ali topikalna (nanos na kožo v obliki kreme; komercialno ime Efudex® cream.) (BC Cancer Agency, 2012). Biološka razpoložljivost je 28-100 % (BC Cancer Agency, 2012). Po aktivaciji fluorouracila v celicah nastanejo trije aktivni metaboliti (FdUMP, FdUTP, FUTP) in neaktiven metabolit dihidrifluorouracil (BC Cancer Agency, 2012).
Nespremenjen fluorouracil in njegovi metaboliti se v 80 % razgradijo v jetrih (Chabner in Longo, 2001) in iz telesa v 60-80 % izločijo v obliki CO2 preko dihal ter v 2-3 % preko biliarnega sistema (z žolčem in nato blatom) (BC Cancer Agency, 2012), <10 % intaktnega fluorouracila pa se izloči z urinom (Chabner in Longo, 2001).
Stranski učinki zdravljenja s flurouracilom so številni, med klinično pomembnejše spadajo kardiotoksičnost, blage do močne bolečine v prsih, (huda) driska, stomatitis in palmarno- plantarna eritrodizestezija (PPE), dokazano pa je njegovo delovanje tudi mutageno (v primeru nekaterih bakterijskih sevov; klastogenost je bila pri sesalcih dokazana z in vitro in in vivo kromosomskimi testi (BC Cancer Agency, 2012)) in potencialno teratogeno. V registru Zveznega urada za hrano in zdravila (FDA ang. Food and Drug Administration) spada v nosečnostno kategorijo D (BC Cancer Agency, 2012), kar pomeni, da obstajajo
dokazi škodljivosti za plod, vendar potencialna korist za nosečnico v določenih primerih tveganje lahko upraviči.
2.1.2.2 Imatinib
Imatinib (IM; sinonim: imatinib mezilat, STI-571) je citostatična protirakava učinkovina, ki jo je konec devetdesetih let preteklega stoletja razvila raziskovalna skupina pod vodstvom biokemika Nicholasa Lydona, patentiran je bil leta 1996. Po klasifikaciji ATC spada v skupino L01XE (inhibitorji proteinskih kinaz; oznaka L01XE01) (WHOCC, 2013). Deluje kot inhibitor tirozinske kinaze BCR-ABL, fuzijskega proteina, ki nastane zaradi kromosomske abnormalnosti, imenovane kromosom Philadelphia (Ph). Ta je značilna za večino kroničnih mieloičnih levkemij (KML), za zdravljenje katerih se imatinib primarno uporablja (BC Cancer Agency, 2007), z njim pa zdravijo tudi akutno limfoblastno levkemijo s prisotnim kromosomom Philadelphia (Ph+ ALL) (Wassmann in sod., 2003). Kemijska zgradba molekule imatiniba je prikazana na Sliki 2.
Slika 2: Kemijska zgradba imatiniba; ime po IUPAC: 4-[(4-metilpiperazin-1-il)metil]-N-{4-metil-3-{[4- (piridin-3-il)pirimidin-2-il]amino]fenill}benzamid (ChEBI, 2014)
Tirozin kinaze so encimi, ki katalizirajo prenos fosfatne skupine (fosforilacija) iz adenozin trifosfata (ATP) na tirozinske ostanke proteina. Fosforilacija ima pomembno vlogo v mehanizmu znotrajceličnega prenosa signalov in pri regulaciji procesov celične difenciacije, rasti in smrti (Hanks in sod., 1988). Imatinib z ATP tekmuje za vezavno mesto s tirozinsko kinazo BCR-ABL, kar vodi v inhibicijo fosforilacije proteinov, vključenih v prenos signalov z BCR-ABL. Celice, ki izražajo BCR-ABL, imajo tako ovirano rast ali apoptozo, s čimer je preprečena nekontrolirana delitev tumorskih celic, delovanje normalnih celic pa naj bi bilo neovirano (BC Cancer Agency, 2007). Imatinib poleg BCR-ABL inhibira tudi tirozin kinaze PDGF-R (receptor za rastni faktor trombocitov) in tirozin kinaze Kit (receptor za rastni faktor matičnih celic). Slednje so povezane z razvojem gastrointestinalnih stromalnih tumorjev (GIST), zato imatinib uporabljajo tudi za zdravljenje le teh (Joensuu in sod., 2001).
Komercialno ime za imatinib je Gleevec® oz. Glivec® in je na voljo v obliki kapsul ali tablet, uporaba zdravila je torej oralna. Biodostopnost učinkovine je 98 %. Aktivni metabolit imatiniba se imenuje N-desmethyl derivative (CGP 74588) (Ford, 2000), neaktivni metaboliti niso znani. Presnovi se v jetrih in se iz organizma izloči z urinom (13
%) in blatom (68 %). Kljub načeloma specifičnemu delovanju so znani številni stranski učinki zdravljenja z imatinibom, med katerimi so klinično pomembnejši slabokrvnost, nenormalno znižanje števila nevtofilcev in trombocitov, edem, povišana raven bilirubina in jetrnih encimov ALT, AST in alkalne fosfataze (BC Cancer Agency, 2007). Študije na živalih so pokazale karcinogen učinek (Dorval, 2006) in zmanjšano plodnost (East Hanover, 2006). Pri sesalcih se je z in vitro kromosomskimi testi izkazal za klastogenega (East Hanover, 2006). Je potencialno teratogen in v registru FDA uvrščen v nosečnostno kategorijo D (razloženo pod točko 2.1.2.1.) (East Hanover, 2006).
2.1.2.3 Etopozid
Etopozid (ET; sinonim: VP-16) je citotoksična protirakava učinkovina, ki po klasifikaciji ATC spada v skupino L01C (rastlinski alkaloidi in drugi naravni produkti) in podskupino L01CB (derivati podofilotoksina; oznaka L01CB01) (WHOCC, 2013). Je umetni derivat naravne učinkovine podofilotoksina. Ta se nahaja v koreninah in korenikah rastlin rodu Podophyllum (Xu in sod., 2009) in se že stoletja uporablja v ljudskem zdravstvu (Hande, 1998). V petdesetih letih 20. stoletja se je začelo iskanje bolj učinkovitega derivata, kar je privedlo do razvoja novega razreda protirakavih učinkovin, ki delujejo na topoizomerazo II (Hande, 1998). Prvič so etopozid (epipodofilotoksin) sintetizirali leta 1966, s strani FDA pa je bila njegova uporaba odobrena leta 1983 (Hande, 1998). Kemijska zgradba etopozida je prikazana na Sliki 3.
Slika 3: Kemijska zgradba etopozida; ime po IUPAC: 4'-Demetilepipodofilotoksin 9-(4,6-O-(R)-etilidene- beta-D-glukopiranozid) (ChEBI, 2014)
Topoizomeraze so encimi, ki regulirajo navoj DNK tako, da katalizirajo prekinitev in ponovno tvorbo fosfodiesterskih vezi. Topoizomeraza II cepi obe verigi DNK, nato DNK verigo ob konformacijski spremembi potegne skozi nastali prekinitvi in nazadnje poveže skupaj proste konce. V DNK tako vnese dva dodatna supernavoja (Champoux, 2001).
Etopozid onemogoča funkcijo topoizomeraze II s tem, da ji prepreči povezovanje prostih koncev DNK, DNK verige zato razpadejo, kar vodi v celično smrt (Hande, 1998; Pommier in sod., 2010).
Za zdravljenje je na voljo v obliki za oralno (komercialno ime Vepesid®) in parenteralno uporabo (komercialno ime Etopophos®). Po vnosu v organizem se v aktivne (in neaktivne) metabolite biotransformira v jetrih, izloči pa se z urinom (44-60 %, 67 % v nespremenjeni obliki) in blatom (do 16 %, nespremenjen in njegovi metaboliti) (BC Cancer Agency, 2013). Etopozid primarno uporabljajo za zdravljenje raka mehurja, vratu, glave, nožnice, jajčnikov, prostate, mod in pljuč, možganskih tumorjev in limfoma, pa tudi za zdravljenje hepatoma, Ewingovega in z AIDS povezanega Kaposijevega sarkoma, akutne limfocitne in mielocitne levkemije, neuroblastoma, rabdomiosarkoma in Wilmovega tumorja (McEvoy, 2004; Bristol-Myers Squibb, 2008). Med klinično pomembne stranske učinke zdravljenja z etopozidom spadajo preobčutljivostna reakcija med ali takoj po vnosu, supresija delovanja kostnega mozga, izčrpanost, izguba las in dlak, zaprtje, driska, anoreksija, slabost in bruhanje, vnetje ust in ustnic, spremenjeno okušanje, vnetje sluznic in akutna levkemija (BC Cancer Agency, 2013). Etopozid je potencialno karcinogen (rak epitelnih celic) (McEvoy, 2006) in mutagen (dokazano v in vitro testih mutacij pri sesalcih in z Amesovim testom; klastogenost pri sesalcih dokazana z in vitro in in vivo testi). V registru FDA je uvrščen v nosečnostno kategorijo D (razloženo pod točko 2.1.2.1.). Ker se izloča tudi z mlekom, ženske na terapiji ne bi smele dojiti (Bristol-Myers Squibb, 2008).
2.2 OKOLJSKA PROBLEMATIKA PROTIRAKAVIH ZDRAVIL 2.2.1 Farmacevtsko aktivne učinkovine v okolju
V številnih državah po svetu so rezultati študij dokazali prisotnost mnogih različnih farmacevtsko aktivnih učinkovin v odpadnih, površinskih in podtalnih vodah, zasledili pa so jih tudi že v pitni vodi (Heberer, 2002). Farmacevtsko aktivne učinkovine se v okolju ne pojavljajo same, temveč v obliki kompleksnih mešanic večih sestavin (Gomez in sod., 2007; Kasprzyk-Hordern in sod., 2008; Kolpin in sod., 2002; Moldovan, 2006; Vulliet in Cren-Olive, 2011). Iz znanstvenih raziskav o toksikologiji oziroma ekotoksikologiji kemijskih mešanic je razvidno, da je njihov skupni učinek pogosto večji od le seštevka učinkov vsake sestavine te iste mešanice, uporabljene posamezno, ne glede na kemijsko sestavo mešanice, izpostavljen organizem ali tarčno mesto delovanja posameznih sestavin (Kortenkamp in sod., 2009). Do jasnega ekotoksičnega učinka posamezne spojine večinoma privedejo šele v mnogo višjih koncentracijah, kot jih lahko pričakujemo v okolju (Han in sod., 2006; Miege in sod., 2006; Wilson in sod., 2004). Vendar pa so v različnih
študijah dokazali, da je lahko mešanica signifikantno toksična tudi v primeru, ko so vse sestavine zmesi prisotne v koncentracijah, ki uporabljene posamezno povzročijo zanemarljiv toksičen učinek (Altenburger in Greco, 2009; Faust in sod., 2001; Hass in sod., 2007; Kortenkamp in sod., 2007; Rajapakse in sod., 2002; Silva in sod., 2002). Zaradi trenutno prevladujočih študij toksičnosti posameznih učinkovin je potencialna nevarnost, ki jo farmacevtsko aktivne učinkovine predstavljajo za okolje, tako mnogokrat podcenjena.
2.2.2 Protirakava zdravila v okolju
2.2.2.1 Vir in pojavnost protirakavih zdravil v okolju
Pomembno skupino za okolje nevarnih farmacevtskih učinkovin predstavljajo protirakava zdravila, ki so potencialno citotoksična, genotoksična, mutagena in teratogena (Chabner in Longo, 2001; Schimmer in Tannock, 2013; Zounkova in sod., 2007). Po kemoterapiji se v določeni meri izločijo iz telesa bolnika (z blatom, urinom in drugimi telesnimi tekočinami).
Z odpadno vodo bodisi nespremenjena bodisi v obliki aktivnih in/ali neaktivnih metabolitov, ki so lahko prav tako toksični (Kiffmeyer in sod., 1998), ter transformacijskih produktov vstopajo v okolje. Vir onesnaženja z njimi so npr. odpadne vode iz bolnišnic in emisije iz proizvodnih obratov, pomemben vir pa postajajo tudi odplake iz gospodinjstev (Besse in sod., 2012; Buerge in sod., 2006). Številni bolniki namreč jemljejo zdravila doma ali pa odidejo domov po prejetju odmerka zdravila v bolnišnici. Slednji okvirno predstavljajo kar 75 % vseh bolnikov na kemoterapiji, njihovo število pa še narašča (Johnson in sod., 2008; Lenz in sod., 2007). Izločene protirakave učinkovine in njihovi metaboliti se tako znajdejo v bolnišničnih in javnih čistilnih napravah (Kiffmeyer in sod., 1998).
Zdravljenje samo s posameznimi protirakavimi zdravili se je izkazalo za manj učinkovito, saj so v visokih koncentracijah zelo toksični, poleg tega pa se rakave celice in njihova dovzetnost med seboj razlikujejo (Ganta in Amiji, 2009; Lambert in sod., 2008; Nabholtz in Riva, 2001; Piccart-Gebhart in sod., 2008). Kemoterapija je običajno najuspešnejša v primeru uporabe protirakavih zdravil v kombinacijah (Chen, 2013; Kurkjian in Kummar, 2009; Ocvirk, 2009). Posledično se le ta v različnih kombinacijah najpogosteje izločajo tudi v okolje.
V večini obstoječih študij so se osredotočili na merjenje vsebnosti protirakavih učinkovin v odpadni vodi iz bolnišnic. Količine v teh vzorcih so znotraj kratkih časovnih obdobij (teden dni) močno spremenljive, od nekaj ng L-1 do nekaj μg L-1 (Kümmerer, 2001), zato lahko sklepamo, da so količinsko spremenljive tudi emisije v okolje. Poleg bolnišničnih odplak (Kümmerer in sod., 1997; Steger-Hartmann in sod., 1996; Tauxe-Wuersch in sod., 2006; van Heijnsbergen in Schmitt, 2008) so jih zaznali še v:
- odpadnih vodah pred vstopom v čistilno napravo (van Heijnsbergen in Schmitt, 2008;
Kümmerer in sod., 1997),
- v vodah po izstopu iz čistilne naprave (van Heijnsbergen in Schmitt, 2008; Kümmerer in sod., 1997; Kümmerer in sod., 2000; Ternes, 1998),
- v različnih okoljskih vzorcih, vključno s površinskimi vodami (Aherne in sod., 1990;
Buerge in sod., 2006; Coetsier in sod., 2009; Halling-Sørensen in sod., 1998; Martin in sod., 2011; Moldovan, 2006; Valcárcel in sod., 2011; Yin in sod. 2010; Zuccato in sod., 2000).
Vse to nakazuje, da se med čiščenjem iz vode ne odstranijo (v celoti). Iz tega sledi, da se kontinuirano in nekontrolirano sproščajo v naravno vodno okolje. V primeru da dosežejo pitno ali rekreacijsko vodo, bi bilo lahko nevarnosti neposredno izpostavljeno tudi zdravje ljudi.
Poraba protirakavih zdravil je v primerjavi s farmacevtskimi učinkovinami iz drugih skupin količinsko nizka. Globalno je najpogosteje uporabljan FU, sledijo mu gemcitabin, ifosfamid, ciklofosfamid in metotreksat (Kovalova, 2009). V Franciji sta se leta 2008 v skupino štirih najpogosteje uporabljanih zdravil proti raku uvrstila FU in IM (3. in 4. mesto s skupno porabljeno maso 1733,20 kg oz. 873,90 kg), relativno visoko na lestvici pa je bil tudi ET (41,11 kg, kar pomeni 29. mesto od skupno 91 obravnavanih protirakavih zdravil) (Besse in sod., 2012). Nekoliko nižje so bile vrednosti v severozahodni Anglije (za leta 2010-2012: povprečno 22,99 kg leto-1 za FU, 20,40 kg leto-1 za IM in 1,23 kg leto-1 za ET) (Booker in sod., 2014). V okolju se protirakava zdravila večinoma pojavljajo v zelo nizkih koncentracijah (ng L-1 in manj), ki pa že lahko zadoščajo za toksičen učinek na organizme (Johnson in sod., 2008). Prav nizke koncentracije so eden od verjetnih razlogov za slabo poznavanje njihove razširjenosti v okolju, saj so šele nedavno razviti napredni analitični instrumenti omogočili njihovo zaznavanje (Kosjek in Heath, 2011; Negreira in sod., 2013).
Učinkovine lahko, ko govorimo o njihovem vplivu na vodne organizme, po EU direktivi 93/67/EEC (Commission of the European Communities, 1996) razvrstimo v tri skupine glede na njihovo efektivno koncentracijo (EC ang. Effective concentration):
- zelo toksične (EC50 <1 mg L-1) - toksične (EC50 = 1-10 mg L-1) - škodljive (EC50 = 10-100 mg L-1)
Na podlagi EC50, ki so jih opredelili Brezovšek in sod. (2014), se FU uvršča med zelo toksične za P. subcapitata oz. med toksične za Synechococcus leopoliensis, IM med toksične (za P. subcapitata in S. leopoliensis), ET pa med škodljive učinkovine (za P.
subcapitata in S. leopoliensis) (Preglednica 1).
Preglednica 1: Znani toksikološki podatki za izbrana protirakava zdravila.
Protirakavo
zdravilo EC50 Koncentracije v okoljskih vzorcih
5-fluorouracil (FU)
- 0,13 mg L-1 za P. subcapitata (Brezovšek in sod., 2014) - 1,20 mg L-1 za S. leopoliensis
(Brezovšek in sod., 2014) - 44 μg L-1 za P. putida
(Zounkova in sod., 2010)
Bolnišnične odpadne vode:
- maksimalno 124 μg L-1 (Mahnik in sod., 2007) - 35 in 92 ng L-1
(Kosjek in sod., 2013) Komunalne odplake:
- 4,7 - 14 μg L-1
(Kosjek in sod., 2013) Prisotnost v površinski vodi potrebno potrditi.
imatinib mezilat
(IM)
- 2,29 mg L-1 za P. subcapitata (Brezovšek in sod., 2014) - 5,36 mg L-1 za S. leopoliensis
(Brezovšek in sod., 2014)
Prisotnost v okolju potrebno potrditi. Možna kontaminacija vode in zemlje (v primeru raztrosa odpadnega blata iz čistilnih
naprav na polja) (Booker in sod., 2014).
etopozid (ET)
- 30,43 mg L-1 za P.
subcapitata (Brezovšek in sod., 2014)
- brez toksičnega učinka do 351 mg L-1 za S. leopoliensis (Brezovšek in sod., 2014)
Bolnišnične odpadne vode:
- 6 - 380 ng L-1 (Yin in sod., 2010) - 110 - 600 ng L-1
(Catastini in sod., 2008) Pričakovana visoka mobilnost v zemlji (TOXNET, 2015).
P. subcapitata = Pseudokirchneriella subcapitata, S. leopoliensis = Synechococcus leopoliensis; P. putida = Pseudomonas putida
2.2.2.2 Usoda protirakavih zdravil v okolju
Protirakave učinkovine (tako nespremenjene kot njihovi metaboliti) so po vstopu v okolje podvržene nadaljnjim transformacijam, fizičnim, kemičnim in biološkim, npr. hidrolizi, fotolizi, adsorpciji na suspendirane trdne delce in sedimente, biorazgradnji in bioakumulaciji itd., vendar je podatkov o tem zaenkrat zelo malo.
Kosjek in Heath (2011) sta na podlagi trenutno znanih dejstev povzeli, da je večina protirakavih učinkovin polarnih, kar nakazuje njihovo težnjo po zadrževanju v vodni fazi, zato je malo verjetno, da se bodo v procesu čiščenja na čistilni napravi iz vode izločili z vezavo na organski material, ki ga na koncu odstranijo in obdelajo kot odpadno blato. Ker
so večinoma tudi slabo biorazgradljivi, se z vodo iz čistilnih naprav neovirano sproščajo v različna vodna telesa (Aherne in sod., 1990; Steger-Hartmann in sod., 1997).
Slaba biorazgradljivost naj bi bila značilna za ET (Kosjek in Heath, 2011). Rezultati eksperimentov za FU pa so pokazali, da je njegova biorazgradnja lahko uspešna v primeru zmerne začetne koncentracije in odsotnosti drugih protirakavih učinkovin (Kiffmeyer in sod., 1998). Razlike v biorazgradljivosti naj bi bile posledica razlik v kemijski strukturi.
Lažje biorazgradljiva so tista protirakava zdravila, ki so npr. med drugim sestavljena iz (lahko razgradljivih) sladkorjev, prisotnost halogenih elementov pa biorazgradnjo otežuje (Kümmerer in al-Ahmad, 1997). Spreminjanje strukture obstoječih in oblikovanje novih protirakavih zdravil na način hkratne ohranitve terapevtske aktivnost in povečane biorazgradljivosti bi lahko pripomogla k zmanjševanju količine protirakavih učinkovin v okolju (Kümmerer in sod., 2000).
Protirakave učinkovine so slabo hlapne, zato se jih po tej poti iz vode izloči le zanemarljivo majhen delež (Buerge in sod., 2006; Kosjek, 2009). Njihova kemijska zgradba le pri redkih omogoča absorbcijo zadostne količine sončne svetlobe, da lahko pride do direktne fotolize njihovih molekul. Med potencialne izjeme spada npr. ET (TOXNET, 2015). Več jih je dovzetnih za oksidacijo z ozonacijo, med njimi tudi FU (Rey in sod., 1999). Ta postopek se že uporablja za dezinfekcijo pitne vode, kot izgleda pa lahko služi tudi kot učinkovita metoda za odstranjevanje mikroonesnažil (Eggen in sod., 2014), med drugim tudi protirakavih zdravil. Prav tako bi bile za ta namen verjetno učinkovite nekatere druge metode za čiščenje vode, npr. nanofiltracija in reverzna osmoza (Kosjek in Heath, 2011), vendar trdnih dokazov za to trenutno še ni.
2.2.3 Učinek protirakavih zdravil na netarčne organizme
Protirakava zdravila delujejo neselektivno na vse rastoče celice in so potencialno karcinogena, citotoksična, genotoksična, mutagena in teratogena (Chabner in Longo, 2001;
Schimmer in Tannock, 2013; Zounkova in sod., 2007). Zaradi njihovega načina delovanja (poškodbe in inhibicija podvojevanja DNK, prekinitev celične delitve) predvidevajo, da lahko škodljivo vplivajo na praktično vse evkariontske organizme, ki so jim izpostavljeni, tako tarčne (tudi pri človeku ovirajo delovanje rakavih in normalnih celic), kot tudi netarčne (Besse in sod., 2012; Fent, 2003; Johnson in sod., 2008; Kümmerer in al-Ahmad, 2010), npr. vodne primarne producente, katerih predstavnik v naši študiji je alga P.
subcapitata.
Vodni organizmi so zaradi naraščajoče porabe različnih protirakavih zdravil (Besse in sod., 2012; Booker in sod., 2014; Yin in sod., 2010) kronično izpostavljeni mešanici teh toksičnih učinkovin. Samo na podlagi objavljenih študij akutne toksičnosti, ki so trenutno prevladujoče (European Commission, 2002a; European Commission, 2002b), zato ne moremo zadovoljivo opredeliti njihovega okoljskega vpliva (Fent, 2003). Študij
kroničnega učinka (sledenje učinka preko številnih generacij testnega organizma) pa je zaenkrat malo (npr.: al-Ahmad in sod., 1997; al-Ahmad in Kümmerer, 2001; Hirose in sod., 2005; Zounkova in sod., 2007). Tveganja, ki ga protirakave učinkovine in njihovi metaboliti predstavljajo za okolje, zato še ne moremo zanesljivo oceniti (Fent, 2003), sklepamo pa lahko, da je mnogokrat podcenjeno, saj imajo posamezne učinkovine v splošnem pogosto jasen ekotoksičen učinek šele pri koncentracijah, ki so mnogo višje od okoljskih (Han in sod., 2006; Miege in sod., 2006; Wilson in sod., 2004). Poleg tega je treba upoštevati mnogokrat spregledano dejstvo, da v okolju niso izolirane od drugih učinkovin. Ob neupoštevanju dokazov o povečani toksičnosti mešanic kljub nizkim koncentracijam njihovih posameznih sestavin (Altenburger in Greco, 2009; Faust in sod., 2001; Hass in sod., 2007; Kortenkamp in sod., 2007; Rajapakse in sod., 2002; Silva in sod., 2002), tako lahko pridemo do zmotnega sklepanja o odsotnosti nevarnosti za ljudi in ekosisteme (Hagenbuch in Pinckney, 2012; Magnusson in sod., 2010; Pomati in sod., 2008; Silva in sod., 2002; Sumpter in sod., 2006).
Večjo toksičnost mešanic v primerjavi z delovanjem posameznega protirakavega zdravila so za alge in cianobakterije pred kratkim pokazali Brezovšek in sod. (2014). Testirali so učinke štirih protirakavih zdravil (FU, ET, IM in cisplatina (CDDP)) in nekaterih njihovih dvojnih mešanic (FU+CDDP, FU+IM in CDDP+ET). Uporabili so dva testna organizma, algo P. subcapitata in cianobakterijo S. leopoliensis. Učinek mešanice je bil sinergističen v primeru kombinacije FU+CDDP pri vseh testiranih koncentracijah za P. subcapitata in pri najvišjih za S. leopoliensis ter v primeru kombinacije FU+IM za P. subcapitata. Po drugi strani se je v primeru kombinacije CDDP+ET pri obeh testnih organizmih izkazal za antagonističnega, kot tudi v primeru kombinacije FU+IM za S. leopoliensis. Delovanje protirakavih zdravil se v kombinacijah torej lahko zelo razlikuje od njihovega delovanja v primeru, da so uporabljena posamezno. Iz rezultatov je bila med drugim v splošnem razvidna večja dovzetnost alge (evkarionta) za vpliv s strani izbranih protirakavih zdravil, tako posameznih kot v kombinacijah, kar je z ekološkega vidika pomembna informacija, saj lahko na podlagi tega sklepamo o potencialni nevarnosti za porušenje običajne sestave fitoplanktonskih združb. Zaradi različne občutljivosti na delovanje protirakavih zdravil (Pei in Ma, 2002) bi se lahko zelo zmanjšala npr. algna populacija, kar lahko vodi v prekomerno namnožitev cianobakterijskih populacij (Ma in sod., 2008). Še posebno zaskrbljujoča je prekomerna namnožitev cianobakterij, ki proizvajajo različne toksine, nevarne za ljudi in vodne organizme (Žegura in sod., 2011). Žal so trenutno študije na temo vpliva farmacevtskih učinkovin na različne organizme še zelo redke, glede na naraščajočo ozaveščenost o tej problematiki pa lahko pričakujemo, da se bo njihovo število sčasoma začelo povečevati.
2.2.3.1 Zelena alga Pseudokirchneriella subcapitata
Pseudokirchneriella subcapitata ((Korshikov) F. Hindak), predhodno imenovana Selenastrum capricornutum, Kirchneriella subcapitata in Raphidocelis subcapitata (Nygaard in sod., 1986), je enocelična alga, ki jo najdemo v fitoplanktonskih združbah celinskih voda (jezera, mlake, reke) (John in Tsarenko, 2003). Celice imajo značilno zvito/srpasto obliko (Slika 4) in so velikosti 3-6 x 6-26 μm (John in Tsarenko, 2003).
Običajno se med seboj ne povezujejo v večje skupke, razen občasno med celično delitvijo (Aruoja, 2011). Ta vrsta mikroalg je precej občutljiva na prisotnost toksičnih učinkovin in hkrati lahko dostopna ter ubikvitarna, zato jo zelo pogosto uporabljajo v toksikoloških testih (Nygaard in sod., 1986).
Slika 4: Celice alge Pseudokirchneriella subcapitata
2.3 PRETOČNA CITOMETRIJA
Pretočna citometrija je tehnika za simultano multiparametrično ugotavljanje lastnosti celic in njihovo štetje. Meritev poteka tako, da celice po tanki cevki ena za drugo potujejo skozi pretočno komoro z optičnim sistemom ogledal, leč in filtrov, mimo vira svetlobe (laserski žarek, npr. argonski, kriptonski, helij-kadmijski, helij-neonski). Svetlobni žarek (krajših valovnih dolžin), ki zadane celico, se odbije, lomi ali pa absorbira v določenih fluorokromih, ki nato izsevajo svetlobo daljših valovnih dolžin. Vse spremembe svetlobe ob prehodu posamezne celice zaznava sistem fotodetektorjev. Svetlobni impulzi se pretvorijo v električne, ti pa v digitalne. Slednje zbira, analizira in usklajuje računalnik. Po obdelavi z ustreznimi računalniškimi programi signal prikažemo matematično in grafično, v obliki točkovnih diagramov in/ali histogramov (Kotnik in sod., 2010; Ihan, 1999).
Shematsko je zgradba pretočnega citometra prikazana na Sliki 5.
Odboj in lom svetlobe merita dva fotodetektorja, eden iz smeri vira vpadne svetlobe (FSC ang. Forward Scatter), drugi pa pravokotno nanj (SSC ang. Side Scatter). FSC posreduje informacijo o velikosti celice, SSC pa o njeni granuliranosti in površinski strukturi.
Fluorescenčni detektorji preko sistema filtrov in zrcal prejmejo svetlobo določene valovne dolžine, ki so jo oddali fluorokromi. Tako dobimo še informacijo o vrsti in moči fluorescenčnih signalov (Ihan, 1999).
Slika 5: Shematski prikaz pretočnega citometra (Brown in Wittwer, 2000)
2.4 MODELI ZA NAPOVEDOVANJE IN ANALIZO TOKSIČNOSTI MEŠANIC 2.4.1 Modela seštevka koncentracij in neodvisnega delovanja
Modela seštevka koncentracij (CA ang. Concentration addition (Loewe in Muischnek, 1926) in neodvisnega delovanja (IA ang. Independent action (Bliss, 1939)) sta matematična modela, ki omogočata napovedovanje pričakovane toksičnosti mešanice toksičnih učinkovin na osnovi podatkov o toksičnosti posameznih sestavin mešanice.
Napovedna moč obeh modelov je tako omejena s kvaliteto le teh (Backhaus in sod., 2004a).
(I) Osnova za CA je teoretično načelo, da se učinkovine, ki med seboj ne reagirajo, razlikujejo samo v moči delovanja, zato lahko vsako obravnavamo kot redčitev ostalih (Cedergreen, 2008). Različne redčitve iste učinkovine se vedno obnašajo v skladu s CA (Berenbaum, 1989), zato predvidevajo, da isto velja tudi za mešanice različnih učinkovin, ki pa imajo skupno molekulsko tarčno mesto ali delujejo na podoben način (McCarty in Borgert, 2006). Vendar pa je samo mesto ali način delovanja težko definirati, saj za večino
učinkovin velja, da sta pri nizkih koncentracijah drugačna kot pri visokih, za mnoge učinkovine pa niti nista poznana (McCarty in Borgert, 2006). CA se je izkazal za natančen napovedni model v primeru mešanic sestavin s podobnim tarčnim mestom (Arrhenius in sod., 2004; Cedergreen in sod., 2007; Faust in sod., 2001; Junghans in sod., 2003), v primeru sestavin s podobnim načinom delovanja pa so rezultati nezanesljivi (Cedergreen in sod., 2007).
(II) IA pa temelji na predpostavki o farmakološki neodvisnosti sestavin mešanice, toksično delovanje vsake od sestavin je torej neodvisno od ostalih sestavin. IA lahko zato opiše le toksičnost mešanic, ki so sestavljene iz sestavin z različnimi mehanizmi delovanja (npr. v primeru, da imata sestavini isto tarčno vezavno mesto, bo med njima prišlo do tekmovanja za le to - njuno delovanje tako ne bo vzajemno neodvisno (Cedergreen, 2008)). Vendar pa se, kot je izpostavil Gessner (1988), postavlja vprašanje, če je sestava mešanice iz sestavin, ki ne bi niti posredno (na fizikalnem, kemijskem ali biološkem nivoju) vplivale na delovanje ostalih, sploh mogoča, glede na kompleksnost povezav v živih organizmih. Ne moremo namreč enostavno predvidevati, da vpliv na določen tarčni receptor, organ ali sistem ne bo do določene mere spremenil odzivnosti ostalih receptorjev, organov ali sistemov na druge, istočasno prisotne, dejavnike (Gessner, 1988). Kljub zadržkom s teoretičnega vidika se je IA v praksi večkrat izkazal za dober napovedni model v primeru mešanic učinkovin z različnimi mesti oz. načini delovanja (Backhaus in sod., 2000;
Backhaus in sod., 2004a; Chen in Lu, 2002; Faust in sod., 2003), vendar ne izključno (Backhaus in sod., 2004b).
V študiji učinkov dvojnih mešanic protirakavih zdravil z različnimi mehanizmi delovanja, ki so jo izvedli Brezovšek in sod. (2014), se je na podlagi primerjave napovedanih in dejanski rezultatov izkazalo, da niti CA niti IA nista pravilno napovedala toksičnosti izbranih mešanic v izbranem koncentracijskem območju EC5-EC90.
Glede na naraščajočo porabo in številčnost različnih za terapije uporabljanih protirakavih zdravil je praktično nemogoče eksperimentalno oceniti ekološko tveganje za vse potencialne kombinacije, zato bi bilo nujno razviti zanesljive modele, ki bi lahko natančno napovedali skupen učinek mešanic protirakavih zdravil (idr. farmacevtskih učinkovin) na podlagi podatkov o toksičnosti posameznih učinkovin (Cedergreen in sod., 2008).
2.4.2 Kombinacijski indeks
Kombinacijski indeks (CI ang. Combination index) sta iz potrebe po standardizirani definiciji sinergizma v kontekstu študij učinkov zdravil v kombinacijah razvila Ting-Chao Chou in Paul Talalay leta 1983/84, na podlagi več desetletnih študij (Chou, 2010). Pred tem je bilo definicij sinergizma več (Goldin in Mantel, 1957), obstajale so tudi različne metode za njegovo opredelitev, ki pa se med seboj niso skladale (Greco in sod., 1995). CI v osnovi izhaja iz fizikalno-kemijskega zakona o vplivu koncentracij (po starem »zakon o
vplivu (delovanju) mas« ali ang. Mass-action law), na podlagi katerega je Chou preko izpeljave več kot 300 enačb o encimski dinamiki ter matematične indukcije in dedukcije leta 1974 uvedel enačbo za srednji učinek (MEE ang. Median-effect equation; podrobnejši opis v podpoglavju 3.2.5) (Chou, 2006).
CI enostavno kvantitativno opredeli sinergizem (CI < 1), aditiven učinek (CI = 1) in antagonizem (CI > 1) (Chou, 2006). Uporabnost koncepta se je močno povečala z razvojem ustreznega računalniškega programa za analizo odvisnosti učinka od koncentracije. Z napredkom na področju računalništva so program s časom še izboljšali, leta 2005 so tako razvili že tretjo generacijo t.i. programa CompuSyn (Chou, 2010).
3 MATERIALI IN METODE
Slika 6: Hodogram poskusov
KULTURA ZA INOKULUM P. subcapitata
merjenje celične gostote (števna komora)
TEST INHIBICIJE RASTI
TESTNE KULTURE 5 x 103-104 celic mL-1
FU+IM+ET
(EC5, EC10, EC20, EC50, EC90)
KONTROLA 5 x 103-104 celic mL-1
inkubacija (72 ur)
vzorčenje na 24 ur
analiza s pretočnim citometrom
STABILNOST IN VEZAVA PROTIRAKAVIH ZDRAVIL NA/V CELICE
TESTNE KULTURE
5 x 103-104 celic mL-1 FU+IM+ET
(EC10 in EC90)
TESTNE KULTURE
5 x 103-104 celic mL-1 FU+IM+ET
(EC5 in EC10)
inkubacija (0 in 72 ur) inkubacija (72 ur)
centrifugiranje centrifugiranje
SUPERNATANT BIOMASA
zamrzovanje v tekočem dušiku
liofilizacija
priprava vzorca za elektronsko
mikroskopijo
analiza z elektronskim mikroskopom analiza z UPLC-MS/MS
3.1 MATERIALI
3.1.1 Protirakava zdravila
V raziskavi smo uporabili tri protirakava zdravila in sicer 5-fluorouracil (FU) (Sigma- Aldrich, Nemčija), imatinib mezilat (IM) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., ZDA) in etopozid (ET) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., ZDA).
Stabilnost protirakavih zdravil smo preverili s kemijsko analizo (podrobneje opisano v podpoglavju 3.2.6).
Eksperimenti so bili izvedeni v skladu z internimi varnostnimi standardi za rokovanje s protirakavimi zdravili (Etiel in sod., 2000). Vse eksperimentalne odpadke, ki so vsebovali protirakava zdravila, smo ločeno shranjevali in ustrezno zavrgli kot nevarne odpadke.
3.1.2 Testni organizem
Za test smo, v skladu s priporočili iz smernice OECD TG 201 (2011), uporabili zeleno algo Pseudokirchneriella subcapitata (P. subcapitata) (SAG 61.81) iz algne zbirke “Sammlung von Algenkulturen Univerzitaett Goettingen” (=SAG) Inštituta za fiziologijo rastlin Univerze v Göttingenu (Nemčija). Hranili smo jo v gojišču OECD pri sobni temperaturi in dnevni svetlobi. Kulturo smo redno precepljali v svež medij z namenom ohranjanja njene čistosti in živosti.
3.1.3 Gojišče OECD
Za izvedbo testa inhibicije rasti smo uporabili gojišče OECD. Pripravljali smo ga po navodilih iz smernice OECD TG 201 (2011) iz štirih vnaprej pripravljenih založnih raztopin (Preglednica 2).
Za vsako založno raztopino smo v ločeno steklenico natehtali ustrezne mase vseh sestavin in jim dodali 250 ml destilirane vode. Raztopine smo nato sterilizirali z membransko filtracijo (povprečen premer por 0,2 μm) in jih do uporabe shranjevali v hladilniku (4 °C).
Za pripravo gojišča smo v 500 mL sterilne destilirane vode dodali 10 mL založne rastopine 1 in po 1 mL založnih raztopin 2, 3 in 4 ter steklenico dopolnili s sterilno destilirano vodo do skupno 1 L volumna.
Preglednica 2: Seznam spojin za pripravo založnih raztopin, potrebnih za pripravo gojišča OECD, in končne koncentracije posamezne sestavine v vsaki od založnih raztopin.
Hranila Končna koncentracija
Založna raztopina 1: makro hranila NH4Cl
MgCl2×6H2O CaCl2×2H2O MgSO4×7H2O KH2PO4
+ dH2O
1,5 g L-1 1,2 g L-1 1,8 g L-1 1,5 g L-1
0,16 g L-1 250 mL Založna raztopina 2: železo
FeCl3×6H2O Na2EDTA×2H2O + dH2O
64 mg L-1 100 mg L-1 250 mL Založna raztopina 3: elementi v sledovih
H3BO3
MnCl2×4H2O ZnCl2
CoCl2×2H2O CuCl2×2H2O Na2MoO4×2H2O + dH2O
185 mg L-1 415 mg L-1 3 mg L-1 1,5 mg L-1 0,01 mg L-1 7 mg L-1 250 mL Založna raztopina 4: bikarbonat
NaHCO3 + dH2O
50 g L-1 250 mL 3.2 METODE
3.2.1 Merjenje celične gostote kulture za inokulum
Koncentracijo celic kulture za inokulum smo ugotavljali neposredno, z uporabo števne komore (Bürker Türk, Brand, Nemčija) (Slika 7) in svetlobnega mikroskopa. Majhen vzorec dobro premešane kulture (20 μL) smo nanesli na za to določeno površino števne komore in ga pokrili s krovnim stekelcem. Preparat smo si ogledali z mikroskopom in prešteli celice znotraj površine kvadratnih števnih polj ter na njihovih zgornjih in levih robovih (na spodnjih in desnih pa ne).
Števna komora Bürker Türk ima dve mreži, vsaka je sestavljena iz štirih primarnih kvadratov (površina 1 mm2), znotraj vsakega od teh pa so štiri števna polja (sekundarni kvadrati, površina 1/16 mm2), skupno torej 32 števnih polj (Slika 8). Izračunali smo povprečno število preštetih celic na števno polje in ga pomnožili z ustreznim faktorjem
(1,6 x 105), ki smo ga izračunali na podlagi znanega volumna vzorca nad posameznim števnim poljem. Zmnožek s tako dobljenim faktorjem je predstavljal število celic mL-1.
Slika 7: Števna komora (Veranič in sod., 2003)
celotna mreža (štirje primarni kvadrati, s prekinjeno štiri števna polja (sekundarni kvadrati) črto je označen zgornji levi) znotraj primarnega kvadrata
Slika 8: Shematski prikaz mreže števne komore Bürker Türk
3.2.2 Priprava testnih mešanic protirakavih zdravil
Mešanico treh protirakavih zdravil (FU+IM+ET) smo pripravljali sproti iz založnih raztopin, ki smo jih v ustreznih volumnih dodali v gojišče vsake testne kulture.
Koncentracije založnih raztopin so bile sledeče:
- 75 g L-1 za FU (v topilu DMSO (Merck, Nemčija)), - 25 g L-1 za ET (v topilu DMSO),
- 50 g L-1 za IM (v OECD mediju).
Založne raztopine smo shranjevali v temi, v hladilniku pri 4 °C.
Na podlagi petih EC, ki so jih Brezovšek in sod. (2014) za vsako od izbranih protirakavih zdravil opredelili za algo P. subcapitata (EC5, EC10, EC20, EC50 in EC90),smo sestavili pet trojnih mešanic s predvidoma istimi petimi EC. To smo izvedli tako, da smo za vsako od treh protirakavih zdravil izračunali pet tretjinskih EC (EC5/3, EC10/3, EC20/3, EC50/3 in EC90/3) in jih združili v pet mešanic tako, da so bile EC vseh treh protirakavih zdravil v vsaki od mešanic enake. Koncentracije vsakega protirakavega zdravila v mešanici pri posamezni EC in deleži od celotne količine treh protirakavih zdravil, ki ga le te predstavljajo, so prikazani v Preglednicah 3 in 4.
Preglednica 3: Koncentracija posameznega protirakavega zdravila v izbrani mešanici in skupna koncentracija protirakavih zdravil za vsako efektivno koncentracijo mešanice
FU [µg L-1] IM [µg L-1] ET [µg L-1] Σ [µg L-1]
EC5 2,9 184,2 4279,2 4466,4
EC10 5,8 264,1 5621,6 5891,5
EC20 12,1 390,3 7567,1 7969,5
EC50 42,7 761,7 12569,2 13373,5
EC90 315,0 2197,3 28087,5 30599,9
EC = efektivna koncentracija (ang. Effective concentration); FU = 5-fluorouracil, IM = imatinib mezilat, ET
= etopozid
Preglednica 4: Odstotek posameznega protirakavega zdravila v izbrani mešanici od skupne koncentracije za vsako efektivno koncentracijo mešanice.
FU [%] IM [%] ET [%] Σ [%]
EC5 0,1 4,1 95,8 100
EC10 0,1 4,5 95,4 100
EC20 0,2 4,9 95,0 100
EC50 0,3 5,7 94,0 100
EC90 1,0 7,2 91,8 100
EC = efektivna koncentracija (ang. Effective concentration); FU = 5-fluorouracil, IM = imatinib mezilat, ET
= etopozid
3.2.3 Testiranje inhibicije rasti
Učinek mešanice protirakavih zdravil (FU+IM+ET) na rast alge P. subcapitata smo ugotavljali po postopku iz Evropske smernice OECD TG 201 (2011).
Celične kulture alge P. subcapitata smo gojili v tekočem gojišču OECD v steklenih erlenmajericah. Znotraj posamezne ponovitve poskusa je bilo na začetku eksperimenta v vseh testnih kulturah, vključno s kontrolami, enako število celic (znotraj intervala 5 x 103- 104 celic mL-1; začetne koncentracije so se med ponovitvami poskusa razlikovale). V vseh testnih kulturah in kontrolah je bila enaka količina gojišča (20 mL) in topila (DMSO).
Slednjega smo v vsako kulturo dodali toliko, da je bila končna vsota enaka tisti pri kulturi z najvišjo koncentracijo protirakavih zdravil (EC90). Začetna celična gostota je morala biti
