MAGISTRSKO DELO

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKO DELO

David Matoh

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJA

Določanje faktorjev občutljivosti sorodnih substanc aktivnih farmacevtskih učinkovin

MAGISTRSKO DELO

David Matoh

Mentor: prof. dr. Matevž Pompe

Ljubljana, 2021

(3)

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisani David Matoh sem avtor magistrskega dela z naslovom:

Določanje faktorjev občutljivosti sorodnih substanc aktivnih farmacevtskih učinkovin

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. dr. Matevža Pompeta;

 sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

 je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 10.08.2021 Podpis avtorja:

(4)

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Kemija.

Delo je bilo opravljeno na UL FKKT.

Senat UL FKKT je za mentorja magistrskega dela imenoval prof. dr. Matevža Pompeta.

Recenzenti:

izr. prof. dr. Mitja Kolar izr. prof. dr. Drago Kočar

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela Predsednik komisije:

izr. prof. dr. Mitja Kolar, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Član:

izr. prof. dr. Drago Kočar, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

(5)

Zahvala

Na prvem mestu se moram zahvaliti svojemu mentorju g. prof. dr. Matevžu Pompetu za vse napotke in usmeritve pri izdelavi tega magistrskega dela.

Zahvala gre tudi moji družini, ki mi je vse od otroštva stala ob strani, verjela vame in me vseskozi vzpodbujala.

Posebej se zahvaljujem svoji ženi Melaniji za vso podporo in razumevanje, še posebej v tistih trenutkih, kadar ni bilo lahko.

(6)

Določanje faktorjev občutljivosti sorodnih substanc aktivnih farmacevtskih učinkovin

Povzetek:

Ena od prevladujočih analiznih metod v farmacevtski industriji je tekočinska kromatografija. Za potrditev istovetnosti analitov s pomočjo kromatografije ta analitska metoda zahteva primerjavo retencijskih časov analitov z retencijskimi časi standardnih substanc. Veliko število sorodnih substanc, ki jih je potrebno pri proizvodnji aktivnih farmacevtskih učinkovin spremljati s tekočinsko kromatografijo, zahteva veliko število primerjalnih standardnih substanc, to pa je stroškovno manj učinkovito.

Pri rutinskih kromatografskih analizah se lahko v določenih primerih izognemo uporabi primerjalnih standardov, kar omogoči hitrejše analizne postopke ter boljšo stroškovno učinkovitost, saj nakupi dragih sorodnih substanc niso potrebni.

Namen tega magistrskega dela je bil razviti kromatografsko metodo za določanje vsebnosti norfloksacina, enrofloksacina ter ciprofloksacina, izvesti njihovo pospešeno razgradnjo z različnimi reagenti, ter določiti faktorje občutljivosti in relativne faktorje občutljivosti nastalih sorodnih substanc na različnih koncentracijskih nivojih.

Ključne besede: tekočinska kromatografija, sorodna substanca, faktor občutljivosti, relativni faktor občutljivosti

(7)

Response factor determination for related substances of active pharmaceutical ingredients

Abstract:

Liquid chromatography is one of the most powerful analytical methods in pharmaceutic industry. Identification of substances using chromatography requires retention time comparison of analyte and standard substance. Higher number of related substances, produced during synthesis of active pharmaceutical ingredients, must be analysed by liquid chromatography, therefore high number of standard substances are required which is not cost effective.

Some routine analyses do not require standard substance usage, which enables faster analytical procedures and better cost effectiveness, because purchasing of expensive standard substances is not necessary.

Objectives of this master thesis were development of chromatographic method for quantification of norfloxacine, enrofloxacine and ciprofloxacine, successful execution of forced degradation using different agents and determination of response factors and relative response factors of produced related substances on different concentration levels.

Keywords: liquid chromatography, related substance, response factor, relative response factor

(8)

Kazalo vsebine

1 Uvod ... 1

1.1 Kromatografija ... 2

1.1.1 Vrste kromatografskih metod ... 2

1.1.2 LC kromatografija ... 2

1.1.3 HPLC kromatografija ... 3

1.1.4 Sestava HPLC kromatografskega sistema ... 3

1.1.5 Linearnost metode ... 5

1.1.6 Faktor občutljivosti ... 6

1.1.7 Korekcijski faktor ... 6

1.2 Fluorokinoloni ... 7

1.2.1 Enrofloksacin ... 8

1.2.2 Ciprofloksacin ... 8

1.2.3 Norfloksacin ... 9

2 Namen dela ... 10

3 Eksperimentalni del ... 11

3.1 Materiali ... 11

3.1.1 Standardi ... 11

3.1.2 Reagenti in topila ... 11

3.2 Aparature in laboratorijski pribor ... 12

3.3 Pogoji končno razvite kromatografske metode ... 12

3.4 Priprava raztopin za kromatografsko analizo ... 13

3.4.1 Raztopine za HPLC meritve po končni metodi... 13

3.4.2 Raztopine uporabljene za določanje linearnosti ... 14

3.4.3 Raztopine za pospešeno razgradnjo ... 16

4 Rezultati in diskusija ... 17

4.1 Razvoj kromatografske metode za določanje vsebnosti floksacinov ... 17

4.1.1 Topnost floksacinov ... 17

(9)

4.1.2 Detekcija ... 18

4.1.3 Optimizacija kromatografskih pogojev ... 18

4.2 Linearnost ... 25

4.3 Pospešena razgradnja floksacinov ... 30

4.3.1 Pospešena razgradnja norfloksacina ... 31

4.3.2 Pospešena razgradnja ciprofloksacina ... 34

4.3.3 Pospešena razgradnja enrofloksacina ... 36

4.4 Določitev faktorjev občutljivosti ... 38

4.4.1 Faktorji občutljivosti norfloksacina in njegovega razgradnega produkta 38 4.4.2 Faktorji občutljivosti ciprofloksacina in njegovega razgradnega produkta ... 42

4.4.3 Faktorji občutljivosti enrofloksacina in njegovega razgradnega produkta ... 45

5 Zaključek ... 49

6 Literatura ... 51

(10)

Kazalo slik

Slika 1: Shematski prikaz sestavnih delov HPLC sistema ... 5

Slika 2: Enačba za izračun naklona premice oz. faktorja občutljivosti Rf ... 6

Slika 3: Enačba za izračun relativnega faktorja občutljivosti RRf ... 6

Slika 4: Enačba za izračun korekcijskega faktorja Cf ... 6

Slika 5: Splošna skeletna formula fluorokinolonskega obroča ... 7

Slika 6: Strukturna formula enrofloksacina ... 8

Slika 7: Strukturna formula ciprofloksacina ... 9

Slika 8: Strukturna formula norfloksacina ... 9

Slika 9: Prekriti kromatogrami izokratske in gradientne elucije floksacinov na koloni Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm ... 20

Slika 10: Prekriti kromatogrami izokratske in gradientne elucije floksacinov na koloni Gemini 5u C6-Phenyl 110A; 150 x 4.6 mm 5 micron ... 22

Slika 11: Prekriti kromatogrami gradientne elucije floksacinov z različnimi razmerji MFA:MFB, na 12. minuti, na koloni Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm ... 23

Slika 12: Kromatogram gradientne elucije floksacinov po končni metodi, na koloni Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm, 0,1 % TFA ... 24

Slika 13: Vrednosti S/N pri DL za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin ... 25

Slika 14: Umeritvena krivulja norfloksacina – celotno območje ... 27

Slika 15: Umeritvena krivulja ciprofloksacina – celotno območje ... 27

Slika 16: Umeritvena krivulja enrofloksacina – celotno območje ... 28

Slika 17: Prekriti kromatogrami v območju od DL do QL za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin ... 28

Slika 18: Prekriti kromatogrami v območju od QL do 10 µg/ml za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin ... 29

Slika 19: Prekriti kromatogrami v območju od 10 do 50 µg/ml za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin ... 29

Slika 20: Prekriti kromatogrami v območju od 60 do 100 µg/ml za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin ... 30

Slika 21: Kromatogram razgradnje norfloksacina s segrevanjem na 70 °C ... 30

Slika 22: Kromatogram razgradnje ciprofloksacina s segrevanjem na 70 °C ... 31

Slika 23: Kromatogram razgradnje enrofloksacina s segrevanjem na 70 °C ... 31

Slika 24: Kromatogram razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, sobna temperatura ... 32

Slika 25: Kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, s segrevanjem na 70 °C ... 32

Slika 26: Kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M NaOH, sobna temperatura ... 33

(11)

Slika 27: Kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M NaOH, s segrevanjem pri 70 °C ... 33 Slika 28: Kromatogram razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, sobna temperatura ... 34 Slika 29: Kromatogram razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, s segrevanjem pri 70 °C ... 34 Slika 30: Kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M NaOH, sobna temperatura ... 35 Slika 31: Kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M NaOH, s segrevanjem pri 70 °C ... 35 Slika 32: Kromatogram razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, sobna temperatura ... 36 Slika 33: Kromatogram razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, s segrevanjem pri 70 °C ... 36 Slika 34: Kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M NaOH, sobna temperatura ... 37 Slika 35: Kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M NaOH, s segrevanjem pri 70 °C ... 37 Slika 36: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju na 70 °C, koncentracije SS od 5 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 25 µg/ml (najvišji vrh v črni barvi) ... 38 Slika 37: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, norfloksacin ... 39 Slika 38: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, razgradni produkt ... 39 Slika 39: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 0,50 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 2,50 µg/ml (najvišji vrh v modri barvi) ... 40 Slika 40: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, norfloksacin ... 40 Slika 41: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, razgradni produkt ... 41 Slika 42: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 5 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 25 µg/ml (najvišji vrh v temno zeleni barvi) ... 42 Slika 43: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, ciprofloksacin ... 42

(12)

Slika 44: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, razgradni produkt ... 43 Slika 45: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije razgradnega produkta od 0,50 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 2,50 µg/ml (najvišji vrh v temno modri barvi) ... 43 Slika 46: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, ciprofloksacin ... 44 Slika 47: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, razgradni produkt ... 44 Slika 48: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 5 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 25 µg/ml (najvišji vrh v črni barvi) ... 45 Slika 49: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, enrofloksacin ... 46 Slika 50: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, razgradni produkt ... 46 Slika 51: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 0,50 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 2,50 µg/ml (najvišji vrh v temno modri barvi) ... 47 Slika 52: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, enrofloksacin ... 47 Slika 53: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, razgradni produkt ... 48

Kazalo tabel

Tabela 1: Gradientni program HPLC metode ... 13 Tabela 2: Priprava raztopin za linearnost (območje od 10 do 100 µg/ml)... 15 Tabela 3: Priprava raztopin za linearnost (območje od 0,10 do 8,50 µg/ml) ... 15 Tabela 4: Pregled raztapljanja standardnih substanc floksacinov s pomočjo ultrazvočne kopeli v različnih topilih ... 17 Tabela 5: Kromatografski pogoji izhodiščne metode (kolona Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm, izokratska elucija) ... 18 Tabela 6: Testirana razmerja mobilnih faz... 19 Tabela 7: Kromatografski pogoji gradientne metode (kolona Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm, gradientna elucija) ... 19 Tabela 8: Gradientni program ... 19

(13)

Tabela 9: Kromatografski pogoji kromatografske metode (kolona Gemini 5u C6-

Phenyl 110A; 150 x 4.6 mm 5 micron, izokratska elucija) ... 20

Tabela 10: Testirana razmerja mobilnih faz... 21

Tabela 11: Gradientni program ... 21

Tabela 12: Kromatografski pogoji gradientne metode (kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm, gradientna elucija) ... 22

Tabela 13: Gradientni program ... 23

Tabela 14: Kromatografski pogoji končne metode (kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm, gradientna elucija) ... 24

Tabela 15: Gradientni program končne metode ... 24

Tabela 16: Vrednosti S/N pri določanju QL za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin ... 26

Tabela 17: Vrednosti parametrov umeritvene krivulje norfloksacina ... 26

Tabela 18: Vrednosti parametrov umeritvene krivulje ciprofloksacina ... 27

Tabela 19: Vrednosti parametrov umeritvene krivulje enrofloksacina ... 28

Tabela 20: Izračunane vrednosti za primer norfloksacina ... 41

Tabela 21: Izračunane vrednosti za primer ciprofloksacina ... 45

Tabela 22: Izračunane vrednosti za primer enrofloksacina ... 48

(14)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

API angl. Active Pharmaceutical Ingredient, aktivna farmacevtska učinkovina HPLC angl. High Performance Liquid Chromatography, tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

SS sorodna substanca

Rt angl. Retention time, retencijski čas Rf angl. Response factor, faktor občutljivosti

RRf angl. Relative Response factor, relativni faktor občutljivosti Cf ang. Correction factor, korekcijski faktor

FDA angl. Food and Drug Administration, Uprava za hrano in zdravila DNK deoksiribonukleinska kislina

LC angl. Liquid Chromatography, tekočinska kromatografija GC angl. Gas Chromatography, plinska kromatografija

NPLC angl. Normal Phase Liquid Chromatography, normalnofazna tekočinska kromatografija

RPLC angl. Reverse Phase Liquid Chromatography, reverznofazna tekočinska kromatografija

FD angl. Forced Degradation, pospešena razgradnja

(15)

1

1 Uvod

Farmacevtska industrija je ena od bolj reguliranih industrijskih panog. Vse uporabljene komponente v končnih farmacevtskih produktih je potrebno natančno poznati ter redno kontrolirati skozi celoten življenjski cikel farmacevtskega izdelka.

V ta namen podjetja ne vlagajo veliko sredstev le v razvoj aktivnih farmacevtskih učinkovin – API-jev, ampak tudi v razvoj ustreznih in zanesljivih analiznih metod za določevanje vsebnosti ter sinteznih in razkrojnih nečistot. Zaradi relativno enostavne uporabe se je v zadnjih desetletjih močno razširila uporaba tekočinske kromatografije visoke ločljivosti oziroma HPLC. Ta v številnih analiznih laboratorijih predstavlja močno orodje za detekcijo in kvantifikacijo komponent v širokem koncentracijskem območju. Novo razvita HPLC analizna metoda se praviloma validira, torej se testira njena ustreznost, rezultati testiranj pa morajo ustrezati pogojem, ki so predpisani v validacijskem protokolu.

Osnovna HPLC analizna tehnika je najbolj poznana v kombinaciji z UV-Vis detekcijo, ki temelji na absorbciji svetlobe ene ali več različnih valovnih dolžin.

Pogoj je prisotnost ustreznih kromofornih skupin v preiskovanih spojinah. Tovrstna detekcija največkrat ne omogoča nedvoumne identifikacije analitov, zato je potrebno primerjati retencijske čase (v nadaljnjem besedilu: Rt) izbranih kromatografskih vrhov na kromatogramih standarda in vzorca.

Aktivna farmacevtska učinkovina se lahko sčasoma zaradi same narave spojine in/ali pod določenimi zunanjimi vplivi deloma pretvori v svoje strukturno sorodne oblike. Tovrstni razpadni produkti nimajo zahtevanega biološkega učinka in so velikokrat toksikološko sporni. Natančna identifikacija in karakterizacija tovrstnih sorodnih substanc (v nadaljnjem besedilu: SS) je zato ključna za varnost končnega uporabnika. Zaradi mnogih vsakodnevnih kontrol SS je uporaba primerjalnih standardov ekonomsko neučinkovita, saj je nihova cena praviloma precej višja od cene primerjalnega standarda glavne učinkovine. Alternativna možnost je določitev in izračun faktorjev občutljivosti za znane SS že v sklopu same validacije analizne metode. To pomeni, da primerjamo odzive glavne učinkovine in posameznih SS.

Ugotovljene korelacije lahko uporabimo za namen rutinskih analiz znanih SS in se na ta način izognemo uporabi njihovih standardov. Izhodišče magistrskega dela je torej določitev in potrditev tovrstnih korelacij na različnih koncentracijskih nivojih izbranih aktivnih farmacevtskih učinkovin.

(16)

2

1.1 Kromatografija

Kromatografija je postopek, pri katerem pride do ločevanja posameznih komponent v mešanici. Je fizikalno-kemijska separacijska metoda, ki deluje na principu ločevanja različnih spojin na podlagi njihovih hitrosti potovanja vzdolž kromatografske kolone, kromatografske plošče ali kapilarne kolone. Čas, v katerem spojina prepotuje kolono, oziroma elucijski čas, je za različne spojine različen, po separaciji pa spojine lahko tudi identificiramo in kvantificiramo z ustreznim detektorjem. Rezultat kromatografske analize je kromatogram, na katerem se nahajajo kromatografski vrhovi ali signali oz. odzivi detektorja za posamezne spojine. Položaj posameznega kromatografskega vrha je za določeno spojino pod določenimi pogoji specifičen, njegova višina in površina pa sta sorazmerni količini oziroma koncentraciji te spojine v vzorcu.^[1]

1.1.1 Vrste kromatografskih metod

Kromatografija je zelo širok pojem, saj vključuje različne vrste kromatografskih tehnik, ki se razlikujejo na podlagi različnih parametrov. Med najbolj splošne parametre, po katerih se razlikujejo kromatografske tehnike, uvrščamo agregatno stanje mobilne faze, način ločbe, sestavo stacionarne faze, namen uporabe kromatografske tehnike itd. Glede na agregatno stanje mobilne faze ločimo dve vrsti kromatografije, in sicer plinsko (GC) in tekočinsko kromatografijo (LC), glede na namen uporabe pa analitsko in preparativno kromatografijo.

Preparativna kromatografija se uporablja za ločevanje spojin v zmeseh, rezultat pa so ločene in čiste spojine. Pri analitski kromatografiji gre ravno tako za ločevanje spojin v zmesi, njen namen pa je potrditev njihove identitete (istovetnosti) in koncentracije v vzorcu. ^{[2, 3]}

1.1.2 LC kromatografija

LC oziroma tekočinska kromatografija spada med bolj razširjene kromatografske metode, njena mobilna faza se nahaja v tekočem agregatnem stanju, kar pove že njeno ime. Obstaja v kolonski in planarni izvedbi, pogosteje pa je uporabljena kolonska izvedba. ^[4]

(17)

3 1.1.3 HPLC kromatografija

HPLC ali tekočinska kromatografija visoke ločljivosti je zelo razširjena separacijska analizna tehnika. Ločba poteka pri visokih tlakih, ki se začnejo od nekaj deset pa vse do 350 bar. Osnova ločbe spojin na kromatografski koloni so njihove različne fizikalno kemijske lastnosti, ki so posledica različno močnih interakcij spojin s stacionarno fazo, to pa se na kromatogramu odraža v različnih retencijskih časih posameznih spojin. Glede na polarnost mobilne in stacionarne faze ločimo normalnofazno tekočinsko kromatografijo ali NPLC ter reverznofazno tekočinsko kromatografijo ali RPLC.^[1]

1.1.4 Sestava HPLC kromatografskega sistema

HPLC kromatografski sistem je v splošnem sestavljen iz črpalke, mešalnega ventila, injektorja, kromatografske kolone, detektorja ter računalnika s programsko opremo za zajem in obdelavo podatkov.

a) Črpalka

Naloga črpalke je transport mobilne faze skozi kromatografski sistem. To so visokotlačne batne črpalke, ki imajo vzporedno umeščena dva bata, ki tekočino potiskata izmenjujoče z namenom eliminacije pulzirajočega toka mobilne faze.

Narejene so iz nerjavnih materialov in so zato primerne tudi za črpanje agresivnih kemikalij.

b) Mešalni ventil

Z njim kromatografski sistem uravnava želeno razmerje mobilnih faz za kromatografsko analizo, bodisi za gradientni ali izokratski režim elucije.

(18)

4 c) Injektor

Injektor je sestavljen iz preklopnega ventila in polnilne zanke. Preklopni ventil ima funkcijo, da napolni polnilno zanko točno določenega volumna z raztopino vzorca, v drugi stopnji pa ventil ta fiksni volumen vzorca dozira v HPLC sistem.^[5]

d) Kromatografska kolona

Kromatografska kolona je del HPLC kromatografskega sistema, na katerem poteka ločba spojin v vzorcu. Kolone razlikujemo glede na sestavo stacionarne faze, premer kolone, dolžino kolone itd. Izbira primerne kromatografske kolone je ključna za optimalno ločbo in karseda kratek čas analize.^[5]

e) Detektor

Funkcija detektorja je zaznava spojin, ki jih na kromatografski koloni ločimo.

Poznamo več vrst detektorjev, ki imajo svojevrsten način detekcije, v splošnem pa jih ločimo na selektivne in univerzalne. Univerzalni detektorji primerjajo odziv mobilne faze z odzivom mobilne faze z raztopljenim analitom, selektivni pa dajo odziv na račun analita samega. Končni rezultat HPLC analize je kromatogram z ločenimi kromatografskimi vrhovi posameznih spojin, katerih površina in višina sta sorazmerni količini teh spojin v analitu.^[4]

f) Mobilna faza

Mobilna faza je medij za transport analita skozi kromatografsko kolono. Pred HPLC analizo je potrebno mobilno fazo ustrezno pripraviti, pri čemer moramo paziti, da uporabimo topilo ustrezne čistosti, da je mobilna faza homogenizirana in po potrebi obdelana v ultrazvočni kopeli. Sam HPLC sistem s pomočjo razplinjevalca odstrani v mobilni fazi raztopljene pline, ki bi slabšali kvaliteto detekcije in s tem okrepili pojav anomalij na kromatogramu.

(19)

5

Slika 1: Shematski prikaz sestavnih delov HPLC sistema: 1 – rezervoar mobilne faze, 2 – črpalka, 3 – injektor, 4 – vzorec, 5 – kromatografska kolona, 6 – detektor,

7 – zajem in obdelava podatkov, 8 – odpad^[6]

1.1.5 Linearnost metode

Linearnost analizne metode je lastnost, ki nam pove, ali so merjeni signali v nekem koncentracijskem območju direktno sorazmerni koncentraciji določevane spojine v vzorcu. Sorazmernost je lahko dokazana direktno, tj. samo z raztopinami vzorca (ali standarda), ali z metodo standardnega dodatka, kjer so k raztopinam vzorca dodane standardne substance. Linearnost mora biti definirana z vsaj petimi različnimi koncentracijskimi točkami, ki pokrivajo delovno koncentracijsko območje analizne metode.

Linearnost lahko ocenimo vizualno z grafičnim prikazom odvisnosti signala instrumenta od koncentracije analita, ki ga moramo praviloma statistično ovrednotiti z ustrezno statistično metodo (npr. linearno regresijo).

(20)

6 1.1.6 Faktor občutljivosti

Iz statističnih parametrov, dobljenih pri določanju linearnosti metode, tj. z metodo linearne regresije, lahko določimo faktor občutljivosti za spojino.

Faktor občutljivosti za spojino je razmerje med ploščino kromatografskega vrha določene spojine in njeno koncentracijo. Z določanjem linearnosti dobimo naklon premice k, ki je izračunan na različnih koncentracijskih nivojih, ta pa nam predstavlja faktor občutljivosti (Rf) določene substance:^[7]

𝑅𝑓 = 𝑘 = ∑ (𝑥 − 𝑥̅)(𝑦 − 𝑦)

∑ (𝑥 − 𝑥̅)

Slika 2: Enačba za izračun naklona premice oz. faktorja občutljivosti Rf

Relativni faktor občutljivosti ali relativni faktor odziva – RRf se uporablja kot alternativna metoda določanju količine sorodnih substanc v zmesi s pomočjo uporabe primerralnih standardnih substanc.^[8]

Izračunamo ga kot razmerje med faktorjem občutljivosti sorodne substance in faktorjem občutljivosti glavne substance (npr. aktivne farmacevtske učinkovine):

𝑅𝑅𝑓 = 𝑅𝑓 𝑅𝑓

Slika 3: Enačba za izračun relativnega faktorja občutljivosti RRf

1.1.7 Korekcijski faktor

Korekcijski faktor Cf je obratno sorazmerna vrednost relativnega faktorja občutljivosti RRf in se upošteva pri izračunu koncentracije sorodnih substanc v analitu.^[7]

𝐶 = 1 𝑅𝑅𝑓

Slika 4: Enačba za izračun korekcijskega faktorja Cf

(21)

7

1.2 Fluorokinoloni

Fluorokinoloni so heterociklične spojine, ki se uporabljajo kot antibiotiki za zdravljenje širokega spektra okužb pri ljudeh in živalih. Sintetično pridobljeni fluorokinolonski antibiotiki so se skozi čas precej modificirali, še posebej z namenom povečanja njihove antimikrobne aktivnosti, spremembe farmakokinetičnih lastnosti in posledično njihove varnosti uporabe kot zdravilo.

Čeprav so bili kinoloni v začetku učinkoviti le v genitourinarnem in gastrointestinalnem traktu in so bili aktivni le proti Gram-negativnim bakterijam, imajo novi fluorokinoloni širši nabor indikacij in večjo aktivnost. Njihov mehanizem delovanja je tak, da fluorokinoloni zavirajo topoizomerazo v bakterijah. Naloga topoizomeraze je, da ohranja obliko supervijačnice v celični DNK, natančneje v bakterijskih kromosomih, in tako omogoča podvajanje. Fluorokinoloni to preprečijo, saj omogočijo odvitje supervijačnice in tako onemogočajo podvajanje. Poznamo štiri vrste topoizomeraz, fluorokinoloni pa vplivajo na tip I (DNK giraza) in tip IV.

[9,10]

Vsem fluorokinolonom je skupna struktura fluorokinolonskega obroča, ta pa je pri različnih fluorokinolonih različno modificiran. Na spodnji sliki so na mestih, označenih z R1, R2, R5, R7, R8, možne neštete strukturne modifikacije, na mestu označenim z X pa se praviloma nahaja ogljikov ali dušikov atom.^[11]

Slika 5: Splošna skeletna formula fluorokinolonskega obroča

(22)

8

Fluorokinolonski obroč je kromofor, saj nam na to nakazuje prisotnost konjugiranih dvojnih vezi oziroma neveznih π-elektronov. Posledično bo molekula s takim obročem potencialno dobro absorbirala svetlobo v vidnem in UV delu spektra.^[12]

Vsi trije fluorokinoloni; enrofloksacin, ciprofloksacin ter norfloksacin, ki smo jih uporabili v eksperimentalnem delu, tak obroč v svoji strukturi imajo, zato je bila uporaba UV-Vis detektorja pri HPLC analizi smiselna.

1.2.1 Enrofloksacin

Enrofloksacin je eden od mnogih fluorokinolonskih antibakterijskih aktivnih farmacevtskih učinkovin. S strani FDA je odobren za uporabo v veterini in je zelo učinkovit pri zdravljenju glavnih bakterijskih procesov pri rejnih živalih.^[13]

Slika 6: Strukturna formula enrofloksacina

1.2.2 Ciprofloksacin

Ciprofloksacin je aktivna farmacevtska učinkovina, ki spada v družino fluorokinolonov druge generacije. Deluje antibakterijsko in se uporablja za zdravljenje sistemskih okužb ter je eden najbolj uporabljenih fluorokinolonov na splošno. In vitro je zelo aktiven proti Gram-negativnim bakterijam.^[14]

(23)

9

Slika 7: Strukturna formula ciprofloksacina

1.2.3 Norfloksacin

Norfloksacin je eden novejših fluorokinolonskih antibakterijskih učinkovin.

Strukturno je povezan z nalidiksno kislino, vendar ima širši in vitro antibakterijski spekter in je na splošno bolj aktiven. Večina Gram-negativnih patogenov je susceptibilnih do norfloksacina. Aktivnost norfloksacina je manjša v primerjavi z aktivnostjo ciprofloksacina.^[15]

Slika 8: Strukturna formula norfloksacina

(24)

10

2 Namen dela

V prvem delu magistrske naloge bomo poskusili razviti HPLC kromatografsko metodo za določanje vsebnosti treh različnih antibiotikov: norfloksacina, ciprofloksacina ter enrofloksacina. Nato bomo metodo ustrezno validirali – preverili linearnosti metode, določili DL in QL.

V drugem delu magistrske naloge bomo s pomočjo različnih reagentov poskusili izvesti pospešeno razgradnjo norfloksacina, ciprofloksacina ter enrofloksacina. Z novo razvito HPLC metodo bomo nato poskusili določiti vsebnost nastalih sorodnih substanc in izračunati njihove faktorje občutljivosti ter jih primerjati s faktorji občutljivosti norfloksacina, ciprofloksacina ter enrofloksacina na različnih koncentracijskih nivojih.

Namen tega dela je torej potrditi oziroma ovreči korelacijo med faktorji občutljivosti omenjenih aktivnih farmacevtskih učinkovin in faktorji občutljivosti nastalih sorodnih substanc skozi celotno koncentracijsko območje novo razvite HPLC metode.

(25)

11

3 Eksperimentalni del 3.1 Materiali

3.1.1 Standardi

 Enrofloxacin, Sigma Aldrich, Lot: 0000102779, ≥ 99.0 % (HPLC)

 Ciprofloxacin, Sigma Aldrich, Lot: 0000104372, ≥ 98 % (HPLC)

 Norfloxacin, Sigma Aldrich, Lot: SLCG1651, ≥ 98 % (TLC) 3.1.2 Reagenti in topila

 voda, prečiščena, za kromatografijo, Millipore MilliQ^®

 acetonitril, Fisher Scientific, Lot: 2050360, ≥ 99.9 %, HPLC Gradient grade

 ortofosforna kislina, 85 %, H3PO4, Carlo Erba Reagents, Lot: V9L531039L

 trifluoroocetna kislina, TFA, Lot: W25E708, Alfa Aesar, HPLC Grade, 99.5+%

 natrijev hidroksid, NaOH, Lot: B1684698, Merck, p.a.

 klorovodikova kislina, HCl(aq), Lot: P0C085300C, Carlo Erba, 37 %

(26)

12

3.2 Aparature in laboratorijski pribor

 mikrotehtnica Mettler Toledo XPR2U

 ultrazvočna kopel

 laboratorijski sušilnik Binder

 laboratorijska steklovina; bučke, merilne in polnilne pipete, kapalke, čaše

 tekočinski kromatograf Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 s:

- črpalko LPG-3400SD

- avtomatskim vzorčevalnikom WPS-3000 Split Loop - kolonskim termostatom TCC-3000

- detektorjem z nizom diod DAD-3000 - programom Chromeleon 7.3

 kromatografska kolona Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4,6 mm, Lot:

587293-22

 kromatografska kolona Gemini 5u C6-Phenyl 110A; 150 x 4,6 mm 5 micron, Lot: 417066-9

 kromatografska kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4,6 mm, Lot:

720012-9

3.3 Pogoji končno razvite kromatografske metode

 temperatura termostatiranja kolone: 25 °C

 temperatura avtomatskega vzorčevalnika: 20 °C

 volumen injiciranja: 5 µl

 pretok mobilne faze: 1,0 ml/min

(27)

13

 mobilna faza A: 0,1% TFA (vodna)

 mobilna faza B: ACN

 gradientna elucija

Tabela 1: Gradientni program HPLC metode

čas / min MFA MFB

0 90 10

1 90 10

8 70 30

10 20 80

13 20 80

13,5 90 10

17 90 10

 detekcija: meritev absorbance pri valovni dolžini 280 nm (UV)

 kromatografska kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm, Lot:

720012-9

3.4 Priprava raztopin za kromatografsko analizo

3.4.1 Raztopine za HPLC meritve po končni metodi

Mobilna faza A

V 1000 ml merilno bučo odpipetiramo 1,0 ml TFA ter dodamo približno 900 ml vode in premešamo. Z vodo dopolnimo do oznake in premešamo.

Mobilna faza B ACN

(28)

14 2 % raztopina H3PO4

V 1000 ml merilno bučo nalijemo približno polovico volumna vode in odpipetiramo 20,0 ml koncentrirane H3PO4, premešamo ter pustimo, da se raztopina temperira na sobni temperaturi. Nato z vodo dopolnimo do oznake volumna in premešamo.

Topilo

V reagenčni steklenici zmešamo 500 ml ACN in 500 ml 2 % raztopine H3PO4.

3.4.2 Raztopine uporabljene za določanje linearnosti

RS0-C: Osnovna raztopina standarda ciprofloksacina

V 10 ml merilno bučko natančno natehtamo približno 10 mg standarda ciprofloksacina, dodamo topilo in raztapljamo na ultrazvočni kopeli vsaj 5 min oz.

dokler se standard popolnoma ne raztopi. Raztopino temperiramo na sobno temperaturo in dopolnimo s topilom do oznake volumna. Dobro premešamo.

RS0-N: Osnovna raztopina standarda norfloksacina

Priprava je enaka pripravi RS0-C, le da uporabimo norfloksacin.

RS0-E: Osnovna raztopina standarda enrofloksacina

Priprava je enaka pripravi RS0-C, le da uporabimo enrofloksacin.

(29)

15

Tabela 2: Priprava raztopin za linearnost (območje od 10 do 100 µg/ml) Oznaka raztopine Volumen alikvota

RS0-X / µl

Volumen bučke / ml

Koncentracija spojine / µg/ml

LIN-X-10 1000 100 10

LIN-X-20 200 10 20

LIN-X-30 300 10 30

LIN-X-40 400 10 40

LIN-X-50 500 10 50

LIN-X-60 600 10 60

LIN-X-70 700 10 70

LIN-X-80 800 10 80

LIN-X-90 900 10 90

LIN-X-100 1000 10 100

X= N ali E ali C

Tabela 3: Priprava raztopin za linearnost (območje od 0,10 do 8,50 µg/ml) Oznaka raztopine Volumen alikvota

LIN-X-10 / µl

Volumen bučke / ml

Koncentracija raztopine / µg/ml

LIN-X-0,10 100 10 0,10

LIN-X-0,25 250 10 0,25

LIN-X-0,40 400 10 0,40

LIN-X-0,55 550 10 0,55

LIN-X-0,70 700 10 0,70

LIN-X-0,85 850 10 0,85

LIN-X-1,00 1000 10 1,00

LIN-X-2,50 2500 10 2,50

LIN-X-4,00 4000 10 4,00

LIN-X-5,50 5500 10 5,50

LIN-X-7,00 7000 10 7,00

LIN-X-8,50 8500 10 8,50

X= N ali E ali C

(30)

16 3.4.3 Raztopine za pospešeno razgradnjo

2 M vodna raztopina NaOH

V 100 ml merilno bučko natančno natehtamo približno 8 g NaOH, raztopimo v približno 50 ml vode in temperiramo na sobno temperaturo. Nato dopolnimo z vodo do oznake volumna in premešamo.

0,2 M vodna raztopina NaOH

V 100 ml merilno bučko nalijemo približno 20 ml vode in odpipetiramo 10,0 ml 2 M vodne raztopine NaOH. Nato dopolnimo z vodo do oznake volumna in premešamo.

2 M vodna raztopina HCl

V 100 ml merilno bučko nalijemo približno 20 ml vode in odpipetiramo 16,6 ml koncentrirane HCl. Nato dopolnimo z vodo do oznake volumna in premešamo.

0,2 M vodna raztopina HCl

V 100 ml merilno bučko nalijemo približno 20 ml vode in odpipetiramo 10,0 ml 2 M vodne raztopine HCl. Nato dopolnimo z vodo do oznake volumna in temeljito premešamo.

FD – v 0,1 M HCl

V 5 ml merilno bučko odpipetiramo 2,5 ml 0,2 M HCl in 2,5 ml RS0-X, dodamo topilo ter premešamo. Nato s topilom dopolnimo do oznake volumna in premešamo. Raztopino nalijemo v več vial in segrevamo na 70 °C v laboratorijskem sušilniku.

FD – v 0,1 M NaOH

V 5 ml merilno bučko odpipetiramo 2,5 ml 0,2 M NaOH in 2,5 ml RS0-X, dodamo topilo ter premešamo. Nato s topilom dopolnimo do oznake volumna in premešamo. Raztopino nalijemo v več vial in segrevamo na 70 °C v laboratorijskem sušilniku.

(31)

17

4 Rezultati in diskusija

4.1 Razvoj kromatografske metode za določanje vsebnosti floksacinov

4.1.1 Topnost floksacinov

Na začetku razvoja kromatografske metode za določanje vsebnosti floksacinov smo najprej preverili topnosti vseh treh analitov v izbranem topilu. Najprej smo si za topilo izbrali vodo. Vsako spojino smo natehtali v svojo merilno bučko in dodali vodo do oznake volumna. Vse vzorce smo pripravili v koncentraciji 1 mg/ml. Nato smo jih 30 min obdelovali na ultrazvočni kopeli, termostatirani na 25 °C. Ker se vzorci v vodi niso raztopili, smo enak postopek ponovili s topili, ki so zbrana v Tabeli 4.

Tabela 4: Pregled raztapljanja standardnih substanc floksacinov s pomočjo ultrazvočne kopeli v različnih topilih

norfloksacin ciprofloksacin enrofloksacin

topilo

čas obdelave

na UZ / min

topen

čas obdelave

na UZ / min

topen

čas obdelave

na UZ / min

topen

MQ 30 ne 30 ne 30 ne

1 % H3PO4 30 ne 30 ne 30 ne

ACN:MQ=10:90 30 ne 30 ne 30 ne

ACN:MQ=20:80 30 ne 30 ne 30 ne

ACN:MQ=30:70 30 ne 30 ne 30 ne

ACN:MQ=40:60 30 ne 30 ne 30 ne

1 % H3PO4:ACN

= 50:50 5 da 30 da 5 da

2 % H3PO4:ACN

= 50:50 5 da 5 da 5 da

Na podlagi testov topnosti smo za vse spojine izbrali mešanico 2 % H3PO4 in ACN v razmerju 50:50 in čas raztapljanja na ultrazvočni kopeli 5 min.

(32)

18 4.1.2 Detekcija

Vsem trem strukturam floksacinov je skupen fluorokinolonski obroč, ki je kromofor, saj vsebuje konjugirane dvojne vezi. Na podlagi tega smo se odločili, da za njihovo detekcijo po kromatografski ločbi izberemo UV-Vis detektor. Vse meritve smo opravili pri valovni dolžini 280 nm.

4.1.3 Optimizacija kromatografskih pogojev

Razvoja kromatografije smo se lotili z injiciranjem raztopin vseh treh standardov norfloksacina, ciprofloksacina ter enrofloksacina, ki so bili pripravljeni v koncentraciji 0,05 mg/ml.

Za prvo kromatografsko kolono smo uporabili kolono Kinetex 2.6u XB-C18 100A;

150 x 4.6 mm. Ostali kromatografski pogoji so zbrani v Tabeli 5.

Tabela 5: Kromatografski pogoji izhodiščne metode (kolona Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm, izokratska elucija)

Temperatura kolone 25 °C

Volumen injiciranja 5 µl

Temperatura avtomatskega vzorčevalnika

20 °C

Pretok 1,0 ml/min

Kromatografska kolona Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm

Vrsta elucije izokratska

Mobilna faza MQ:ACN = 50:50 (v/v)

Zaradi prezgodnje elucije in neločenih kromatografskih vrhov smo spreminjali razmerje mobilnih faz na način, da smo postopoma zviševali delež organske faze v mešanici. Uporabljena razmerja mobilnih faz prikazuje Tabela 6, na Sliki 9 pa so prikazani kromatogrami, posneti s temi razmerji mobilnih faz (siva, zelena in črna krivulja na kromatogramu).

(33)

19

Tabela 6: Testirana razmerja mobilnih faz Razmerje mobilnih faz 1. injiciranje MQ : ACN = 50 : 50 2. injiciranje MQ : ACN = 40 : 60 3. injiciranje MQ : ACN = 30 : 70

Ker tudi s spreminjanjem razmerja mobilnih faz nismo dosegli signifikantnih sprememb, smo poskusili z gradientno elucijo, torej smo spreminjali razmerje mobilnih faz tekom kromatografske analize. Kromatografski pogoji so navedeni v Tabeli 7.

Tabela 7: Kromatografski pogoji gradientne metode (kolona Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm, gradientna elucija)

20 °C

Pretok 1,0 ml/min

Kromatografska kolona Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm

Vrsta elucije gradientna

Mobilna faza A MQ

Mobilna faza B ACN

Tabela 8: Gradientni program Čas /

min

MFA /

%

MFB /

%

0 90 10

2 90 10

12 20 80

12,5 90 10

15 90 10

(34)

20

Z gradientno elucijo po programu, navedenemu v Tabeli 8, smo uspeli podaljšati čas zadrževanja komponent na koloni, vendar nam jih med sabo še vedno ni uspelo ločiti (prikazano z modro na Sliki 9).

V naslednjem koraku smo uporabili drugačno mobilno fazo A. Namesto MQ smo uporabili vodno raztopino 0,1 % TFA, z namenom izboljšanja oblike vrhov in njihove potencialne ločbe (prikazano z vijolično na Sliki 9).

Slika 9: Prekriti kromatogrami izokratske in gradientne elucije floksacinov na koloni Kinetex 2.6u XB-C18 100A; 150 x 4.6 mm

Iz Slike 9 je razvidno, da vrhovi niso bili dovolj ločeni, zato smo zamenjali kolono.

Poskusili smo s kromatografsko kolono Gemini 5u C6-Phenyl 110A; 150 x 4.6 mm 5 micron. Kromatografski pogoji so navedeni v Tabeli 9, razmerja uporabljenih mobilnih faz pa v Tabeli 10.

Tabela 9: Kromatografski pogoji kromatografske metode (kolona Gemini 5u C6- Phenyl 110A; 150 x 4.6 mm 5 micron, izokratska elucija)

20 °C

Pretok 1,0 ml/min

Kromatografska kolona Gemini 5u C6-Phenyl 110A; 150 x 4.6 mm 5 micron

Vrsta elucije izokratska

Mobilna faza MQ:ACN = 60:40 (v/v)

(35)

21

Tabela 10: Testirana razmerja mobilnih faz Razmerje mobilnih faz 1. injiciranje MQ : ACN = 60 : 40 2. injiciranje MQ : ACN = 50 : 50 3. injiciranje MQ : ACN = 40 : 60 4. injiciranje MQ : ACN = 30 : 70

Ločbe vrhov nismo dosegli, zato smo poskusili z gradientno elucijo po gradientnem programu, prikazanem v Tabeli 11 (turkizno modra na Sliki 10).

Tabela 11: Gradientni program Čas /

min

MFA /

%

MFB /

%

0 90 10

2 90 10

12 20 80

12,5 90 10

15 90 10

Tudi s tem ločbe nismo dosegli, zato smo mobilno fazo A zamenjali z 0,1 % vodno raztopino TFA.

Iz Slike 10 je razvidno, da je bila bolj smiselna uporaba gradientne elucije ter 0,1 % TFA v mobilni fazi A, saj je bila v primerjavi s prejšnjo kromatografsko kolono ločba izrazitejša, vendar vrhovi še vedno niso bili popolnoma ločeni med sabo (črna krivulja).

(36)

22

Slika 10: Prekriti kromatogrami izokratske in gradientne elucije floksacinov na koloni Gemini 5u C6-Phenyl 110A; 150 x 4.6 mm 5 micron

Kljub temu, da je prišlo do delne ločbe vrhov, smo se odločili da testiramo še kromatografsko kolono Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm.

Za mobilno fazo A smo uporabili 0,1 % H3PO4 in injicirali iste raztopine standardov kot na predhodni koloni pod kromatografskimi pogoji navedenimi v Tabeli 12.

Tabela 12: Kromatografski pogoji gradientne metode (kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm, gradientna elucija)

20 °C

Pretok 1,0 ml/min

Kromatografska kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm

Mobilna faza A 0,1 % H3PO4

Mobilna faza B ACN

Nato smo v gradientnem programu spreminjali maksimalni delež organske mobilne faze B na 12. minuti. Začeli smo s 60 % MFB (rjava krivulja na Sliki 11). Ugotovili smo, da so bili vrhovi popolnoma ločeni med sabo. Ker smo želeli izboljšati obliko vrhov, smo povečevali delež organske faze po 10 %, vse do deleža 90 % MFB (Tabela 13). Pri deležu 90 % MFB na 12. minuti so bili vrhovi še vedno ločeni med sabo, vendar so se vsi trije eluirali v časovnem intervalu 30 s (črna krivulja na Sliki

(37)

23

11). Odziv in oblika vseh treh vrhov sta se prav tako signifikantno izboljšala (Slika 11).

Tabela 13: Gradientni program Čas / min MFA / % MFB /

%

0 90 10

2 90 10

12 10 90

12,5 90 10

15 90 10

Slika 11: Prekriti kromatogrami gradientne elucije floksacinov z različnimi razmerji MFA:MFB, na 12. minuti, na koloni Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm

Ker smo na prejšnjih kolonah uporabili 0,1 % TFA z namenom izboljšanja oblike vrhov, torej zmanjšanja sekundarnih interakcij s stacionarno fazo, smo tudi na tej koloni uporabili to raztopino. Enak pozitiven efekt se je pokazal tudi na tej koloni (Slika 12). Končni kromatografski pogoji razvite metode so navedeni v Tabeli 14, končni gradientni program pa v Tabeli 15.

(38)

24

Slika 12: Kromatogram gradientne elucije floksacinov po končni metodi, na koloni Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm, 0,1 % TFA

Tabela 14: Kromatografski pogoji končne metode (kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm, gradientna elucija)

20 °C

Pretok 1,0 ml/min

Kromatografska kolona Kinetex 2.6u Biphenyl 100A; 100 x 4.6 mm

Mobilna faza A 0,1 % TFA

Mobilna faza B ACN

Tabela 15: Gradientni program končne metode Čas / min MFA / % MFB /

%

0 90 10

1 90 10

3 70 30

10 20 80

13 20 80

13,5 90 10

17 90 10

(39)

25

4.2 Linearnost

Po uspešno razviti končni kromatografski metodi smo nadaljevali s preverbo linearnosti razvite metode. Koncentracijsko območje za linearnost smo izbrali na podlagi izkušenj, pridobljenih med razvojem kromatografske metode.

V območju od 0 do 100 µg/ml smo določili linearnost vseh treh floksacinov. V območju od 10 do 100 µg/ml je razmik med točkami 10 µg/ml, v območju od 0 do 10 pa je razmik 1,5 µg/ml.

Meja detekcije - DL

Pri razvoju metode smo izračunali teoretično koncentracijo, pri kateri bi moral biti S/N med 3 in 10. Meritve so pokazale, da je S/N pri koncentraciji 0,10 µg/ml v omenjenem območju, zato smo omenjeno koncentracijo označili za mejo detekcije – DL (Slika 13).

Slika 13: Vrednosti S/N pri DL za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin

Meja kvantifikacije - QL

Pri razvoju metode smo izračunali tudi teoretično koncentracijo, pri kateri bi moral biti S/N vsaj 10. Meritve so pokazale, da vrednosti S/N pri koncentraciji floksacinov 1,0 µg/ml ustrezajo temu pogoju, zato smo omenjeno koncentracijo označili za mejo kvantifikacije – QL (Tabela 16).

(40)

26

Tabela 16: Vrednosti S/N pri določanju QL za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin

γ = 0,001

mg/ml S/N

ponovitve norfloksacin ciprofloksacin enrofloksacin

1 13,4 13,5 11,4

2 15,0 14,8 12,5

3 16,0 15,4 13,0

4 19,1 16,6 14,0

5 19,0 18,6 14,9

6 19,2 19,3 15,8

povprečje 17 16 14

Umeritvene krivulje

Kot je razvidno iz Tabele 17 in Slike 14, so vrednosti parametrov umeritvene krivulje norfloksacina ustrezne. Prekriti kromatogrami injiciranj se nahajajo na Sliki 18, 19, 20 in 21.

Tabela 17: Vrednosti parametrov umeritvene krivulje norfloksacina Parameter umeritvene premice Vrednost parametra

Korelacijski koeficient 0,9997

Naklon premice, k 0,4258

Odsek na osi y, n 0,033

A [mAU × min] = k [(mAU × min)/(µg/ml)] × c [µg/ml] + n [mAU × min] =

= 0,4258 × c + 0,033

(41)

27

Slika 14: Umeritvena krivulja norfloksacina – celotno območje

Kot je razvidno iz Tabele 18 in Slike 15, so bile vrednosti parametrov umeritvene krivulje ciprofloksacina ustrezne. Prekriti kromatogrami injiciranj se nahajajo na Sliki 18, 19, 20 in 21.

Tabela 18: Vrednosti parametrov umeritvene krivulje ciprofloksacina Parameter umeritvene premice Vrednost parametra

Korelacijski koeficient R≥ 0,999 0,9998

= 0,4310 × c + 0,0125

Slika 15: Umeritvena krivulja ciprofloksacina – celotno območje

Kot je razvidno iz Tabele 19 in Slike 16, so bile vrednosti parametrov umeritvene krivulje enrofloksacina ustrezne. Prekriti kromatogrami injiciranj se nahajajo na Sliki 17, 18, 19 in 20.

(42)

28

Tabela 19: Vrednosti parametrov umeritvene krivulje enrofloksacina Parameter umeritvene premice Vrednost parametra

Korelacijski koeficient R≥ 0,999 0,9999

= 0,4055 × c + 0,0167

Slika 16: Umeritvena krivulja enrofloksacina – celotno območje

Slika 17: Prekriti kromatogrami v območju od DL do QL za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin

(43)

29

Slika 18: Prekriti kromatogrami v območju od QL do 10 µg/ml za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin

Slika 19: Prekriti kromatogrami v območju od 10 do 50 µg/ml za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin

(44)

30

Slika 20: Prekriti kromatogrami v območju od 60 do 100 µg/ml za norfloksacin, ciprofloksacin in enrofloksacin

4.3 Pospešena razgradnja floksacinov

Po preveritvi linearnosti metode smo nadaljevali s pospešeno razgradnjo (angl.

forced degradation) floksacinov, da bi generirali razgradne produkte (sorodne substance) norfloksacina, ciprofloksacina ter enrofloksacina.

Razgradnjo smo poskušali najprej doseči samo z gretjem standardnih raztopin. To nam ni uspelo, saj so spojine pri tej temperature očitno termično stabilne, kot je razvidno iz Slik 21, 22 in 23, kjer ni signifikantnega razgradnega vrha sorodnih substanc.

Slika 21: Kromatogram razgradnje norfloksacina s segrevanjem na 70 °C

(45)

31

Slika 22: Kromatogram razgradnje ciprofloksacina s segrevanjem na 70 °C

Slika 23: Kromatogram razgradnje enrofloksacina s segrevanjem na 70 °C

Po neuspelih poskusih razgradnje samo s segrevanjem smo poskušali razgradnjo doseči z 0,1 M vodno raztopino HCl ter 0,1 M vodno raztopino (z in brez segrevanja na 70 °C).

4.3.1 Pospešena razgradnja norfloksacina

Uporaba 0,1 M HCl, brez segrevanja, v standardni raztopini norfloksacina ni pokazala signifikantnih razlik niti po 20 urah (Slika 24). Na kromatogramu nismo opazili pojava dodatnih kromatografskih vrhov ali povečanja ploščine že prisotnih vrhov, eluiranih okrog 7. minute.

(46)

32

Slika 24: Kromatogram razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, sobna temperatura

Razpadni vrh pri norfloksacinu je nastal po uporabi 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, količina sorodne substance pa je s časom naraščala (Slika 25).

Slika 25: Kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, s segrevanjem na 70 °C

(47)

33

Po obdelavi standardne raztopine norfloksacina z 0,1 M NaOH, brez segrevanja, je sicer nastal razpadni vrh sorodne substance, vendar oba vrhova nista bila popolnoma ločena (Slika 26).

Slika 26: Kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M NaOH, sobna temperatura

Segrevanje na 70 °C, skupaj z obdelavo standardne raztopine norfloksacina z 0,1 M NaOH, je privedlo do izrazitejšega razpadnega vrha, vendar se je tudi tu pokazala težava z ločevanjem glavnega in razpadnega vrha (Slika 27).

Slika 27: Kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M NaOH, s segrevanjem pri 70 °C

(48)

34 4.3.2 Pospešena razgradnja ciprofloksacina

Uporaba 0,1 M HCl, brez segrevanja, v standardni raztopini ciprofloksacina ni pokazala signifikantnih razlik niti po 20 urah (Slika 28). Na kromatogramu nismo opazili pojava dodatnih kromatografskih vrhov ali povečanja ploščine že prisotnih vrhov, eluiranih med 7. in 8. minuto.

Slika 28: Kromatogram razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, sobna temperatura

Razpadni vrh pri ciprofloksacinu je nastal po uporabi 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, količina sorodne substance pa je s časom nekoliko naraščala (Slika 29).

Slika 29: Kromatogram razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, s segrevanjem pri 70 °C

(49)

35

Po obdelavi standardne raztopine ciprofloksacina z 0,1 M NaOH, brez segrevanja, je nastal razpadni vrh sorodne substance, vendar med glavnim in razpadnim vrhom ni prišo do popolne ločbe (Slika 30).

Slika 30: Kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M NaOH, sobna temperatura

Segrevanje na 70 °C, skupaj z obdelavo standardne raztopine ciprofloksacina z 0,1 M NaOH, je tudi privedlo do nastanka razpadnega vrha, vendar se je tudi tu pokazala težava z ločbo vrhov (Slika 31).

Slika 31: Kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M NaOH, s segrevanjem pri 70 °C

(50)

36 4.3.3 Pospešena razgradnja enrofloksacina

Uporaba 0,1 M HCl, brez segrevanja, v standardni raztopini enrofloksacina ni pokazala signifikantnih razpadnih vrhov niti po 20 urah (Slika 32). Na kromatogramu nismo opazili pojava dodatnih kromatografskih vrhov ali povečanja ploščine že prisotnih vrhov, eluiranih med 8. in 9. minuto.

Slika 32: Kromatogram razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, sobna temperatura

Izrazit razpadni vrh pri enrofloksacinu je nastal po uporabi 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, količina sorodne substance pa je s časom naraščala (Slika 33).

Slika 33: Kromatogram razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, s segrevanjem pri 70 °C

(51)

37

Po obdelavi standardne raztopine enrofloksacina z 0,1 M NaOH, brez segrevanja, je prišlo do nastanka razpadnega vrha na 11,5 minuti, vendar oblika vrha ni bila ustrezna (Slika 34).

Slika 34: Kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M NaOH, sobna temperatura

Segrevanje na 70 °C, skupaj z obdelavo standardne raztopine enrofloksacina z 0,1 M NaOH, je privedlo do nastanka manjših, vendar nesignifikantih razpadnih vrhov (Slika 35).

Slika 35: Kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M NaOH, s segrevanjem pri 70 °C

(52)

38

4.4 Določitev faktorjev občutljivosti

Po pospešeni razgradnji floksacinov smo ugotovili, da je do največjih razpadov prišlo pri uporabi 0,1 M HCl in segrevanju na 70 °C, zato smo določitev faktorjev občutljivosti nadaljevali s temi raztopinami. Največji razpad glavne učinkovine smo določili pri enrofloksacinu, pri norfloksacinu in ciporfloksacinu pa je bil razpad manj izrazit.

Raztopine po pospešeni razgradnji smo primerno redčili, da smo dosegli koncentracijski območji od 0,50 do 2,50 µg/ml ter od 5 do 25 µg/ml. Nastale razgradne produkte smo vrednotili relativno glede na odziv učinkovine (glavni vrh).

4.4.1 Faktorji občutljivosti norfloksacina in njegovega razgradnega produkta

Iz Slike 36 in Slike 39 je razvidno, da se je razpadni produkt norfloksacina eluiral med 5,9 in 6,0 minuto. Na Slikah 36 in 39 so prekriti kromatogrami redčenih raztopin norfloksacina, po pospešeni razgradnji norfloksacina v 0,1 M HCl in segrevanju na 70 °C.

Slika 36: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju na 70 °C, koncentracije SS od 5 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do

25 µg/ml (najvišji vrh v črni barvi)

(53)

39

Slika 37: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, norfloksacin

Slika 38: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, razgradni produkt

y = 0,4327x - 0,0308 R² = 1

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

0 5 10 15 20 25 30

Ploščina [mAU x min]

Koncentracija [µg/mL]

y = 0,0274x - 0,0018 R² = 0,9998

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800

0 5 10 15 20 25 30

(54)

40

Slika 39: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 0,50 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 2,50

µg/ml (najvišji vrh v modri barvi)

Slika 40: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, norfloksacin

y = 0,428x - 0,0157 R² = 0,9998

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

(55)

41

Slika 41: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje norfloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, razgradni produkt

Iz naklona premic na Slikah 37, 38, 40 in 41 smo določili faktor občutljivosti Rf norfloksacina ter njegove sorodne substance, s pomočjo enačb na Sliki 3 in Sliki 4 pa smo izračunali relativni faktor občutljivosti RRf in korecijski faktor Cf (Tabela 20).

Tabela 20: Izračunane vrednosti za primer norfloksacina Koncentracijsko območje [µg/ml] Rfglavni vrh RfSS RRf Cf

0,50-2,50 0,428 0,0276 0,064 15,5

5-25 0,4327 0,0274 0,063 15,8

y = 0,0276x - 0,0018 R² = 0,9971

0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600 0,0700 0,0800

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

(56)

42

4.4.2 Faktorji občutljivosti ciprofloksacina in njegovega razgradnega produkta

Iz Slike 42 in Slike 45 je razvidno, da se je razgradni produkt ciprofloksacina eluiral med 6,5 in 6,7 minuto.

Slika 42: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 5 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 25 µg/ml

(najvišji vrh v temno zeleni barvi)

Slika 43: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, ciprofloksacin

y = 0,423x - 0,0228 R² = 1

0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000

0 5 10 15 20 25 30

(57)

43

Slika 44: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, razgradni produkt

Slika 45: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije razgradnega produkta od 0,50 µg/ml (najnižji vrh v

črni barvi) do 2,50 µg/ml (najvišji vrh v temno modri barvi)

y = 0,0227x - 0,0007 R² = 1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

0 5 10 15 20 25 30

(58)

44

Slika 46: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, ciprofloksacin

Slika 47: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje ciprofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, razgradni produkt

Iz naklona premic na Slikah 43, 44, 46 in 47 smo določili faktor občutljivosti Rf ciprofloksacina ter njegove sorodne substance, s pomočjo enačb na Sliki 3 in Sliki 4 pa smo izračunali relativni faktor občutljivosti RRf in korecijski faktor Cf (Tabela 21).

y = 0,4135x - 0,0053 R² = 0,9999

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

y = 0,0215x + 0,0007 R² = 0,9966

0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

(59)

45

Tabela 21: Izračunane vrednosti za primer ciprofloksacina Koncentracijsko območje [µg/ml] Rfglavni vrh RfSS RRf Cf

0,50-2,50 0,4135 0,0215 0,052 19,2

5-25 0,423 0,0227 0,054 18,6

4.4.3 Faktorji občutljivosti enrofloksacina in njegovega razgradnega produkta

Iz Slike 48 in Slike 51 je razvidno, da se je razgradni produkt enrofloksacina eluiral med 7,2 in 7,3 minuto.

Slika 48: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 5 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 25 µg/ml

(najvišji vrh v črni barvi)

(60)

46

Slika 49: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, enrofloksacin

Slika 50: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 5-25 µg/ml, razgradni produkt

y = 0,1424x - 0,026 R² = 1

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000

0 5 10 15 20 25 30

y = 0,0215x - 0,006 R² = 0,9998

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600

0 5 10 15 20 25 30

(61)

47

Slika 51: Prekriti kromatogram pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl, ob segrevanju, koncentracije SS od 0,50 µg/ml (najnižji vrh v črni barvi) do 2,50

µg/ml (najvišji vrh v temno modri barvi)

Slika 52: Umeritvena krivulja pospešene razgradnje enrofloksacina v 0,1 M HCl ob segrevanju na 70 °C, 0,50-2,50 µg/ml, enrofloksacin

y = 0,1385x - 0,002 R² = 0,9993

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00