U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOMAGISTRSKO DELO
Borut Šketa
Ljubljana, 2021
U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOMAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJSKO INŽENIRSTVO
Imobilizacija transaminaz na prepletena nanovlakna v mikroreaktorjih
MAGISTRSKO DELO
Borut Šketa
M
ENTORICA: prof. dr. Polona Žnidaršič Plazl
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
diplomskega/magistrskega dela
Spodaj podpisani Borut Šketa sem avtor magistrskega dela z naslovom: Imobilizacija transaminaz na prepletena nanovlakna v mikroreaktorjih.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. dr.
Polone Žnidaršič Plazl;
• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;
• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.
V Ljubljani, 18. 8. 2021 Podpis avtorja:
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Kemijsko inženirstvo. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo UL;
pod mentorstvom prof. dr. Polone Žnidaršič Plazl.
Senat UL FKKT je za mentorico imenoval prof. dr. Polono Žnidaršič Plazl.
Recenzenti: izr. prof. dr. Marjan Marinšek, doc. dr. Marina Klemenčič
Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Marjan Marinšek, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Članica: prof. dr. Polona Žnidaršič Plazl, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, mentorica
Članica: doc. dr. Marina Klemenčič, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Zahvala
Iskreno se zahvaljujem svoji mentorici prof. dr. Poloni Žnidaršič Plazl, za vso pomoč pri raziskovalnem delu. Zahvaljujem se ji za potrpežljivost, strokovno usmerjanje in nenehno spodbudo tokom študija.
Za pomoč pri raziskovalnem delu, dodatno znanje in strokoven pregled dela se zahvaljujem doc. dr. Marini Klemenčič.
Za hiter in strokoven pregled se zahvaljujem prof. dr. Marjanu Marinšku.
Zahvaljujem se tudi Tadeju Menegattiju in Mojci Seručnik, za pomoč, nasvete in družbo med raziskovalnim delom.
Za oporo, spodbudo in vlivanje motivacije za pisanje magistrskega dela se zahvaljujem vsem prijateljem in študentom iz laboratorija.
Zahvaljujem se tudi staršem in družini, ki so mi stali ob strani in me spodbujali med študijem. Hvaležen sem za vso podporo, pri doseganju mojih ciljev.
Imobilizacija transaminaz na prepletena nanovlakna v mikroreaktorjih Povzetek:
Encimska kataliza omogoča izvedbo enantioselektivnih reakcij pri nizkih temperaturah, blagem pH in atmosferskem tlaku. Kljub tem prednostim pa je za ekonomsko upravičenost biokatalitskih procesov v industriji ključna imobilizacija encimov. Ta zagotovi manjše izgube dragih encimov, hkrati pa lahko izboljša njihovo stabilnost in odpornost v pogojih industrijskih procesov, ki zelo odstopajo od naravnega okolja encimov. Izvedba biokatalitskih procesov v mikropretočnih sistemih, ki zaradi dobre regulacije temperature, prenosa snovi in majhnega volumna omogočajo visoke konverzije ob majhnih količinah porabljenih topil ter nastalih stranskih
produktov, hkrati pa nudijo možnost kontinuirnega delovanja, v zadnjem času zavzema vse več pozornosti. Prepletena nanovlakna predstavljajo prilagodljiv nosilec za imobilizacijo encimov v mikroreaktorje. Imajo veliko specifično površino z možnostjo funkcionalizacije, obenem pa zaradi velike poroznosti omogočajo skoraj nemoten transport snovi. V pričujočem delu smo izrazili in izolirali več amin transaminaz s heksahistidinskm (His6) označevalcem na različnih koncih proteina in brez njega ter primerjali njihovo imobilizacijo na prepletenih nanovlaknih z različnimi funkcionalnimi skupinami. Na nanovlaknih, na katere se je transaminaza vezala kovalentno, smo opazili veliko izgubo aktivnosti, medtem ko je koordinativna vezava preko His6 označevalca zadržala največ prvotne encimske aktivnosti. Poleg tega smo na izbranih prepletenih nanovlaknih uspešno izvedli koimobilizacijo kofaktorja encima.
Ključne besede: imobilizacija, amin transaminaza, mikropretočni sistemi, biotransformacija
Immobilization of transaminases on nanofiber mats in microreactors Abstract:
Enzyme catalysis allows for enantioselective reactions to be performed at low temperatures, mild pH and atmospheric pressure. Despite these advantages, the immobilization of enzymes is crucial for the economic viability of biocatalytic processes in industry. Immobilization ensures lower losses of expensive enzymes and at the same time can improve their stability under the conditions of industrial processes that deviate greatly from the natural environment of enzymes. The implementation of biocatalytic processes in microflow systems allows for high conversions with small amounts of solvents and by-products, due to good temperature regulation, fast mass transfer and low volume. At the same time microflow systems offer the possibility of continuous operation and have received much attention lately. Nanofiber mats represent a flexible carrier for the immobilization of enzymes in microreactors. They have a large specific surface with the possibility of functionalization and at the same time, due to their high porosity, they enable efficient mass transport. In this work, expression and isolation of several amine transaminases with and without hexahistidine (His6) tags at different ends of the protein was performed and compared regarding their immobilization efficiency on nanofiber mats with different functional groups. A large loss of enzyme activity was observed when transaminases were covalently bound to the nanofiber mat, while coordinate binding via His6 tag resulted in the highest retained enzyme activity. In addition, the cofactor co-immobilization on a selected nanofiber mat was successful.
Keywords: immobilization, amine transaminase, microfluidic systems, biotransformation
Kazalo
1 Pregled literature ... 1
1.1 Mikropretočni sistemi ... 1
1.2 Encimi ... 1
1.2.1 Amin transaminaze ... 2
1.3 Pridobivanje encimov ... 3
1.3.1 Indukcija izražanja encimov ... 3
1.3.2 Izolacija in čiščenje encimov ... 3
1.4 Imobilizacija encimov ... 4
1.4.1 Imobilizacija encimov na nanomaterialih... 5
1.4.2 Imobilizacija encimov na nanovlaknih ... 5
2 Namen dela ... 7
3 Eksperimentalni del ... 9
3.1 Material in oprema... 9
3.1.1 Kemikalije in drugi materiali ... 9
3.1.2 Naprave ... 11
3.1.3 Encimi ... 12
3.2 Pridobivanje encimov ... 13
3.2.1 Gojišče in založne raztopine za pripravo avtoindukcijskega gojišča ... 13
3.2.2 Transformacija celic ... 14
3.2.3 Izražanje encimov ... 14
3.2.4 Izolacija in čiščenje encimov ... 15
3.2.5 Analiza proteinov ... 16
3.3 Priprava raztopin za biotransformacije ... 17
3.3.1 Priprava založnih raztopin ... 17
3.3.2 Priprava raztopine encima ... 17
3.4 Imobilizacija encima na prepletena nanovlakna ... 18
3.4.1 Testiranje prepletenih nanovlaken v šaržnem procesu ... 18
3.5 Priprava mikroreaktorja ... 20
3.5.1 Imobilizacija encima in kofaktorja na prepletena nanovlakna v mikroreaktorju ... 21
3.6 Biotransformacija ... 23
3.6.1 Primerjava reakcije z eksogeno dodanim kofaktorjem in brez njega ... 23
3.6.2 Primerjava različnih encimov ... 24
3.6.3 Izračun izmerjene aktivnosti ... 25
3.7 Analizne metode ... 25
3.7.1 Določanje substrata in produkta reakcije ... 25
3.7.2 Izbira metode za določanje koncentracije proteinov ... 26
3.7.3 Določanje koncentracije proteina ... 28
3.7.4 Določanje aktivnosti encimov ... 28
4 Rezultati in razprava ... 31
4.1 Izražanje proteinov ... 31
4.1.1 Čistost encimov ... 31
4.1.2 Koncentracije proteinov v raztopinah encimov ... 32
4.2 Aktivnost encimov ... 33
4.2.1 Določanje aktivnosti ... 34
4.3 Izbor metode za določanje koncentracije proteinov ... 39
4.3.1 Primerjava linearnih območij ... 39
4.3.2 Priprava umeritvenih krivulj za določanje koncentracije proteina ... 42
4.4 Izbor prepletenih nanovlaken ... 43
4.4.1 Določanje mase imobiliziranega encima ... 44
4.4.2 Določanje izmerjene aktivnosti ... 45
4.5 Biotransformacije z imobiliziranim encimom v mikroreaktorju ... 47
4.5.1 Primerjava biotransformacije z eksogeno dodanim kofaktorjem PLP in brez njega 47 4.5.2 Primerjava imobilizacije različnih encimov ... 49
5 Zaključek ... 57
6 Literatura ... 59
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
A absorbanca
A205 absorbanca pri 205 nm A208 absorbanca pri 280 nm
ACP acetofenon (ang. acetophenone) Ael aktivnost v eluatu
Aim imobilizirana aktivnost Aiz izmerjena aktivnost
Apn površina koščka prepletenih nanovlaken
ATA amin transaminaza
APS amonijev persulfat (ang. ammonium persulfate) Az začetna aktivnost
BSA goveji serumski albumin (ang. bovine serum albumin)
C koncentracija
Ce koncentracija encima
Ck končna koncentracija encima
Cer koncentracija encima v reakcijski raztopini Cs koncentracija encima po spiranju
CT α-kimotripsin (ang. α-chymotrypsin)
Cz začetna koncentracija encima
dH20 demineralizirana voda
DNA deoksiribonukleinska kislina (ang: deoxyribonucleic acid) His6 heksahistidinski označevalec (ang. hexahistidine tag)
HPLC visoko-zmogljivostna tekočinska kromatografija (ang. high- performance liquid chromatography)
IMAC afinitetna kromatografija z imobiliziranimi kovinami (ang. immobilized metal-affinity chromatography)
IPTG izopropil-β-D-tiogalaktozid (ang. isopropyl-β-D-thiogalactoside) L-ALA L-alanin (ang. L-alanine)
LB lizogeni bujon(ang. lysogeny broth) LBA lizogeni bujon z dodanim ampicilinom
MBA (S)-(-)-α-metilbenzilamin (ang. (S)-(-)-α-methylbenzylamine) mim masa imobiliziranega encima
PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza
PLP piridoksal-5-fosfat (ang. pyridoxal-5-phosphate) PMMA Polimetilmetakrilat (ang. poly(methyl methacrylate) PYR piruvat (ang. pyruvate)
r faktor redčenja
RNA ribonukleinska kislina (ang. ribonucleic acid) NaDS natrijev dodecilsulfat (ang. sodium dodecyl sulfate)
SA specifična aktivnost
std standard
UV-Vis ultravijolična in vidna svetloba
Ve volumen encima
Vel volumen eluata
Vk končni volumen
Vr reakcijski volumen Vre volumen reaktorja Vs volumen po spiranju Vz začetni volumen
Ε učinkovitost imobilizacije
ρp površinska gostota imobiliziranega proteina
τ zadrževalni čas
1
1 Pregled literature
1.1 Mikropretočni sistemi
V zadnjih desetletjih je tehnologija mikroreaktorjev in ostalih mikrofluidnih naprav zelo napredovala. V mnogih aplikacijah so bolj učinkoviti kot šaržni reaktorji in pogosto tudi bolj kot tradicionalni pretočni reaktorji. Med prednosti, ki jih s svojo majhnostjo omogočajo mikroreaktorji, sodi izboljšan nadzor temperature ter prenosa toplote in snovi, kar vodi do boljše stabilnosti procesa, manjše porabe energije in večje homogenosti.
Najpreprostejši mikroreaktorji so cevke z notranjim premerom, manjšim od 1 mm, danes pa so mikroreaktorji zelo napredne naprave, zasnovane za specifično uporabo [1].
Moderni mikrokapilarni reaktorji so izdelani iz cevk iz silicijevega stekla, nerjavečega železa ali polimerov, kot je na primer polivinilklorid. Zaradi majhnih dimenzij takšni reaktorji omogočajo izvrsten nadzor nad temperaturo s pomočjo preprostih vodnih ali oljnih kopeli. Druga pogosta vrsta mikropretočnih sistemov se imenuje Lab-on-a-chip, ta je v obliki čipa z mnogimi kanali. S pravilnim načrtovanjem takšnih mikroreaktorjev lahko na enem mikročipu integriramo več stopenj procesa. Takšni sistemi so lahko izdelani iz silicija, polimerov ali kovin [2].
1.2 Encimi
Velika večina encimov je globularnih proteinov, ki katalizirajo biološko pomembne reakcije in omogočajo nemoten potek metabolizma [3]. Glavna prednost encimov v primerjavi z anorganskimi katalizatorji je, da običajno katalizirajo reakcije pri milih pogojih, nizkih temperaturah, nevtralnem pH in običajnem tlaku. Poleg tega so encimske katalize pogosto visoko enantioselektivne in regioselektivne [4] Glede na reakcije, ki jih katalizirajo, jih delimo v sedem skupin: oksidoreduktaze, transferaze, hidrolaze, liaze, izomeraze, ligaze in translokaze [3, 4, 5].
Za delovanje encimov je ključna njihova nativna konformacija. Celotnemu encimu s kofaktorjem rečemo holoencim. Kofaktor je lahko kovinski ion, metalo-organska spojina ali kompleksna organska spojina. Če je kofaktor zelo stabilno ali celo kovalentno vezan, mu rečemo tudi prostetična skupina [3].
Katalitska reakcija poteka v aktivnem mestu encima, kjer se nahajajo aminokislinski ostanki, ki tvorijo interakcije s substratom in na ta način znižujejo aktivacijsko energijo reakcije [3].
2
1.2.1 Amin transaminaze
Amin transaminaze (ATA) so podskupina ω-transaminaz, ki so podskupina transaminaz [6].
Transaminaze so skupina encimov, ki katalizirajo reakcijo prenosa amino skupine iz amin donorja na amin akceptor oziroma na molekulo s karbonilno skupino. Spadajo med encime, odvisne od piridoksal-5-fosfata (PLP, ang. pyridoxal-5'-phosphate). Glede na pozicijo prenesene amino skupine se delijo na α-transaminaze in ω-transaminaze. α- transaminaze amino skupino prenesejo na α-ogljik, medtem ko lahko ω-transaminaze kot amin akceptor uporabljajo molekule, ki imajo karbonilno skupino na drugih, bolj oddaljenih mestih [6, 7].
1.2.1.1 Uporabljene amin transaminaze
Uporabljali smo tetramerni encim divjega tipa ATA-wt, ki je bil pridobljen iz metagenomske knjižnice podjetja c-LEcta (Nemčija) in ima 92 odstotno ujemanje sekvence z amin transaminazo iz Pseudomonas mandelii. Polega tega encima smo uporabljali tudi njegovo mutanto ATA-v1, ki vsebuje dve mutaciji, Asn161Ile in Tyr164Leu. Zaradi teh mutacij je ATA-v1 bolj odporna proti povišanim temperaturam in organskim topilom, kot je na primer n-heptan. Optimalna obratovalna temperatura za modelno biotransformacijo se je pri tej mutanti tako dvignila s 40 na 50 °C. Encimi, ki smo jih uporabljali, so vsebovali His6 [6, 8, 9].
1.2.1.2 Modelna reakcija
Za opazovanje in vrednotenje uporabljenih encimov smo uporabili modelno reakcijo, pri kateri se (S)-(-)-α-metilbenzilamin (MBA) in piruvat (PYR, ang. pyruvate) pretvorita v L-alanin (L-ALA) in acetofenon (ACP, ang. acetophenone) (slika 1) [6].
Slika 1: Modelna reakcija za vrednotenje uporabljenih ATA [6].
3
1.3 Pridobivanje encimov
1.3.1 Indukcija izražanja encimov
Za izražanje želenih proteinov iz rekombinantnih plazmidov v gostiteljskih celicah bakterije Escherichia coli se pogosto uporablja prepisovanje s T7 RNA polimerazo, katere izražanje se inducira z izopropil-β-D-tiogalaktozido (IPTG). DNA, ki kodira želeni protein, je na plazmidu pod kontrolo T7 promotorja in se zato prepisuje ob prisotnosti IPTG, kar vodi v proizvodnjo želenega proteina. T7 RNA polimeraza je zelo aktivna in selektivna, zato je količina tarčne RNA lahko tudi enaka količini ribosomske RNA.
Posledično so tudi koncentracije tarčnega proteina precej velike [10]. Namesto indukcije z IPTG lahko uporabimo avtoindukcijo. To je proces, ki temelji na delovanju regulatornih elementov laktoznega operona ob prisotnosti glukoze, glicerola in laktoze. Laktozni operon je potreben za presnovo laktoze. Med prvo fazo rasti se prioritetno porablja glukoza, zaradi česar je metabolna pot za presnovo laktoze zavirana. Ko začne primanjkovati glukoze, začne celica vnašati in porabljati laktozo in glicerol. V tem procesu se tvori alolaktoza, ki deluje kot induktor proizvodnje T7 RNA polimeraze [11].
1.3.2 Izolacija in čiščenje encimov
1.3.2.1 Afinitetna kromatografija z imobiliziranimi kovinami
Afinitetna kromatografija z imobiliziranimi kovinami (IMAC, ang. immobilized metal- affinity chromatography) je metoda, s katero lahko očistimo proteine, s His6. Temelji na interakciji med negativno nabitimi histidini in pozitivnimi ioni (Cu2+, Ni2+, Co2+), ki so imobilizirani v koloni. Vezane proteine lahko selektivno eluiramo s kolone s spremembo pH ali pa s povečanjem koncentracije imidazola [12].
Če želimo očistiti proteine, ki vsebujejo kovinske ione, je bolje uporabiti drugačno metodo, kot je IMAC, saj se ti kovinski ioni lahko adsorbirajo na kolono [12].
1.3.2.2 Poliakrilamidna gelska elektroforeza ob prisotnosti natrijevega dodeclisulfata Poliakrilamidna gelska elektroforeza (PAGE) je proces, v katerem se proteini v gelu pomikajo pod vplivom električnega polja. Poliakrilamidni gel je narejen s polimerizacijo akrilamida ob dodatku premreževalca bisakrilamida. Gele običajno označujemo z odstotkom, ki se nanaša na vsebnost akrilamida in bisakrilamida. Običajno se uporabljajo geli, ki vsebujejo od 7 do 15 odstotkov akrilamida, manj akrilamida pomeni, da imajo geli večje pore, zaradi česar molekule skozenj potujejo hitreje. Hitrost gibanja proteinov v gelu je odvisna od naboja proteina in njegove velikosti [13].
4
Natrijev dodecilsulfat (NaDS) je anionski detergent, ki denaturira proteine ter s tem poruši njihovo sekundarno, terciarno in kvartarno zgradbo [14]. Stabilnost proteina ob prisotnosti NaDS je odvisna od strukture. Oligomerni proteini z β-ploskvami so denimo bolj odporni proti denaturaciji [15]. Poleg tega se NaDS veže na hidrofobne regije aminokislinske verige in s tem povzroči negativen celokupen naboj proteina, zaradi česar je ob prisotnosti NaDS gibanje molekul pod vplivom električnega polja odvisno samo od velikosti proteinov [14].
1.4 Imobilizacija encimov
Kljub mnogim prednostim, ki jih imajo encimi v primerjavi s tradicionalnimi katalizatorji, je na področju biotransformacij v industriji še nekaj izzivov. V primerjavi z običajnimi katalizatorji so encimi običajno dragi, zaradi stroškov čiščenja in izolacije [16]. Za industrijsko uporabo encimov je poleg tega ključno tudi to, da se encimom poveča odpornost proti zunanjim dejavnikom kot so temperatura, pH in ionska moč.
Izboljšanje odpornosti proti tem dejavnikom lahko dosežemo z imobilizacijo [17].
Metode za imobilizacijo encimov v grobem razdelimo na štiri pristope: adsorpcijo encimov, ujetje encimov, kovalentno vezavo in bioafinitetne interakcije. Pri adsorpciji encimov gre za nekovalentno vezavo, ki je pogosto šibka in reverzibilna. V ta namen se najpogosteje uporabljajo tehnike, kot so pasivna adsorpcija na hidrofobne površine in elektrostatske interakcije z nabitimi površinami. Za namen fizičnega ujetja se na primer uporablja ujetje v sol-gel ali ujetje v lipidne vezikle. Prednost inkapsulacije encimov je, da se njihova struktura dobro ohrani. Kovalentna vezava omogoča močno vezavo encima preko funkcionalnih skupin nanjegovi površini. Tako vezava poteka preko stranskih skupin, kot sta lizin in cistein. Slabost kovalentne vezave encima je, da se lahko encim veže v naključnih orientacijah, kar lahko vodi do zmanjšanja aktivnosti. Pri vezavi z afinitetno interakcijo gre za interakcije protein-protein ali protein-majhna molekula, ki so zelo specifične. Najbolj poznana med takšnimi interakcijami se tvori med His6 in kovinami prehoda, kot so baker(II), kobalt(II), cink(II) in nikelj(II). Takšen način imobilizacije se pogosto uporablja tudi za začasno vezavo encimov med procesom čiščenja [16].
Za pravilno vrednotenje uspešnosti imobilizacije so pomembne tudi naslednje definicije.
Enačba 1 opisuje izračun izkoristka imobilizacije [18]:
𝑖𝑧𝑘𝑜𝑟𝑖𝑠𝑡𝑒𝑘 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑒 [%] = 𝐴𝑖𝑚
𝐴𝑧 ∗ 100 , (1)
5
pri čemer začetna aktivnost (Aim) predstavlja celotno aktivnost uporabljene količine encima pred začetkom imobilizacije, imobilizirana aktivnost (Az) pa razliko med začetno aktivnostjo in aktivnostjo, ki ostane neimobilizirana. Enačba 2 prikazuje izračun učinkovitosti imobilizacije [18]:
𝑢č𝑖𝑘𝑜𝑣𝑖𝑡𝑜𝑠𝑡 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑒 (𝜀)[%] =𝐴𝑖𝑧
𝐴𝑖𝑚∗ 100 , (2)
kjer je izmerjena aktivnost (Aiz) dejanska aktivnosti imobiliziranega encima.
Enačba 3 se uporablja za izračun zadržane aktivnosti [18]:
𝑧𝑎𝑑𝑟ž𝑎𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 [%] =𝐴𝑖𝑧
𝐴𝑧 ∗ 100, (3)
1.4.1 Imobilizacija encimov na nanomaterialih
Pogost zaplet pri uporabi imobiliziranih encimov v industriji je nizka biokatalitska učinkovitost. Neporozni nosilci z na površini imobiliziranimi encimi omogočajo precej neomejen prenos substrata do encimov, vendar pa je količina encima, ki ga lahko na tak način imobiliziramo, precej nizka. Ravno nasprotno lahko opazimo pri poroznih nosilcih, ki omogočajo imobilizacijo velikih količin encima, vendar pa je transport substrata in produkta v porah omejen. Z manjšanjem velikosti nosilnih elementov lahko izboljšamo učinkovitost imobiliziranih encimov. Nanostrukturne nosilce za imobilizacijo lahko razdelimo na nanodelce, nanovlakna, mezoporozno siliko, encime, inkapsulirane v sol- gel, in nanodelce s posamičnim encimom [19].
1.4.2 Imobilizacija encimov na nanovlaknih
Nanovlakna, pridobljena iz polimerov z elektrosukanjem, predstavljajo perspektiven material za imobilizacijo encimov. Njihove prednosti so, da so lahko izdelana iz mnogih različnih polimerov, s čimer jih lahko prilagajamo različnim namenom uporabe. Zaradi vlaknaste mikrostrukture imajo veliko poroznost, ki ne omejuje transporta snovi do in od encima. Njihovo površino se da funkcionalizirati ali modificirati na tak način, da se ohranja čim večja aktivnost encima. Nanovlakna se pogosto oblikujejo v tanke plasti prepletenih vlaken oziroma nanomembran, ki jih nato laže uporabimo [20].
Jia s sodelavci [21] je na nanovlaknih iz polistirena imobilizirala α-kimotripsin (CT). Po kovalentni vezavi se encim ni spiral. Določili pa so, da masa na nanovlaknih vezanega encima znaša 1,4 odstotka mase nanovlaken. Na nanovlaknih z velikostjo 120 nm je to pomenilo monoplast encima, ki je prekrival 27,4 odstotka površine nanovlaken [21].
6
Količino imobiliziranega encima se da povečati tako, da ga na površini nanovlaken premrežimo, kot je to storil Kim s sodelavci [22]. Na vlakna so najprej kovalentno imobilizirali CT, nato pa med procesom dodali glutaraldehid. Tako se je del encima kovalentno vezal na nanovlakna, del pa se je nato z glutaraldehidom premrežil in naredil oblogo, podobno premreženim encimskim agregatom. Aktivnost na nanovlaknih z oblogo iz premreženih encimov je bila osemkrat večja kot aktivnost na nanovlaknih s kovalentno vezanimi encimi, kar je najverjetneje posledica večje količine imobiliziranega encima [22].
7
2 Namen dela
Namen magistrskega dela je bil imobilizirati izbrane encime na prepletena nanovlakna in pridobiti podatke o učinkovitosti imobilizacije. V ta namen sem uporabil različne amin transaminaze s heksahistidinskimi označevalci - modificirana nativna encima N-His6-ATA-wt in C-His6-ATA-wt, ter gensko spremenjeni različici ATA-v1 in N-His6-ATA-v1. ATA-v1 smo pridobili od proizvajalca v liofilizirani obliki, preostale tri pa sem s pomočjo pridobljenih plazmidov izrazil v bakteriji E. coli BL21(DE3).
Cilj raziskovalnega dela je bil primerjati učinkovitost imobilizacije amin transaminaz na prepletenih nanovlaknih z različnimi funkcionalnimi skupinami. V ta namen sem uporabil Tiss-Link in Tiss-NH2, na katera se encim lahko veže kovalentno, ter Tiss-IMAC-Cu, na katerega se encim veže kovalentno preko koordinacijske vezi med histidini in bakrovimi atomi. Poleg tega sem želel koimobilizirati tudi kofaktor PLP, učinkovitost koimobilizacije pa sem želel preveriti z biotransformacijo ob prisotnosti eksogeno dodanega kofaktorja PLP in brez njegove prisotnosti.
Aktivnost encima sem spremljal s pomočjo reakcije, v kateri se MBA in PYR pretvorita v ACP in L-ALA.
9
3 Eksperimentalni del
3.1 Material in oprema
3.1.1 Kemikalije in drugi materiali
Kemikalije uporabljene za izražanje encimov:
• 40 % akrilamid/bisakrilamid (Sigma-Aldrich)
• Amonijev persulfat (APS) (Serva)
• Ampicilin (Fischer BioReagents)
• Dinatrijev hidrogen fosfat (Merck)
• Dinatrijev sulfat (Fluka)
• Glicerol (Fisher Chemical)
• Glukoza monohidrat (Sigma-Aldrich)
• Imidazol (Sigma-Aldrich)
• Kalijev dihidrogenfosfat (Gram-Mol)
• Kazeinski hidrolizat pepton (Sigma-Aldrich)
• Kvasni ekstrakt (Biolife)
• Magnezijev sulfat hidrat (Honeywell Fluka)
• Natrijev dodecilsulfat (NaDS) (Sigma-Aldrich)
• Natrijev klorid (Gram-Mol)
• Piridoksal-5-fosfat (PLP) (Sigma-Aldrich)
• Plazmid za izražanje encima C-His6-ATA-wt (dr. James L. Galman, Univerza v Manchestru)
10
• Plazmid za izražanje encima N-His6-ATA-wt (dr. James L. Galman, Univerza v Manchestr)
• Plazmid za izražanje encima N-His6-ATA-v1 (dr. James L. Galman, Univerza v Manchestru)
• Standard za NaDS-PAGE - Pierce™ Unstained Protein MW Marker (Thermo Fisher)
• TEMED (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)
• Tris(hidroksimetil)amino metan (Sigma-Aldrich)
• α-laktoza monohidrat (Sigma)
Kemikalije uporabljene za biotransformacije:
• Acetonitril (≥99,9 %, Honeywell)
• Acetofenon (ACP) (99 %, Sigma-Aldrich)
• Dinatrijev hidrogen fosfat (Merck
• (S)-(-)-α-metilbenzilamin (MBA) (≥99,0 %, Sigma-Aldrich)
• Natrijev dihidrogen fosfat monohidrat (Merck)
• Natrijev hidroksid (Sigma-Aldrich)
• Piridoksal-5-fosfat (PLP) (≥97,0 %, Sigma-Aldrich)
• Piruvat (PYR) (≥99,0 %, Sigma-Aldrich)
• 2-propanol (≥99,8 %, Sigma-Aldrich) Drug uporabljen material:
• Centrifugirni filtri – Amicon Ultra - 4 (1000 MWCO, Merck Millipore)
• Prepletena nanovlakna – Tiss-IMAC_Cu (NanoMyP)
• Prepletena nanovlakna – Tiss-Link (NanoMyP)
11
• Prepletena nanovlakna – Tiss-NH2 (NanoMyP)
• PFA cevke (Zunanji premer: 1/16 inča, Notranji premer: 0,25 mm, Vici)
3.1.2 Naprave
Uporabljene naprave:
• Centrifuga – Centifuge 5810 R (Eppendorf, Nemčija)
• Centrifuga – Sorvall RC 6+ Centrifuge (Thermo Scientific, ZDA)
• Grelni blok – Mini dry bath (STAR LAB, Velika Britanija)
• HPLC kolona – Gemini 3 µm NX-C18 110 Å (Phenomenex, ZDA)
• IMAC kolona – His Trap FF 1 mL (Cytiva, ZDA)
• Injekcijska črpalka – PHD 4400 (Harvard Apparatus, ZDA)
• Kad za NaDS-PAGE – Mini Gel Tank, Invitrogen (Thermo Fischer, ZDA)
• Magnetno mešalo s temperaturno kontrolo – RCT Basic in EST-D5 (IKA, Nemčija)
• Peristaltična črpalka – FH30 (Thermo Scientific, ZDA)
• Peristaltična črpalka – PP 10 (vwr, Indija)
• Sistem za slikanje NaDS-PAGE gelov – ChemiDoc MP Imaging System (Bio- Rad, ZDA)
• Stresalnik -MaxQ 4000 (Thermo Scientific, ZDA)
• Stresalnik s temperaturno kontrolo (SANYO, Japonska)
• Stresalnik s temperaturno kontrolo – Innova 4230 (New Brunswick scientific, ZDA)
12
• Ultrazvočni procesor – UP100H ( Hielscher, Nemčija)
• UV-VIS spektrofotometer – UV-2600 (Shimadzu, Japonska)
• Vir za NaDS-PAGE – MightySlim SX250 power suply (Hoefer, ZDA)
• Visoko-zmogljivostni tekočinski kromatograf (ang. high-performance liquid chromatography - HPLC) (Shimadzu, Japonska)
• Vorteks mešalo – VIBROMIX 204 EV (Tehtnica Železniki, Slovenija) 3.1.3 Encimi
Za biotransformacijo smo uporabili več različnih encimov, ki so našteti spodaj. Encimi, ki smo jih izrazili sami, so bili do uporabe shranjeni v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8,0 in 0,1 mM PLP pri – 20 °C. Encim ATA-v1 je bil shranjen v liofilizirani obliki pri – 20
°C.
Uporabljeni encimi:
• ATA-v1, lot: LH-a-0002 (liofiliziran encim, c-LEcta, Nemčija) (ATA-v1)
• ATA-v1 s His6 označevalcem na N koncu (N-His6-ATA-v1)
• ATA-wt s His6 označevalcem na N koncu (N-His6-ATA-wt)
• ATA-wt s His6 označevalcem na C koncu iz prve šarže (C-His6-ATA-wt-n1)
• ATA-wt s His6 označevalcem na C koncu iz druge šarže (C-His6-ATA-wt-n2)
13
3.2 Pridobivanje encimov
3.2.1 Gojišče in založne raztopine za pripravo avtoindukcijskega gojišča
V procesu transformacije, pri pripravi prekonočnih kultur in pri izražanju encimov v bakterijskih celicah smo uporabili tekoči gojišči LB in LBA. Pred uporabo je bilo gojišče LB avtoklavirano, gojišče LBA pa je bilo pripravljeno iz avtoklaviranega gojišča LB.
Njuna sestava je podana v tabeli 1.
Tabela 1: Sestava tekočih gojišč LB in LBA.
Gojišče Sestavine za pripravo 1 L tekočega gojišča
LB 10 g NaCl
10 g kazeinskega hidrolizata 5,0 g kvasnega ekstrakta
LBA Tekoče LB gojišče s 100 µg/mL ampicilina
Za izražanje encima v bakterijskih celicah smo uporabili tudi založne raztopine 50× M, 50× 5052 in 1 M MgSO4 [10]. Raztopini 50× M in 1 M MgSO4 sta bili avtoklavirani, raztopina 50× 5052 pa je bila sterilno filtrirana z 0,2 µm poroznim filtrom. Sestave založnih raztopin so podane v tabeli 2 [23].
14
Tabela 2: Sestava založnih raztopin za avtoindukcijsko gojišče [23].
Spojina Masa [g]
Sestava 1 M MgSO4 (100 mL) MgSO4 24,65
dH2O 87
Sestava 50× M (100 mL) Na2HPO4 17,75
KH2PO4 17
NH4Cl 13,4
Na2SO4 3,55
dH2O 80
Sestava 50× 5052 (100 mL) Glicerol 25
Glukoza 2,5
α-laktoza monohidrat 10
dH2O 73
3.2.2 Transformacija celic
Transformacijo smo izvajali s temperaturnim šokom. Najprej smo na ledu odtajali 100 µL kompetentnih celic bakterije E. coli BL21(DE3). Ko so se odtalile, smo jim dodali 2 µL plazmida ter celice 30 min pustili na ledu. Nato smo celice za 45 sekund izpostavili temperaturi 42 °C tako, da smo epico s celicami in plazmidom vstavili v grelni blok.
Celice smo nato 2 minuti pustili na ledu, da ni prišlo do dodatnih poškodb, nato pa smo dodali 400 µL gojišča LB ter inkubirali 1 uro pri 37 °C in stresanju pri 180 min-1. Za pripravo prekonočne kulture smo 200 µL kulture prenesli v 3 mL LBA gojišča v epruveti in inkubirali preko noči pri temperaturi 37 °C in stresanju s 180 min-1.
3.2.3 Izražanje encimov
Encime smo izražali z avtoindukcijo.
15
V 400 mL LB gojišča smo dodali 8 mL raztopine 50× M, 8 mL raztopine 50× 5052, 800 µL raztopine 1 M MgSO4, 400 µL raztopine ampicilina s koncentracijo 100 mg/mL in 1000 µL prekonočne kulture. Tako pripravljeno celično kulturo smo 4 ure inkubirali v sterilni 2 L erlenmajerici pri temperaturi 37 °C in stresanju s 180 obrati na minuto. Nato smo temperaturo znižali na 16 °C in pustili, da se kultura z enako frekvenco stresa preko noči.
3.2.4 Izolacija in čiščenje encimov
Za vezavo, spiranje in elucijo proteinov smo uporabili pufre, ki so vsebovali 50 mM TRIS-HCl, 0,1 mM PLP s pH 7,4 in različne koncentracije imidazola. V pufru za vezavo je bila koncentracija imidazola 5 mM, v pufru za spiranje 30 mM in v elucijskem pufru 250 mM.
Kulturo smo po izražanju encimov najprej 10 min centrifugirali pri 5000 rcf. Po centrifugiranju smo supernatant odlili, celice pa resuspendirali v približno 20 mL pufra za vezavo. Nato smo celice sonificirali trikrat po 5 min pri 80 odstotni amplitudi in ciklu, sestavljenem iz 0,8 s sonifikacije in 0,2 s premora. Pred drugim in tretjim sonificiranjem se je raztopina 5 min hladila na ledu. Med sonificiranjem je bila raztopina v ledeni kopeli.
Po lizi smo raztopino 30 min centrifugirali pri 25000 rcf ter obdržali supernatant, ki smo ga nato nanesli na IMAC kolono His Trap FF.
Kolono za čiščenje proteinov smo s pomočjo peristaltične črpalke najprej sprali s približno 10 mL demineralizirane vode. Nato smo jo sprali še s približno 10 mL pufra za vezavo. Temu je sledilo nanašanje supernatanta. Kolono smo po nanosu sprali s približno 10 mL pufra za spiranje. Za elucijo encimov smo pripravili 8 mikrocentrifugirk. Ko smo kolono začeli spirati z elucijskim pufrom, smo v vsako epico ujeli približno 0,5 mL raztopine. Med celotnim procesom čiščenja na koloni je bil pretok tak, da je iz kolone pritekla približno ena kapljica na sekundo.
Očiščene encime smo nato še skoncentrirali in prenesli v 20 mM fosfatni pufer s pH 8 in 0,1 mM PLP. Elucijske frakcije smo iz mikrocentrifugirk prelili v centrifugirni filter ter 7 min centrifugirali pri 6000 rcf, tako da je ostalo približno 0,5 do 1 mL. Nato smo dolili približno 2 do 2,5 mL 20 mM fosfatnega pufra s pH 8 in 0,1 mM PLP ter ponovno centrifugirali. Ta korak smo ponovili petkrat, nato pa smo raztopino centrifugirali pri 6000 rcf toliko časa, da je ostalo približno 0,5 mL raztopine.
Tako dobljeni encim smo nato shranili v 1,5 mL mikrocentrifugirkah. Alikvotirali smo po 100 µL raztopine.
16
3.2.5 Analiza proteinov
Izolirane encime smo analizirali z poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti NaDS (NaDS-PAGE). Pri analizi smo uporabili natrijev dodecilsulfat, ki denaturira proteine in povzroči, da je njihov naboj negativen, zaradi česar v električnem polju vsi potujejo proti pozitivno nabiti elektrodi. Za izvedbo NaDS-PAGE smo uporabili gele, sestavljene iz 5 % koncentracijskega gela in 12,5 % ločevalnega gela (sestava je podana v tabeli 3) [23].
Tabela 3: Sestava gela za NaDS-PAGE [23].
Sestava ločevalnega gela (12,5 %) [mL]
Sestava
koncentracijskega gela (5%) [mL]
4× pufer za ločevalni gel
(1,5 M Tris, pH 8,8) 2,5 /
4× pufer za
koncentracijski gel (0,5 M Tris, pH 6,8)
/ 2,5
dH2O 4,27 6,15
Akrilamid/bis-akrilamid (37:1)
3,13 1,25
10 % (w/v) APS 30 30
10 % (w/v) NaDS 0,100 0,100
TEMED 0,015 0,015
Skupaj 10 10
K 1 µL očiščenega in skoncentriranega encima smo dodali 11 µL dH2O vode in 3 µL 5× nanašalnega pufra za NaDS-PAGE. Nato smo vzorce pred nanosom na gel 10 minut segrevali pri 95 °C [23].
Iz gela smo odstranili glavničke in ga prenesli v kad za NaDS-PAGE ter do oznake nalili 1-kraten pufer za NaDS-PAGE. V žepke smo nato nanesli vzorce in standard, kad pokrili s pokrovom in nastavili tok 35 mA. Tok smo izključili, ko je barvilo iz nanašalnega pufra doseglo rob gela [23].
17
Gele smo nato 30 min barvali z rahlim stresanjem v barvalni raztopini, katere sestava je predstavljena v tabeli 4. Temu je sledilo še razbarvanje v raztopini s 30 % v/v etanola in 10 % v/v ocetne kisline, ki je trajalo 30 min oziroma dokler se geli niso dovolj razbarvali.
Gele smo nato slikali [23].
Tabela 4: Sestava barvalne raztopine [23].
Kemikalija Količina
Coomassie Brilliant Blue R-250 125 mg
ocetna kislina 35 mL
etanol 150 mL
dH2O do 500 mL
3.3 Priprava raztopin za biotransformacije
3.3.1 Priprava založnih raztopin
Za pripravo reakcijskih raztopin smo uporabili založne raztopine: 200 mM raztopino MBA, 500 mM raztopino PYR in 5 mM raztopino PLP. Raztopine smo pripravili tako, da smo kemikalijo raztopili v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8 ter ponovno uravnali njen pH na 8 z NaOH in H3PO4 ter dodali pufer do želenega volumna.
3.3.2 Priprava raztopine encima
Za biotransformacije smo uporabljali raztopine encima, ki smo jih pripravili po naslednjem postopku.
Encim ATA-v1 smo zatehtali in ga raztopili v želeni količini 20 mM fosfatnega pufra s pH 8 ter ga ob konstantnem mešanju 30 min rehidrirali pri sobni temperaturi.
Koncentracija je bila odvisna od posamičnega poskusa.
Ostale encime, ki so se že nahajali v raztopini, smo vzeli iz zmrzovalnika (- 20°C) in jih odtajali ter nato uporabili.
18
3.4 Imobilizacija encima na prepletena nanovlakna
3.4.1 Testiranje prepletenih nanovlaken v šaržnem procesu
Z namenom izbora prepletenih nanovlaken, na katerih je učinkovitost imobilizacije največja, smo testirali tri različno funkcionalizirana prepletena nanovlakna: Tiss-Link, Tiss-NH2 in Tiss-IMAC-Cu; slednja je prikazana na sliki 2. Pri prvih dveh pride do kovalentne vezi med encimom in prepletenimi nanovlakni, pri zadnji pa imobilizacija poteka preko koordinacijske vezi med histidinom in kovinskim ionom na površini prepletenih nanovlaken. Imobilizacijo smo izvajali pri 4 °C z encimom C-His6-ATA-wt-n2.
Slika 2. Prepletena nanovlakna Tiss-IMAC-Cu.
Optimalna prepletena nanovlakna smo izbrali po naslednjem postopku: encim smo razredčili z 20 mM fosfatnim pufrom s pH 8 do koncentracije 400 µg/mL ter izmerili
19
absorbanco pri valovni dolžini 280 nm (A280). Nato smo v epice odpipetirali po 600 µL raztopine in vanjo dodali košček prepletenih nanovlaken, katerih površino smo pred tem izmerili. Nato smo epice 20 ur (preko noči) stresali pri 300 min-1 in temperaturi 4 °C. Po končani imobilizaciji smo prepletena nanovlakna prestavili v drugo epico, ki je vsebovala 500 µL 20 mM fosfatnega pufra s pH 8, in jo pri enakih pogojih stresali še 30 min, da se je nevezani encim spral s prepletenih nanovlaken. Po končanem eksperimentu smo s pomočjo A280 določili koncentracijo encima v raztopinah po imobilizaciji ter s pomočjo absorbance pri 205 nm (A205) še koncentracije, ki so ostale v raztopinah za spiranje. S pomočjo koncentracije v raztopinah smo določili maso imobiliziranega encima na koščkih prepletenih nanovlaken in imobilizirano aktivnost. Enačba 4 prikazuje izračun mase imobiliziranega encima:
𝑚𝑖𝑚 = 𝐶𝑧∗ 𝑉𝑧− 𝐶𝑘∗ 𝑉𝑘− 𝐶𝑠∗ 𝑉𝑠, (4) V enačbi mim predstavlja maso imobiliziranega encima, Cz in Vz predstavljata začetno koncentracijo in volumen, Ck in Vk predstavljata končno koncentracijo in volumen, Cs in Vs pa predstavljata koncentracijo in volumen po spiranju. Nato smo iz mim in površine koščka prepletenih nanovlaken (Apn) izračunali še površinsko gostoto imobiliziranih proteinov (ρp), kar prikazuje enačba 5:
𝜌𝑝 = 𝑚𝑖𝑚
𝐴𝑝𝑛, (5)
Določitev izmerjene aktivnosti smo izvedli s pomočjo šaržnih aktivnostnih testov s skupnim volumnom 5 mL. Reakcijsko raztopino smo pripravili iz 3,5 mL 20 mM fosfatnega pufra s pH 8, 1 mL založne raztopine MBA, 0,4 mL založne raztopine PYR in 100 µL založne raztopine PLP, tako da so bile končne koncentracije 40 mM MBA in PYR ter 0,1 mM PLP v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8.
Biotransformacijo smo izvajali v epruvetah, potopljenih v vodno kopel s 30 °C, in z mešanjem pri 200 min-1. V reakcijsko raztopino smo potopili košček prepletenih nanovlaken in nato vzorčili 0,2 mL po 2,5, 5, 10, 20 in 30 minutah. Vzorcem smo takoj dodali 0,8 mL 0,1 M NaOH, s katerim smo zaustavili reakcijo. Vzorce smo nato analizirali na HPLC po postopku, opisanem v poglavju 3.7.1.
Izmerjeno aktivnosti (Aiz) smo izračunali iz reakcijskega volumna (Vr) in naklona v območju linearne odvisnosti na grafu koncentracije ACP v odvisnosti od časa.
Imobilizirano aktivnost (Aim) pa smo izračunali iz mase imobiliziranega encima (mim) in specifične aktivnosti encima (Ae). Enačba 6 prikazuje izračun izmerjene aktivnsoti encima pri šaržnemdoločanju aktivnosti:
𝐴𝑖𝑧 = 𝑛𝑎𝑘𝑙𝑜𝑛 𝑝𝑟𝑒𝑚𝑖𝑐𝑒 ∗ 𝑉𝑟, (6)
20
Enačba 7 prikazuje izračun imobilizirane aktivnosti pri šaržnem določanju aktivnosti na nanotkaninah:
𝐴𝑖𝑚 = 𝑚𝑖𝑚∗ 𝑆𝐴, (7)
3.5 Priprava mikroreaktorja
Biotransformacije z imobiliziranim encimom smo izvajali v mikropretočnem reaktorju, ki je prikazan na sliki 3. Mikroreaktor je bil sestavljen iz dveh plošč iz polimetilmetakrilata (PMMA), med kateri je bil stisnjen teflonski distančnik debeline 200 µm, v katerega je bila z laserjem vrezana oblika kanala. Na spodnjo PMMA ploščo je bil prilepljen kos prepletenih nanovlaken enake oblike kot kanal mikroreaktorja. V zgornji plošči sta izvrtani luknji za priklop cevk. Mikroreaktor je bil 200 µm globok, 10 mm širok, njegova površina pa je znašala 350 mm2. Teoretični volumen praznega reaktorja je znašal 70 µL.
Slika 3: Sestavljeni reaktor z zaprtimi luknjami za priklop cevk.
21
3.5.1 Imobilizacija encima in kofaktorja na prepletena nanovlakna v mikroreaktorju 3.5.1.1 Priprava reaktorja za poskus z eksogeno dodanim kofaktorja in brez njega Z namenom primerjave reakcije z dodanim kofaktorjem in brez dodanega kofaktorja smo polnili odprt reaktor. Reaktor smo brez zgornje plošče položili v eksikator in vanj odpipetirali 70 µL raztopine z encimom, kot je prikazano na sliki 4. Nato smo eksikator zaprli in počakali toliko, da se je gladina raztopine spustila pod rob teflonskega distančnika. Pri tem je bilo zelo pomembno, da se reaktor ni posušil, saj bi to lahko močno vplivalo na aktivnost encima. Nato smo reaktor pokrili še z zgornjo ploščo in ga stisnili toliko, da je dobro zatesnil. Obe luknji smo zaprli s čepi in ga preko noči pustili v hladilniku na 4 °C.
Slika 4: Odprt mikroreaktor z nanešeno raztopino encima.
Pred uporabo smo reaktor s PFA cevko z notranjim premerom 0,25 mm priključili na injekcijsko črpalko in ga spirali z 20 mM fosfatnim pufrom s pH 8 pri pretoku 100 µL/min. Elucije smo lovili in s pomočjo aktivnostnega testa, opisanega v poglavju 3.7.3., določili aktivnost spranega encima.
3.5.1.2 Priprava reaktorja za primerjavo imobilizacije različnih encimov
Zaradi lažjega vnosa encima in manjše verjetnosti za nastanek mehurčkov v reaktorju smo se pri ostalih biotransformacijah odločili za drugačen način imobilizacije encima, ki je prikazan na sliki 5. Encim smo imobilizirali neposredno v zaprt reaktor po naslednjem postopku: 80 µL raztopine encima smo z injekcijo vbrizgali v sestavljen reaktor in ga zaprli s čepi. Tako pripravljen reaktor smo čez noč pustili v hladilniku na 4 °C. Pred uporabo smo ga sprali na enak način, kot je opisano v poglavju 3.5.1.1.
22
Slika 5: Polnjenje zaprtega reaktorja s pomočjo injekcije.
3.5.1.3 Izračun imobilizirane aktivnosti v mikroreaktorju
Za izračun smo uporabili enačbo 8, ki prikazuje izračun imobilizirane aktivnosti v mikroreaktorju:
𝐴𝑖𝑚 = 𝑉𝑒𝐶𝑒𝑆𝐴−∑(𝑉𝑒𝑙𝐴𝑒𝑙)
𝑉𝑟𝑒 , (8)
kjer, 8 Aim predstavlja zadržano aktivnost v mikroreaktorju v U/mL, Ve predstavlja volumen injicirane raztopine z encimom v mL, Ce predstavlja koncentracijo proteinov v raztopini encimskega pripravka v mg/mL, SA predstavlja specifično aktivnost encima v U/mg, Vel predstavlja volumen elucije v mL, Ael predstavlja aktivnost v eluatu v U/mL in Vre dejanski volumen reaktorja v mL. Za izračun smo uporabili naklon premice z območja linearne odvisnosti na grafu koncentracije ACP v odvisnosti od časa. Enačba 9 prikazuje izračun aktivnosti v eluatu, kjer r predstavlja faktor redčenja, ki v vseh primerih znaša 2:
𝐴𝑒𝑙 = 𝑉𝑒𝑙∗𝑟
𝑉𝑟 ∗ 𝑛𝑎𝑘𝑜𝑛 𝑝𝑟𝑒𝑚𝑖𝑐𝑒, (9)
23
3.6 Biotransformacija
3.6.1 Primerjava reakcije z eksogeno dodanim kofaktorjem in brez njega
Vpliv prisotnosti eksogeno dodanega kofaktorja PLP na reakcijo z imobiliziranim encimom in koimobiliziranim PLP smo proučevali v pretočnem sistemu z encimom N-His6-ATA-v1. Encim smo pripravili, kot je opisano v poglavju 3.3.2., in ga imobilizirali, kot je opisano v poglavju 3.5.1.1 PLP, ki se je imobiliziral z encimom, je bil prisoten že v raztopini z encimom. Iz založnih raztopin za pripravo reakcijske raztopine smo pripravili raztopini, ki sta vsebovali 40 mM PYR in MBA v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8. Ena izmed raztopin je vsebovala tudi 0,1 mM PLP.
Reaktor smo s PFA cevkami z notranjim premerom 0,25 mm povezali na injekcijsko črpalko (slika 6), ki je vsebovala reakcijsko raztopino s PLP. Med priklopom cevk smo pazili, da v reaktor niso vstopili mehurčki. Reaktor smo potopili v vodo s temperaturo 30 °C, tako da je bila temperatura konstantna, kot je prikazano na sliki 6. Temperaturo smo bila regulirali z magnetnim mešalom s temperaturno kontrolo. Reaktor smo najprej brez pretoka segreli na delovno temperaturo, nato pa nastavili pretok na 10 µL/min.
Vzorčiti smo začeli po 40 min, ko se je vzpostavilo stacionarno stanje.
Slika 6: Postavitev sistema za izvajanje biotransformacije z imobiliziranim encimom.
24
Vzorčili smo po 0,2 mL v epico, v kateri je bilo že pripravljeno 0,8 mL 0,1 M NaOH.
Tega smo uporabili zato, da smo ustavili reakcijo, saj je encim izgubil aktivnost.
Vzorčenje je potekalo po naslednjem postopku: najprej smo v epico odpipetirali 0,8 mL 0,1 M NaOH. Nato smo cevko, po kateri je vzorec pritekel iz mikroreaktorja, vstavili v epico in jo ovili v parafilm, da bi preprečili izhlapevanje hlapnih snovi. Volumen vzorca smo določili tako, da smo merili čas od trenutka, ko smo vstavili cevko, in nato iz časa in pretoka izračunali volumen. Med celotnim procesom vzorčenja se je epica stresala, kot je prikazano na sliki 6. Vzorčili smo trikrat.
Poskus smo takoj na enak način ponovili še z reakcijsko raztopino brez PLP. Uporabili smo isti reaktor, zato da so bili vsi pogoji imobilizacije encima identični.
Po končanem eksperimentu smo reaktor posušili ter izmerili njegov dejanski volumen.
To smo storili tako, da smo v suh reaktor z injekcijsko črpalko vodili demineralizirano vodo in odčitali volumen, ko se je reaktor napolnil.
3.6.2 Primerjava različnih encimov
Za namen primerjave imobilizacije različnih encimov smo uporabili encime N-His6-ATA-v1, N-His6-ATA-wt in C-His6-ATA-wt-n2. Glede na rezultate primerjave biotransformacije ob prisotnosti kofaktorja PLP in brez njegove prisotnosti smo se odločili, da bomo nadaljnje biotransformacije izvajali brez prisotnosti kofaktorja PLP.
Reakcijo smo vodili pri 30 °C in pri pretokih 20, 40, 80 in 160 µL/min.
Encim C-His6-ATA-wt-n2 smo pripravili, kot je opisano v poglavju 3.3.2., in ga imobilizirali tako, kot je opisano v poglavju 3.5.1.2. Iz založnih raztopin za pripravo reakcijske raztopine smo pripravili raztopino, ki je vsebovala 40 mM PYR in MBA v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8.
Reaktor smo nato povezali na enak način kot v točki 3.6.1. Ponovno smo pazili, da v reaktor ne bi vdrli mehurčki. Potopili smo ga v vodo s temperaturo 30 °C. Po približno 20 min, ko se je segrel, smo nastavili pretok na 20 µL/min. Ko so minili 4 zadrževalni časi, smo začeli vzorčenje.
Vzorčili smo po 0,2 mL v epico, v kateri je bilo že pripravljeno 0,8 mL 0,1 M NaOH.
Vzorčenje je potekalo pa naslednjem postopku: najprej smo v epico odpipetirali 0,8 mL 0,1 M NaOH. Nato smo cevko, po kateri je vzorec pritekel iz mikroreaktorja, vstavili v epico in jo ovili v parafilm, da bi preprečili izhlapevanje hlapnih snovi. Volumen smo določili tako, da smo merili čas od trenutka, ko smo vstavili cevko, pa do trenutka, ko smo jo odstranili, ko je v epico preteklo 0,2 mL. Med celotnim procesom vzorčenja se je epica stresala. Pri vsakem pretoku smo vzorčili trikrat.
25
Po vzorčenju smo pretok povečali na 40 µL/min in ponovno po štirih zadrževalnih časih vzorčili. Enako smo ponovili tudi za pretoka 80 in 160 µL/min.
Ko smo zaključili zadne vzorčenje, smo izmerili še dejanski volumen reaktorja enako, kot smo to storili v poglavju 3.6.1.
Celoten postopek smo nato ponovili še za encima N-His6-ATA-v1 in N-His6-ATA-wt.
3.6.3 Izračun izmerjene aktivnosti
Za izračun izmerjene aktivnosti smo vedno uporabili podatke, dobljene pri najkrajšem zadrževalnem času, ki je bil najbolj primerljiv s podatki iz šaržnih aktivnostnih testov.
Enačba 10 prikazuje izračun izmerjene aktivnosti (Aiz), pri čemer τ predstavlja zadrževalni čas:
𝐴𝑖𝑧 = 𝐶(𝐴𝐶𝑃)
𝜏 , (10)
Učinkovitost imobilizacije smo nato izračunali po enačbi 2. Za lažje vrednotenje rezultatov smo izračunali tudi izgube produkta in substrata po masni bilanci. Enačba 11 prikazuje izračun izgub snovi med procesom:
𝑖𝑧𝑔𝑢𝑏𝑒 =40 𝑚𝑀−(𝐶(𝐴𝐶𝑃)+𝐶(𝑀𝐵𝐴))
40 𝑚𝑀 ∗ 100, (11)
3.7 Analizne metode
3.7.1 Določanje substrata in produkta reakcije
Koncentracijo substrata MBA in produkta ACP smo določali s HPLC napravo (slika 7) s sklopljenim UV-VIS detektorjem in kolono Gemini 3 µm NX-C18 110. Uporabljali smo izokratsko metodo, mobilna faza je bila mešanica acetonitrila in NaOH s pH 11 v vodi, prečiščeni z Milli-Q sistemom v razmerju 1 : 1 in skupnim pretokom 1 mL/min. Kolona je bila termostatirana na 30 °C, sklopljeni detektor pa je zaznaval pri valovni dolžini 226 nm. Celotna metoda je trajala 5 min, vrh, ki je predstavljal MBA, se je nahajal pri 2,61 min, vrh, ki je predstavljal ACP, pa pri 3,77 min. Injekcijski volumen je znašal 5 µL.
26
Slika 7: HPLC naprava s sklopljenim UV-VIS detektorjem.
Kvantitativno vrednotenje koncentracije substrata in produkta v vzorcih sta nam omogočili umeritveni krivulji, ki sta bili posneti pri znanih koncentracijah.
3.7.2 Izbira metode za določanje koncentracije proteinov
Z namenom izbire najprimernejše metode za določanje koncentracije proteinov smo primerjali A280, A205, metodo po Bradfordu in meritev z napravo Qubit fluorimeter.
Za meritev A280 in A205 s spektrofotometrom (slika 8) smo najprej v obe kiveti odpipetirali 300 µL 20 mM fosfatnega pufra s pH 8 in kalibrirali napravo, tako da je bila absorbanca 0. Nato smo v eno izmed kivet odpipetirali 300 µL raztopine z vzorcem in izmerili njeno absorbanco. Med vsakim vzorcem smo kiveto sprali z demineralizirano vodo in 70 % etanolom ter jo osušili.
27
Za meritev po Bradfordu smo najprej pripravili vzorce tako, da smo v razmerju 30 : 1 zmešali Bradfordov reagent in vzorec ter inkubirali 10 min. Nato smo s spektrofotometrom določili absorbanco pri 595 nm na enak način, kot je to potekalo pri določitvi A280 in A205.
Slika 8: Spektrofotometer Shimadzu UV-2600.
Za določanje koncentracije s Qubit fluorimetrom smo najprej pripravili delovno raztopino, ki smo jo pripravili tako, da smo za vsak vzorec zmešali 1 µL reagenta in 199 µL pufra za Qubit analizo. Standardi za Qubit fluorimeter imajo koncentracije 0, 200 in 400 µg/mL ter vsebujejo BSA. Za umeritev smo 10 µL standarda zmešali s 190 µL delovne raztopine in na sobni temperaturi inkubirali 15 min, nato pa izvedli meritev.
Koncentracijo v vzorcih smo določili tako, da smo od 1 do 20 µL vzorca zmešali s toliko delovne raztopine, da je bil skupni volumen 200 µL. Nato smo prav tako inkasirali 15 min in izmerili koncentracijo. Naprava sama preračunava koncentracije glede na standarde, ki smo jih uporabili.
28
3.7.2.1 Določanje območja linearnosti
Najprej smo določili linearna območja vseh štirih metod tako, da smo pripravili raztopino encima ATA-v1 s koncentracijo 1,6 mg/mL v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8. Nato smo pripravili redčenja s koncentracijami 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05 in 0,025 mg/mL. Po zgoraj opisanih metodah smo izmerili absorbanco, določili linearno območje in izbrali najprimernejšo metodo.
3.7.2.2 Priprava umeritvenih krivulj
Za določanje koncentracije proteinov smo pripravili umeritveni krivulji na podlagi BSA za A280 in A205. Pripravili smo raztopino BSA s koncentracijo 1,6 mg/mL in jo redčili tako, da smo dobili raztopine s koncentracijami 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 in 0,0125 mg/mL. Nato smo pripravili umeritveni krivulji.
3.7.3 Določanje koncentracije proteina
Odločili smo se, da bomo za meritev proteina uporabljali A280 in A205, kot je opisano v poglavju 3.7.2.
Koncentracijo proteina smo po izražanju določili s pomočjo naprave Nanodrop. 2 µL raztopine proteina smo odpipetirali na senzor ter izmerili A280, iz katere je bila nato preračunana koncentracija proteinov. Naprava je bila umerjena s pomočjo BSA.
3.7.4 Določanje aktivnosti encimov
Aktivnost encima smo določali v šaržnem procesu. Reakcijo smo izvajali v dveh volumskih izvedbah, pri katerih je končni volumen znašal 2 ali 5 mL.
Izvedbo s skupnim volumnom 5 mL smo uporabljali za določanje aktivnosti encima ATA-v1 in za določanje aktivnosti pri imobilizaciji na prepletenih nanovlaknih. V epruveti smo zmešali 1 mL založne raztopine MBA, 0,4 mL založne raztopine PYR, 0,1 mL založne raztopine PLP in 3 mL 20 mM fosfatnega pufra. V epruveto smo dodali magnetno mešalo in epruveto do polovice potopili v vodo s 30 °C, kot je prikazano na sliki 9. Po 10 min smo dodali 0,5 mL raztopine z encimom s koncentracijo 2 mg/mL, tako da so bile začetne koncentracije 40 mM PYR in MBA, 0,01 mM PLP ter 200 µg/mL encima v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8. Ko smo določali izmerjeno aktivnost na prepletenih nanovlaknih, smo namesto 0,5 mL raztopine encima dodali 0,5 mL pufra ter nanomaterial z imobiliziranim encimom. Med potekom aktivnostnega testa je bila temperatura 30°C, raztopino pa smo mešali z 200 min-1. Vzorčili smo po 0,2 mL in vzorec takoj zmešali z 0,8 mL 0,1 M NaOH, da smo prekinili reakcijo. Število vzorčenj in časi vzorčenj so bili odvisni od posamičnega poskusa.
29
Slika 9: Postavitev za izvajanje aktivnostnih testov.
Izvedbo s skupnim volumnom 2 mL smo uporabljali za določanje aktivnosti ostalih encimov in za določanje aktivnosti v eluatih pri spiranju reaktorja po imobilizaciji. V epruveti smo zmešali 0,4 mL založne raztopine MBA, 0,16 mL založne raztopine PYR in 40 µL založne raztopine. Pri določanju aktivnosti encimov smo dodali še raztopino encima in 20 mM fosfatni pufer s pH 8 v takšnem razmerju, da je bila končna koncentracija encima 200 µg/mL, skupni volumen pufra in raztopine encima pa 1,4 mL.
Pri določanju aktivnosti v vzorcih, izpranih iz reaktorja, smo dodali 0,2 mL vzorca in 1,2 mL 20 mM fosfatnega pufra s pH 8. Raztopino z encimom smo vedno dodali, ko so bile ostale komponente že segrete na 30 °C. Med potekom aktivnostnega testa je bila temperatura 30 °C, raztopino pa smo mešali z 200 min-1. Vzorčili smo po 0,04 mL in vzorce takoj zmešali z 0,2 mL 0,1 M NaOH, da smo prekinili reakcijo. Število vzorčenj in časi vzorčenj so bili odvisni od posamičnega poskusa.
30
3.7.4.1 Izračun specifične aktivnosti encimov
Za izračun specifične aktivnosti encimov smo uporabili enačbo 12. SA predstavlja specifično aktivnost encima v U/mg, Cre pa koncentracijo proteinov v reakcijski raztopini, ta je vedno znašal 0,2 mg/mL. Naklon premice smo odčitali v območju linearne odvisnosti z grafa koncentracije ACP v odvisnosti od časa.
𝑆𝐴 =𝑛𝑎𝑘𝑙𝑜𝑛 𝑝𝑟𝑒𝑚𝑖𝑐𝑒
𝐶𝑟𝑒 , (12)
31
4 Rezultati in razprava
4.1 Izražanje proteinov
V celicah E. coli smo encime izražali na osnovi plazmidov, pripravnjenih na Univerzi v Manchestru. Dvakrat zapored smo izrazili encim ATA-wt s His6 označevalcem na C koncu (oznaki C-His6-ATA-wt-n1 in C-His6-ATA-wt-n2) ter enkrat ATA-wt s His6
označevalcem na N koncu (N-His6-ATA-wt) in ATA-v1 s His6 označevalcem na N koncu (N-His6-ATA-v1). Proces izražanja in čiščenja encimov je obakrat potekal brez posebnosti.
4.1.1 Čistost encimov
Čistost encimov smo določali z ločevanjem elucijskih frakcij na gelu NaDS-PAGE. Vse vzorce smo po končanem koncentriranju nanesli v takšni obliki, kot smo jih nato uporabili za biotransformacije. Slika gela po barvanju je prikazana na sliki 10.
32
Slika 10: NaDS-PAGE gel z nanešenim standardom (std), vzorcem encima N-His6-ATA-v1 (a), vzorcem encima C-His6-ATA-wt-n1 (b), vzorcem encima
N-His6-ATA-wt (c) in vzorcem encima C-His6-ATA-wt-n2 (d).
Pričakovana velikost tetramernega encima je malo manj kot 200 kDa, posamezna monomerna polipeptidna veriga pa ima molekulsko maso približno 50 kDa [8], kar se tudi ujema z dobljenimi lisami, ki so vidne v vsakem nanosu nad standardom z molsko maso 45 kDa. Poleg lis, ki predstavljajo želeni encim, lahko opazimo tudi pasove pri molski masi približno 116 kDa, ki so najbolj opazni pri encimu N-His6-ATA-v1. Ti pasovi lahko predstavljajo nečistoče ali ne popolnoma denaturiran encim, saj je v primerjavi z encimom ATA-wt encim v ATA-v1 bolj stabilen pri višjih temperaturah, v dvofaznih topilih in organskih topilih.
4.1.2 Koncentracije proteinov v raztopinah encimov
Po končanem izražanju, čiščenju in koncentriranju encimov smo določili tudi koncentracijo proteinov. Encim smo alikvotirali v 1,5 mL epicah tako, da je bilo v vsaki epici 100 µL. Koncentracija proteinov in število polnih epic sta prikazana v tabeli 5.
33
Tabela 5: Tabela s koncentracijami proteinov, volumni raztopin encimov in masami izraženih encimov
Oznaka encima Koncentracija proteinov [mg/mL]
Volumen dobljenega encima [µL]
Masa dobljenih proteinov [mg]
N-His6-ATA-v1 13,5 600 8,1
N-His6-ATA-wt 10,2 500 5,1
C-His6-ATA-wt-n1 3,2 400 1,28
C-His6-ATA-wt-n2 9,3 500 4,65
4.2 Aktivnost encimov
Vsem encimom smo določili aktivnost encimov s šaržnim procesom z začetnimi koncentracijami 40 mM PYR, 40 mM MBA, 0,1 mM PLP in 0,2 mg/mL encima v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8. Za encim ATA-v1 smo aktivnostne teste izvajali s skupnim volumnom 5 mL, vse ostale pa smo izvajali s skupnim volumnom 2 mL pri temperaturi 30 °C.
Za vsak encim smo izvedli dve meritvi in nato po enačbi 12 izračunali povprečno aktivnost encima. Vse aktivnosti so prikazane v tabeli 6.
34
Tabela 6: Aktivnosti encimov v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8 in začetnimi koncentracijami 40 mM MBA in PYR, 0,1 mM PLP in 0,2 mg/mL pri temperaturi
30 °C.
Oznaka encima Posamezna meritev SA [U/mg] Povprečna SA [U/mg]
ATA-v1 2,48 2,67 2,57
N-His6-ATA-v1 5,44 5,23 5,34
N-His6-ATA-wt 67,34 66,30 66,82
C-His6-ATA-wt-n1 28,11 26,24 27,18
C-His6-ATA-wt-n2 60,94 59,78 60,36
4.2.1 Določanje aktivnosti 4.2.1.1 ATA-v1
Rezultati meritev odvisnosti koncentracije produkta od časa med šaržno reakcijo z ATA- v1 so grafično predstavljeni na grafu 1. Vzorčili smo po 5 s, 2,5 min, 5 min in 10 min. Pri izračunu aktivnosti smo zanemarili točko pri 10 min, saj pri tem času ni linearne odvisnosti koncentracije produkta reakcije od časa.
35
Graf 1: Določanje aktivnosti encima ATA-v1 v 20 mM fosfatnem pufru s pH8 in začetnimi koncentracijami 40 mM MBA in PYR, 0,1 mM PLP pri koncentraciji encima
0,2 mg/mL in temperaturi 30 °C.
4.2.1.2 N-His6-ATA-v1
Rezultati meritev odvisnosti koncentracije produkta od časa med šaržno reakcijo z N-His6-ATA-v1 so grafično predstavljeni na grafu 2. Vzorčili smo po 5 s, 2,5 min, 5 min in 10 min. Pri izračunu aktivnosti smo zanemarili točko pri 10 min, saj pri tem času ni linearne odvisnosti koncentracije produkta reakcije od časa.
y = 0,4952x + 0,0826 R² = 0,9999 y = 0,5344x + 0,0818
R² = 0,9996
0 1 2 3 4 5 6 7
0 2 4 6 8 10 12
C(ACP) [mM]
Čas [min]
ATA-v1 (1) ATA-v1 (2)
36
Graf 2: Določanje aktivnosti encima N-His6-ATA-v1 v 20 mM fosfatnem pufru s pH 8 in začetnimi koncentracijami 40 mM MBA in PYR, 0,1 mM PLP pri koncentraciji
encima 0,2 mg/mL in temperaturi 30 °C.
4.2.1.3 C-His6-ATA-wt-n1
Rezultati meritev odvisnosti koncentracije produkta od časa med šaržno reakcijo z C-His6-ATA-wt-n1 so grafično predstavljeni na grafu 3. Vzorčili smo po 5 s, 2,5 min, 5 min in 10 min. Pri izračunu aktivnosti smo zanemarili točki pri 5 in 10 min, saj pri teh časih ni linearne odvisnosti koncentracije produkta reakcije od časa. Zaradi velike aktivnosti tega encima smo v nadaljevanju pri vseh encimih ATA-wt vzorčili pri krajših časih.
y = 1,0889x + 0,1359 R² = 1
y = 1,0452x + 0,0824 R² = 0,9998
0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10 12
C(ACP) [mM]
Čas [min]
N-His6-ATA-v1 (1) N-His6-ATA-v1 (2)
