VLOGA NARAVNIH SPOJIN RASTLINSKEGA IZVORA V AVTOFAGIJI

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Ema MOLAN

VLOGA NARAVNIH SPOJIN RASTLINSKEGA IZVORA V AVTOFAGIJI

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Ema MOLAN

VLOGA NARAVNIH SPOJIN RASTLINSKEGA IZVORA V AVTOFAGIJI

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja

THE ROLE OF NATURAL PLANT COMPOUNDS IN AUTOPHAGY

B. SC. THESIS Academic Study Programmes

.

Ljubljana, 2021

(3)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, 2021

II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.

Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Polono Jamnik.

Komisija za oceno in predstavitev:

Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: prof. dr. Polona JAMNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Iztok PRISLAN

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Datum predstavitve: 9.7.2021 Ema MOLAN

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 606:61:615.322(043.2)

KG avtofagija, naravne spojine, rastlinske snovi, celastrol, resveratrol, DMC, berberin AV MOLAN, Ema

SA JAMNIK, Polona (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija

LI 2021

IN VLOGA NARAVNIH SPOJIN RASTLINSKEGA IZVORA V AVTOFAGIJI TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)

OP VI, 20 str., 7 sl., 34 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Eden izmed ključnih, evolucijsko ohranjenih, preživetvenih procesov je avtofagija, katero lahko induciramo tudi s pomočjo naravnih spojin rastlinskega izvora. Le-te najpogosteje izvirajo iz rastlin in so del tradicionalne kitajske medicine. Najbolj preučene so resveratrol, DMC, berberin in celastrol, ki delujejo na zelo različne načine. Resveratrol inducira avtofagijo preko mTOR kompleksa ter razgradnje klasičnega receptorja avtofagije p62, DMC deluje odvisno od Atg proteinov, celastrol preko inhibicije signalne poti Akt/mTOR in povečanja izražanja avtofagosomov in p62, berberin pa preko hranilnega senzorja SIRT1. Vsem štirim naravnim spojinam je skupno, da učinkovito inducirajo avtofagijo tarčnih celic in ne poškodujejo sosednjih, zdravih celic. Tako predstavljajo velik potencial v medicini za zdravljenje rakavih in drugih obolenj, zato je bil naš namen pregled literature o vlogi naravnih spojin rastlinskega izvora v avtofagiji ter pregled že izvedenih študij o potencialni uporabi le- teh pri kemoterapiji. Zaradi dvoličnosti avtofagije, ki je lahko zaviralec, a tudi spodbujevalec raka, je zelo pomembno poznavanje stadija tumorja, makrookolja ter ustrezne kombinacije med avtofagija-inducirajočo spojino in kemterapevtikom. Kot najboljše naravne spojine so se izkazali resveratrol, celastrol in DMC, ki inducirajo avtofagijo v rakavih celicah ter zmanjšajo citotoksičen učinek kemoterapevtika na okoljske zdrave celice. Naravne spojine same po sebi sicer že inducirajo avtofagijo, a je njihov učinek na omejitev rasti rakavih celic boljši takrat, ko so uporabljene v kombinaciji z ustreznim kemoterapevtikom.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 606:61:615.322(043.2)

CX autophagy, natural compounds, celastrol, resveratrol, DMC, berberin, plant compounds

AU MOLAN, Ema

AA JAMNIK, Polona (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology

PY 2021

TI THE ROLE OF NATURAL PLANT COMPOUNDS IN AUTOPHAGY

DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 20 p., 7 fig., 34 ref.

LA sl AL sl/en

AB One of the crucial evolutionarily preserved survival processes is autophagy, which can also be induced with the help of natural compounds of plant origin. These most commonly originate from plants and are part of Chinese traditional medicine. The most studied compounds are resveratrol, DMC, berberine and ceastrol, which work in very different ways. Resveratrol induces autophagy via the mTOR complex and degradation of the classical p62 autophagy receptor, DMC works dependent of Atg proteins, celastrol inhibits Akt/mTOR signaling pathway and increases expression of autophagosomes and p62 proteins and berberin works via the SIRT1 nutrient sensor.

All four natural compounds have in common that they effectively induce target cell autophagy and do not damage neighboring, healthy cells. Thus, they represent a great potential in medicine for the treatment of cancer and other diseases, so our purpose was to review the literature on natural compounds of plant origin and review already conducted studies on their potential use in chemotherapy. Due to the hypocrisy of autophagy that can be inhibits or promotes cancer, it is very important to know the stage of the tumor, the microenvironment and the appropriate combination of cancer inhibitors based on autophagy and chemotherapeutics. Resveratrol, celastrol and DMC have been shown to be the best natural compounds, inducing autophagy in tumor cells and preventing the cytotoxic effect of the chemotherapeutic on healthy cells. It is known that natural compounds already induce autophagy themselves, but have a better effect on limiting the growth of cancer cells when used in a combination with appropriate chemotherapeutics.

(6)

V

KAZALO VSEBINE

Str.

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK ... VI OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VI

1 UVOD ... 1

2 AVTOFAGIJA ... 1

2. 1 POTEK AVTOFAGIJE ... 2

2.2 MODELNI ORGANIZMI ZA PROUČEVANJE AVTOFAGIJE ... 3

2.2.1 Kvasovke ... 3

2.2.2 Miši ... 5

2.3 AVTOFAGIJA V NORMALNEM FIZIOLOŠKEM STANJU ... 6

2.4 AVTOFAGIJA V PATOFIZIOLOŠKEM STANJU ... 8

3 NARAVNE SPOJINE RASTLINSKEGA IZVORA IN AVTOFAGIJA ... 8

3.1 RESVERATROL... 9

3.1.1 Mehanizem induciranja avtofagije ... 9

3.1.2 Degradacija p62 ... 10

3.1.3 Regulacija Nrf2 ... 10

3.2 FLAVONOID -4,4- DIMETOKSIHALKON (DMC) ... 11

3.2.1 Delovanje DMC ... 11

3.3 CELASTROL ... 13

3.3.1 Delovanje celastrola ... 13

3.4 BERBERIN ... 14

3.4.1 Delovanje berberina ... 15

3.5 UPORABA NARAVNIH SPOJIN RASTLINSKEGA IZVORA PRI RAKAVIH OBOLENJIH ... 15

4 ZAKLJUČEK ... 17

5 VIRI ... 17

(7)

VI KAZALO SLIK

Str.

Slika 1: Selektivna avtofagija pri kvasovkah S. cerevisiae (Wen in Klionsky, 2016). ... 2

Slika 2: Potek avtofagije (Mitchell, 2012). ... 3

Slika 3: Potek avtofagije pri kvasovkah S. cerevisiae (Wen in Klionsky, 2016). ... 4

Slika 4: Mehanizem delovanja resveratrola (Tian in sod., 2019). ... 9

Slika 5: Struktura večdomenskega proteina p62 (Ichimura in Komatsu, 2010). ... 10

Slika 6: Delovanje DMC (Zimmerman in sod., 2019). ... 12

Slika 7: Vpliv celastrola na celice (Liu in sod., 2019). ... 14

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI 8-oksoG 8-okso-7,8-dihidroguanin

ACE2 encim pretvorbe angiotenzina 2 (ang. Angiotensin-converting enzyme 2)

AMPK AMP-aktivirana protein kinaza (ang. AMP-activated protein kinase) ATG avtofagni geni (ang. Autophagy-related genes)

ATP adenozin trifosfat (ang. Adenosine triphosphate)

CHEK2 serin/treonin- protein kinaza Chk2 (ang. Checkpoint Kinase 1)

CIP2A rakasti zaviralci proteinske fosfataze 2A (ang. Cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A)

Da dalton

DDR odziv na poškodbo DNA (ang. DNA Damage Detection and Response) DEPTOR DEP domena, ki vsebuje mTOR- interakcijski protein (ang. DEP domain-

containing mTOR-interacting protein) DMC flavonoid 4,4-dimetoksihalkon

DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid) GFP zeleni fluorescentni protein (ang. green fluorescent protein) JAK Janus kinaza

LPS lipopolisaharid

mRNA informacijska RNA (ang. Messenger RNA)

mTOR tarča rapamicina pri sesalcih (ang. Mammalian target of rapamycin) NAD+ nikotinamid adenin dinukleotid

Nrf2 jedrni faktor, ki vsebuje eritroid 2 (ang. nuclear factor erythroid 2–related factor 2)

PTM postranslacijske modifikacije

RNA ribonukleinska kislina (ang. Ribonucleic acid)

ROS reaktivne kisikove zvrsti (ang. Reactive oxygene species) SIRT1 sirtuin 1

TLR Toll-like receptor

TOR tarča rapamicina (ang. Target of rapamycin)

Ub ubikvitin

(8)

1 1 UVOD

Eden ključnih, evolucijsko ohranjenih preživetvenih celičnih procesov je avtofagija, ki je pomembna pri številnih fizioloških procesih organizma, kot sta prilagoditev na stres in diferenciacija celic (Parzych in Klionsky, 2014). Zaznamo jo lahko tako pri enostavnih evkariontskih celičnih modelih, kot je kvasovka Saccharomyces cerevisiae, kot tudi pri že bolj razvitih živalskih modelih- miših. Induciranje avtofagije se izkorišča predvsem v medicini in farmaciji pri zdravljenju rakavih in drugih obolenj, pri čemer ima lahko dvorezen meč- ali spodbuja ali pa zavira rast rakavih celic in tumorjev (Jiang in sod., 2019).

Za induciranje omenjenega procesa se največkrat poslužujemo kemijsko sintetiziranih spojin, ki pa imajo stranske učinke, na primer poškodba sosednjih, zdravih celic. Tradicionalna kitajska medicina pa uporablja marsikatere zdravilne rastline, tudi take, ki imajo prisotne spojine, zmožne induciranja avtofagije le v tarčnih celicah. Poznanih jih je že več vrst, mi pa smo se poglobili v štiri najbolj perspektivne, in sicer celastrol, resveratrol, berberin in flavonoid 4,4-dimetoksihalkon (ang. Flavonoid 4,4-dimethoxychalcone, DMC) . Delujejo na več različnih načinov, njihov skupni faktor pa je induciranje avtofagije le v tarčnih celicah in zanemarljivo delovanje na ostale celice.

Cilj diplomske naloge je bil pregled literature o poteku avtofagije, ohranjenosti procesa v nižje in višje razvitih celicah ter pregled do sedaj že poznanih naravnih spojin rastlinskega izvora, ki so zmožne inducirati avtofagijo. Zanimalo nas je tudi, kakšen potencial imajo določene naravne spojine rastlinskega izvora pri zdravljenju različnih rakavih obolenj v povezavi z avtofagijo ter kakšno vlogo ima avtofagija v zdravih celicah v primerjavi z vlogo v rakavih celicah.

2 AVTOFAGIJA

Izraz »avtofagija« izhaja iz grščine in v dobesednem pomenu besede pomeni »pojesti samega sebe« (Glick in sod., 2010). Je zelo pomemben evolucijsko ohranjen proces pri enoceličnih in večceličnih organizmih, še posebej pri sesalskih celicah, saj omogoča njihovo preživetje v stresnem okolju (stradanje, okužba s patogenom, sevanje, rakavo obolenje,…) ter ohranjanje celične homeostaze (Parzych in Klionsky, 2014). Prav tako je njena funkcija odstranjevanje odmrlih celic, okvarjenih oziroma poškodovanih organelov, intercelularnih patogenov in proteinov ter obnavljanje med diferenciacijo in razvojem celic, s čimer prepreči poškodbe genoma. Vzdržuje tudi celično ravnovesje in se v času stradanja močno poveča, pri čemer si celica pridobiva energijo v obliki ATP s samorazgradnjo lastnih komponent. Tako ustvarja aminokisline in maščobne kisline, ki se reciklirajo in uporabijo pri sintezi novih makromolekul, da se lahko celica prilagodi na stres. Samorazgradnja se v primeru neizboljšanja razmer nadaljuje in vodi v avtofagni tip celične smrti (Levine in sod., 2019).

Znane so tri vrste avtofagije, in sicer makroavtofagija, mikroavtofagija in avtofagija, katero aktivirajo šaperoni (ang. chaperone-mediated autophagy, CMA). Vsem trem je skupno spodbujanje razgradnje celičnih komponent v lizosomu (Glick in sod., 2010).

Avtofagija je lahko selektivna ali neselektivna, kar je odvisno od vrste tovora, ki ga zajema avtofagosom. Pri neselektivni avtofagija gre za degradacijo naključnih delov citoplazme in je

(9)

2

ključnega pomena za preživetje celice, saj omogoča pridobivanje hranilnih snovi in onemogoča pomankanje energije. Selektivna avtofagija pa deluje skupaj z bazalno avtofagijo in omogoča vzdrževanje celične homeostaze ter celično preoblikovanje. Pri tem je membrana fagoforja tesno nameščena na tovor, kar preprečuje preklic razsute citoplazme in omogoča transport tovora, kar je lahko mitohondrij, peroksisom, protein, lipid ali intracelularni patogen, v vakuolo. Pod selektivno avtofagijo spadajo pot od citoplazme do vakuole (ang.

cytoplasm-to-vacuole, Ctv), mitofagija in peksofagija. Pri Ctv poti je primarni protein za razgradnjo tovora prekurzorska aminopeptidaza (ang. Precursor aminopeptidase, prApe1), ki je sintetizirana v citosolu in veže receptor Ctv poti Atg19 z Atg11 ter s tem omogoča selektiven preklic delovanja fagoforja. Za mitofagijo je značilna vezava Atg32 receptorja na mitohondtriiju z Atg11, pri peksofagiji pa vezava Atg36 receptorja na peroksisomu z Atg11.

Tudi ti dve selektivni avtofagiji omogočata selekcijo tovora, ki se bo razgradil v avtofagosomu. Slednje je predstavljeno na sliki 1 (Wen in Klionsky, 2016).

Slika 1: Selektivna avtofagija pri kvasovkah S. cerevisiae (Wen in Klionsky, 2016).

2. 1 POTEK AVTOFAGIJE

Izolacijska membrana oziroma fagofor, ki izhaja iz lipidnega dvosloja, se razširi in tako zajame znotrajcelično komponento, ki je namenjena razgradnji (proteinski agregat, celični organel, ribosom). Tako nastali avtofagosom se nato združi z lizosomom, dozori in nastane avtolizosom. S tem spodbudi razgradnjo avtofagosomske vsebine s proteazami in drugimi hidrolazami ter prenos aminokislin in drugih stranskih produktov s permeazami in prenašalci

(10)

3

nazaj v citoplazmo, kjer jih lahko celica ponovno uporabi za gradnjo makromolekul in celično presnovo (Slika 2) (Glick in sod., 2010).

Slika 2: Potek avtofagije (Mitchell, 2012).

Pri procesu so ključni Atg proteini, ki sodelujejo pri induciranju avtofagije ter zorenju avtofagosomov. V zgodnjih fazah nastajanja avtofagosoma sta pomembna ubikvitinu podobna proteina Agt12 in Agt8. Agt12 se s pomočjo proteinov Agt7 in Agt10 pripne na protein Agt5 in tako nastane konjugat Agt5-Agt12. Le-ta tvori kompleks s proteinom Agt16, nastali konjugat Agt5-Agt12-Agt16 pa tvori predhodni plašč, ki omogoča deformiranje fagofora pri nastajanju aftofagosomskih veziklov in olajša lipidacijo Atg8. Slednji je kot drugi ubikvitinu podoben protein pomemben za širitev fagofora in nastanek avtofagosoma ter določa velikost avtofagosoma. Proteaza Agt4 namreč cepi Agt8 blizu C-konca, da se izpostavi glicinski preostanek in se kot tak veže na fosfatildiletanolamin (PE). Pred zlitjem lizosoma z avtofagosomom se protein Agt8 in drugi proteinski kompleksi odcepijo od membrane vezikla, se sprostijo v citosol in so tako na razpolago za nadaljnjo uporabo pri nastanku novih avtofagosomov (Revuelta in Matheu, 2017).

2.2 MODELNI ORGANIZMI ZA PROUČEVANJE AVTOFAGIJE 2.2.1 Kvasovke

Kvasovke (Saccharomyces cerevisiae) so enocelične glive, katerih genom gradi 12068 kilobaz, organiziranih na 16 kromosomih in so močno prisotne v našem življenju, predvsem pri proizvodnji fermentiranih živil in biogorivih. Prav tako so pomembne kot model za preučevanje osnovnih celičnih procesov evkariontskih celic ter za proizvodnjo farmacevtskih in biokemičnih proizvodov (Belda in sod., 2019). Njihove prednosti pred drugimi modeli so namreč te, da imajo zelo kratek generacijski čas (1-2h pri 30°C), njihovo gojenje je enostavno in poceni, možno je enostavno gensko manipuliranje, tako odstranjevanje kot tudi vstavljanje novih genov, hkrati pa imajo zelo podobno celično organizacijo kot rastline in živali (Stewart, 2014). Študije na celičnih organelih kvasovke (tj. na celični membrani, vakuoli, jedru,

(11)

4

endoplazmatskem retikulumu in mitohondriju) so tako postavile temelje znanja o evkariontskih organelih (Stewart, 2014).

Za kvasovke je značilna predvsem makroavtofagija, ki je sestavljena iz 6 faz- indukcije, nukleacije fagoforja, razširitve fagoforja, dokončnega izoblikovanja avtofagosoma, zlitja z vakuolo in razgradnje ter odstranjevanja razgradnjih produktov (Slika 3). Pri kvasovkah se prvi korak začenja na perivakuolarnem mestu blizu vakuole, imenovanem mestu nastajanja fagoforja (ang. phagophore assembly site, PAS), katerega kontrolira kompleks Atg1 vključno s trojnim podkompleksom Atg17-Atg31-Atg29. Nato Atg14 kompleks, ki vključuje fosfatdilinozitol-3-kinazo, nadaljuje s fazo nukleacije na mesto montaže fagoforja, katerega glavna naloga je izoblikovanje primarnega oddelka z dvojno membrano za odvajanje oziroma fagoforja. Sledi faza ekspanzije in dokončanja fagoforja. Tu sta ključni konjugacijski mesti, ki vključujeta ubikvitinu podobne proteine. Ta dva sistema uporabljata Ubl protein Atg12, vključno s komponentami Atg5, Atg7, Atg10 in Atg16, ter protein Atg8, vključno z Atg3, Atg4 in Atg7. V nekaterih modelih je ključen tudi transmembranski protein Atg9, ki kroži med PAS in perifernimi strukturami, katere nosijo ali usmerjajo dostavo membrane. Po fazi širjenja fagoforja je dvofazni avtofagosom končan in v celoti obdaja tovor. Sam mehanizem zaprtja in regulacije zaprtja tovora z avtofagosomom še ni povsem jasen, je pa verjetno, da vključuje cepitev membrane. Končni avtofagosom s fuzijo obeh membran prenese svoj tovor v vakuolo, sam čas tega prenosa in postopek fuzije membran pa je ključnega pomena za zagotavljanje razgradnje in je zato natančna regulacija le-tega zelo pomembna. Kot zadnji korak makroavtofagije pa je degradacija avtofagosoma z lipazo Atg15 in vakuolnimi hidrolazami, kar doprinese k sprostitvi razgradnih produktov v citoplazmo kvasovke (Wen in Klionsky, 2016).

Slika 3: Potek avtofagije pri kvasovkah S. cerevisiae (Wen in Klionsky, 2016).

Makroavtofagija je v za kvasovke primernem okolju v fazi normalnega delovanja, medtem ko se ob pojavu stresa, kamor sodi recimo stradanje, njena intenziteta delovanja močno poveča,

(12)

5

kar omogoča celično preživetje in odstranjevanje uničenih ali poškodovanih celičnih organelov. Na drugi strani lahko tudi nekontrolirana makroavtofagija ob pretirani ali premajhni intenziteti delovanja mehanizma povzroči škodo. (Wen in Klionsky, 2016).

Avtofagija predstavlja pomembno fiziološko vlogo in mora biti zato zelo dobro regulirana. To omogočajo epigenetska, transkripcijska in post-transkripcijska regulacija ter post-translacijska modifikacija. Pod epigenetsko regulacijo spadajo metilacija in acetilacija ter deacetilacija histonov H3 in H4. Dokazano je bilo, da sinteza Atg proteinov ni nujno potrebna za tvorbo fagosomov, je pa pomembna za ustvarjanje normalno velikih avtofagosomov. Tu nastopi vloga transkripcijske regulacije, ki opravlja nadzor nad prepisovanjem genov Atg s pomočjo Ume6 in Atg8. Ume6 je DNA-vezavni protein, ki je odvisen od korepresorja Sin3 in Rpd3, ki negativno regulirata raznovrstnost genov pri kvasovkah. Delecija Ume6, Sin3 ali Rpd3 rezultira v znižanju Atg8 mRNA ter vodi v hitre avtofagne odzive, ko se celice premaknejo do stanja, ki inducira avtofagijo. Pomembno vlogo ima tudi kinaza Rim15, ki je pozitivni regulator makroavtofagije in integrira signale od TOR in kinaz A ter Rph1, ki regulira makroavtofagijo preko kontrole genske ekspresije Atg (ang. Autophagy related genes, Atg) in Pho23, ki v sodelovanju z Rpd3 modulira gensko ekspresijo. K post-translacijski regulaciji spadajo Dhh1/Vad1/DDX6, ki negativno regulirajo makroavtofagijo. Vežejo namreč 5`

netranslacijsko regijo določenega transkripta in rekrutirajo Dcp2 encim, ki fosforilira in aktivira TOR. To rezultira v degradaciji specifičnega transkripta. Kot zadnja pomembna regulacija makroavtofagije pa je post-translacijska modifikacija (ang. Posttranslation modification, PTM). Sem spadajo fosforilacija, ubikvitinacija in acetilacija, ki omogočajo funkcionalnost Atg proteinov in drugih regulacijskih faktorjev. Fosforilacija je najbolj okarakterizirana PTM na Atg proteinih, kjer je pomembno delovanje kinaz in fosfataz.

Ubikvitinacija ima pomembno vlogo pri iskanju in degradaciji tarčnih proteinov, kar omogočajo majhni regulatorni proteini ubikvitini (Ub) in 26S proteosomi. Mehanizem ubikvitinacije je sestavljen iz treh faz, in sicer aktivacije, konjugacije in ligacije z E1, E2 in E3 encimi. Pod določenimi pogoji je prisoten tudi E4 encim. Malo manj raziskana post- translacijska modifikacija pa je acetilacija. Znano je le to, da je pomembna katalitična podenota NuA4, ki je histon acetiltransferaza (Wen in Klionsky, 2016).

2.2.2 Miši

Pomemben živalski model so tudi miši, ki predstavljajo velik genetski resurs za odkrivanje in dojemanje fizioloških vlog mehanizmov pri sesalcih. V zadnjem desetletju se je prav s pomočjo miši znanje o fizioloških vlogah avtofagije pri sesalcih močno povečalo. Za analizo avtofagije in vivo sta bili uporabljeni dve vrsti gensko spremenjenih mišjih modelov, in sicer

»miši, pri katerih je avtofagija prisotna« in »miši, ki jim avtofagija primanjkuje« (Kuma in sod., 2017).

Na začetku se je za spremljanje avtofagije uporabljala elektronska mikroskopija, po identifikaciji MAP1LC3/LC3, z mikrotubuli povezanega proteina, pa sta ključni transgeni miši, ki izražata EGFP-LC3. Le-te sta omogočili poenostavljeno opazovanje in kvantifikacijo avtofagije . Poleg njiju pa so pomembno orodje za razumevanje mehanizma tudi miši, ki jim primanjkujejo določeni geni Atg. Pri kvasovkah se namreč koncept »znotrajcelične kontrole kakovosti« zaradi prehitre celične delitve ni videl, le-to so omogočile raziskave na mišjih modelih brez izražene avtofagije. Zaradi pomankanja avtofagije je namreč prišlo do kopičenja

(13)

6

vseprisotnih proteinov, poškodovanih organelov in substratov, značilnih za avtofagijo, kot je na primer SQSTM1/p62 (ang. Sequestosome 1, SQSTM1). Te ugotovitve so pokazale, da je avtofagija ključnega pomena za preprečevanje kopičenja toksičnih in poškodovanih proteinov in organelov pri sesalcih (Kuma in sod., 2017).

Med proteine Atg spada tudi LC3, eden od homologov Atg8, pri sesalcih uveljavljen kot avtofagosomski označevalec, saj nam njegovo sledenje omogoča spremljanje avtofagosoma in na splošno avtofagije. Povečano število avtofagosomov lahko namreč predstavlja indukcijo avtofagije ali poslabšanje fuzije avtofagosom-lizosom ali pa lizosomsko razgradnjo. Za odkrivanje LC3 se uporablja imunobarvanje ali fluorescentno označevanje, pri čemer se uporablja enomolekularne sonde, kot je na primer mRFP-EGFP-LC3. Na zeleno in rdeče združenih slikah so avtofagosomi z uporabljeno sondo označeni z rumenim, avtolizosomi pa z rdečim signalom. Na ta način lahko zasledimo celoten postopek avtofagije, saj se ob aktivaciji avtofagije poveča število rumenih točk, ki predstavljajo avtofagosome ter število rdečih točk, ki predstavljajo avtolizosome, ob blokiranju pa zaznamo le povečanje števila rumenih točk (avtofagosomov) (Kuma in sod., 2017).

LC3 in GABARAP, ki je prav tako pomemben protein, se na karboksilnem koncu posebej cepita s proteini Atg4 in tako tvorita LC3-I oziroma GABARAP-I ter imata izpostavljen karboksilni terminalni glicin. Le-ta je konjugiran s fosfatidiletanolaminom in tako tvori LC3- II, ki je tesno vezan na notranjo in zunanjo površino fagoforja in avtofagosomsko membrano.

Ob zlitju avtofagosoma in lizosoma, se LC3-II na zunanji membrani ponovno razcepi s proteini Atg4 in sprosti iz membrane, LC3-II na notranji membrani pa se razgradi z lizosomskimi encimi (Kuma in sod., 2017).

Drug pomemben mišji model so miši GFP-LC3-RFP-LC3∆G, ki so bile razvite z namenom natančne kvantifikacije avtofagičnega pretoka z zaznavanjem zmanjšanja signalov GFP-LC3 v lizosomih. V tem primeru se uporabljata sondi GFP-LC3 ter tfLC3, LC3 pa je označevalec avtofagosomskih struktur. Razmerje GFP:RFP se lahko izmeri s pomočjo fluorescentnega mikroskopa, pretočnega citometra ali čitalnika mikrotiterskih plošč (Kuma in sod., 2017).

Za spremljanje mitofagije, ki je mehanizem selektivne razgradnje poškodovanih mitohondrijev z avtofagijo in spremljanja kakovosti mitohondrijev, sta bila razvita transgena mišja modela mt-Keima in mito-QC. Keima je fluorescentni protein, odporen proti lizosomu in se vzbuja predvsem pri svetlobni dolžini 458 nm v nevtralnem okolju ter pri 561 nm v kislem okolju. Samo razmerje med 561 nm in 458 nm kaže na dostavo mitohondrijev v lizosome in posledično na mitofagično aktivnost. Oba mišja modela temeljita na podobnem konceptu, da mitofagijo zaznamo s spremembo pH. Kljub temu, da sta pomembna za študije mitofagije, imata tudi pomankljivosti, na primer pri opazovanju mitofagije z mišmi mt-Keima potrebujemo sveže izrezane organe. Slabost je tudi to, da vzbujevalni spektri med kislim in nevtralnim okoljem niso popolnoma ločeni (Kuma in sod., 2017).

2.3 AVTOFAGIJA V NORMALNEM FIZIOLOŠKEM STANJU

Človeški imunski sistem in avtofagija naj bi bila tesno povezana. Na eni strani avtofagija regulira celice imunskega sistema, tj. celice naravne ubijalke (ang. natural killer cells, NK), makrofage, dendritične celice (ang. dendritic cells, DCs) ter limfocite T in B in vpliva na

(14)

7

njihovo aktivacijo, homeostazo, preživetje, diferenciacijo in proilferacijo. Vplivala naj bi tudi na sproščanje citokinov in protiteles. Na drugi strani pa interferon-y (INF-y), transformirajoči faktor β (ang. transforming growth factor β, TGF- β), interlevkini IL-1, IL-2, in IL-12 inducirajo avtofagijo, interlevkini IL-4, IL-10 in IL-13 pa jo zavirajo (Jiang in sod., 2019).

Obstaja veliko eksperimentalnih dokazov o vpletenosti avtofagije v s starostjo povezano mišično degradacijo (ang. age-related muscular degeneration, AMD). Avtofagija je namreč tesno povezana s celičnim odzivom na stres in je element odziva poškodb DNA (ang. DNA demage response, DDR), kjer je popravilo DNA ključnega pomena za obrambo pred celičnim stresom in je tako verjetnost, da je AMD povezana ravno z motnjo v popravilu DNA.

Oksidativni stres namreč povzroči različne lezije DNA, 8-okso-7,8-dihidrogvanin (8-oksoG) pa je znak oksidativne poškodbe DNA, ki se najpogosteje popravi z gOGsilazo hOOG1 po poti osnovne ekscizijske obnove. V primeru izognitve 8-oksoG samemu procesu popravila, replikativna DNA polimeraza napačno vstavi adenin namesto citozina in to rezultira k aktivaciji alternativne poti BER, in sicer k BER s hMYH glikozilazo, ki ta adenin odstrani.

Ugotovili so, da je variabilnost genov hOOG1 in hMYH povezana s pojavom in napredovanjem AMD in da poškodbe DNA kažejo na pomembnost oksidativnega stresa pri razvoju AMD (Blasiak in sod., 2017).

Genetski poskusi na različnih modelnih organizmih, kot so Saccharomyces cerevisiae, C.

elegans, Drosophilla in miš, kažejo na potrebo po ključnih regulatorjih avtofagije (to so Atg1, Atg7, Atg8, Atg11), saj upad njihovega delovanja pospešuje staranje in tako zmanjšuje življenjsko dobo organizma. Pojavijo se namreč poškodovani mitohondriji, zmanjša se srčna zmogljivost, kopičijo se lipidi, mišice pa močno degenerirajo. V primeru čezmernega izražanja Atg5 in Atg12 pa pride do podaljšanja življenjske dobe in zmanjšanja senescence, saj se vzdržuje delovanje mitohondrijev in motoričnih funkcij (Revuelta in Matheu, 2017).

Senescenca ali celično staranje je stanje, v katerem se celice ne delijo več oziroma ne proliferirajo ter izražajo drugačen fenotip, a kljub temu še vedno vršijo metabolne aktivnosti.

Poznamo i) spontano oziroma replikativno senescenco ter ii) prezgodnjo senescenco, ki je sprožena s stresom (Campisi, 1996; Bolden in Lowe, 2015):

i) replikativna senescenca je nepopravljiv zastoj celične proliferacije in spremenjenega delovanja celic, katerega nadzira več dominantno delujočih genov in je odvisna od števila celičnih delitev, vrste celic in starosti organizma.

Nastopi zaradi krajšanja telomer, kar je značilno za vse zdrave somatske celice.

Značilnosti celic v senescenci so: povečanje velikosti, povečanje vsebnosti proteinov, povečana jedra in lizosomi s povišano aktivnostjo β-galaktozidaz, povečana ekspresija in izločanje citokinov in kemokinov, rastnih faktorjev, sestavin zunajceličnega matriksa ter fibronektinov, kar pa vodi do aktivacije imunskega odziva in izločanja senescentnih celic.

ii) Prezgodnja senescenca, sprožena s stresom, je stanje, do katerega pride zaradi ekspresije onkogenov, izgube supresorja tumorskih celic, poškodb DNA ali reaktivacije supresorske poti tumorjev.

Znano je, da je ob pojavu senescence močno povečana avtofagija, še posebej makroavtofagija.

Aktivacija le-te je zaradi povzročenega stresa, ki povzroči staranje ali celično smrt, hkrati pa samo zaviranje avtofagije povzroča staranje celic (Wiley in Campisi, 2016). Tako lahko

(15)

8

rečemo, da je avtofagija kot nek senzor za zaznavanje staranja celic (Revuelta in Matheu, 2017).

2.4 AVTOFAGIJA V PATOFIZIOLOŠKEM STANJU

Avtofagija igra pomembno vlogo pri zaviranju širjenja raka, vendar pa je ta proces pri tumorjih dokazano »dvorezen meč« (ang. “double-edged sword”), saj je glede na vrsto celic oziroma tkiva in stadija tumorja avtofagija lahko tudi pospeševalec razvoja tumorja (Jiang in sod., 2019). Na to, ali bo avtofagija v prid zdravim celicam ali v prid rakavim celicam, vplivajo tudi razpoložljivost hranil, imunski odziv in vpliv mikrookolja (Alvarez-Metyhaler in sod., 2020). Z zagotavljanjem presnovne homeostaze, povečanjem poškodb DNA in sproščanjem ATP ter povečanjem proliferacije tumorskih celic avtofagija namreč spodbuja razvoj tumorja. Z zagotavljanjem normalne celične strukture, zaviranjem mutagenih snovi in preprečevanjem kopičenja poškodovanih beljakovin in organelov, zlasti mitohondrijev, pa zavira razvoj tumorja. Prav tako ima avtofagija pomembno vlogo pri predelavi antigenov za predstavitev le-teh poglavitvenemu histokompatibilnostnemu kompleksu I in II (ang. Major histocompatibility complex class I and II, MHCI in MHCII), saj okrepi predstavitev tumorskih antigenov do CD8+ T celic. Ugotovljeno je bilo, da so tumorji bolj odvisni od avtofagije kot običajna tkiva, saj so odvisni od recikliranja za ohranitev mitohondrijske funkcije in energijske homeostaze, da bi zadostili presnovnim potrebam po rasti in širjenju (Jiang in sod., 2019).

Kot že omenjeno, stadij tumorja pogojujejo koristnost delovanja avtofagije. Tako je pred začetkom tumorigeneze v zdravih tkivih avtofagija močno potrebna, saj omogoča genomsko stabilnost, preprečuje mutacije, preprečuje genotoksičnost pri nastajanju ROS v mitohondrijih ter preprečuje maligne transformacije, ki so potrebne za pojav raka. Ko pa je rak že razvit, je lahko avtofagija hitro bolj koristna za raka, saj rakavim celicam omogoči reprogramiranje metabolizma in s tem agresivnejšo rast kljub zdravljenju (Silva in sod., 2020).

Ta kompleksnost tumorjev je razlog, da je zdravljenje tumorjev z regulacijo avtofagije izredno zapleteno. Učinkovit pristop odstranjevanja ali zmanjševanja obsega rakavih celic ali tumorja je tako poznavanje optimalne kombinacije zaviralca, ki temelji na avtofagijii ter kemoterapije, radioterapije ali genske terapije. Dva, predklinično že testirana zaviralca rakavih celic, ki temeljita na avtofagiji, sta klorokin, ki poveča aktivnost DC, NK in T- celic ter 3-metiladenin (3-MA), ki znatno poveča apoptozo, povzročeno z IL-24 (Jiang in sod., 2019).

3 NARAVNE SPOJINE RASTLINSKEGA IZVORA IN AVTOFAGIJA

Uporaba naravnih spojin, za katere je značilna nizka toksičnost za normalno tkivo, je vedno bolj prisotna tema raziskav za induciranje avtofagije. Razumevanje mehanizma delovanja teh spojin bi lahko bilo ključno za razvoj novih terapevtskih ali kemopreventivnih možnosti za zdravljenje rakavih obolenj (Tian in sod., 2019). V nadaljevanju je opisanih nekaj najbolj zanimivih in do sedaj tudi najbolj raziskanih naravnih spojin rastlinskega izvora, ki s svojim delovanjem lahko inducirajo avtofagijo.

(16)

9 3.1 RESVERATROL

Resveratrol ali 3,5,4-trihidroksistilben je naravno prisotna ne-flavonoidna spojina ter spada pod spojine, ki omogočajo zaščito pred oksidativnim stresom. Najdemo ga v številnih rastlinah, ki ga producirajo kot odziv na različne zunanje stresne dejavnike, kot so prekomerna sončna svetloba, ultravijolično sevanje ali napad glivične okužbe in je tako prisoten v murvi, arašidih, ananasu, grozdju in vinu (Tian in sod., 2019).

3.1.1 Mehanizem induciranja avtofagije

Glavno mesto delovanja resveratrola je tarča rapamicina pri sesalcih (ang. Mammalian Target of Rapamycin, mTOR), kompleks serin/treonin kinaze, ki je osrednji zaviralec avtofagije v celicah sesalcev. Kompleks je bil prvič odkrit v zgodnjih devetdesetih kot tarča pri protiglivnem zdravilu rapamicin ter obstaja v dveh različnih kompleksnih oblikah, in sicer kot mTOR kompleks 1 (mTORC1) in kot mTOR kompleks 2 (mTORC2). Resveratrol naj bi izboljšal interakcijo med mTOR in DEP-domeno, ki vsebuje mTOR-interakcijski protein (ang. DEP domain-contaninig mTOR interacting protein, DEPTOR) z zaviranjem mTOR kompleksa. Bistvenega pomena za uravnavanje energijskega in presnovnega ravnovesja celice je namreč aktivacija AMP-aktivirane protein kinaze (ang. AMP-activated protein kinase, AMPK), ki s fosforilacijo deluje na različne molekule, kot je sestavni del kompleksa mTORC1- raptor in SIRT1 (ang. Sirtuin 1). V tem primeru resveratrol zavira aktivnost mTORC1 z aktiviranjem endogene AMPK, neposredno pa lahko tudi zavira mTOR. To pomeni, da dodajanje resveratrola in vitro zavira aktivnost mTOR ter inducira mTOR- odvisno avtofagijo. Tako tudi zmanjšuje sposobnost preživetja rakavih celic, saj avtofagija pospeši razgradnjo klasičnega receptorja avtofagije p62 ter zatre aktivacijo mTOR in Nrf2 (ang. Nuclear factor-Erythroid 2-related factor 2) (Slika 4) (Tian in sod., 2019).

Slika 4: Mehanizem delovanja resveratrola (Tian in sod., 2019).

(17)

10 3.1.2 Degradacija p62

p62 ali sekvestosom 1 je večdomenski protein, njegovo zaporedje aminokislin pa vključuje domene PB1, ZZ cinka, TB, regijo LC3-interakcije (LIR), Kelchu podobno ECH-povezano aminokislino 1 (ang. Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1), interakcijsko regijo KIR, dva signala jedrne lokalizacije (ang. Nuclear lokalization signal, NLS1/2), en motiv jedrnega izvoznega signala (ang. Nucelar export signal, NES) in domeno C, ki je povezana z ubikvitinom (ang. Ubiquitin-associated domain, UBA) (Slika 5) (Tian in sod., 2019).

Slika 5: Struktura večdomenskega proteina p62 (Ichimura in Komatsu, 2010).

Protein substrata za avtofagijo sodeluje z domeno UBA p62, kar tvori agregacijo oligomera p62 in substrata avtofagije. Skozi območje LIR p62 je agregacija usmerjena v avtofagosom ter se razgradi v lizosomu. Zaradi večnamenske funkcije p62 predstavlja center več signalnih poti, ki omogoča vzdrževanje in uravnavanje osnovnih celičnih funkcij, nenormalno kopičenje p62 zaradi oslabljene avtofagije pa na drugi strani spodbuja tumorigenezo z aktiviranjem signalne poti, ki jo ureja ta isti protein. Visoke koncentracije tega proteina namreč privedejo do maligne transformacije epiteljskih celic z ali brez oslabljene avtofagije.

V tem primeru je ključen resveratrol, ki poveča razgradnjo p62 proteina s povečanjem avtofagije, to pa spodbuja nastanek apoptoze. Le-ta aktivira kompleks Fas/Cav1 in cepitev beklina 1 ter aktiviranje kaspaze 8. Iz tega sledi, da sta avtofagija in apoptoza ključna biološka dejavnika za vzdrževanje stabilnosti, strukture in funkcije celice, nenormalnosti avtofagije pa povzročajo pojav rakavih celic. Prav tako resveratrol kot povzročitelj avtofagije prepreči napredovanje onkogenske transformacije in z razgradnjo p62 zmanjša ponovitev raka (Tian in sod., 2019).

3.1.3 Regulacija Nrf2

Nrf2 je signalni protein, ki uravnava transkripcijo in se odziva na oksidativni stres ter je pod regulacijo Keap1. Keap 1 je redoks občutljiv adaptor substrata ubikvitin ligaze E3 in se v primeru oksidativnega stresa oksidira v reaktivnh ostankih cisteina, to pa povzroči inaktivacijo Keap1 in stabilizacijo Nrf2. Nrf2 se v tem primeru preseli v jedro in se veže na

(18)

11

antioksidativne odzivne elemente ciljnih genov (ang. Antioxidant response elements, ARE).

V primeru kopičenja p62 proteina zaradi okvare avtofagije pride do aktiviranja Nrf2 z izolacijo Keap1 v inkluzijska telesa. Trajna aktivacija Nrf2 omogoča zaščito pred oksidativnim stresom v rakavih celicah ter poveča njihovo terapevtsko odpornost. Tukaj zopet nastopi naravna spojina resveratrol, ki olajša razgradnjo p62 in s tem zatre aktivacijo Nrf2, poleg tega pa ima tudi zaščitno vlogo pred oksidativnim stresom z uravnavanjem sinteze proteinov, ki sodelujejo v oksidativnem stresnem odgovoru ter uravnavanjem oksidaze, saj aktivira signalno pot Nrf2/ARE. To je še en dokaz več, da resveratrol preprečuje tumorigenezo (Tian in sod., 2019).

3.2 FLAVONOID -4,4- DIMETOKSIHALKON (DMC)

Flavonoid 4,4-dimetoksihalkon (ang. Flavonoid 4,4-dimethoxychalcone, DMC) je ena izmed nedavno odkritih naravnih spojin, ki ima sposobnost upočasniti staranje, zmanjšati možnost za srčni infarkt, ki ga povzroča dolgotrajna ishemija miokarda, hkrati pa močno vpliva na presnovo aminokislin (Zimmermann in sod., 2019). Odkrili so ga v rastlini Angelica keiskei koidzumi, ki ji v azijski tradicionalni medicini pripisujejo učinke na dolgoživost in zdravje (Carmona-Gutierrez in sod., 2019). Angelica keiskei koidzumi ali Ashibata, kar v japonščini pomeni »jutrišnji list«, je bila odkrita na Japonskem in spada v družino Apiaceae (Andrei, 2019).

3.2.1 Delovanje DMC

Študije delovanja DMC so izvajali na kvasovkah, črvih, miškah in muhah ter ugotovili, da ob motenju ali utišanju določenih proteinov Atg, ki so povezani z avtofagijo, DMC izgubi sposobnost podaljšanja življenjske dobe. Tako recimo pri miškah ob pogojno odstranjenem Atg7 v srčni mišici DMC ne more zaščititi miške pred ishemijo miokarda (Slika 6) (Zimmermann in sod., 2019). Prav tako motnja transkripcijskega faktorja GATA GLN325 in prekinitev protein fosfataze 2A (ang. Protein phosphatase 2A, PP2A) ter dušikovega odzivnega transkripcijskega regulatorja (ang. nitrogen-responsive transcriptional regulator, GLN3) ogrozita celično zaščito z DMC, medtem ko transkripcijski faktorji GATA Gat1, Dal80 in Gzf3 ne vplivajo na delovanje naravne spojine (Carmona-Gutierrez in sod., 2019).

Iz teh podatkov lahko sklepamo, da gre za vzročno delovanje DMC z avtofagijo, saj zaščitni učinki DMC delujejo le ob prisotnosti avtofagije (Zimmermann in sod., 2019). Hkrati pa DMC deluje neodvisno od kinaze TORC1, ki je glavni regulator avtofagije, katere zaviranje je bilo v veliki meri povezano z dolgoživostjo. Tako sama delecija glavne komponente TORC1 niti YPK1, ki je ciljna kinaza TORC2, ne vpliva na učinke delovanja DMC. Le-ta namreč ne vpliva na fosforilacijo ribosomskih proteinov S6 (Rps6), ki so označevalci aktivnosti TORC1 (Carmona-Gutierrez in sod., 2019).

(19)

12 Slika 6: Delovanje DMC (Zimmerman in sod., 2019).

Iz študije iz leta 2019 je razvidno, da je optimalni odmerek DMC za kvasne celice 100 µM, saj zmanjša starostno povečanje apoptotičnih in nekrotičnih celičnih populacij. Pri črvu C.elegans in sadni muhi Drosophila melanogaster je 200 µM odmerek DMC podaljšal življenjsko dobo za približno 20 %, ni pa vplival na vnos hrane ali na plodnost ter njegovo delovanje ni bilo odvisno od sestave hrane (Carmona-Gutierrez in sod., 2019).

V nadaljnjih raziskavah, ali bi DMC aktiviral avtofagijo, so ugotovili, da je v celicah kvasovk, ki so bile podvržene kronološkemu staranju, DMC povečal samodejno prerazporeditev fuzijskega proteina GFP-Atg8 (ang. Green fluorescent protein, GFP) proti vakuolam in njegovo nadaljnjo razgradnjo. Tako je nastal prosti GFP. Pri črvih je 48-urno hranjenje z DMC povzročilo povečano tvorbo avtofagosomov, možgani ostarelih muh po 30-dnevnem hranjenju z DMC pa so pokazali zmanjšano število Ref2P oziroma homologa človeškega sekvestosoma-1 (SQSTM1/p62). V človeških celičnih linijah U2OS, HCT116 in HepG2 je DMC povzročil avtofagijo ter zmanjšal raven SQSTM1/p62, pri miših divjega tipa (ang. Wild tipe, WT) C57BL/6 pa je DMC v jetrih in srcu sprožil povečanje lipidizacije LC3 in s tem povzročil avtofagijo (Carmona-Gutierrez in sod., 2019).

Istega leta je potekalo tudi raziskovanje možnih poti, po katerih naj bi DMC spodbujal avtofagijo, pri čemer so ugotovili, da DMC ni oslabil niti aktivnosti proteasomov niti ni povzročil stresa endoplazmatskega retikuluma. To pomeni, da je izključena možna pot delovanja DMC s ksenobiotiki. Ker zdravljenje z DMC v odsotnosti GLN3 ni moglo povzročiti avtofagije, je bila izključena tudi druga možnost delovanja naravne spojine, to je delovanje DMC v odsotnosti avtofagije. Se je pa s tem odkritjem dokazalo, da DMC posreduje svoj učinek z zaviranjem aktivnosti Gln3, saj so mutanti z izbrisanim GLN3 pokazali zmanjšano starostno odmiranje celic in višjo stopnjo avtofagije kot pa celice divjega

(20)

13

tipa. To pomeni, da deluje naravna spojina po isti poti kot GLN3 (Carmona-Gutierrez in sod., 2019).

3.3 CELASTROL

Celastrol ali tripterin je naravna spojina, katero najdemo v korenini rastline Trupterygium wilfordii (»grom božje trte«), ki je že več let pomemben del kitajske medicine (Liu in sod., 2019). Znano je namreč, da deluje protivnetno in zmanjšuje oksidativni stres, saj inducira povečano proizvodnjo protivnetnih citokinov in kemokinov ter migracijo imunskih celic v sklepe (Venkatesha in sod., 2016). Prav tako zatira tumorsko angiogenezo, zavira rast tumorja, inducira apoptozo ter ščiti celice pred nevrodegenerativnimi boleznimi (Han in sod., 2014). Tako bi lahko v prihodnosti pripomogel pri zdravljenju nekaterih avtoimunskih bolezni, kot je na primer artritis ter pri zdravljenju rakavih obolenj (Venkatesha in sod., 2016).

3.3.1 Delovanje celastrola

Izpostavljenost celic celastrolu povzroči zaustavitev celične delitve v fazi G2/M, sproži celično apoptozo preko aktiviranja reaktivnih kisikovih vrst in stres-aktivirane protein kinaze (ang. Reactive oxygen species/c-Jun-N-terminal kinase, ROS/JNK) oziroma preko aktiviranja signalizacije ROS/JNK ter povzroči avtofagijo, povečanje tvorbe avtofagosomov, kopičenje LC3B in sintezo proteina p62 ter blokira aktivnost mTOR kinaz in signalno pot Akt/mTOR (Slika 7). Sam zastoj celične delitve v fazi G2/S povzroči preko uravnavanja proteinov, ki so povezani s celičnim ciklom, in sicer regulira izražanje tumorskega supresijskega gena serin/treonin-protein kinaze Chk2 (ang. Checkpoint kinase 2, CHEK2), ki kodira protein Chk2, p-Chk2, cikline B1, p-cdc2 in p21 ter zmanjšuje izražanje Cdc25C. Celično apoptozo sproža preko aktiviranja zunanjih in notranjih poti, kot so morfološke spremembe v celicah, krčenje celic, kondenzacija kromatina in fragmentacija jedra ter povečanje koncentracije proteinov in kaspaz 3, 8 in 9 in s tem aktiviranjem signalne poti ROS/JNK, avtofagijo pa povzroča preko povečanja tvorbe LC3 in Beclin-1, p62 ter avtofagosomov in s tem zaviranjem signalne poti Akt/mTOR (Wen in Klionsky, 2016). Inducira tudi mitohondrijsko posredovano apoptozo, saj se po 24-urni izpostavljenosti celic celastrolu močno poveča število zgodnjih in poznih apoptotičnih celic ter se zmanjša mitohondrijski membranski potencial. Pri tem inhibicija apoptoze povzroči aktiviranje avtofagije, ravno tako pa inhibicija avtofagije povzroči aktiviranje apoptoze (Li in sod., 2015).

(21)

14 Slika 7: Vpliv celastrola na celice (Liu in sod., 2019).

Poleg uravnavanja ROS/JNK in Akt/mTOR signalnih poti celastrol modulira tudi Janus kinazo (ang. Janus kinase, JAK), ki je signalni pretvornik in aktivator transkripcije (ang.

Activator of transcription, STAT), fosfatdilinozitol-3-kinazo (PI3K) ter Toll-like receptor (TLR). Slednje uravnava z zaviranjem lipopolisaharid (LPS) povzročeno angiogenezo preko zaviranja aktivacije NF-kB, ki jo posreduje TLR4. To opazimo tudi pri makrofagih, kjer blokira vezavo LPS na kompleks TLR4. Preko zaviranja NF-kB zavira nastajanje protivnetnih citokinov TNFα, IL-1, IL-6β in IL-17 (Martinon in sod., 2020). Celastrol uravnava tudi HIF- 1α na več ravneh, ki lahko skupaj ali posamično prispevajo k njegovi protitumorski aktivnosti proti angiogenezi, a učinki in mehanizem navedene naravne spojine na signalne poti in angiogenezo še niso povsem znani (Gao in sod., 2019). To pa zato, ker je celastrol več-ciljna spojina, ki ima različne neposredne cilje in lahko aktivira zapletene kaskade signalov (Feng in sod., 2013).

3.4 BERBERIN

Berberin je izokinolinski kvaternarni alkaloid z 20 atomi ogljika in molekulsko maso 336 Da.

Najdemo ga v rastlinah rodov Berberis in Hydrasis ter ekstraktu rastline Rhizome coptidis in ima značilno avtofagično in apoptotično delovanje (Guaman-Ortiz in sod., 2017). Njegovo delovanje se že vrsto let s pridom uporablja v kitajski medicini za zdravljenje prebavil in driske, jetrne steatoze, diabetesa in zmanjševanje telesne teže, saj ima protimikrobno, antidiabetično ter protivnetno funkcijo in ščiti celice pred oksidativnim stresom (Sun in sod., 2018).

(22)

15 3.4.1 Delovanje berberina

Nedavne študije na miših so pokazale, da berberin inducira hranilni senzor SIRT1, ki spodbuja mišično funkcijo ter avtofagijo. SIRT1 je nikotinamid adenin dinukleotid (ang.

nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+), ki ga kodira gen SIRT1 in je odvisen do histonske deacetilaze ter je tarča histonskih in nehistonskih proteinov. Njegova glavna vloga v telesu številnih organizmov je podaljševanje življenjske dobe, uravnavanje odziva na post, omejevanje kalorij in gibanje ter obramba pred oksidativnim stresom (Elibol in Kilic, 2018).

Pomankanje SIRT1 proteina povzroči zmanjšanje sposobnosti berberina, da povzroči avtofagijo, kar nakazuje na neposredno povezavo med berberinom in SIRT1. Pomankanje SIRT1 namreč povzroči močno zmanjšanje LC3-II, pomemben pa je tudi z vidika uravnavanja avtofagije z deacetiliranjem Atg5 in Atg7. Tako naravna spojina berberin uravnava avtofagijo s pomočjo SIRT1 posredovane deacetilacije proteinov Atg (Sun in sod., 2018).

Dokazano je bilo, da so miši, katerim je bil dodan berberin, odporne na razvoj debelosti, saj je prišlo do povečane porabe energije in kisika, kar nakazuje na dejstvo, da je prišlo do enakomerne porabe ogljikovih hidratov v primerjavi z lipidi kot virom energije. Prav tako je izboljševal maščobnost miši preko povečanja signalizacije rekombinantnega proteina človeškega rastnega faktorja fibroblastov 21 (ang. Recombinant protein of human fibroblast growth factor 21, FGF21) ter izboljšanje porabe energije celotnega telesa. Tako bi lahko kot zaščito pred debelostjo začeli uporabljati berberin, s pomočjo katerega bi preko delovanja na FGF21 učinkoviteje porabljali zaužito energijo (Sun in sod., 2018).

3.5 UPORABA NARAVNIH SPOJIN RASTLINSKEGA IZVORA PRI RAKAVIH OBOLENJIH

Mnoge genetske študije so pokazale, da inaktivacjia različnih proteinov Atg ter drugih sodelujočih dejavnikov pri avtofagiji rezultira v razvoju nevrodegenerativnih bolezni, rakavih obolenj, srčnih okvar ter zmanjšani mišični masi, prav tako pa predstavlja tudi večjo možnost za razvoj Alzheimerjeve ali Parkinsonove bolezni (Revuelta in Matheu, 2017). Ker se število bolnikov s predhodno naštetimi boleznimi, predvsem bolnikov z rakom, vsako leto povečuje, je bilo v zadnjem desetletju izvedenih mnogo raziskav na različnih naravnih spojinah, med drugim tudi na tistih rastlinskega izvora. Med njimi je glede na širino spektra uporabe najbolj privlačen celastrol, pri katerem so že dokazali učinkovito protitumorsko in protirakavo delovanje proti več kot 5 vrstam rakavih obolenj. Dokazano je, da lahko naravne spojine že same po sebi inducirajo avtofagijo, vendar je njihovo protirakavo delovanje učinkovitejše v kombinaciji s kemoterapevtikom, pri čemer omogočijo avtofagijo v zdravih celicah in s tem vzdržujejo homeostazo, hkrati pa s pomočjo kemoterapevtika dokončno in ciljno razgrajujejo rakave celice in preprečijo njihovo širjenje. Študije na v nadaljevanju opisanih naravnih spojinah so bile usmerjene v induciranje avtofagije ter so pokazale pozitivne rezultate pri zaviranju širjenja raka, vendar je pred njihovo uporabo potrebno vedeti stadij razvoja rakavega obolenja. Njihova uporaba je namreč opravičena le v začetnih fazah raka, medtem ko je lahko pri razširjenem rakavem obolenju to le dodatna spodbuda za njegovo nadvlado v človeškem telesu in je bolj smotrno inhibirati avtofagijo, zato so tu potrebne še dodatne raziskave.

(23)

16

Celastrol naj bi imel protitumorsko delovanje proti različnim malignim boleznim, saj poveča tvorbo avtofagosomov, izražanje p62, kopičenje LC3B v celicah glioma, aktivacijo JNK, proizvodnjo ROS ter aktivira aktivnost mTOR kinaz. Raziskava na mišjih možganih, ki so imele razvit tumor, je pokazala, da celastrol močno poveča avtofagijo tumorskih celic ter ima hkrati zanemarljiv toksičen učinek na sosednje možganske celice in ostale organe (Liu in sod., 2019). Učinkovito naj bi deloval tudi proti kolorektalnemu raku (ang. Colorectal cancer, CRC), tj. malignemu tumorju notranje stene debelega črevesja, ki je na drugem mestu vzrokov smrti zaradi raka. Vendar pa je njegovo delovanje učinkovitejše v kombinaciji s kemoterapevtikom, kjer izrazito zmanjša hude neželene stranske učinke kemoterapije, kot so palmoplantarni eritem oziroma sindrom roka-noga, občutljive alergijske reakcije in nevropatija, hkrati pa poveča induciranje avtofagije v okoliških zdravih celicah, pri katerih se odstrani nastala škoda zaradi kemoterapevtika ter poveča citotoksičen učinek na rakave celice.

Kot najučinkovitejša kombinacija za kemoterapevtsko zdravljenje CRC se je izkazala kombinacija celastrola in salinomicina, ki je zaviralec matičnih celic raka (Gao in sod., 2019).

Najpogostejši primarni maligni tumor kosti je osteosarkom, proti kateremu bi prav tako potencialno uporabili celastrol, ki bi preko inhibiranja G2/M faze zaviral celično razmnoževanje ter induciral avtofagijo s povečano tvorbo avtofagosomov in LCB3-II v rakavih celicah (Li in sod., 2015). Učinkovit naj bi bil tudi pri razgradnji rakastih zaviralcev proteinske fosfataze 2A (ang. Cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A, CIP2A), ki je potreben za celično proliferacijo in maligno transformacijo ter posledično nastanek pljučnega raka. Razgrajuje jih po poti ubikvitin-proteasom, ki predstavlja glavno pot razgradnje znotrajceličnih proteinov v evkariontski celici (Liu in sod., 2014). Leta 2015 je Jianquan Guo s sodelavci odkril potencialno učinkovitost celastrola proti raku na prostati, in sicer naj bi pri zdravljenju zgodnje faze razvoja tovrstnega raka povzročil povečano ekspresijo genov ATG5 in ATG7 ter induciral avtofagijo rakavih celic (Guo in sod., 2015). Kot še neizkoriščen terapevtski potencial se je izkazal tudi pri raku želodca, pri katerem so stranski učinki kemoterapije še hujši kot pri poprej že omenjenih rakavih obolenjih. Poskusi na miškah z razvitim rakom na želodcu so pokazali pozitivne učinke zdravljenja s celastrolom, ki je povečal število avtofagosomov, inhibiral celično proliferacijo in migracijo ter zaviral AKT/mTOR signalno pot v rakavih celicah (Lee in sod., 2014).

Resveratrol, zaužit z grozdjem, naj bi zmanjšal tveganje za razvoj raka na dojkah za kar 50 odstotkov, saj koncentracijsko zavira sposobnost preživetja rakavih celic in pri tem uničuje le manjše število zdravih celic. Prav tako naj bi zaviral rast rakavih celic na prostati, pljučih in v ustni votlini ter v debelem črevesju. Resveratrol namreč posreduje avtofagijo preko Ca2+/AMPK-mTOR signalne poti ali pa tvori ROS in s tem povzroči smrt rakastih celic.

Izkazalo se je, da je kombinacija kemoterapije in resveratrola učinkovit način kemoterapevtskega zdravljenja rakavih bolnikov, saj resveratrol s pospešeno razgradnjo p62 in zaviranjem signalne poti p62 povečuje citotoksičen učinek zdravila (Tian in sod., 2019).

DMC naj bi zaviral rast matičnih celic glioma (ang. Glioma stem cells, GSC) preko induciranja avtofagije, vendar bi bil za učinkovito protitumorsko delovanje bolj primeren njegov analog, DMC-BH, ki je za razliko od DMC zmožen prehajati krvno-možgansko pregrado. Lei Shi in sodelavci so leta 2020 dokazali, da prisotnost DMC inducira nastanek večjega števila avtofagosomov v GSC celicah ter poveča izražanje proteina LC3-II in zmanjša raven SQSTM1. LD50 pri miškah je bila 48,0628 mg/kg, a je bilo dokazano, da je že koncentracija DMC-BH 20 mg/kg dovoljšna za induciranje avtofagije (Shi in sod., 2020).

(24)

17 4 ZAKLJUČEK

Avtofagija je zelo kompleksen, a hkrati zelo pomemben proces v vseh enoceličnih in večceličnih organizmih. Sodeluje z imunskim sistemom in tako omogoča normalno delovanje zdravih celic in učinkovitejše odstranjevanje tujkov, prav tako pa je nepogrešljiva pri odstranjevanju celic, ki so podlegle poškodbam DNA zaradi stresa ali drugega zunanjega dražljaja ter zaznava staranje celic, katere prav tako učinkovito odstrani. Lahko rečemo, da je prisotna na vseh koncih in krajih organizma ter uravnava homeostazo.

Najbolj okarakterizirane naravne spojine rastlinskega izvora, ki inducirajo avtofagijo, so resveratrol, celatrol, DMC in berberin. Resveratrol inducira avtofagijo preko mTOR kompleksa ter razgradnje klasičnega receptorja avtofagije p62, DMC deluje odvisno od Atg proteinov, celastrol preko inhibicije signalne poti Akt/mTOR in povečanja izražanja avtofagosomov ter p62, berberin pa preko hranilnega senzorja SIRT1.

Potencial za zdravljenje rakavih obolenj kažejo predvsem resveratrol, celastrol in DMC, ki so na predkliničnih testiranjih že pokazali potencial za zdravljenje malignih tumorjev, raka na dojkah, pljučih in na črevesju. Njihova glavna prednost pred ostalimi kemoterapevtiki je predvsem delovanje le na tarčne celice in ne-poškodovanje okoliških zdravih celic, pri čemer pa je pomembna ustrezna kombinacija kemoterapevtika in naravne spojine. Prav tako je pomembno vedeti, v kateri fazi razvoja je tumor, saj je lahko avtofagija poleg zaviranja rasti tumorja v že poznem stadiju tudi njegova pospeševalka.

Uporaba poznanih naravnih spojin rastlinskega izvora je široka in iz vidika prednosti pred ne- naravnimi spojinami zelo privlačna, a je zaradi omejenega števila ustreznih rastlin ter njihove dolgotrajne rasti in premajhne koncentracije naravnih spojin za industrijsko raven, postopek pridobivanja in uporaba le-teh predraga. Potrebne so tudi dodatne raziskave na kulturah človeških celic ter iskanje možnih alternativ za pridobivanje zgoraj omenjenih naravnih spojin rastlinskega izvora. K razumevanju uporabe naravnih spojin, ki inducirajo avtofagijo, pa bi pripomogle tudi dodatne raziskave na rakavih celicah, da bi lahko z gotovostjo vedeli, kdaj natanko je stadij razvoja rakavega obolenja tako daleč, da bi bilo avtofagijo smotrnejše zavirati kot pa inducirati.

5 VIRI

Alvarez-Metyhaler J.G., Garcia-Mayea Y., Mir C., Kondoh H., LLeonart M.E. 2020.

Autophagy Takes Center Stage as a Possible Cancer Hallmark. Frontiers in Oncology, 10:586069, doi:10.3389/fonc.2020.586069: 23 str.

Andrei M. 2019. Natural compound found to increase longevity in yeast, worms and cultured human cells: 1 str.

https://www.zmescience.com/science/natural-compound-longevity-18022019/ (februar 2021).

Belda I., Ruiz J., Santos A., Wyk N., Pretorius I. 2019. Saccharomyces cerevisiae. CellPress, 35, 12: 956-957

(25)

18

Blasiak J., Piechota M., Pawlowska E., Szatkowska M., Sikora E., Kaarniranta K. 2017.

Cellular Senescence in Age-Related Macular Degeneration: Can Autophagy and DNA Damage Response Play a Role? Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 5293258, doi:10.1155/2017/5293258: 15 str.

Bolden J. E., Scott W. L. 2015. Cellular senescence. V: The molecular basis of cancer. 4th ed.

Elsevier: 29-238

Campisi J. 1996. Replicative Senscence: An Old Live`s Tale? CellPress, 84, 4: 497-500 Carmona-Gutierrez D., Zimmermann A., Kainz K., Pietrocola F., Chen G., Maglioni S.,

Schiavi A. 2019. The flavonoid 4,4'-dimethoxychalcone promotes autophagy-dependent longevity across species. Nature Communications, 10, doi: 10.1038/s41467-019-08555-w:

17 str.

Elibol B., Kilic U. 2018. High Levels of SIRT1 Expression as a Protective Mechanism against Disease-Related Conditions. Frontiers in Endocrinology, 9: 614, doi:

10.3389/fendo.2018.00614: 7 str.

Feng L., Zhang D., Fan C., Ma C., Yang W., Meng Y., Wu W., Guan S., Jiang B., Yang M., Liu X., Guo D. 2013. ER stress-mediated apoptosis induced by celastrol in cancer cells and important role of glycogen synthase kinase-3β in the signal network. Cell Death and Disease, 4, doi:10.1038/cddis.2013.222: 10 str.

Gao Y., Zhou S., Pang L., Yang J., Li HJ., Huo X., Qian S.Y. 2019. Celastrol suppresses nitric oxide synthases and the angiogenesis pathway in colorectal cancer. Free radical research, 53, 3: 324-334

Glick D., Barth S., Macleod K.F. 2010. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. Journal of Pathology, 221, 1: 3-12

Guamán-Ortiz LM., Orellana M. I., Ratovitski E.A. 2017. Natural Compounds as Modulators of Non-apoptotic Cell Death in Cancer Cells. Current Genomics, 18, 2: 132-155

Guo J., Huang X., Wang H., Yang H. 2015. Celastrol Induces Autophagy by Targeting AR/miR-101 in Prostate Cancer Cells. PLoS One, 10, 10:e0140745, doi:10.1371/journal.pone.0140745: 18 str.

Han X., Sun S., Zhao M., Cheng X., Chen G., Lin S., Guan Y., Yu X. 2014. Celastrol stimulates hypoxia-inducible factor-1 activity in tumor cells by initiating the ROS/Akt/p70S6K signaling pathway and enhancing hypoxia-inducible factor-1α protein synthesis. PLoS One, 9, 11:e112470, doi:10.1371/journal.pone.0112470: 15 str.

Ichimura Y., Komatsu M. 2010. Selective degradation of p62 by autophagy. Semin Immunopathol, 32, 4: 431-436

Jiang G. M., Tan Y., Wang H., Peng L., Chen H. T., Meng X. J., Li L. L., Liu Y., Li W. F., Shan H. 2019. The relationship between autophagy and the immune system and its applications for tumor immunotherapy. Molecular Cancer, 18, 1:17, doi: 10.1186/s12943- 019-0944-z: 22 str.

Kuma A., Komatsu M., Mizushima N. 2017. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy, 13, 10: 1619-1628

(26)

19

Lee H.W., Jang K.S., Choi H.J., Jo A., Cheong J.H., Chun K.H. 2014. Celastrol inhibits gastric cancer growth by induction of apoptosis and autophagy. BMB Reports Online, 47, 12: 697-702

Levine B., Kroemer G. 2019. Functions of Autophagy Genes: A Disease Perspective. CellPress, 176, 1-2: 11-42

Li H.Y., Zhang J., Sun L.L., Li B.H., Gao H.L., Xie T., Zhang N., Ye Z.M. 2015. Celastrol induces apoptosis and autophagy via the ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma cells: an in vitro and in vivo study. Cell Death and Disease, 6, 1:e1604, doi:10.1038/cddis.2014.543: 14 str.

Liu X., Zhao P., Wang X., Wang L., Zhu Y., Song Y., Gao W. 2019. Celastrol mediates autophagy and apoptosis via the ROS/JNK and Akt/mTOR signaling pathways in glioma cells. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research, 38, 1:184, doi:10.1186/s13046-019-1173-4: 18 str.

Liu Z., Ma L., Wen Z.S., Hu Z., Wu F.Q., Li W., Liu J., Zhou G.B. 2014. Cancerous inhibitor of PP2A is targeted by natural compound celastrol for degradation in non-small-cell lung cancer. Carcinogenesis, 35, 4: 905-914

Mitchell P. 2012. Autophagy. Nexcelom Bioscience.

https://www.nexcelom.com/autophagy/ (februar 2021).

Parzych K.R., Klionsky D.J. 2014. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling, 20, 3: 460-473

Revuelta M., Matheu A. 2017. Autophagy in stem cell aging. Aging Cell. 16, 5: 912-915 Shi L., Sun G., Zhu H. 2020. Demethoxycurcumin analogue DMC-BH inhibits orthotopic

growth of glioma stem cells by targeting JNK/ERK signaling. Aging, 12, 14: 14718-14735 Silva V.R., Neves S.P., Santos L.S., Dias R.B., Bezerra D.P. 2020. Challenges and Therapeutic Opporunities of Autophagy in Cancer Therapy. Cancers (Basel), 12, 11: 3461, doi: 10.3390/cancers12113461: 36 str.

Stewart G.G. 2014. Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae. V: Encyclopedia of Food Microbiology. 2nd. ed. Elsevier: 309-315

Sun Y., Xia M., Yan H., Han Y., Zhang F., Hu Z., Cui A., Ma F., Liu Z., Gong Q., Chen X., Gao J., Bian H., Tan Y., Li Y., Gao X. 2018. Berberine attenuates hepatic steatosis and enhances energy expenditure in mice by inducing autophagy and fibroblast growth factor 21. British Journal of Pharmacology, 175, 2: 374-387

Tian Y., Song W., Li D., Cai L., Zhao Y. 2019. Resveratrol as A Natural Regulator Of Autophagy For Prevention And Treatment Of Cancer. Onco Targets and Therapy, 12:

8601-8609

Venkatesha S.H., Dudics S., Astry B., Moudgil K.D. 2016. Control of autoimmune inflammation by celastrol, a natural triterpenoid. Pathogens and Disease, 74, 6, doi:10.1093/femspd/ftw059: 12 str.

Wen X., Klionsky D. J. 2016. An overview of macroautophagy in yeast. Journal of Molecular Biology, 428: 0022-2836, doi:10.1016/j.jmb.2016.02.021: 19 str.

(27)

20

Wiley C.D., Campisi J. 2016. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell metabolism, 23, 6: 1013-1021

Zimmermann A., Kainz K., Hofer S.J., Bauer M.A., Schroeder S., Dengjel J., Pietrocola F., Kepp O., Ruckenstuhl C., Eisenberg T., Sigrist S.J., Madeo F., Gutierrez D.C., Kroemer G.

2019. 4,4'Dimethoxychalcone: a natural flavonoid that promotes health through autophagy- dependent and –independent effects. Autophagy, 15, 9: 1662-1664

ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Poloni Jamnik za izdatno pomoč pri izdelavi diplomskega dela. Prav tako bi se rada zahvalila Blažu Murnu, družini in sošolcem za podporo ter spodbudne besede med študijem.