IMUNSKI ODZIV IN FUNKCIONALNOST TOLL-U PODOBNIH RECEPTORJEV PRI BOLNIKIH S KLOPNIM MENINGOENCEFALITISOM, CEPLJENIH PROTI TEJ BOLEZNI

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Miša MARUŠIĆ

IMUNSKI ODZIV IN FUNKCIONALNOST TOLL-U PODOBNIH RECEPTORJEV PRI BOLNIKIH S

KLOPNIM MENINGOENCEFALITISOM, CEPLJENIH PROTI TEJ BOLEZNI

DOKTORSKA DISERTACIJA

Ljubljana, 2022

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Miša MARUŠIĆ

IMUNSKI ODZIV IN FUNKCIONALNOST TOLL-U PODOBNIH RECEPTORJEV PRI BOLNIKIH S KLOPNIM

MENINGOENCEFALITISOM, CEPLJENIH PROTI TEJ BOLEZNI

DOKTORSKA DISERTACIJA

IMMUNE RESPONSE AND FUNCTIONALITY OF TOLL-LIKE RECEPTORS IN VACCINE BREAKTHROUGH PATIENTS WITH

TICK-BORNE ENCEPHALITIS

DOCTORAL DISSERTATION

Ljubljana, 2022

(3)

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

II

Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepa Komisije za doktorski študij Univerze v Ljubljani z dne 1. 7. 2019 je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na Interdisciplinarnem doktorskem študijskem programu Bioznanosti, znanstveno področje znanosti o celici. Za mentorja je bila imenovana akad. prof. dr. Tatjana Avšič Županc.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednica: prof. dr. Mojca NARAT

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: prof. dr. Roman Jerala

Kemijski inštitut, Odsek za sintezno biologijo in imunologijo Član: izr. prof. dr. Miroslav PETROVEC

Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo

Datum zagovora:

Miša MARUŠIĆ

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ŠD Dd

DK UDK 616.831.9-002(043.3)

KG klopni meningoencefalitis, virus klopnega meningoencefalitisa, Toll-u podobni receptorji, imunski odziv, dendritične celice, citokini, kemokini, cepivo proti KME

AV MARUŠIĆ, Miša, mag. strukturne in funkcionalne biologije SA AVŠIČ ŽUPANC, Tatjana (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študijski program Bioznanosti, znanstveno področje znanosti o celici

LI 2022

LI IMUNSKI ODZIV IN FUNKCIONALNOST TOLL-U PODOBNIH RECEPTORJEV PRI BOLNIKIH S KLOPNIM MENINGOENCEFALITISOM, CEPLJENIH PROTI TEJ BOLEZNI

TD Doktorska disertacija

OP XV, 151 str., 12 pregl., 43 sl., 296 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Klopni meningoencefalitis (KME) je virusna bolezen centralnega živčnega sistema (CŽS), ki jo povzroča virus klopnega encefalitisa (KMEV). Najbolj učinkovita zaščita pred KME je cepivo, vendar nekateri posamezniki zbolijo kljub cepljenju. Cepljeni bolniki s KME so v primerjavi z necepljenimi starejši, imajo enofazni potek bolezni in razvijejo hujše bolezenske znake. Zaradi vse več dokazov o vpletenosti imunskega sistema v patološke manifestacije KME, smo z doktorsko nalogo želeli raziskati, ali se funkcionalnost Toll-u podobnih receptorjev (TLR) 3, 7 in 8 ter aktivacija imunskega sistema pri bolnikih s KME, ki zbolijo kljub cepljenju proti bolezni, razlikuje od necepljenih bolnikov s KME. Z genotipizacijo enonukleotidnih polimorfizmov (SNP), povezanih s funkcionalnostjo TLR, smo ugotovili, da je frekvenca divjega alela za TLR8 pri cepljenih bolnicah s KME višja kot pri necepljenih bolnicah, zato bi lahko funkcionalni TLR8 predstavljal dejavnik tveganja za pojav KME kljub cepljenju. S stimulacijo mononuklearnih celic iz periferne krvi (PBMC) cepljenih in necepljenih bolnikov s KMEV in vitro smo poskusili poustvariti dogajanje v začetni fazi patogeneze KME. Ugotovili smo, da se cepljeni in necepljeni bolniki s KME ne razlikujejo po izražanju površinskih aktivacijskih molekul na dendritičnih celicah, smo pa pri cepljenih bolnikih s KME v zgodnjih časovnih točkah in vitro simulacije izmerili statistično značilno nižje koncentracije citokinov IFN-α, IL-12p70 in IL-15, kar bi lahko omogočilo obsežnejše virusno razmnoževanje in vodilo v šibkejšo aktivacijo drugih imunskih celic ter nižji protitelesni odziv. Po drugi strani pa smo v pozni točki in vitro stimulacije izmerili višjo koncentracijo IL-6, ki bi lahko ojačala vnetni odziv in prispevala k porušenju krvno- možganske pregrade. V kliničnih vzorcih cepljenih bolnikov s KME, odvzetih v nevrološki fazi bolezni, smo izmerili sistemsko povišane koncentracije vnetnih citokinov. Večina vnetnih citokinov, povezanih s prirojenim in Th1 celičnim odzivom, je bila koncentrirana v likvorju in je pozitivno korelirala z imunskimi celicami, kar kaže na lokalizacijo Th1 in vnetnih odzivov v CŽS.

Cepljeni bolniki s KME so imeli še posebej izrazito povišan VEGF-A, ki bi lahko povzročil obsežnejše porušenje krvno-možganske pregrade in omogočil vstop imunskih celic v CŽS ter tako prispeval k oblikovanju intratekalnega vnetnega žarišča in k težjemu poteku bolezni. Obenem so imeli cepljeni bolniki s KME še dva meseca po pojavu nevroloških simptomov sistemsko povišane vrednosti IL-8/CXCL8 in GROα/CXCL1, kar kaže na dolgotrajno aktivacijo imunskega sistema.

Obsežnejši in dlje časa trajajoč vnetni odziv pri cepljenih bolnikih s KME nakazuje na vpletenost imunskega odziva v pojav in potek bolezni pri tej skupini bolnikov s KME, vendar so za podrobnejše razumevanje mehanizma, ki leži za pojavom bolezni kljub cepljenju, potrebne še dodatne raziskave.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)

DN Dd

DC UDC 616.831.9-002(043.3)

CX tick-borne encephalitis, tick borne encephalitis virus, Toll-like receptor, immune response, dendritic cell, cytokine, chemokine, tick-borne encephalitis vaccine AU MARUŠIĆ, Miša, M.Sc. Structural and Functional Biology

AA AVŠIČ ŽUPANC, Tatjana (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Interdisciplinary Doctoral Programme in Biosciences, Scientific Field Cell Sciences

PY 2022

TI IMMUNE RESPONSE AND FUNCTIONALITY OF TOLL-LIKE RECEPTORS IN VACCINE BREAKTHROUGH PATIENTS WITH TICK- BORNE ENCEPHALITIS

DT Doctoral dissertation

NO XV, 151 p., 12 tab., 43 fig., 296 ref.

LA sl AL sl/en

AB Tick-borne meningoencephalitis (TBE) is a viral disease of the central nervous system (CNS) caused by tick-borne encephalitis virus (TBEV). The most effective protection against TBE is vaccination, however, despite highly immunogenic vaccine, vaccine breakthrough (VBT) infections still occur. VBT TBE patients are usually older, develop a monophasic disease and more severe symptoms compared to unvaccinated TBE patients. In contrast to unvaccinated TBE patients, VBT TBE patients are older and more often develop monophasic disease with more severe clinical symptoms. With growing evidence on pathological involvement of immune system in TBE, we aimed to investigate the functionality of Toll-like receptors (TLRs) 3, 7 and 8 and the activation of the immune system in VBT TBE patients. Genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with TLR functionality showed that the frequency of the wild allele for TLR8 was higher in vaccinated females with TBE than in unvaccinated females with TBE, therefore functional TLR8 receptor could represent a risk factor for VBT TBE in women.

To recreate the events in the initial phase of TBE pathogenesis, we stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from VBT TBE and unvaccinated TBE patients with TBEV in vitro.

Vaccinated and unvaccinated TBE patients did not differ in the expression of activation molecules dendritic cells after stimulation with TBEV in vitro, however, significantly lower concentrations of IFN-α, IL-12p70 and IL-15 were measured in supernatants of stimulated PBMCs from VBT patients in early time points. This could lead to more extensive viral replication and impair the activation of other immune cells. On the other hand, an observed increased IL-6 expression in VBT patients in late stages of in vitro stimulation, could support the extensive inflammatory responses and contribute to the blood-brain barrier disruption. Additionally, in acute phase of the disease, VBT TBE patients had systemically elevated inflammatory cytokines, with majority of them concentrated in cerebrospinal fluid and positively correlating with immune cell counts, indicating a localized Th1 and inflammatory responses in the central nervous system. Markedly elevated VEGF-A could lead to an extensive disruption of the blood-brain barrier, supporting immune cells entry and the formation of an intrathecal inflammatory focus, therefore contributing to a more severe disease. Also, VBT TBE patients had systemically upregulated levels of IL- 8/CXCL8 and GROα/CXCL1 up to two months after the onset of neurological symptoms, indicating long-term systemic immune activation, which could explain the need for longer hospitalization of VBT TBE patients. An observed more extensive and prolonged inflammatory response in VBT TBE patients suggests an involvement of the immune response in the onset and development of the disease. However, additional studies are needed to better understand the mechanism behind vaccination breakthrough infections.

(6)

0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD

9

.$=$/296(%,1(

./-8ý1$'2.80(17$&,-6.$,1)250$&,-$.', ,,,

.(<:25''2&80(17$7,21.:' ,9

.$=$/296(%,1( 9

.$=$/235(*/('1,& ,;

.$=$/26/,. ;

2.5$-â$9(,16,0%2/, ;,,,

892'

+,327(=(

=$6129$5$=,6.$9(

35(*/('2%-$9

261291(=1$ý,/1267,.0(9

.ODVLILNDFLMD.0(9

=JUDGED.0(9

3RPQRåHYDQMH.0(9

(3,'(0,2/2*,-$.0(

.0(Y6ORYHQLML

3$72*(1(=$.0(

,0816.,2'=,91$2.8ä%26.0(9

3ULURMHQLLPXQVNLRG]LYQDRNXåERV.0(9

,QWHUIHURQVNLRG]LYQDRNXåERV.0(9

$QWDJRQLVWLþQRGHORYDQMH.0(9QDLPXQVNLRG]LYJRVWLWHOMD

3ULURMHQLFHOLþQLRG]LYQDRNXåERV.0(9

3ULGREOMHQLLPXQVNLRG]LYQDRNXåERV.0(9 %FHOLþQLLQSURWLWHOHVQLLPXQVNLRG]LYQDRNXåERV.0(9

7FHOLþQLLPXQVNLRG]LYQDRNXåERV.0(9

',$*1267,.$.0(

/DERUDWRULMVNHSUHLVNDYH

/DERUDWRULMVNHSUHLVNDYHNUYLLQOLNYRUMD

1HSRVUHGQHPHWRGHGRND]RYDQMDRNXåEHV.0(9

3RVUHGQHPHWRGHGRND]RYDQMDRNXåEHV.0(9

(7)

9,

.OLQLþQHSUHLVNDYH

35(35(ý(9$1-(2.8ä%6.0(9

(YURSVNDFHSLYDSURWL.0(

6HVWDYDFHSLYD

3URJUDPFHSOMHQMD

$SOLNDFLMDFHSLYDLQQHåHOHQLXþLQNL

,PXQRJHQRVWFHSLYSURWL.0(

&HOLþQLRG]LYQDFHSLYRSURWL.0(

3UHFHSOMHQRVWSUHELYDOVWYDHYURSVNLKGUåDY

,PXQRJOREXOLQL

1HVSHFLILþQL]DãþLWQLXNUHSL

%2/1,.,6.0(&(3/-(1,3527,7(-%2/(=1,

0$7(5,$/,10(72'(

0$7(5,$/

0(72'(

'RORþDQMHVSHFLILþQLKSURWLWHOHVSURWL.0(9 2VDPLWHYPRQRQXNOHDUQLKFHOLFSHULIHUQHNUYL3%0&

2VDPLWHYJHQRPVNH'1$

*HQRWLSL]DFLMD613YJHQLKUHFHSWRUMHY7/57/5LQ7/5 'RORþDQMHIXQNFLRQDOQRVWLUHFHSWRUMHY7/5LQLQYLWUR

3ULSUDYDFHOLF

3ULSUDYDGHORYQHUD]WRSLQHDNWLYDWRUMHYUHFHSWRUMHY7/5 6SRGEXMDQMH3%0&]DNWLYDWRUMLUHFHSWRUMHY7/5

0HUMHQMH,/YVXSHUQDWDQWLKVSRGEXMDQLK3%0&

3ULSUDYD.0(9]DVWLPXODFLMR3%0&

3ULSUDYDFHOLþQHOLQLMH9(52(

3RPQRåHYDQMH.0(9

ýLãþHQMH.0(9QD$PLFRQ8OWUDHSUXYHWDK]DXOWUDILOWUDFLMR 2VDPLWHY FHORNXSQH QXNOHLQVNH NLVOLQH LQ SUHYHUMDQMH SULVRWQRVWL

FHOLþQLKPLNRSOD]HP

.YDQWLILNDFLMD.0(9

6WLPXODFLMD3%0&V.0(9LQFHSLYRP)60(,0081LQYLWUR

(8)

9,,

3ULSUDYD3%0&]DVWLPXODFLMRLQYLWUR

6WLPXODFLMD3%0&LQYLWURV.0(9LQFHSLYRP)60(,0081 $QDOL]DSURILOD3%0&VSUHWRþQLPFLWRPHWURP

9]RUþHQMH3%0&

2]QDþHYDQMH3%0&

$QDOL]D3%0&VSUHWRþQLPFLWRPHWURP

'RORþDQMHNRQFHQWUDFLMHFLWRNLQRYLQNHPRNLQRY]PHWRGRVRþDVQH

DQDOL]HYHþUD]OLþQLKDQDOLWRY

'RORþDQMH NRQFHQWUDFLMH FLWRNLQRY LQ NHPRNLQRY Y VXSHUQDWDQWLK

VWLPXOLUDQLK3%0&

'RORþDQMHFLWRNLQRYLQNHPRNLQRYYVHUXPXLQOLNYRUMXEROQLNRYV

.0(LQYVHUXPX]GUDYLKRVHE

6WDWLVWLþQDDQDOL]D

5(=8/7$7,=5$=35$92

359,'(/5$=,6.$9(±)81.&,21$/12675(&(3725-(9 7/57/5,17/535,%2/1,.,+6.0(&(3/-(1,+

3527,%2/(=1,

5H]XOWDWL

*HQRWLSL]DFLMDSROLPRUIL]PRYYJHQLKUHFHSWRUMHY7/57/5LQ

7/5

'RORþDQMH IXQNFLRQDOQRVWL UHFHSWRUMHY 7/5 7/5 ,1 7/5LQ

YLWUR

5D]SUDYD

'58*,'(/5$=,6.$9(±,0816.,2'=,93267,08/$&,-,

3%0&6.0(9$/,&(3,920)60(,0081LQYLWUR

5H]XOWDWL

$NWLYDFLMD '& SR VWLPXODFLML 3%0& EROQLNRY V .0( LQ ]GUDYLK

RVHEV.0(9DOLFHSLYRP)60(,0081LQYLWUR

$NWLYDFLMD OLPIRFLWRY 7 SR VWLPXODFLML 3%0& EROQLNRY V .0( LQ

]GUDYLKRVHEV.0(9LQFHSLYRP)06(,0081LQYLWUR 'LIHUHQFLDFLMD OLPIRFLWRY % Y SOD]PDEODVWH SR VWLPXODFLML 3%0&

EROQLNRY V .0( LQ ]GUDYLK RVHE V .0(9 LQ FHSLYRP )06(

,0081LQYLWUR

(9)

9,,,

&LWRNLQVNL LQ NHPRNLQVNL RG]LY SR VWLPXODFLML 3%0& EROQLNRY V .0(LQ]GUDYLKRVHEV.0(9DOLFHSLYRP)60(,0081LQYLWUR

5D]SUDYD

$NWLYDFLMD'&LQFLWRNLQVNLRG]LYSRVWLPXODFLML3%0&V.0(9DOL

)60(,0081LQYLWUR

$NWLYDFLMDOLPIRFLWRY7LQFLWRNLQVNLRG]LYSRVWLPXODFLML3%0&V

.0(9DOL)60(,0081LQYLWUR

'LIHUHQFLDFLMDOLPIRFLWRY%YSOD]PDEODVWHSRVWLPXODFLML3%0&V

.0(9DOL)60(,0081LQYLWUR

75(7-,'(/5$=,6.$9(±$1$/,=$&,72.,16.(*$,1 .(02.,16.(*$2'=,9$%2/1,.296.0(9$.871,

)$=,%2/(=1,

5H]XOWDWL

.RQFHQWUDFLMDFLWRNLQRYLQNHPRNLQRYYVHUXPXFHSOMHQLKEROQLNRY

V.0(YDNXWQLID]LEROH]QLLQYVHUXPX]GUDYLKRVHE .RQFHQWUDFLMFLWRNLQRYLQNHPRNLQRYYVHUXPXLQOLNYRUMXFHSOMHQLK

EROQLNRYV.0(YDNXWQLID]LEROH]QL

.RQFHQWUDFLMFLWRNLQRYLQNHPRNLQRYYVHUXPXLQOLNYRUMXFHSOMHQLK

LQQHFHSOMHQLKEROQLNRYV.0(YDNXWQLID]LEROH]QL 9SOLY VWDURVWL VSROD LQ ãWHYLOD RGPHUNRY FHSLYD QD FLWRNLQVNL LQ

NHPRNLQVNLRG]LYSULEROQLNLKV.0(FHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL .RQFHQWUDFLMFLWRNLQRYLQNHPRNLQRYYVHUXPXFHSOMHQLKEROQLNRYV

.0(L]NRQYDOHVFHQWQHID]HEROH]QLLQYVHUXPX]GUDYLKRVHE .RUHODFLMD PHG NRQFHQWUDFLMDPL FLWRNLQRY LQ NHPRNLQRY WHU

LPXQVNLKFHOLFYVHUXPXLQOLNYRUMXFHSOMHQLKEROQLNRYV.0(

.RUHODFLMD PHG NRQFHQWUDFLMDPL FLWRNLQRY LQ NHPRNLQRY WHU

SURWLWHOHVLYVHUXPXLQOLNYRUMXFHSOMHQLKEROQLNRYV.0(

5D]SUDYD

6./(3,

329=(7(.6800$5<

329=(7(.

6800$5<

9,5,

(10)

IX

KAZALO PREGLEDNIC

Pregl. 1: Demografske značilnosti preiskovancev 40

Pregl. 2: Priprava delovnih raztopin aktivatorjev TLR 43 Pregl. 3: Kombinacije uporabljenih fluorescenčno označenih monoklonskih

protiteles (mAb) 49

Pregl. 4: Seznam citokinov in kemokinov, merjenih v supernatantih PBMC,

spodbujanih s KMEV ali cepivom FSME IMMUN 53

Pregl. 5: Seznam citokinov in kemokinov, merjenih v kliničnih vzorcih

preiskovancev 55

Pregl. 6: Frekvenca genotipov in alelov na polimorfnem mestu receptorja TLR3 rs3775291 pri cepljenih in necepljenih bolnikih s KME ter zdravih

prostovoljcih 57

prostovoljcih 58

prostovoljcih 59

prostovoljcih 60

Pregl. 10: Deleži odzivnih in neodzivnih posameznikov v testu funkcionalnosti

receptorjev TLR in vitro 61

Pregl. 11: Korelacija med koncentracijami citokinov in kemokinov ter imunskih celic v serumu in likvorju cepljenih bolnikov s KME ob pojavu

nevroloških znakov bolezni 110

Pregl. 12: Korelacija med koncentracijami citokinov in kemokinov ter anti-

KMEV IgG protitelesi v serumu in likvorju cepljenih bolnikov s KME 107

(11)

X

KAZALO SLIK

Sl. 1: Filogenetsko drevo KMEV serokompleksa 5

Sl. 2: Filogenetsko drevo KMEV 6

Sl. 3: Zgradba virusnega delca flavivirusov 7

Sl. 4: Shematski prikaz zgradbe genoma KMEV, virusnih beljakovin,

ki jih kodira virusna RNA 8

Sl. 5: Shematski prikaz življenjskega kroga KMEV 10

Sl. 6: Geografska razširjenost prenašalcev KMEV, klopov Ixodes spp. in

endemična območja KME 11

Sl. 7: Porazdelitev potrjenih primerov KME na 100 000 prebivalcev v letu

2019 po državah EU/EGP 12

Sl. 8: Prijavljeni primeri KME v Sloveniji po mesecih v letih 2016-2018 13 Sl. 9: Prijavljene incidenčne stopnje klopnega meningoencefalitisa (KME)

v letu 2018 po spolu in starostnih skupinah v Sloveniji 14 Sl. 10: Shematski prikaz prenosa KMEV znotraj življenjskega cikla klopov

in na človeka 14

Sl. 11: Shematski prikaz dvofaznega poteka KME 15

Sl. 12: Shematski prikaz okužbe gostitelja s KMEV 17

Sl. 13: Signalna kaskada aktivacije TLR receptorjev 20 Sl. 14: Signalna kaskada aktivacije RIG-I receptorjev 21 Sl. 15: Shematski prikaz pojava kliničnih simptomov KME, razmnoževanja

virusa in nastanka virusno specifičnih protiteles 30

Sl. 16: Shema cepljenja proti KME. 33

Sl. 17: Shema stimulacije PBMC bolnikov s KME in zdravih oseb s KMEV

in cepivom FSME IMMUN 47

Sl. 18: Določanje svetilnosti aktivacijskih markerjev na DC 50 Sl. 19: Določanje deleža aktiviranih in regulatornih limfocitov T 51 Sl. 20: Določanje deleža plazmablastov. A-ločitev limfocitov od ostalih vrst

levkocitov glede na velikost in granuliranost 52 Sl. 21: Izražanje HLA-DR in CD86 na DC po 24-urni in 48-urni stimulaciji

PBMC cepljenih in necepljenih zdravih oseb s KMEV in cepivom

FSME IMMUN in vitro ter pri nestimuliranih celicah 66

(12)

XI

Sl. 22: Faktor svetilnosti HLA-DR in CD86 na DC po 24-urni in 48-urni stimulaciji PBMC necepljenih zdravih oseb s cepivom FSME

IMMUN in vitro 67

Sli. 23: Izražanje HLA-DR in CD86 na DC po 24-urni in 48-urni stimulaciji PBMC cepljenih in necepljenih KME bolnikov s KMEV in vitro ter

pri nestimuliranih celicah 68

Sl. 24: Faktor svetilnosti HLA-DR in CD86 na DC po 24-urni in 48-urni stimulaciji PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME s KMEV

in vitro 69

Sl. 25: Delež celic Th (CD4+) in Tc (CD8+), ki izražajo aktivacijske markerje CD69, CD25 in HLA-DR po 6-dnevni stimulaciji PBMC necepljenih zdravih oseb s KMEV in cepivom FSME IMMUN in vitro ter pri

nestimuliranih celicah (NK) 70

Sl. 26: Faktor povečanja deleža celic Th (CD4+) in Tc (CD8+), ki izražajo aktivacijske markerje CD69, CD25 in HLA-DR po 6-dnevni stimulaciji PBMC necepljenih zdravih oseb s KMEV ali cepivom FSME IMMUN

in vitro 71

Sl. 27: Delež celic Th (CD4+) in Tc (CD8+), ki izražajo aktivacijske markerje CD69, CD25 in HLA-DR po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih

zdravih oseb s KMEV in vitro ter pri nestimuliranih celicah (NK) 72 Sl. 28: Faktor povečanja deleža celic Th (CD4+) in Tc (CD8+), ki izražajo

aktivacijske markerje CD69, CD25 in HLA-DR po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih zdravih in necepljenih oseb s KMEV in vitro 73 Sl. 29: Delež celic Th (CD4+) in Tc (CD8+), ki izražajo aktivacijske markerje

CD69, CD25 in HLA-DR po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME s KMEV in vitro ter pri nestimuliranih

celicah (NK) 74

Sl. 30: Faktor povečanja deleža celic Th (CD4+) in Tc (CD8+), ki izražajo aktivacijske markerje CD69, CD25 in HLA-DR po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME s KMEV in vitro 75 Sl. 31: Delež plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) po 6-dnevni stimulaciji

PBMC necepljenih zdravih oseb s KMEV in cepivom FSME IMMUN

in vitro ter pri nestimuliranih celicah (NK) 76

Sl. 32: Faktor povečanja deleža plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) po 6-dnevni stimulaciji PBMC necepljenih zdravih oseb s KMEV in

cepivom FSME IMMUN in vitro 77

(13)

XII

Sl. 33: Delež plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih zdravih oseb s KMEV in vitro ter pri nestimuliranih

celicah (NK) 77

Sl. 34: Faktor povečanja deleža plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih in necepljenih zdravih oseb s

KMEV in vitro 78

Sl. 35: Delež plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME s KMEV in vitro ter

pri nestimuliranih celicah (NK) 78

Sl. 36: Faktor povečanja deleža plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) po 6-dnevni stimulaciji PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME

s KMEV in vitro 79

Sl. 37: Koncentracija citokinov v supernatantu PBMC necepljenih zdravih oseb 24h, 48h in 6 dni po stimulaciji s KMEV in cepivom FSME

MMUN in vitro ter v supernatantu nestimuliranih celic (NK) 81 Sl. 38: Koncentracija citokinov v supernatantu PBMC cepljenih in necepljenih

zdravih oseb 24h, 48h in 6 dni po stimulaciji s KMEV in vitro ter v

supernatantu nestimuliranih celic (NK) 83

Sl. 39: Koncentracija citokinov v supernatantu PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME 24h, 48h in 6 dni po stimulaciji s KMEV ter v

supernatantu nestimuliranih celic (NK) 85

Sl. 40: Primerjava koncentracij citokinov in kemokinov v serumu cepljenih bolnikov s KME ob pojavu nevroloških znakov bolezni in v serumu

zdravih oseb 97

Sl. 41: Primerjava koncentracij citokinov in kemokinov v serumu in likvorju cepljenih bolnikov s KME ob pojavu nevroloških znakov bolezni 99 Sl. 42: Primerjava koncentracij citokinov in kemokinov v (A) serumu in (B)

likvorju cepljenih in necepljenih bolnikov s KME ob pojavu

nevroloških znakov bolezni 101

Sl. 43: Primerjava koncentracij citokinov in kemokinov v serumih, odvzetih 2–3 tedne (S2) in 1–2 meseca (S3) po pojavu nevroloških znakov

bolezni pri cepljenih bolnikih s KME z zdravimi kontrolami 103

(14)

XIII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

ADE od protiteles odvisno ojačanje (angl. antibody dependent enhancement) APC antigen predstavitvene celice

APRIL indukcijski ligand proliferacije (ang. A proliferation inducing ligand) BAFF faktor aktivacije limfocitov B (ang. B cell activating factor)

BCA B limfocitni kemoatraktant (angl. B cell-attracting chemokine) Bcl-2 protein B celičnega limfoma 2 (angl. B-cell lymphoma 2 protein) C kapsidna beljakovina (angl. capsid)

CCL ligand CCR (angl. CCR ligand)

CCR kemokinski receptor CCR (angl. CC chemokine receptor, beta chemokine receptor)

CD označevalec pripadnosti (angl. cluster of differentiation) cDC konvencionalne dendritične celice

CEF fibroblasti piščančjih zarodkov (angl. chick embryo fibroblasts) CL097 derivat imidazokinolinske spojine R848

CRP C-reaktivni protein

CXCL ligand CXCR (angl. chemokine C-X-C motif ligand)

CXCR kemokinski receptor CXCR (angl. CXC chemokine receptor) CŽS centralni živčni sistem

DC dendritične celice

DENV virus denga (angl. Dengue virus)

DNA deoksiribonukleinska kislina (angl. deoxyribonucleic acid) dsRNA dvoverižna RNA (angl. double stranded RNA)

ssRNA enoverižna RNA (angl. single stranded RNA) E ovojnična beljakovina (angl. envelope)

EDTA Etilendiamintetraocetna kislina (angl. Ethylenediaminetetraacetic acid ) EIA encimskoimunska metoda (angl. enzyme immunoassay)

ELISA encimsko-imunski test (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) ER endoplazemski retikulum

FSC svetlobni signal iz smeri vira svetlobe (angl. forward-scattered light) FTS fetalni telečji serum

GM-CSF granulocitno-makrofagne kolonije stimulirajoči faktor (angl. granulocyte macrophage colony stimulating factor)

HIV-1 virus humane imunske pomanjkljivosti 1 (angl. human immunodeficiency virus 1)

HLA-DR površinski celični receptor tipa MHC II HSV virus herpesa simpleksa

IFN interferon

IFNAR interferon-α/β receptor (angl. interferon-α/β receptor) Ig imunoglobulin

IL interlevkin

(15)

XIV IONO ionomicin

IP-10 z interferonom gama induciran protein 10 (angl. interferon gamma-induced protein 10)

IPS interferon beta promotor stimulator (angl. interferon-beta promoter stimulator)

IRF interferon regulatorni faktor (ang. interferon regulatory factor) ISG z interferoni spodbujeni gen (angl. interferon stimulated gene)

ISGF faktor stimulacije interferona 3 (angl. interferon-stimulated gene factor) I-TAC z interferom induciran alfa kemoatraktant limfocitov T (angl. interferon-

inducible T cell alpha chemoattractant) JAK kinaza janus (angl. Janus kinase) JE japonski encefalitis

JEV virus japonskega encefalitisa (angl. Japanese encephalitis virus) K23 sev Karlsruhe

Ki67 jedrni protein Ki67 KME klopni meningoencefalitis

KMEV virus klopnega meningoencefalitisa LGTV virus Langat (angl. Langat virus)

M membranska beljakovina (angl. membrane)

MCP makrofagni kemotaktični protein (angl. macrophage chemotactic protein) MDA-5 z diferenciacijo melanoma povezan protein 5 (angl. melanoma

differentiation-associated protein-5)

MHC poglavitni kompleks tkivne skladnosti (angl. major histocompatibility complex)

MIG z interferonom gama induciran monokin (angl. monokine induced by gamma interferon)

MIP makrofagni vnetni protein (angl. macrophage inflammatory protein) MMP-9 metaloproteinaza 9

MOI multipliciteta okužbe (angl. multiplicity of infection) MRI magnetna resonanca (angl. magnetic resonance imaging)

MyD88 diferenciacijski mieloidni protein 88 (angl. myeloid differentiation primary- response protein 88)

mRNA informacijska ribonukleinska kislina (angl. messenger RNA) NFκB nuklearni faktor kappa B

NIJZ Nacionalni inštitut za javno zdravje

NK celica naravna ubijalka (angl. natural killer cell) NS nestrukturna beljakovina (angl. nonstructural) NT nevtralizacijski test (angl. neutralisation test)

OAS oligoadenilatna sintetaza (angl. oligoadenylate synthetase) prM necepljena prekurzorska oblika membranske beljakovine M

(16)

XV

PAMP patogenom pridruženi molekularni vzorci (angl. pathogen associated molecular patterns)

PBMC mononuklearne celice iz periferne krvi (angl. peripheral blood mononuclear cells)

PD-1 protein programirane celične smrti 1 (angl. programmed cell death protein 1) pDC plazmacitoidne dendritične celice

PMA forbol-12-mirisat-13-acetat

Poly(I:C) poliinozinska:policitidinska kislina (angl. polyinosinic:polycytidylic acid) PRR receptorji za prepoznavo molekularnih vzorcev (angl. pattern recognition

receptor)

RIG-I z retinojsko kislino induciran gen I (angl. retinoic acid-inducible gene I) RLR RIG-1 podobni receptorji i (angl. RIG-I-like receptors)

RNA ribonukleinska kislina (angl. ribonucleic acid)

RT-PCR verižna reakcija s polimerazo z reverzno transkripcijo (angl. reverse transcription polymerase chain reaction)

SDF rasni dejavnik stromalnih celic (angl. stromal cell-derived factor)

SNP polimorfizem posameznega nukleotida (angl. single nucleotide polymorphism)

SSC svetlobni signal pravokotno na smer vira svetlobe (angl. side-scattered light) STAT signalni prenašalec in aktivator transkripcije (angl. signal transducer and

activator of transcription) TCR T celični receptor

Tc citotoksični limfocit T (angl. cytotoxic lymphocyte T)

TCID50 50-odstotni infektivni odmerek na tkivni kulturi (angl. 50-percent Tissue culture infective dose)

Th celica T pomagalka (angl. helper T cell)

TLR Toll-u podobni receptor (angl. Toll-like receptor) TNF tumor nekrozni faktor (ang. tumour necrosis factor) TRIM79α protein TRIM79α (angl. tripartite motif protein-79α) Tyk tirozinska kinaza (angl. tyrosine kinase)

WNV virus Zahodnega Nila (angl. West Nile Virus) YFV virus rumene mrzlice (angl. Yellow fever virus)

VEGF vaskularni endotelni rasni faktor (angl. vascular endothelial growth factor) ZIKV virus Zika (angl. Zika virus)

(17)

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost TLR receptorjev pri bolnikih s KME, cepljenih proti tej bolezni.

1 1 UVOD

Klopni meningoencefalitis (KME) je virusna bolezen centralnega živčnega sistema (CŽS), ki jo povzroča virus klopnega encefalitisa (KMEV). Ljudje se z evropskim podtipom KMEV (Eu-KMEV) lahko okužijo ob vbodu okuženega klopa ali z zaužitjem nepasteriziranega mleka ali mlečnih izdelkov okužene živine (Lindquist in Vapalahti, 2008; Hudopisk in sod. 2012). Večina okužb z Eu-KMEV poteka brez opaznih kliničnih znakov bolezni, v 72 % klinično izraženih okužb pa je bolezen dvofazna, pri čemer bolniki v drugi fazi bolezni razvijejo nevrološke znake, ki se lahko raztezajo vse od blažje oblike-meningitisa do hujših oblik-meningoencefalitisa ali meningoencefalomielitisa (Tomažič in sod., 1996; Kaiser, 2008; Gustafson in sod., 1992; Bogovič in Strle, 2015).

Kljub temu, da je smrtnost po okužbi z evropskim podtipom KMEV sicer nizka (1-2 %), večina kliničnih znakov pa po preboleli bolezni izzveni (Bogovic in Strle, 2015), do 5 % bolnikov trpi za trajnimi parezami, tretjina obolelih pa razvije postenecefalitični sindrom (Bogovič in sod., 2018), kar močno zniža kvaliteto njihovega življenja in predstavlja pomembno breme tudi za zdravstveni sistem.

Trenutno zdravil za zdravljenje okužbe z virusom KME ni na voljo, zato je zdravljenje bolnikov le podporno. Najbolj učinkovito zaščito pred KME predstavlja cepivo, ki pri 98- 99,5 % cepljenih ljudi uspešno spodbudi nastanek nevtralizacijskih protiteles (Heinz in sod., 2007; Loew-Baselli in sod., 2011). Kljub temu so v Sloveniji med leti 2000 in 2015 potrdili 39 primerov KME pri ljudeh, ki so bili cepljeni proti tej bolezni, kar je 1,7 % vseh dokazanih primerov KME v tem obdobju (Lotrič-Furlan in sod. 2017). Za to skupino bolnikov je značilen poseben vzorec pojavljanja protiteles proti KMEV, saj pojav nevroloških znakov bolezni spremlja močan porast specifičnih in visoko avidnih ter nevtralizacijskih IgG protiteles, ki ga spremlja odsotnost ali nizki titri IgM protiteles (Stiasny in sod., 2009; Andersson in sod., 2010; Lotrič-Furlan in sod. 2017). To nakazuje na anamnestični odziv, ki pa pri osebah, ki zbolijo za KME kljub cepljenju, verjetno ni dovolj učinkovit, da bi preprečil nastanek bolezni (Stiasny in sod., 2009). Obenem so bolniki s KME po cepljenju proti tej bolezni, v primerjavi z necepljenimi, v povprečju starejši, bolezen poteka enofazno in večinoma v težji obliki (Lotrič-Furlan in sod.

2017).Vzroki in mehanizmi, odgovorni za pojav KME, kljub cepljenju proti tej bolezni, do sedaj še niso bili opredeljeni.

Z doktorsko nalogo smo želeli osvetliti nekatere ključne dogodke v oblikovanju učinkovite imunske obrambe proti KMEV in prispevati k boljšemu razumevanju virusne patogeneze. Pomembno vlogo pri zgodnji zamejitvi virusnega pomnoževanja in širjenja po telesu ima dovolj obsežna aktivacija prirojenega imunskega sistema, kakor tudi sodelovanje prirojenega in pridobljenega imunskega sistema. Zaradi narave poteka KME, ki se v prvi fazi kaže z nespecifičnimi bolezenskimi znaki, so za raziskave patogeneze KME na razpolago predvsem klinični vzorci, odvzeti v drugi fazi bolezni, ki navadno

(18)

2

nastopijo približno tri tedne po okužbi s KMEV. Tako smo, da bi bolje razumeli dogodke, ki sledijo vstopu virusa v telo, s stimulacijo PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME in vitro poskusili poustvariti dogajanje v začetni fazi patogeneze KME.

Ene izmed prvih celic, ki pridejo v stik z virusom, so dendritične celice (DC), ki jih virus okužuje in se v njih razmnožuje (Labuda in sod. 1996, Thangamani in sod., 2017).

Aktivacijska sposobnost in ustrezno delovanje DC sta odvisna od funkcionalnosti Toll-u podobnih receptorjev (TLR, ang. Toll-like receptor) 3, 7 in 8, ki z aktivacijo specifičnih transkripcijskih faktorjev sprožijo nastanek interferonov tipa I (IFN I) na eni, ter vnetnih citokinov na drugi strani. IFN I aktivirajo izražanje t.i. od interferonov odvisnih genov (ISG, ang. interferon-stimulated genes), ki omejijo razmnoževanje flavivirusov (Lindqvist in sod., 2018), vnetni citokini pa sodelujejo pri aktivaciji celic prirojenega in pridobljenega imunskega sistema. Predispozicijo za razvoj hude oblike bolezni KME povezujejo s polimorfizmi genov TLR3 (Kindberg in sod., 2011; Barkhash in sod., 2013;

Mickiene in sod., 2014), funkcionalnost receptorjev TLR7 in TLR8 pa povezujejo z obsegom viremije, nastankom vnetnega odziva, sintezo protiteles ter potekom bolezni pri okužbi z drugimi flavivirusi (Town in sod., 2009;Sarion in sod., 2011; Xie in sod., 2013;

Sabouri in sod., 2014). Poleg aktivacije prirojenega imunskega odziva, ima pomembno vlogo pri zamejitvi virusne okužbe tudi učinkovita aktivacija limfocitov T in B ter nastanek spominskih celic, ki nudijo dolgotrajno zaščito in se ob ponovnem stiku z antigenom hitro reaktivirajo. V doktorski nalogi smo tako želeli raziskati funkcionalnost TLR receptorjev in aktivacijo DC ter ugotoviti, ali se aktivacijska in efektorska funkcija limfocitov T ter sposobnost diferenciacije limfocitov B v plazmablaste, ki izločajo specifična protitelesa, razlikuje med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME po preboleli okužbi.

Kljub temu, da je močan imunski odziv v zgodnji fazi okužbe ključen za hitro odstranitev virusov in preprečevanje razvoja bolezni (King in sod., 2015; Lindqvist in sod., 2016), pa čedalje več raziskav nakazuje na neposredno vključenost imunskega sistema v nevropatološke manifestacije KME (Lepej in sod., 2007; Gunther in sod., 2011; Kang in sod., 2013; Grygorczuk in sod., 2017; Grygorczuk in sod., 2018; Bogovič in sod., 2019).

Ker bolezen pri bolnikih, cepljenih proti KME v večini primerov poteka enofazno in v težji obliki, bolniki pa so navadno hospitalizirani za dlje časa v primerjavi z necepljenimi bolniki s KME (Lotrič-Furlan in sod., 2017; Dobler in sod., 2020), smo želeli opredeliti citokinski in kemokinski odziv bolnikov, cepljenih proti KME v akutni fazi bolezni in ugotoviti, ali se razlikuje od citokinskega odziva necepljenih bolnikov s KME.

Zaradi naraščajoče ozaveščenosti prebivalstva o pomenu cepljenja proti KME obstaja verjetnost, da se bo število cepljenih z leti povečevalo, kar pa bi lahko pomenilo tudi večje število primerov KME kljub cepljenju proti tej bolezni. Tako smo z doktorsko nalogo želeli ugotoviti, kateri so morebitni dejavniki tveganja za nastanek okužbe kljub cepljenju

(19)

SURWL.0(LQPRUGDSULVSHYDWLNREOLNRYDQMXQRYLKVPHUQLF]DFHSOMHQMHLQVSUHPOMDQMH RVHE]YLãMRVWRSQMRWYHJDQMD]DUD]YRM.0(FHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL

+,327(=(

9GRNWRUVNLQDORJLVPRSUHYHUMDOLVOHGHþHKLSRWH]H

+3ROLPRUIL]PHUHFHSWRUMHY7/5LQSRYH]XMHMR]REVHåQHMãRYLUHPLMRLQWHåMLP SRWHNRP EROH]QL SUL RNXåEDK V IODYLYLUXVL 3UHGYLGHYDPR GD VH IUHNYHQFD DOHORY QD SROLPRUIQLKPHVWLKUHFHSWRUMHY7/5UD]OLNXMHPHGEROQLNLKV.0(NLVRELOLFHSOMHQL SURWLWHMEROH]QLLQQHFHSOMHQLPLEROQLNLV.0(

+ 3RPHPEQR YORJR SUL XþLQNRYLWHP LPXQVNHP RG]LYX QD YLUXVQR RNXåER LPDMR GHQGULWLþQHFHOLFHNLSUHNRUHFHSWRUMHY7/5SUHSR]QDMRYLUXVQRQXNOHLQVNRNLVOLQRLQVH DNWLYLUDMR2EWHPSRYHþDMRL]ORþDQMHFLWRNLQRYLQQDSRYUãLQRL]UD]LMRNRVWLPXODWRUQH PROHNXOHNLVRSRWUHEQH]DDNWLYDFLMROLPIRFLWRY7LQ%3UHGYLGHYDPRGDMHVWRSQMD DNWLYDFLMHGHQGULWLþQLKFHOLFFHSOMHQLKEROQLNRYV.0(QLåMDYSULPHUMDYL]QHFHSOMHQLPL EROQLNLV.0(

+2VHEHNL]EROLMR]D.0(NOMXEFHSOMHQMXSURWLWHMEROH]QLLPDMRSRJRVWRHQRID]QL LQ KXMãL SRWHN EROH]QL NDU SRYH]XMHPR ] REVHåQHMãR DNWLYDFLMR LPXQVNHJD RG]LYD LQ SRYLãDQLPLYUHGQRVWPLYQHWQLKFLWRNLQRY3ULþDNXMHPRGDERPRSULFHSOMHQLKEROQLNLKV .0(GRND]DOLYLãMHNRQFHQWUDFLMHYQHWQLKFLWRNLQRYYDNXWQLQHYURORãNLID]LEROH]QLNRW SULQHFHSOMHQLKEROQLNLK.0(

=$6129$5$=,6.$9(

5D]LVNDYRVPRUD]GHOLOLYWULGHOH

9 SUYHP GHOX GRNWRUVNH QDORJH VPR UD]LVNDOL DOL MH IXQNFLRQDOQRVW UHFHSWRUMHY 7/5 UD]OLþQDSULFHSOMHQLKLQQHFHSOMHQLKEROQLNLKV.0(=JHQRWLSL]DFLMR613UHFHSWRUMHY 7/5LQVPRåHOHOLXJRWRYLWLDOLMHSULEROQLNLKV.0(NL]EROLMRNOMXEFHSOMHQMX SURWL WHM EROH]QL IUHNYHQFD SROLPRUIL]PRY UHFHSWRUMHY 7/5 LQ GUXJDþQD NRW SUL QHFHSOMHQLK EROQLNLK V .0( WHU ]GUDYLK SURVWRYROMFLK 3ROHJ JHQHWVNHJD ]DSLVD ]D IXQNFLRQDOQL UHFHSWRU 7/5 MH ]D XVWUH]HQ SURWLYLUXVQL RG]LY SRVUHGRYDQ V 7/5 UHFHSWRUMLSRPHPEQDXþLQNRYLWDDNWLYDFLMDFHORWQH7/5VLJQDOQHSRWL'DELSUHYHULOL DOLMH7/5VLJQDOQDSRWSULFHSOMHQLKEROQLNLKV.0(IXQNFLRQDOQDVPR3%0&FHSOMHQLK LQQHFHSOMHQLKEROQLNRYV.0(VWLPXOLUDOL]]QDQLPLDJRQLVWLUHFHSWRUMHY7/5WHU LQ Y VXSHUQDWDQWLK GRORþDOL NRQFHQWUDFLMR YQHWQHJD FLWRNLQD ,/ WHU JD SULPHUMDOL ] UHIHUHQþQLPLYUHGQRVWPLRG]LYQLKRVHE

(20)

4

V drugem delu doktorske disertacije smo raziskovali aktivacijo imunskega sistema po in vitro stimulaciji PBMC necepljenih zdravih oseb s KMEV in cepivom FSME IMMUN (Pfizer Luxembourg SARL, Luksemburg, Luksemburg) in PBMC cepljenih zdravih oseb ter cepljenih in necepljenih bolnikov s KME, odvzetih po preboleli okužbi, s KMEV. S pretočno citometrijo smo ugotavljali izražanje aktivacijskih markerjev na površini DC in limfocitov T ter diferenciacijo limfocitov B v plazmablaste, aktivacijo imunskih celic pa smo opredelili tudi na citokinskem nivoju.

Ker se cepljeni in necepljeni bolniki med seboj razlikujejo po poteku in trajanju bolezni, smo v tretjem delu raziskave želeli ugotovili kakšen je citokinski in kemokinski odziv bolnikov, cepljenih proti KME v akutni fazi bolezni in ali se le ta razlikuje od citokinskega odziva necepljenih bolnikov s KME. V kliničnih vzorcih obeh skupin bolnikov s KME in zdravih prostovoljcih, ki so ustrezali po spolu in starosti, smo z metodo sočasne analize več različnih analitov izmerili koncentracije imunskih mediatorjev, povezanih s prirojenim ter pridobljenim T in B celičnim odzivom v akutni in konvalescentni fazi bolezni.

(21)

35(*/('2%-$9

261291(=1$ý,/1267,.0(9 .ODVLILNDFLMD.0(9

.0(9 VNXSDM ] GUXJLPL ]D þORYHND SDWRJHQLPL YLUXVL NRW VR YLUXV =DKRGQHJD 1LOD DQJO:HVW 1LOH YLUXV :19 YLUXV UXPHQH PU]OLFH DQJO<HOORZ IHYHU YLUXV <)9 YLUXVMDSRQVNHJDHQFHIDOLWLVDDQJO-DSDQHVHHQFHSKDOLWLVYLUXV-(9YLUXV=LNDDQJO

=LND YLUXV =,.9 LQ YLUXV GHQJD DQJO'HQJXH YLUXV '(19 VRGL Y URG)ODYLYLUXV GUXåLQH )ODYLYLULGDH )ODYLYLUXVL VH QD QDUDYQH JRVWLWHOMH SUHQDãDMR ] RNXåHQLPL þOHQRQRåFLNRWVRNORSLLQNRPDUML]DWRVSDGDMRYVNXSLQRDUERYLUXVRYDQJDUWKURSRGH ERUQHYLUXV0HGNORSQRSUHQRVOMLYHIODYLYLUXVHSROHJ.0(9VSDGDMRWXGLYLUXVEROH]QL JR]GD.\DVDQXUDQJO.\DVDQXU)RUHVWGLVHDVHYLUXV.)'9YLUXVRPVNHKHPRUDJLþQH PU]OLFHDQJO2PVNKHPRUUKDJLFIHYHUYLUXV2+)9YLUXV3RZDVVDQDQJO3RZDVVDQ YLUXV 32:9 YLUXV /RXSLQJ LOO DQJO/RXSLQJ LOO YLUXV /,9 LQ YLUXV /DQJDW DQJO /DQJDWYLUXV/*79LQWYRULMRWL.0(9VHURNRPSOHNVVOLND

6OLND)LORJHQHWVNRGUHYR.0(9VHURNRPSOHNVDUGHþH'REOHULQVRG

(22)

6

Na podlagi filogenetskih analiz zaporedij beljakovine E so ločili tri glavne podtipe KMEV: evropski, sibirski in daljnovzhodni podtip (slika 2), ki se med seboj razlikujejo v do 5,6 % aminokislinskega zaporedja (Ecker in sod., 1999). Nedavno so odkrili še dva potencialna podtipa KMEV, enega v bližini Bajkalskega jezera in severne Mongolije, ki so ga poimenovali bajkalski podtip (Kozlova in sod., 2018), drugega pa v svizcih vrste Marmota himalayana v bližini Tibeta na Kitajskem, ki so ga poimenovali himalajski podtip KMEV (Dai in sod., 2018). Zaenkrat zemljepisna porazdelitev in klinični pomen predlaganih podtipov KMEV ostajata še neznana.

Slika 2: Filogenetsko drevo KMEV (prirejeno po Ecker in sod., 1999)

(23)

7 2.1.2 Zgradba KMEV

Infektivni virusni delci KMEV so okrogle oblike in v premeru merijo okrog 50 nm (slika 3). Njihovo ikozaedrično nukleokapsido obdaja lipidna ovojnica gostiteljskega izvora, v katero sta vgrajeni dve strukturni beljakovini – glikozilirana ovojnična beljakovina (angl.

envelope, E) in neglikozilirana membranska beljakovina (angl. membrane, M).

Slika 3: Zgradba virusnega delca flavivirusov. A- shematični prikaz nezrelega in zrelega flavivirusnega delca; B- rekonstrukcija psevdoatomskaega krioelektronskega modela nezrelega flavivirusnega viriona; C- rekonstrukcija psevdoatomskega krioelektronskega modela zrelega flavivirusnega viriona; D- krioelektronska mikrografija nezrelih virionov KMEV (prirejeno po Dobler in sod., 2020:19).

Genom KMEV je pozitivno-polarna enovijačna ribonukleinska kislina (angl. ribonucleic acid, RNA), dolga približno 11 000 nukleotidov. Genomska RNA je z več kopijami kapsidne beljakovine (angl. capsid, C) povezana v kapsidno jedro s premerom okrog 30 nm (Lindenbach in sod., 2013). RNA nosi zapis za en sam odprti bralni okvir, dolg več kot 10 000 nukleotidov, ki ga na obeh koncih obdajata nekodirajoči regiji, na 5'- koncu je metilirana kapa, 3'-konec pa je brez poliadenilatnega repa (slika 4). Kodirajoči del genoma KMEV se prepiše v en sam poliprotein iz približno 3400 aminokislin, ki se s ko- in posttranslacijskimi procesiranjem preveden v tri strukturne (C, prM in E) in sedem nestrukturnih beljakovin (NS; NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B in NS5) (Heinz in Madl, 1993), nekodirajoči deli genoma pa tvorijo sekundarne strukture, ki najverjetneje sodelujejo pri pomnoževanju in prevajanju genoma ter sestavljanju viriona (Thurner in sod., 2004; Gritsun in sod., 1997; Proutski in sod., 1997a, Proutski in sod.,1997b).

(24)

8

Slika 4: Shematski prikaz zgradbe genoma KMEV, virusnih beljakovin, ki jih kodira virusna RNA (prirejeno po Dobler in sod., 2020:20).

Strukturne beljakovine so virusni gradbeni elementi. Beljakovina C je majhna, močno pozitivno nabita in bazična beljakovina, ki v povezavi z virusno RNA gradi nukleokapsido. Manjša ovojnična beljakovina prM-glikoziliran prekurzor membranske beljakovine M, deluje kot šaperon in usmerja zvijanje beljakovine E (Lorenz in sod., 2002). Glavna ovojnična beljakovina E je zgrajena iz treh domen (DI-DIII) in predstavlja osrednjo tarčo nevtralizacijskih protiteles. Posreduje vezavo virusa na receptor tarčne celice in njegov vstop z endocitozo, saj omogoča zlitje virusne membrane z membrano endocitotskega vezikla, pri izstopu virusa iz celice pa -omogoči zlitje membrane endocitotskih veziklov in plazmaleme (Heinz in Allison, 2003; Lindenbach in sod., 2013;

Mandl, 2005). Dve beljakovini E skupaj z dvema beljakovinama M oblikujeta heterotertramer, ki je glavna gradbena enota viriona (Füzik in sod., 2018).

Poleg strukturnih, pri prevajanju virusnega genoma nastanejo tudi nestrukturne beljakovine (NS). NS1 je močno ohranjena beljakovina med različnimi flavivirusov, ki skupaj z drugimi nestrukturnimi beljakovinami tvori t.i. replikacijski kompleks ter v sodelovanju z gostiteljskimi beljakovinami podpira pomnoževanje virusa, prevajanje genoma in sestavljanje novih virionov (Cervantes-Salazar in sod., 2015). NS1 obstaja v monomerni obliki, ki je prosto v citoplazmi, v dimerni obliki, vezani na membrano, ter v heksamerni obliki, ki se izloča v krvožilje in deluje kot topni antigen. NS1 je močno imunogena molekula, saj aktivira Toll-u podobne receptorje in spodbudi močan humoralni odziv (Chen in sod., 2015), po drugi strani pa lahko zavre delovanje komplementnega sistema, aktivira trombocite in imunske celice ter preko interakcije z endotelnimi celicami povzroči porušenje medceličnih stikov, ki vzdržujejo endotelijsko

(25)

9

pregrado (Avirutnan in sod., 2011; Rastogi in sod., 2016; Puerta-Guardo in sod., 2019).

NS2A je vključena v oblikovanje replikacijskega kompleksa ter sestavljanje virusa (Lindenbach in Rice, 2003), s svojim imunomodulatornim delovanjem pa lahko zavre signalizacijo interferonov (IFN) (Liu in sod., 2004). Beljakovina NS2B je ključni kofaktor proteazne aktivnosti beljakovine NS3, ki omogoča razgradnjo prevedene poliproteinske molekule. Mutacije v bližini aktivnega mesta proteaze NS2B-NS3 naj bi vplivala na nevroinvazivnost KMEV pri miših (Bollati in sod., 2010). NS3 poleg funkcije serinske proteaze opravlja še vlogo helikaze in RNA nukleozid trifosfataze (Lindenbach in Rice, 2003). NS4A skupaj z NS1 in NS2A tvori replikacijski kompleks (Uchil in sod., 2003), NS4B pa je sposobna delno zavreti aktivacijo signalnega prenašalca in aktivatorja transkripcije (ang. signal transducer and activator of transcription, STAT1) in s tem omejiti IFN odziv (Muñoz-Jordan in sod., 2005). Največja in med flavivirusi najbolj ohranjena nestrukturna beljakovina je beljakovina NS5 - od RNA odvisna RNA polimeraza (Steffens in sod., 1999). Ta beljakovina ima metiltransferazno in RNA polimerazno aktivnost in skupaj z NS3 tvori polimerazni kompleks, ki je preko NS1 in NS2A povezan z membrano endoplazemskega retikuluma (Lindenbach in Rice, 2003).

Ugotovili so, da NS5 s svojim delovanjem tudi zavira signalizacijo preko JAK-STAT signalne poti (Best in sod., 2005, Werme in sod., 2008).

2.1.3 Pomnoževanje KMEV

Okužba gostiteljske celice s KMEV se prične z vezavo virusne beljakovine E na celični receptor, ki do zdaj še ni natančno opredeljen (slika 5). Eden izmed potencialnih receptorjev za vstop KMEV v celico je heparan sulfat, vendar so v proces vstopa virusa v celico najverjetneje vpleteni različni celični receptorji (Kroschewski in sod., 2003).

Predvidevajo, da bi lahko ravno sposobnost flavivirusov, da vstopajo v celico preko različnih receptorjev, omogočila pomnoževanje v tako raznolikih gostiteljih, ki zajemajo vse od različnih vrst členonožcev do različnih vrst sesalcev. Vezavi virusa na ustrezen celični receptor sledi receptorsko posredovana endocitoza, pri čemer virus vstopi v klatrinske vezikle. Znižanje pH v endosomu privede do strukturne spremembe beljakovine E iz dimera v trimer, kar povzroči izpostavitev fuzijske domene beljakovine E. Fuzijska domena omogoči zlitje virusne membrane z gostiteljsko in vstop virusne nukleokapside v citoplazmo gostiteljske celice. Virusna RNA se sprosti z nukleokapside in se prenese na replikacijske komplekse v membranskih strukturah endoplazemskega retikuluma, ki omogočijo koncentriranje komponent potrebnih za njeno sintezo.

Pozitivno-usmerjena RNA služi neposredno kot mRNA, ki se prevede v en poliprotein, hkrati pa se prepiše v negativno-polarno RNA, ki služi kot matrica za sintezo nove genomske RNA. Virusne in gostiteljske proteaze nato nastali poliprotein cepijo na posamezne virusne beljakovine, pri čemer se beljakovini E in prM preneseta v lumen endoplazemskega retikuluma (ER). Na citoplazemski strani ER se na novo nastala virusno RNA združi s kapsido iz beljakovine C, ki se nato z brstenjem v lumen ER obda z virusno ovojnico. Nastale nezrele in neinfektivne oblike viriona s prekurzorsko obliko

(26)

SURWHLQD0SU0QDGDOMXMHMRSRWSUHNRWUDQV*ROJLMHYHJDRPUHåMDREþHPHUSULGHGR FHSLWYH EHOMDNRYLQH SU0 LQ UHRUJDQL]DFLMH EHOMDNRYLQH ( Y IX]LMVNH KRPRGLPHUH NL RPRJRþLMR ]OLWMH HQGRFLWRWVNLK YH]LNORY ] PHPEUDQR JRVWLWHOMVNH FHOLFH 1DVWDOL ]UHOL YLULRQL VH WDNR L] FHOLFH VSURVWLMR ] HNVRFLWR]R 3XONNLQHQ LQ VRG .0(9 Y RNXåHQLKFHOLFDKSRY]URþLREVHåQHPRUIRORãNHVSUHPHPEHLQSRãNRGEH RUJDQHORYNDU YRGLYFHOLþQRVPUWDOLQHNUR]R5X]HNLQVRGD

6OLND 6KHPDWVNL SULND] åLYOMHQMVNHJD NURJD .0(9 3ULSHQMDQMH .0(9 QD SRYUãLQVNH FHOLþQH UHFHSWRUMH 9LUXVQL GHOFL YVWRSLMR ] UHFHSWRUVNR SRVUHGRYDQR HQGRFLWR]R 1L]HN S+ Y SR]QHP HQGRVRPX SRY]URþL NRQIRUPDFLMVNH VSUHPHPEH EHOMDNRYLQH ( NDU RPRJRþL IX]LMR YLUXVQH RYRMQLFH ] HQGRVRPVNR PHPEUDQR JRVWLWHOMVNH FHOLFH LQ VODþHQMH YLUXVD 6LQWH]D QHJDWLYQR SRODUQH 51$ Y PHPEUDQVNLK VWUXNWXUDK HQGRSOD]HPVNHJD UHWLNXOXPD (5 NL VOXåL NRW RVQRYD ]D QDVWDQHN SR]LWLYQR SRODUQHJHQRPVNH51$=ORåHQHQXNOHRNDSVLGHEUVWLMRYOXPHQ(5SULþHPHUVHREGDMR]PHPEUDQR JRVWLWHOMVNHJD L]YRUD 1H]UHOL YLULRQL SRWXMHMR SUHNR *ROJLMHYHJD RPUHåMD 1D WUDQV*ROJLMHYHP RPUHåMX SRWHND ]RUHQMH YLUXVQLK GHOFHY SUL þHPHU SULGH GR UD]FHSD SU0 QD SU LQ 0 LQ UHRUJDQL]DFLMH EHOMDNRYLQH ( =UHOL YLUXVQL GHOFL VH SUHNR FLWRSOD]HPVNLK YH]LNORY ] HNVRFLWR]R VSURVWLMR Y HNVWUDFHOXODUQLSURVWRUSULUHMHQRSR'REOHULQVRG

(3,'(0,2/2*,-$.0(

.0( MH ]RRQR]D NL VH SRMDYOMD QD ]HPOMHSLVQR RPHMHQLK REPRþMLK (YURSH LQ $]LMH LPHQRYDQLKQDUDYQDåDULãþD]QRWUDMNDWHULKYLUXVNURåLPHGSUHQDãDOFLNRSLLQJRVWLWHOML QDMSRJRVWHMH JORGDOFL LQ PDOL VHVDOFL 5D]ãLUMHQRVW SRGWLSRY .0(9 VRYSDGD ] UD]ãLUMHQRVWMR QMHJRYHJD JODYQHJD SUHQDãDOFDNORSD YUVWH,[RGHV ULFLQXV NL SUHQDãD HYURSVNLSRGWLS.0(9WHUNORSDYUVWH,[RGHVSHUVXOFDWXVNLMHSUHQDãDOHFVLELUVNHJDLQ GDOMQRY]KRGQHJD SRGWLSD YLUXVD (YURSVNL SRGWLS .0(9 MH HQGHPLþHQ Y RVUHGQML Y]KRGQL LQ VHYHUQL (YURSL GDOMQRY]KRGQL SRGWLS Y 5XVLML VHYHUQHP GHOX .LWDMVNH LQ -DSRQVNH6LELUVNLSDQDVHYHUX)LQVNHLQYVLELUVNHPGHOX5XVLMHVOLND9EDOWVNLK GUåDYDKVH]UD]ãLUMHQRVWMRREHKYUVWNORSRYL]URGX,[RGHVSRMDYOMDMRYVLWULMHSRGWLSL

(27)

11

KMEV, pri čemer 80 % vseh identificiranih sevov pripada evropskemu podtipu KMEV (Dobler in sod., 2012; Golovljova in sod., 2008; Jääskeläinen in sod., 2010; Jääskeläinen in sod., 2006; Kovalev in sod., 2009; Kovalev in sod., 2010; Lindquist in Vapalahti, 2008;

Randolph, 2008).

Slika 6: Geografska razširjenost prenašalcev KMEV, klopov Ixodes spp. in endemična območja KME (rdeča prekinjena črta) (prirejeno po Lindquist in Vapalathi, 2008:1862)

Poleg prenosa virusa ob vbodu okuženega klopa, ocenjujejo, da je približno 1 % vseh primerov KME posledica uživanja nepasteriziranega mleka in mlečnih izdelkov okužene živine (Caini in sod., 2012; Holzman in sod., 2009; Hudopisk in sod., 2013), nedavno pa so poročali o prvih primerih okužbe s KMEV s transplantacijo čvrstih organov (Lipowski in sod., 2017).

V več kot 30 državah Evrope in severovzhodne Azije letno zboli med 10 000 in 15 000 ljudi, številni primeri se končajo s smrtnim izidom (Dobler, 2010; Bogovič in Strle, 2015).

Države z najvišjo stopnjo incidence v letu 2019 so bile Slovenija, Avstrija, Češka, Slovaška in baltske države (slika 7). V zadnjem času je opazen trend širjenja virusa tudi na območja, ki prej niso bila endemična, močno se je povečala tudi incidenca KME v večini evropskih držav, kar je najverjetneje posledica součinkovanja podnebnih, demografskih, socialnih, ekonomskih in političnih dejavnikov na eni strani ter povečani zdravstveni zavesti, izboljšani diagnostiki in boljšemu epidemiološkemu spremljanju bolezni na drugi (Knap in Avšič-Županc, 2015; Süss, 2008). Kljub poenotenju definicije bolezni s strani Evropskega centra za preprečevanje in nadzor bolezni (ECDC) ter uvrstitve KME na seznam obvezno prijavljivih bolezni, je primerjava bolezenskega bremena med državami, zaradi razlik v klasifikaciji kliničnih oblik bolezni, implementaciji rutinske diagnostike za odkrivanje KME ter razlik v precepljenosti prebivalstva, otežena (Dobler in sod., 2020).

(28)

12

Slika 7: Porazdelitev potrjenih primerov KME na 100 000 prebivalcev v letu 2019 po državah EU/EGP (ECDC, 2021)

2.2.1 KME v Sloveniji

Prvi primer KME v Sloveniji so potrdili že leta 1953, ko so povzročitelja virusnega meningoencefalitisa prvič uspešno osamiti iz krvi bolnika z značilnimi nevrološkimi znaki bolezni (Vesenjak-Zmijanac in sod., 1955), leta 1955 pa so virus uspeli osamiti tudi iz klopa vrste I. ricinus (Likar in sod., 1956). Od leta 1977 je bolezen v Sloveniji obvezno prijavljiva, podatki o pojavnosti bolezni pa se zbirajo v sistemu nadzora nalezljivih bolezni Nacionalnega inštituta za javno zdravje Slovenije (NIJZ).

Letna incidenca KME se v Sloveniji nenehno spreminja, kar je posledica spreminjanja okoljskih dejavnikov, ki vplivajo na prisotnost virusa na posameznem območju (Eržen in Kraigher, 1993; Knap in Avšič-Županc, 2015). Primeri KME v Sloveniji se pojavljajo sezonsko z nekajtedensko zakasnitvijo od pričetka biološke aktivnosti klopov I. ricinus.

Ocenjujejo, da je v Sloveniji okuženih 0,47 % klopov, deleži okuženih klopov na posameznih območjih pa sovpadajo s stopnjo obolevnosti na teh območjih (Durmiši in sod., 2011). Največ primerov KME v Sloveniji zaznamo med aprilom in novembrom, z glavnim vrhom pojavljanja v juniju in juliju, velikokrat pa sledi drugi vrh v septembru in oktobru (slika 8).

(29)

13

Slika 8: Prijavljeni primeri KME v Sloveniji po mesecih v letih 2016-2018. (NIJZ, 2019)

V obdobju med leti 1983 in 2016 je bilo število letno prijavljenih primerov KME v Sloveniji med 62 in 531 (stopnja incidence med 3,0 in 26,6 primeri/100.000 prebivalcev), kar v povprečju znaša 206 primerov na leto s povprečno letno stopnjo incidence 10,3 primerov/100.000 prebivalcev, kar uvršča Slovenijo v sam vrh obolevnosti za KME. V letu 2018, ko je bilo prijavljenih 153 primerov KME, so največ primerov bolezni zabeležili v okolici Kranja (20,1 primer/100.000 prebivalcev), na območju Raven na Koroškem (14,2 primera/100.000 prebivalcev) in v okolici Ljubljane (9,3 primera/100.000 prebivalcev) (NIJZ, 2019).

Tveganju za okužbo so izpostavljene osebe vseh starostnih skupin, vendar se je v zadnjih letih povečalo število primerov bolezni pri starejših osebah (slika 9). Od leta 1994 je bila stopnja obolevnosti za KME najvišja v starostni skupini 55–64 let, bolezen pa je pogosteje prizadela moške kot ženske (Grgič-Vitek in Klavs, 2011). Otroci redkeje zbolevajo za KME, le 5-13 % vseh primerov KME je diagnosticiranih pri otrocih, mlajših od 15 let (Arnez in Avšič-Županc, 2009). Za razliko od incidence KME, pa je bila pri otrocih, starih od 5 do 14 let, invalidnost, prilagojena na življenjska leta, večja kot v skupini odraslih, starih od 50 do 74 let (Fafangel in sod., 2017). Večje tveganje za okužbo in bolezen imajo ljudje, ki bivajo na endemičnih območjih in tisti, ki so zaposleni v poklicih, ki zaradi narave dela predstavljajo večje tveganje za stik s prenašalcem bolezni, kot so gozdarstvo, lesnopredelovalna industrija ter gradbeništvo. Opazno višja incidenca KME je bila ugotovljena pri ljudeh, ki gozdove obiskujejo zaradi rekreacije in nabiranja gozdnih sadežev (Blasko-Markic in Socan, 2012).

(30)

6OLND 3ULMDYOMHQH LQFLGHQþQH VWRSQMH NORSQHJD PHQLQJRHQFHIDOLWLVD .0( Y OHWX SR VSROX LQ VWDURVWQLKVNXSLQDKY6ORYHQLML1,-=

3$72*(1(=$.0(

.ORSQL PHQLQJRHQFHIDOLWLV .0( MH HQD L]PHG QDMSRPHPEQHMãLK YLUXVQLK RNXåE FHQWUDOQHJDåLYþHYMDY(YURSLLQ$]LML6SRY]URþLWHOMHPEROH]QL.0(9VHOMXGMHODKNR RNXåLMRREYERGXRNXåHQHJDNORSDDOL]]DXåLWMHPQHSDVWHUL]LUDQHJDPOHNDDOLPOHþQLK L]GHONRYRNXåHQHåLYLQHVOLND+XGRSLVNLQVRG

6OLND6KHPDWVNLSULND]SUHQRVD.0(9]QRWUDMåLYOMHQMVNHJDFLNODNORSRYLQQDþORYHNDSULUHMHQRSR 5X]HNLQVRG

(31)

5D]LVNDYHVHURSUHYDOHQFHQDYLVRNRHQGHPLþQLKREPRþMLK.0(9QDND]XMHMRQDWRGD YHOLNDYHþLQDRNXåE]HYURSVNLPSRGWLSRP.0(9SRWHNDEUH]RSD]QLKNOLQLþQLK]QDNRY EROH]QL .DLVHU *XVWDIVRQ LQ VRG %RJRYLþ LQ 6WUOH SUL SULEOLåQR GYHKWUHWMLQDKVLPSWRPDWVNLKRNXåESDEROH]HQSRWHNDYGYHKID]DKVOLND

6OLND6KHPDWVNLSULND]GYRID]QHJDSRWHND.0(SULUHMHQRSR%ORPLQVRG

2EYERGXRNXåHQHJDNORSDVHYLUXVSUHQHVHYWHORVOLND.ORSREKUDQMHQMXQDPHVWR YERGDL]ORþDVOLQRNLNRWIDUPDNRORãNRDNWLYQDVSRMLQD]PDQMãXMHEROHþLQRLQVUEHQMHQD PHVWX YERGD WHU V VYRMLP DQWLNRDJXODWRUQLP YD]RGLODWRUQLP LQ LPXQRPRGXODWRUQLP GHORYDQMHP RODMãD SUHQRV YLUXVD Y WHOR LQ QMHJRYR ãLUMHQMH /DEXGD LQ VRG .D]LPLURYDLQVRG9LUXVRNXåLYNRåLSULVRWQHILEUREODVWHQHYWURILOFHPRQRFLWH LQGHQGULWLþQHFHOLFH'&NRåH/DQJHUKDQVRYHFHOLFHLQVHYQMLKSRPQRåXMH/DEXGD LQ VRG 7KDQJDPDQL LQ VRG .RPSRQHQWH NORSRYH VOLQH PRþQR SRYHþDMR GRY]HWQRVW'&]DRNXåERWHU]QLåDMRQMLKRYRVSRVREQRVWL]ORþDQMDFLWRNLQRY)LDORYDLQ VRG NL EL ODKNR ]DPHMLOL SRPQRåHYDQMH YLUXVD 3UHGYLGHYDMR GD RNXåHQH '&

SUHQHVHMRYLUXVYOLPIQHYR]OHNMHUVHOHWDSRPQRåXMHQDSUHM,QNXEDFLMVNLGRELNLWUDMD GQL .DLVHU VOHGL SUYD R] W L YLUHPLþQD ID]D NL VRYSDGD V SRMDYRP QHVSHFLILþQLK NOLQLþQLK ]QDNRY NRW VR YURþLQD EROHþLQH Y PLãLFDK JODYRERO VSORãQR VODERSRþXWMHLQXWUXMHQRVWVOLND/RJDULQVRG/RWULF)XUODQLQVRG 7RPDåLþLQVRG9WHMID]LEROH]QLVHYLUXVUD]QHVHSRWHOHVXLQYVWRSLWXGLYGUXJH RUJDQHNRWVRYUDQLFDMHWUDLQNRVWQLPR]HJNMHUVHYLUXVSRPQRåXMHQDSUHM6SURãþDQMH YLUXVD L] WHK RUJDQRY RPRJRþD YHþGQHYQR YLUHPLMR +DJOXQG LQ *XQWKHU /LQGHQEDFK LQ VRG 5X]HN LQ VRG PHG NDWHUR MH YLUXVQR 51$ YVH GR SRMDYDYLUXVQRVSHFLILþQLKSURWLWHOHVYNUYLLQOLNYRUMXPRåQR]D]QDWLYNUYL]PHWRGR YHULåQHUHDNFLMHVSROLPHUD]RDQJOSRO\PHUDVHFKDLQUHDFWLRQ3&56DNVLGDLQVRG 6DNVLGDLQVRG

(32)

16

Med viremijo virus vstopi v osrednje živčevje (slika 12), vendar natančna pot še ni poznana. Do sedaj je bilo predlaganih več mehanizmov vstopa v osrednje živčevje: (i) z okužbo in retrogradnim transportom po perifernih živcih, (ii) z okužbo visoko občutljivih vohalnih živcev in aksonskim transportom; (iii) z okužbo endotelnih celic možganskih kapilar in transcitozo v možganski parenhim; (iv) s citokini/kemokini posredovano porušenje krvno-možganske pregrade; (v) s transportom virusa v centralno živčevje z okuženimi levkociti (t.i. mehanizem Trojanskega konja), ki so sposobni prehajati krvno- možgansko pregrado. Po vstopu v osrednje živčevje, virus okuži predvsem nevrone (Gelpi in sod., 2005), vendar so za okužbo s KMEV dovzetni tudi astrociti (Palus in sod., 2014; Potokar in sod., 2014). Astrociti, in v nekoliko manjšem obsegu tudi nevroni, se na okužbo odzovejo z močnim protivirusnim odzivom ter izločanjem kemokinov, ki lahko na mesto okužbe privabijo imunske celice (Fares in sod., 2020). Poleg neposrednega vpliva virusa, k obsežnemu propadu nevronov najverjetneje prispeva tudi infiltracija aktiviranih imunskih celic v CŽS (Tomažič in Ihan, 1996), ki predstavljajo možni vir vnetnih citokinov, ki so povišani v likvorju bolnikov ob pojavu nevroloških znakov bolezni (Lepej in sod., 2007; Grygorczuk in sod., 2017; Grygorczuk in sod., 2018;

Bogovič in sod., 2019). Tako obdobju brez vidnih kliničnih znakov bolezni, ki navadno traja en teden, sledi druga ali t.i. nevrološka faza s pojavom nevroloških znakov bolezni, vse od blažje oblike meningitisa, do hujše oblike meningoencefalitisa ali meningoencefalomielitisa. Meningitis se pojavi pri okrog 50 % odraslih bolnikov, meningoencefalitis pri 40 % in meningoencefalomielitis pri 10 % (Kaiser, 2008).

Meningitis se kaže z znaki, kot so visoka vročina, glavobol, otrdel vrat, slabost in bruhanje. Znaki vnetja možganskih ovojnic se lahko pojavijo, vendar navadno niso zelo izraziti. Encefalitis spremljajo motnje zavesti, ki se lahko kažejo vse od občutka zaspanosti do skorajšnje izgube zavesti, v redkih primerih celo do kome. Drugi klinični znaki, ki spremljajo encefalitis, so še nemir, tremor udov ter drgetanje mišic jezika, vrtoglavica in motnje kognitivnih funkcij. Najhujšo obliko bolezni pa predstavlja meningoencefalomielitis, pri čemer se bolezenskim znakom encefalomielitisa pridružijo še znaki, ki nakazujejo na poškodbo hrbtenjače, kot so ohromitve mišic udov in dihal (Bogovič in sod., 2014). Bolezen navadno v hujši obliki poteka pri odraslih v primerjavi z otroci ter pri starostnikih v primerjavi z mlajšimi odraslimi osebami (Logar in sod., 2000; Logar in sod., 2006). Po preboleli bolezni večina kliničnih znakov izzveni, kar pri 46 % bolnikov z nevrološkimi znaki bolezni pa ostanejo dolgotrajne posledice, med njimi okrog 5 % bolnikov trpi za trajnimi parezami, tretjina obolelih pa razvije postenecefalitični sindrom z nevropsihiatričnimi motnjami (Kaiser, 2008; Bogovič in sod., 2018). Smrtnost pri okužbi z evropskim podtipom virusa je nizka in prizadene le 1- 2 % bolnikov (Kaiser, 2008).

(33)

17

Slika 12: Shematski prikaz okužbe gostitelja s KMEV (prirejeno po Ruzek in sod., 2019:26)

Ob okužbi z zaužitjem nepasteriziranega mleka viremične živali, bolezen poteka podobno kot po vbodu okuženega klopa, le da so nevrološki znaki bolezni v drugi fazi manj izraziti, bolniki pa v večini primerov nimajo trajnih posledic (Balogh in sod., 2010; Gritsun in sod., 2003).