Statistična analiza - IMUNSKI ODZIV IN FUNKCIONALNOST TOLL-U PODOBNIH RECEPTORJEV PRI BOLNIKIH

V raziskavi smo primerjali imunske značilnosti bolnikov s KME, cepljenih proti bolezni z necepljenimi bolniki s KME ter zdravimi prostovoljci. Za statistično analizo podatkov smo uporabili program GraphPad Prism 7 in Microsoft Excel. Za določitev osamelcev smo uporabili Dixon Q test, za preverjanje porazdelitve podatkov pa Shapiro Wilk test.

Za statistično testiranje razlik med podatki z normalno porazdelitvijo smo uporabili t-test, za podatke, ki niso imeli normalne porazdelitve pa Mann-Whitney test. Za primerjavo dveh kategorialnih spremenljivk smo uporabili χ² test ali Fisherjev eksaktni test. Stopnjo povezanosti spremenljivk smo testirali s Spearmanovim koeficientom korelacije.

0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL

9]URNL ]D UD]QROLN NOLQLþQL SRWHN EROH]QL VR Y YHOLNL PHUL ãH QHSR]QDQL YHQGDU JUH YHUMHWQR]DNRPELQDFLMRYLUXVQLKLQJRVWLWHOMVNLKGHMDYQLNRYNLGRORþDMRSRWHNRNXåEHLQ UD]YRMEROH]QL3UHGLVSR]LFLMR]DNOLQLþQRPDQLIHVWDFLMRRNXåEHV.0(9LQUD]YRMKXGLK ]QDNRY EROH]QL PHQLQJRHQFHIDOLWLVD SRYH]XMHMR V SROLPRUIL]PL JHQRY YSOHWHQLK Y REOLNRYDQMHLPXQVNHJDRG]LYDPHGGUXJLPWXGLYJHQX]DUHFHSWRU7/5.LQGEHUJLQ VRG %DUNKDVK LQ VRG 0LFNLHQH LQ VRG 9ORJD SROLPRUIL]PRY Y JHQLK ]D UHFHSWRUMD 7/5 LQ 7/5 ãH QL ELOD UD]LVNDQD SUL RNXåEL .0(9 YHQGDU IXQNFLRQDOQRVWUHFHSWRUMHYSRYH]XMHMR]REVHJRPYLUHPLMHQDVWDQNRPYQHWQHJDRG]LYD SULGREOMHQHJD LPXQVNHJD VLVWHPD 3ROHJ VDPHJD JHQHWVNHJD ]DSLVD ]D IXQNFLRQDOQL UHFHSWRU7/5MH]DXVWUH]HQSURWLYLUXVQLRG]LYSRVUHGRYDQV7/5UHFHSWRUMLSRPHPEQD XþLQNRYLWDDNWLYDFLMDFHORWQH7/5VLJQDOQHSRWL'DELSUHYHULOLDOLMH7/5VLJQDOQDSRW SULFHSOMHQLKEROQLNLKV.0(IXQNFLRQDOQDVPR3%0& VWLPXOLUDOL]]QDQLPLDJRQLVWL UHFHSWRUMHY 7/5 3RO\ ,& WHU 7/5 &/ LQ Y VXSHUQDWDQWLK GRORþDOL NRQFHQWUDFLMRYQHWQHJDFLWRNLQD,/

5H]XOWDWL

*HQRWLSL]DFLMDSROLPRUIL]PRYYJHQLKUHFHSWRUMHY7/57/5LQ7/5 9 JHQRWLSL]DFLMR 613 Y JHQLK UHFHSWRUMHY 7/5 7/5 LQ 7/5 VPR YNOMXþLOL EROQLNRYV.0(FHSOMHQLKSURWLEROH]QLLQQHFHSOMHQLKEROQLNRYV.0(NLVRELOLLVWH VWDURVWL LQ VSROD LQ VR ]EROHOL Y LVWHP OHWX NRW FHSOMHQL EROQLNL WHU ]GUDYLK RVHE 6 NRPHUFLDOQLPWHVWRPVPRJHQRWLSL]LUDOL613YJHQLKUHFHSWRUMHY7/5UV7/5

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

rs179008 ter TLR8 rs3764879 in rs3764880. Ker so geni za receptorje TLR7 in TLR8 locirani na kromosomu X, smo analizo rezultatov izvedli za ženske in moške posebej.

Analiza genotipske porazdelitve TLR3 rs3775291 je pokazala, da ima 47,2 % cepljenih bolnikov s KME homozigotni divji genotip C/C, 33,3 % je heterozigotov, 19,5 % pa ima mutirani homozigotni genotip T/T. V tej skupini bolnikov s KME je 64 % preiskovancev nosilcev divjega alela C, 36 % pa je nosilcev mutiranega alela T. Pri analizi genotipske porazdelitve TLR3 necepljenih bolnikih s KME smo ugotovili, da je 45,8 % homozigotov z divjim genotipom C/C, 40,3 % je bilo heterozigotov C/T, 13,9 % pa homozigotov z mutiranim genotipom T/T. Pri necepljenih bolnikih s KME je bilo 66 % preiskovancev nosilcev divjega alela C, 34 % pa je nosilcev mutiranega alela T. Frekvenca homozigotnega divjega genotipa pri zdravih prostovoljcih je bila 46,2 %, delež heterozigotov je bil 46,2 %, frekvenca homozigotnega mutiranega genotipa pa je znašala 7,7 %. 69 % zdravih oseb je bilo nosilcev divjega alela C, 31 % pa je nosilo zapis za mutiran alel T. Rezultati genotipizacije so prikazani v preglednici 6.

Preglednica 6: Frekvenca genotipov in alelov na polimorfnem mestu receptorja TLR3 rs3775291 pri cepljenih in necepljenih bolnikih s KME ter zdravih prostovoljcih.

alel/genotip n ( %)

cepljeni KME bolniki necepljeni KME bolniki zdravi

C/C 17 (47,2)^{a, b} 33 (45,8)^a 18 (46,2)^b

C/T 12 (33,3)^{a, b} 29 (40,3)^a 18 (46,2)^b

T/T 7 (19,5)^{a, b} 10 (13,9)^a 3 (7,7)^b

C 46 (64)^{c, d} 95 (66)^c 54 (69)^d

T 26 (36)^{c, d} 49 (34)^c 24 (31)^d

a primerjava frekvence genotipov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME: p= 0,675 (Pearsonov χ² test)

b primerjava frekvence genotipov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi prostovoljci: p=0,258 (Pearsonov χ² test)

c primerjava frekvence alelov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME: p=0,764 (Fisherjev test)

d primerjava frekvence alelov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi prostovoljci: p=0,495 (Fisherjev test)

Primerjava frekvenc genotipov in alelov na polimorfnem mestu TLR3 rs3775291 med skupinami je pokazala, da se frekvenca genotipov in alelov pri bolnikih s KME, cepljenih proti tej bolezni statistično značilno ne razlikuje od frekvence, opažene pri necepljenih bolnikih s KME ali pri zdravih prostovoljcih.

Z analizo genotipske porazdelitve TLR7 rs179008 smo ugotovili, da ima 85 % cepljenih bolnikov s KME moškega spola prisoten divji alel A, 15 % pa je imelo mutiran alel T. Pri cepljenih bolnikih s KME ženskega spola pa smo ugotovili, da je 62,5 % homozigotov z divjim genotipom A/A, 31,3 % je bilo heterozigotov A/T, 6,2 % pa homozigotov z

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

mutiranim genotipom T/T. Pri tej skupini bolnic je bilo 78 % bolnic nosilk divjega alela A, 22 % pa je nosilk mutiranega alela T. Pri necepljenih bolnikih s KME je bilo 80 % preiskovancev nosilcev divjega alela A, 20 % pa je bilo nosilcev mutiranega alela T.

Frekvenca homozigotnega divjega genotipa pri necepljenih bolnicah s KME je bila 53,1

%, delež heterozigotov je bil 31,3 %, frekvenca homozigotnega mutiranega genotipa pa je znašala 15,6 %. 69 % necepljenih bolnic s KME je bilo nosilk divjega alela A, 31 % pa je nosilo zapis za mutiran alel T. V skupini zdravih prostovoljcev moškega spola smo ugotovili prisotnost divjega alela A pri 70,6 %, 29,4 % zdravih moških pa je bilo nosilcev mutiranega alela T. 40,9 % zdravih žensk je bilo homozigotov z divjim genotipom A/A, 59,1 % pa je bilo heterozigotov A/T. Nobena od zdravih prostovoljk ni imela mutiranega genotipa T/T. 70% zdravih žensk je bilo nosilk divjega alela A, 30 % pa nosilk mutiranega alela T. Rezultati genotipizacije so prikazani v preglednici 7.

Preglednica 7: Frekvenca genotipov in alelov na polimorfnem mestu receptorja TLR7 rs179008 pri cepljenih in necepljenih bolnikih s KME ter zdravih prostovoljcih.

spol alel/genotip n ( %)

cepljeni KME bolniki necepljeni KME bolniki zdravi

moški A 17 (85,0)^{a, b} 28 (80,0)^a 12 (70,6)^b

a primerjava frekvence alelov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME moškega spola: p=0,612 (Fisherjev test)

b primerjava frekvence alelov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi osebami moškega spola: p=0,163 (Fisherjev test)

c primerjava frekvence alelov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME ženskega spola: p=0,337 (Fisherjev test)

d primerjava frekvence alelov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi osebami ženskega spola: p=0,599 (Fisherjev test)

Ker je bila frekvenca mutiranih genotipov rs179008 pri preiskovankah zelo nizka, statistična analiza ni bila mogoča. Frekvenca alelov na polimorfnem mestu TLR7 rs179008 pri bolnikih s KME, cepljenih proti bolezni ni statistično značilno različna od frekvence, opažene pri necepljenih bolnikih s KME ali pri zdravih prostovoljcih.

Z analizo genotipske porazdelitve TLR8 rs3764879 smo ugotovili, da je 78 % cepljenih bolnikov s KME moškega spola nosilcev divjega alela C, 22 % pa mutiranega alela G.

81,3 % cepljenih bolnic s KME je imelo homozigotni divji genotip C/C, 18,7 % pa je bilo heterozigotov C/G, homozigotnega genotipa G/G pa v tej skupini bolnic s KME ni bilo.

V skupini cepljenih bolnic s KME je bilo 91 % nosilk divjega alela C, 9 % pa nosilk

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

mutiranega alela G. Frekvenca divjega alela C pri necepljenih bolnikih s KME je bila 89%, frekvenca mutiranega alela pa je znašala 11%. Pri analizi genotipske porazdelitve TLR8 rs3764879 pri necepljenih bolnicah s KME smo ugotovili, da je 50 % homozigotov z divjim genotipom C/C, 40,6 % je bilo heterozigotov C/G, 9,4 % pa homozigotov z mutiranim genotipom G/G. 70 % preiskovank je bilo nosilk divjega alela C, 30 % pa je nosilcev mutiranega alela G. Delež zdravih moških, nosilcev mutiranega alela je znašal 82,3 %, delež nosilcev mutiranega alela pa 17,7 %. Frekvenca homozigotnega divjega genotipa C/C pri zdravih prostovoljkah je bila 72,7 %, frekvenca heterozigotov C/G je bila 22,7 %, frekvenca homozigotnega mutiranega genotipa G/G pa je znašala 4,6 %. 84

% zdravih prostovoljk je bilo nosilcev divjega alela C, 16 % pa je nosilo zapis za mutiran alel G. Rezultati genotipizacije so prikazani v preglednici 8.

Preglednica 8: Frekvenca genotipov in alelov na polimorfnem mestu receptorja TLR8 rs3764879 pri cepljenih in necepljenih bolnikih s KME ter zdravih prostovoljcih.

spol alel/genotip n ( %)

cepljeni KME bolniki necepljeni KME bolniki zdravi

moški C 14 (78,0)^{a, b} 34 (89,0)^a 14 (82,3)^b

a primerjava frekvence alelov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME moškega spola: p=0,146 (Fisherjev test)

b primerjava frekvence alelov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi osebami moškega spola: p=0,768 (Fisherjev test)

c primerjava frekvence alelov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME ženskega spola: p=0,038 (Fisherjev test)

d primerjava frekvence alelov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi osebami ženskega spola: p=0,505 (Fisherjev test)

Ker je bila frekvenca mutiranih genotipov rs3764879 pri preiskovankah zelo nizka, statistična analiza ni bila mogoča. Primerjava frekvence alelov na polimorfnih mestih TLR8 pa je pokazala, da je frekvenca alela C statistično značilno višja pri bolnicah s KME, ki so se cepile proti bolezni od frekvence v necepljeni skupini bolnic s KME.

Analizo genotipske porazdelitve TLR8 rs3764880 je pokazala, da ima 78 % cepljenih bolnikov s KME moškega spola prisoten divji alel A, 22 % pa je imelo mutiran alel G.

Pri cepljenih bolnikih s KME ženskega spola pa smo ugotovili, da je 81,3 % homozigotov z divjim genotipom A/A, 18,7 % pa je bilo heterozigotov A/G. Mutiranega genotipa G/G pri tej skupini bolnic s KME nismo našli. 91 % cepljenih bolnic s KME je bilo nosilk

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

divjega alela A, 9 % pa je nosilk mutiranega alela G. Pri necepljenih bolnikih s KME moškega spola je bilo 89 % preiskovancev nosilcev divjega alela A, 11 % pa je bilo nosilcev mutiranega alela G. Frekvenca homozigotnega divjega genotipa A/A pri necepljenih bolnicah s KME je bila 50 %, delež heterozigotov je bil 40,6 %, frekvenca homozigotnega mutiranega genotipa G/G pa je znašala 9,4 %. 70 % necepljenih bolnic s KME je bilo nosilk divjega alela A, 30 % pa je nosilo zapis za mutiran alel G. V skupini zdravih prostovoljcev moškega spola smo ugotovili prisotnost divjega alela A pri 82,3 %, 17,7 % zdravih moških pa je bilo nosilcev mutiranega alela G. 72,7 % zdravih žensk je bilo homozigotov z divjim genotipom A/A, 22,7 % je bilo heterozigotov A/G, 4,6 % zdravih žensk pa je imelo mutiran genotip G/G. 84% zdravih žensk je bilo nosilk divjega alela A, 16 % pa nosilk mutiranega alela G. Rezultati genotipizacije so prikazani v preglednici 9.

Preglednica 9: Frekvenca genotipov in alelov na polimorfnem mestu receptorja TLR8 rs3764880 pri cepljenih in necepljenih bolnikih s KME ter zdravih prostovoljcih.

spol alel/genotip n ( %)

cepljeni KME bolniki necepljeni KME bolniki zdravi

moški A 14 (78,0)^{a, b} 34 (89,0)^a 14 (82,3)^b

a primerjava frekvence alelov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME moškega spola: p=0,146 (Fisherjev test)

b primerjava frekvence alelov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi osebami moškega spola: p=0,768 (Fisherjev test)

c primerjava frekvence alelov med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME ženskega spola: p=0,038 (Fisherjev test)

d primerjava frekvence alelov med cepljenimi bolniki s KME in zdravimi osebami ženskega spola: p=0,505 (Fisherjev test)

Tudi frekvenca mutiranega genotipa rs3764880 je bila zelo nizka pri vseh preiskovankah, zato statistična analiza ni bila mogoča. Primerjava alelne frekvence na polimorfnem mestu rs3764880 TLR8 pa je pokazala, da je frekvenca alela A statistično značilno višja pri bolnicah s KME, ki so se cepile proti bolezni od frekvence tega alela v skupini necepljenih bolnic s KME.

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

4.1.1.2 Določanje funkcionalnosti receptorjev TLR3, TLR7 IN TLR8 in vitro

Poleg genotipizacije polimorfizmov receptorjev TLR3, 7 in 8, smo s testom funkcionalnosti želeli preveriti delovanje receptorjev TLR tudi in vitro. V test funkcionalnosti receptorjev TLR in vitro smo vključili 16 bolnikov s KME, cepljenih proti bolezni in 16 necepljenih bolnikov s KME, ki so bili iste starosti in spola in so zboleli v istem letu kot cepljeni bolniki s KME. PBMC cepljenih in necepljenih bolnikov s KME, smo stimulirali z znanimi aktivatorji receptorjev TLR3, poly(I:C), in TLR7/8, CL097, ter z mešanico poliklonskega aktivatorja IONO/PMA. Po 48h spodbujanih PBMC bolnikov s KME smo količino izločenega citokina IL-6 v supernatantih primerjali z referenčnimi vrednostmi zdravih oseb.

Primerjava koncentracije IL-6 z referenčnimi vrednostmi zdravih oseb, uporabljenimi v rutinski diagnostiki Laboratorija za celično imunologijo, Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo je pokazala, da je bilo na stimulacijo z agonistom TLR3 odzivnih 44%

cepljenih bolnikov s KME in 50 % necepljenih bolnikov s KME. Vsi preiskovanci, vključeni v raziskavo stimulacije TLR7/8 in vitro so bili odzivni na stimulacijo z agonistom TLR7/8 in IONO/PMA. Rezultati testa funkcionalnosti receptorjev TLR in vitro so prikazani v preglednici 10.

Preglednica 10: Deleži odzivnih in neodzivnih posameznikov v testu funkcionalnosti receptorjev TLR in vitro.

odzivni (n, %) neodzivni (n, %) skupina/

stimulant Poly(I:C) CL097 IONO/PMA Poly(I:C) CL097 IONO/PMA cepljeni

KME bolniki 7 (44) 16 (100) 16 (100) 9 (66) 0 (0) 0 (0) necepljeni

KME bolniki 8 (50) 16 (100) 16 (100) 8 (50) 0 (0) 0 (0) 4.1.2 Razprava

Receptorji TLR imajo pomembno vlogo v iniciaciji protivirusnih obrambnih mehanizmov, njihovo delovanje pa povezujejo s polimorfizmi posameznih nukleotidov.

SNP rs3775291 v genu TLR3 označuje zamenjavo citozina (C) s timinom (T) v 412.

kodonu gena TLR3, kar vodi v spremembo aminokisline levcin v fenilalanin in se odraža v spremembi funkcionalnosti receptorja TLR3. Raziskave so pokazale, da TLR3, ki vsebuje fenilalanin, veže nižjo količino dsRNA, ki nastane med pomnoževanjem virusa, ter da je delež aktivacije NF-κB za 50 % nižji v primerjavi s TLR3, ki vsebuje levcin (Zhou in sod., 2011), kar posledično lahko vodi v znižan vnetni odziv na okužbo. SNP rs3775291 povezujejo z manjšim tveganjem za okužbo s KMEV, kakor tudi s HIV-1 in

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

virusom herpesa simpleksa (HSV)-2 (Sironi in sod., 2012; Svensson in sod., 2012;

Kindberg in sod., 2011; Barkhash in sod., 2013; Zhou in sod., 2011). Po drugi strani pa so Mickiene in sod. (2014) pokazali tudi, da je pri bolnikih s hudo obliko KME, frekvenca alela, ki kodira nefunkcionalni receptor TLR3, višja v primerjavi s kohorto odraslih s celotnim kliničnim spektrom KME. Ti rezultati nakazujejo na to, da ima lahko TLR3 tako koristno kot škodljivo vlogo v patogenezi KME, saj imajo posamezniki s funkcionalnim receptorjem TLR3 večje tveganje za razvoju klinične oblike bolezni, vendar pa lahko funkcionalni receptor ščiti pred hujšim potekom bolezni v fazi, ko virus že vstopi v možgane. Do podobne ugotovitve so prišli tudi pri testiranju vpliva receptorja TLR3 na potek okužbe z WNV na živalskih modelih. Ugotovili so namreč, da so miši brez receptorja TLR3 bolj odporne na intraperitonealno okužbo z WNV od miši s funkcionalnim receptorjem TLR3. Ob aktivaciji TLR3 nameč pride do sproščanja TNF-α ter porušenja krvno-možganske pregrade, kar olajša prehod WNV v možgane (Wang in sod., 2003). Po drugi strani pa je raziskava Daffis in sod. (2008) pokazala, da funkcionalen TLR3 receptor ščiti pred okužbo z WNV po intrakranialni inokulaciji miši.

Čeprav težji potek KME povezujejo z mutiranim genotipom TLR3 in mutiranim alelom T, pa kljub razlikam v klinični manifestaciji bolezni med cepljenimi in necepljenimi bolniki s KME (Lotric-Furlan in sod., 2017), nismo opazili razlike v frekvenci alelov na polimorfnem mestu TLR3 rs3775291 med skupinama KME bolnikov, niti v primerjavi z zdravimi. Na podlagi teh rezultatov sklepamo, da SNP rs3775291 ne predstavlja dejavnik tveganja za pojav KME kljub cepljenju proti bolezni.

Povezavo med SNP v genih za receptorje TLR 7 in 8 in njihov pomen za okužbo s KMEV in potek bolezni še ni bil raziskan, vendar funkcionalnost teh receptorjev povezujejo z obsegom viremije, nastankom vnetnega odziva, sintezo protiteles ter potekom bolezni pri okužbah z drugimi flavivirusi (Sariol in sod., 2011; Sabouri in sod., 2014; Town in sod., 2009; Xie in sod., 2013; Nazmi in sod., 2014). O pomenu TLR7 pri okužbi s KMEV je znanega izredno malo. Do sedaj je bila objavljena le ena raziskava o pomenu TLR7 pri okužbi z LGTV in vivo, ki je pokazala, da imajo miši brez receptorja TLR7, višje virusno breme v CŽS ter nižji vnetni citokinski odziv, medtem ko je bil IFN I odziv na okužbo z LGTV pri miših brez TLR7 višji v primerjavi z mišmi s funkcionalnim TLR7 (Baker in sod., 2013). Nedavna raziskava aktivacije plazmacitoidnih DC (pDC) in vitro pa je pokazala, da je receptor TLR7 pomemben za prepoznavo inaktiviranega KMEV in oblikovaje IFN I odziva (Etna in sod., 2021). SNP rs179008 označuje zamenjavo adenina (A) v timin (T) na 11. kodonu v genu TLR7, kar povzroči spremembo glutamina v levcin in vpliva na izrezovanje eksona ter posledično na funkcionalnost receptorja TLR7.

Mutiran alel T povezujejo z večjim tveganjem za okužbo z HCV pri obeh spolih in zmanjšano verjetnostjo ustreznega odziva na zdravljenje z IFN-α pri ženskah, okuženih s HCV (Askar in sod., 2010; El-Bendary in sod., 2018). SNP rs179008 povezujejo tudi z višjim virusnim bremenom, pospešenim napredovanjem imunske supresije pri okužbi s HIV-1, večjo dovzetnost za HIV-1 okužbo pri ženskah in zmanjšano tvorbo IFN-α po

Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.

Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022

stimulaciji PBMC z aktivatorjem TLR7, pri čemer pa je tvorba IL-6 ohranjena (Oh in sod., 2009). Ker je bila frekvenca mutiranih genotipov za TLR 7 pri preiskovankah zelo nizka, statistična analiza ni bila mogoča. Frekvenca alelov na polimorfnem mestu TLR7 rs179008 pri bolnikih s KME, cepljenih proti bolezni pa se ni statistično značilno razlikovala od frekvence, opažene pri necepljenih bolnikih s KME ali pri zdravih prostovoljcih. Večina cepljenih (85 % moških in 78 % žensk) in necepljenih bolnikov s KME (80 % moških in 69 % žensk) je bilo nosilcev alela A v genu TLR7, kar kodira delujoč receptor TLR7. Na podlagi teh rezultatov sklepamo, da SNP rs179008 ne predstavlja dejavnika tveganja za pojav KME kljub cepljenju proti bolezni.

Za razliko od TLR7, ki ga izražajo predvsem pDC, pa TLR8 izražajo monociti, makrofagi in konvencionalne DC (cDC) s katerim zaznavajo virusno ssRNA. Aktivacija TLR8 spodbudi nastanek vnetnih citokinov, kot so TNF-α in IL-12, ter IFN I (Gorden in sod., 2005). SNP rs3764879 označuje zamenjavo citozina (C) z gvaninom (G), kar vpliva na vezano transkripcijskih faktorjev in prepisovanje TLR8, SNP rs3764880 TLR8 pa označuje zamenjavo adenina (A) z gvaninom (G), kar vpliva na izrezovanje eksona v TLR8 ter na njegovo transkripcijo in translacijo (Alragasu in sod., 2014; Wang in sod., 2014). Podobno kot so poročali v prejšnjih raziskavah (Alragasu in sod., 2014; Wang in sod., 2014), smo v naših skupinah opazili prisotnost le dveh haplotipov, divji C-A in mutiran G-G. Haplotip TLR8 G-G povezujejo s težjim potekom okužbe z DENV (Alragasu in sod., 2014) in smrtnim izidom krimsko-kongoške hemoragične mrzlice (KKHM) (Engin in sod., 2010). Ker je bila frekvenca mutiranih genotipov rs3764879 in rs3764880 pri preiskovankah zelo nizka, statistična analiza ni bila mogoča. Primerjava frekvence alelov na polimorfnih mestih rs3764879 in rs3764880 TLR8 pa je pokazala, da je frekvenca mutiranega alela G, statistično značilno nižja pri cepljenih bolnicah s KME v primerjavi z necepljenimi bolnicami s KME, ne pa tudi v primerjavi z zdravimi ženskami, medtem ko med obema skupinama moških bolnikov s KME nismo opazili statistično značilnih razlik. Naši rezultati nakazujejo na to, da bi lahko funkcionalen receptor TLR8 predstavljal dejavnik tveganja za pojav bolezni pri ženskah, ki so bile cepljene proti KME. Predvidevamo, da bi lahko funkcionalen receptor TLR8 prispeval k povišanemu izločanju vnetnih citokinov in obsežnejšemu vnetnemu odzivu v možganih, kar bi lahko vodilo v težji potek bolezni. Kljub temu pa je, zaradi pomanjkanja raziskav o pomenu TLR8 receptorja pri okužbi s KMEV ter relativno majhnega števila bolnikov, ki zbolijo kljub cepljenju, potrebna podrobnejša analiza pomena funkcionalnega TLR8 receptorja v patogenezi KME ter pri bolnikih, ki zbolijo kljub cepljenju proti KME.

Poleg samega genetskega zapisa za funkcionalni receptor TLR, je za ustrezen protivirusni odziv, posredovan s TLR receptorji, pomembna učinkovita aktivacija celotne TLR signalne poti. Da bi preverili, ali so receptorji TLR funkcionalni in ali je funkcionalna signalna pot pri cepljenih bolnikih s KME, smo PBMC stimulirali z znanimi agonisti receptorjev TLR3 ter TLR7/8 in s tem spodbudili od TRIF ter MyD88 odvisni signalni poti, ki preko NF-kB vodita v nastanek vnetnih citokinov, predvsem IL-6. Na podlagi

0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD

L]PHUMHQH NRQFHQWUDFLMH ,/ Y VXSHUQDWDQWLK VWLPXOLUDQLK FHOLF LQ SULPHUMDYL OH WHK ] UHIHUHQþQLPLYUHGQRVWPL]GUDYLKRVHEVPRRSUHGHOLOLIXQNFLRQDOQRVWUHFHSWRUMHY7/5SUL UD]LVNRYDQLKVNXSLQDK

'HOHåRG]LYQLKQDVWLPXODFLMR]DJRQLVWRPUHFHSWRUMD7/5SULYVHKWUHKVNXSLQDKMHELO QLåMLYSULPHUMDYLVIUHNYHQFRDOHOD]DIXQNFLRQDOQLUHFHSWRU7/5NDUNDåHQDPRåQRVW REVWRMD GUXJLK 613 NL GRORþDMR IXQNFLRQDOQRVW UHFHSWRUMD 7/5 DOL 613 Y JHQLK YNOMXþHQLKY7/5VLJQDOQRSRWSULFHSOMHQLKEROQLNLKV.0(

9VLSUHLVNRYDQFLYNOMXþHQLYUD]LVNDYRIXQNFLRQDOQRVWLUHFHSWRUMHY7/5LQYLWURSDVR VH RG]YDOL QD VWLPXODFLMR V &/ DJRQLVWRP UHFHSWRUMHY 7/5 LQ *HQRWLSL]DFLMD UHFHSWRUMHY7/5MHSRND]DODGDMHLPHOYVDNSRVDPH]QLNQRVLOHFGLYMHJDDOHOD]DYVDM HQHJDRGUHFHSWRUMHY7/5DOLNDUQDND]XMHQDWRGDMHIXQNFLRQDOQRVWHQHJDL]PHG REHKUHFHSWRUMHYGRYROM]DDNWLYDFLMRVLJQDOQHSRWLNLYRGLYQDVWDQHN,/5D]LVNDYDQD PLãLK MH SRND]DOD GD ]DYLUDQMH GHORYDQMD 7/5 UHFHSWRUMD SRYHþD L]UDåDQMH 7/5 NL QDGRPHVWL IXQNFLMR UHFHSWRUMD 7/5 $ZDLV LQ VRG NDU SRMDVQMXMH RSDåHQH UH]XOWDWH

1DSRGODJLQDãLKUH]XOWDWRYVNOHSDPRGDSUHLVNRYDQL613YJHQX]DUHFHSWRU7/5LQ 7/5QHSUHGVWDYOMDMRGHMDYQLNDWYHJDQMD]DSRMDY.0(NOMXEFHSOMHQMXSURWLWHMEROH]QL PHGWHPNREL613YJHQX]D7/5ODKNRELOSRYH]DQVSRMDYRPEROH]QLNOMXEFHSOMHQMX 5H]XOWDWL IXQNFLRQDOQRVWL UHFHSWRUMHY 7/5 LQ YLWUR SD QDND]XMHMR QD SRWHQFLDOQR SULVRWQRVWSROLPRUIL]PRYYGUXJLKJHQLKYNOMXþHQLKY7/5VLJQDOQRSRW=DSRWUGLWHYWHK SRYH]DY LQ UD]MDVQLWHY YORJH 613 SUL LPXQVNHP RG]LYX SURWL .0(9 SD VR SRWUHEQH GRGDWQHUD]LVNDYHSRYH]DYPHG613LQ.0(WHUIXQNFLRQDOQRVWMRUHFHSWRUMHYQDYHþMHP Y]RUFX %ROMãH UD]XPHYDQMH SRYH]DY PHG 613 LQ SRMDYRP EROH]QL NOMXE FHSOMHQMX ER SRND]DOR DOL ODKNR WHUDSHYWVNR XUDYQDYDQMH DNWLYQRVWL 7/5 SULVSHYD N ]PDQMãDQMX UHVQRVWLEROH]QL

'58*, '(/ 5$=,6.$9( ± ,0816., 2'=,9 32 67,08/$&,-, 3%0& 6 .0(9$/,&(3,920)60(,0081LQYLWUR

2E YVWRSX YLUXVD Y WHOR SULKDMD GR ]DSOHWHQLK LQWHUDNFLM PHG YLUXVRP LQ JRVWLWHOMHP 8VWUH]QD LQ GRYROM REVHåQD DNWLYDFLMD SULURMHQHJD LPXQVNHJD VLVWHPD Y ]JRGQML ID]L RNXåEHSULVSHYDN]DPHMLWYLYLUXVQHJDUD]PQRåHYDQMDLQQMHJRYHJDUD]ãLUMDQMDSRWHOHVX .LQJLQVRG/LQGTYLVWLQVRG2VUHGQMRYORJRSULLQLFLDFLMLSURWLYLUXVQH REUDPEH LPDMR GHQGULWLþQH FHOLFH NL SUHGVWDYOMDMR YH]QL þOHQ PHG SULURMHQLP LQ

In document IMUNSKI ODZIV IN FUNKCIONALNOST TOLL-U PODOBNIH RECEPTORJEV PRI BOLNIKIH S KLOPNIM MENINGOENCEFALITISOM, CEPLJENIH PROTI TEJ BOLEZNI (Strani 71-168)