Druga skupina prirojenih imunskih celic, ki pomembno prispeva k oblikovanju vnetnega odziva na okužbo in je sposobna fagocitiranja patogenov, so nevtrofilci. Raziskave so pokazale, da nevtrofilci migrirajo na mestu hranjenja klopa in so dovzetni za okužbo s KMEV. Kasneje, v začetku nevrološke faze bolezni, je njihova koncentracija močno povišana v likvorju bolnikov s KME in postopoma upada z izhodom iz bolezni (Jeren in sod., 1998), razen pri bolnikih s persistentnimi nevrološkimi znaki bolezni, pri katerih koncentracija nevtrofilcev ostaja visoka (Grygorczuk in sod., 2018). Bolniki s KME imajo ob nastopu nevroloških znakov bolezni v likvorju povišane vrednosti kemokinov, ki bi preko vezave na CXCR1 in CXCR2 omogočile infiltracijo nevtrofilcev v CŽS (Grygorczuk in sod., 2018). Vlogo nevtrofilcev pri poškodbi možganov potrjujejo tudi raziskave na miših z LGTV, kjer so imele miši z izbitim genom za CCR5, izraženim na površini limfocitov T, poleg povišane koncentracije kemoatraktantov nevtrofilcev CXCL1 in CXCL2, tudi višje virusno breme in povečano stopnjo apoptoze možganskega tkiva, pri miših, ki so jim odstranili nevtrofilce, pa tega fenomena po okužbi z LGTV niso opazili (Michlmayr in sod., 2016).
2.4.2 Pridobljeni imunski odziv na okužbo s KMEV
Pridobljeni imunski sistem je sposoben selektivne prepoznave in učinkovitega odstranjevanja patogenov v telesu preko oblikovanja protitelesnega in celičnega imunskega odziva. Ključne celice pridobljenega imunskega sistema so limfociti T in B, ki na svojo površino izražajo antigensko-specifične receptorje, s katerimi so sposobne razločevati med telesu lastnim in tujim, ob stiku z antigenom pa tvorijo imunski spomin, zaradi katerega so sposobne hitre reaktivacije ob ponovnem stiku s tem antigenom.
2.4.2.1 B celični in protitelesni imunski odziv na okužbo s KMEV
Za zamejitev okužbe in dolgotrajno zaščito pred okužbo z vsemi flavivirusi, vključno s KMEV, je ključnega pomena oblikovanje ustreznega in dovolj obsežnega protitelesnega odziva (Pierson in sod., 2008). Ob nastopu nevroloških znakov bolezni je tako v serumu kot v likvorju večine bolnikov, že mogoče zaznati virusno specifična protitelesa. Najprej se pojavijo protitelesa razreda IgM, ki dosežejo svoj vrh zelo zgodaj v bolezni in vztrajajo približno šest do sedem tednov po pojavu nevroloških znakov bolezni, IgG protitelesa pa se pojavijo z nekajdnevno zakasnitvijo in svoj vrh dosežejo v konvalescentni fazi bolezni ter se ohranijo več let ali celo življenje in tako nudijo doživljenjsko zaščito pred boleznijo (Holzmann, 2003).
Humoralni imunski odziv na okužbo s KMEV je povezan s kliničnim potekom in izhodom iz bolezni. Ugotovili so, da bolniki z nizkimi vrednostmi IgM protiteles v likvorju in z nizko koncentracijo nevtralizacijskih protiteles v serumu na začetku nevrološke faze KME, razvijejo hujšo obliko bolezni (Gunther in sod., 1997; Bogovič in sod., 2018). Bolniki z nizkimi vrednosti serumskih IgG protiteles in težjim potekom
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
25
bolezni (Bogovič in sod., 2018), tudi pogosteje trpijo za dolgotrajnimi posledicami KME (Bogovič in sod., 2021).
Glavno zaščitno vlogo imajo t. i. nevtralizacijska protitelesa, ki nastanejo tako po okužbi kot po cepljenju proti KME (Jarmer in sod., 2014). Za nevtralizacijo flavivirusov je potrebna vezava zadostnega števila protiteles na površino viriona, kar je odvisno od afinitete nastalih protiteles in dostopnosti ustreznih epitopov (Pierson in Diamond, 2008).
Primarna tarča nevtralizacijskih protiteles, ki nastanejo po okužbi s KMEV, je beljakovina E, pri katerih prevladujejo protitelesa proti domenam DI in DII. Vezava protiteles na epitope beljakovine E prepreči vezavo virusa na celične receptorje ter s pH posredovano konformacijsko spremembo beljakovine E in izpostavitev fuzijske zanke, s čimer onemogoči vstop virusa v gostiteljsko celico in njegovo nadaljnjo pomnoževanje (Füzik in sod., 2018). Ob okužbi s KMEV pa, poleg protiteles proti beljakovini E, nastanejo tudi protitelesa proti beljakovini prM (Jarmer in sod., 2014) in drugim nestrukturnim virusnim beljakovinam, ki ne zmanjšajo infektivnosti virusa neposredno, vendar verjetno nudijo zaščito preko drugih efektorskih mehanizmov protiteles (Pierson in sod., 2008; Jacobs in sod., 1994). Tako na primer, okužene celice na svojo površino izražajo NS1 beljakovino, nastalo med virusnim pomnoževanjem, ki jo prepoznajo specifična protitelesa, ki nato preko aktivacije komplementa ali celično posredovanega citotoksičnega delovanja zamejijo nadaljnje širjenje virusa (Chambers in Diamond, 2003). Ugotovili so, da so miši, ki so jih najprej imunizirali z NS1 antigenom in nato okužili z letalnim odmerkom KMEV, preživele dlje časa po okužbi, kar kaže na pomembno vlogo NS1 protiteles pri zaščiti pred boleznijo (Salat in sod., 2020), vendar natančen mehanizem še ni poznan. Protitelesa proti nestrukturni beljakovini NS1 KMEV so v dosedanjih raziskavah zasledili le pri naravno okuženih osebah (Girl in sod., 2020;
Albisson in sod., 2017; Albisson in sod., 2018), vendar so rezultati nedavne raziskave pokazali, da je majhne količine beljakovine NS1 možno zaznati tudi v cepivih proti KME.
Kljub temu večina oseb, ki so prejele tri ali več odmerkov cepiva proti KME, niso razvile specifičnega NS1 protitelesnega odziva (Salat in sod., 2020). Poleg omenjenih, so identificirali še nekatere druge epitope virusnih nestrukturnih beljakovin NS2B, NS3, NS4B in NS5, ki jih prepoznajo limfociti B. Na dostopnost virusnih epitopov in posledično dovzetnost virusnih delcev na nevtralizacijsko delovanje protiteles, pa pomembno vplivajo tako intrinzični virusni dejavniki, kot so konformacijska prožnost (pregledano v Kuhn in sod., 2015) in stopnja zrelosti virusnih delcev (pregledano v Nelson in sod., 2008), kakor tudi zunanji dejavniki, kot je inaktivacija virusnih delcev s formaldehidom med postopkom izdelave cepiv (pregledano v Kuivanen in sod., 2014).
Celični fenotip in status aktivacije limfocitov B med patogenezo KME še nista podrobno raziskana. Nekaj podatkov o pomenu B celičnega odziva na okužbo s KMEV izhaja iz poskusov na miših, ki kažejo, da limfociti B prispevajo k izidu okužbe s KMEV saj so v možganskem tkivu miši, okuženih s KMEV, zabeležili dvig ravni mRNA CD19, ki je sovpadal z visoko vsebnostjo nevtralizacijskih protiteles in z manjšo dovzetnostjo s
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
26
KMEV (Palus in sod., 2013). Pri miših, ki so bile bolj dovzetne za okužbo s KMEV, pa so hkrati izmerili močno povišano ekspresijo mRNA za citokine in kemokine, kar nakazuje na vpletenost imunopatoloških mehanizmov v patogenezo KME.
2.4.2.2 T celični imunski odziv na okužbo s KMEV
Ustrezni imunski odziv limfocitov T, tako celic T pomagalk (angl. helper T cell; Th) kot citotoksičnih limfocitov T (angl. cytotoxic T cell; Tc), ima pomembno vlogo v obrambi pred virusnimi okužbami. Aktivirane celice Th z izločanjem številnih citokinov spodbudijo proizvodnjo protiteles pri limfocitih B in citotoksično delovanje celic Tc, kar pomembno prispeva k odstranitvi patogena. Ko naivni limfociti T prepoznajo antigen, se aktivirajo in diferencirajo v efektorske limfocite T, ki izločajo citokine in aktivno sodelujejo pri odstranitvi okužbe. Večina efektorskih celic po zamejitvi in odstranitvi okužbe odmre, le majhen delež celic se diferencira v spominske celice, ki preživijo dlje časa. Spominske celice imajo sposobnost hitre prepoznave in odziva ob ponovnem stiku z istim antigenom (Kaech in Cui, 2012).
Znano je, da imajo celice Th pomembno vlogo pri zamejevanju okužb z flavivirusi, kot sta WNV in ZIKV (Elong in sod., 2019; Sitati in sod., 2006). Raziskave na miših so pokazale, da je odstranitev primarne okužbe z WNV v CŽS odvisen od delovanja celic Th (Sitati in sod., 2006), pri okužbi z ZIKV pa celice Th pomembno prispevajo k zamejevanju okužbe in so ključne za indukcijo specifičnih protiteles (Elong in sod., 2019). Na zaščitno vlogo celic Th pri okužbi s KMEV pa kažejo raziskave na imunsko oslabljenih miših, ki jih vnesene celice Th ščitijo pred nastankom KME in smrtnim izidom bolezni (Ruzek in sod., 2009b).
Glavne tarče specifičnih celic Th, ki nastanejo ob naravni okužbi s KMEV, so epitopi strukturnih beljakovin E in C (Aberle in sod., 2015; Schwaiger in sod., 2014) ter nestrukturne beljakovine NS1 (Volkova in sod., 2007). Sedem dni po hospitalizaciji bolnikov s KME, se število aktiviranih efektorskih celic Th, ki jih določa povečana ekspresija HLA-DR, PD-1 in perforina ter zmanjšano izražanje Bcl-2, poviša (Blom in sod., 2015). Celice Th izločajo predvsem IFN-γ, IL-2 in TNF-α, kar kaže na oblikovanje Th1 celičnega imunskega odziva v akutni fazi bolezni (Aberle in sod., 2015, Schwaiger in sod., 2014).
Poleg virusno specifičnih protiteles in celic Th, so tudi celice Tc pomembne za zaščito pred virusnimi okužbami. Longitudinalne raziskave aktivacije in fenotipa celic Tc pri bolnikih s KME od hospitalizacije do konvalescentne faze bolezni pa so pokazale, da aktivacija citotoksičnih limfocitov T, določene s stopnjo sočasne ekspresije Ki67 in CD38, doseže vrh približno en teden po hospitalizaciji bolnikov in je obsežnejša od aktivacije celic Th v akutni fazi bolezni (Blom in sod., 2015). Glavne tarče celic Tc so epitopi nestrukturnih beljakovin NS2A, NS3, NS4B in NS5, ki so dobro ohranjeni med
0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD
SRGYUVWDPL.0(9/DPSHQLQVRG$NWLYLUDQHFHOLFH7FLPDMRYHIHNWRUVNLID]L SRYHþDQR L]UDåDQMH SHUIRULQD LQ JUDQFLPD % NDVQHMH SD VH GLIHUHQFLUDMR Y VSRPLQVNH OLPIRFLWH 7 3R VWLPXODFLML V .0(9 SHSWLGL VR XJRWRYLOL GD VR FHOLFH 7F Y ]JRGQML VHNXQGDUQL ID]L EROH]QL SUHGYVHP PRQRIXQNFLRQDOQH YHQGDU NDVQHMH Y ID]L RNUHYDQMD EROQLNRYSRVWDQHMRSROLIXQNFLRQDOQHLQL]ORþDMR,)1Ȗ71)ĮLQ0,3ȕ%ORPLQVRG
&HOLFH7FREDNWLYDFLMLSRYLãDMRWXGLL]UDåDQMHĮLQȕLQWHJULQRYNDUQDND]XMH QD QMLKRYR VSRVREQRVW PLJUDFLMH Y FHQWUDOQR åLYþHYMH /DPSHQ LQ VRG YHQGDU QMLKRYDYORJDYSDWRJHQH]L.0(ãHQLQDWDQþQRRSUHGHOMHQD3ROHJLQWHJULQRYELODKNR LPHOLSRPHPEQRYORJRYPLJUDFLMLOLPIRFWLWRY7Y&ä6WXGLNHPRNLQLNRWVWD&;&/
LQ&&/LQQMLKRYLUHFHSWRUML&;&5LQ&&5/HSHMLQVRG=DMNRZVNDLQVRG
*U\JRUF]XNLQVRG
(QD L]PHG UD]LVNDY 7 FHOLþQHJD RG]LYD SUL PLãLK QDND]XMH QD WR GD QDM EL LQILOWUDFLMD OLPIRFLWRY7Y&ä6SULVSHYDODNXJRGQHPXL]KRGXL]EROH]QL0LFKOPD\ULQVRG SUL EROQLNLK V VPUWQLP L]LGRP .0( Y QHSRVUHGQL EOLåLQL RNXåHQLK QHYURQRY RGNULOL REVHåQHLQILOWUDWHFLWRWRNVLþQLKOLPIRFLWRY7*HOSLLQVRG,PXQRSDWRORãNRYORJR YQHVOL FHOLFH 7K 5X]HN LQ VRG E ,]LG L] EROH]QL QDM QH EL ELO SRYH]DQ V NRQFHQWUDFLMROLPIRFLWRY7YPRåJDQLK+D\DVDNDLQVRGSUHGSRVWDYOMDMRSDGD REVWDMDSRYH]DYDPHGVSHFLILþQRVWUHFHSWRUMHYOLPIRFLWRY7LQUHVQRVWMREROH]QL)XMLLQ VRG
',$*1267,.$.0(
=DUDGLQHVSHFLILþQHNOLQLþQHVOLNHEROH]QLMHSROHJXSRãWHYDQMDDQDPQH]HYERGDNORSD DOL ]DXåLWMD QHSDVWHUL]LUDQHJD POHND DOL POHþQLK L]GHONRY RNXåER V .0(9 SRWUHEQR SRWUGLWL ] XVWUH]QLPL SRVUHGQLPL DOL QHSRVUHGQLPL PLNURELRORãNLPL SUHLVNDYDPL LQ NOLQLþQLPLDQDOL]DPL,]ERUPLNURELRORãNHSUHLVNDYH]DGLDJQRVWLNR.0(MHRGYLVHQRG ID]HEROH]QLYNDWHULMHELORGY]HWNOLQLþQLY]RUHF
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
28 2.5.1 Laboratorijske preiskave
2.5.1.1 Laboratorijske preiskave krvi in likvorja
Z osnovnimi biokemičnimi, citološkimi in hematološkimi laboratorijskimi preiskavami krvi bolnikov s KME se določajo koncentracija C-reaktivnega proteina (CRP) in levkocitov ter koncentracija podvrst imunskih celic, z laboratorijsko analizo likvorja pa se ugotavljajo koncentracija in podvrste levkocitov, eritrocitov, glukoze in beljakovin.
Okrog 70 % bolnikov s KME ima v prvi fazi bolezni znižane vrednosti levkocitov (levkopenija) in trombocitov (trombocitopenija) v krvi, pri okrog 20 % bolnikov pa so izmerili nenormalne vrednosti jetrnih testov (Lotric-Furlan in Strle, 1995). V drugi fazi bolezni se pri bolnikih s KME navadno pojavi levkocitoza, ki je najverjetneje posledica povišanja v koncentraciji nevtrofilcev, ki lahko narastejo tudi za 80 % (Cimperman in sod., 2002; Bogovič in Strle, 2015). Koncentracija CRP je v krvi bolnikov s KME navadno normalna tekom celotnega trajanja bolezni (Bogovič in Strle, 2015).
V začetni fazi okužbe s KMEV, v likvorju bolnikov ni mogoče zaznati nobenih abnormalnosti, ob nastopu nevroloških znakov bolezni, pa imajo bolniki s KME v likvorju povečano število levkocitov, ki je običajno pod 500 × 106 celic/ml, v redkih primerih pa lahko vrednosti presežejo celo 1000 × 106 celic/ml (Bogovič in Strle, 2015).
Sprva v likvorju prevladujejo granulociti, kasneje pa se poveča koncentracija limfocitov (Kaiser in Holzmann, 2000). Koncentracija beljakovin je normalna ali zmerno povišana, koncentracija glukoze pa je pri bolnikih s KME normalna ali rahlo znižana. Velik delež (80 %) bolnikov ima rahlo povišano razmerje med koncentracijo albumina v likvorju in serumu, kar nakazuje na blago do zmerno okvaro krvno-možganske pregrade, pleocitoza pa je lahko prisotna še več tednov po prenehanju kliničnih znakov bolezni (Kaiser in Holzmann, 2000).
2.5.1.2 Neposredne metode dokazovanja okužbe s KMEV
Glavna in najbolj široko uporabljena metoda za neposredno dokazovanje virusa v kliničnih vzorcih je metoda verižne reakcije s polimerazo z reverzno transkriptazo v realnem času (angl. real time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR).
Kljub svoji visoki občutljivosti, specifičnosti in hitri izvedbi, ima svoje pomanjkljivosti.
Diagnostična uporabnost metode RT-PCR je omejena predvsem na prvo, viremično fazo bolezni, saj virusne RNA po pojavu specifičnih protiteles v krvi pri večini bolnikov ni več mogoče zaznati (Saksida in sod., 2018). Za razliko od imunokompetentnih bolnikov, je zaznava virusne RNA z metodo RT-PCR pri bolnikih, ki niso sposobni razviti virusno specifičnih protiteles, možna tudi v vzorcih, odvzetih po pojavu nevroloških zakov bolezni (Caracciolo in sod., 2015). Čeprav pri večini bolnikov v nevrološki fazi bolezni v krvi in likvorju virusa ni več mogoče dokazati, pa je nedavna raziskava pokazala, da pa ga je mogoče z metodo RT-PCR zaznati v vzorcih urina, odvzetih do 19 dni po pojavu
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
29
nevroloških znakov bolezni (Veje in sod., 2014). Metoda RT-PCR je izredno pomembna tudi za dokazovanje povzročitelja vročinske bolezni po vbodu klopa, uporabna pa je tudi za potrditev okužbe pri bolnikih s smrtnim izidom bolezni. Obenem se lahko metodo uporablja za neposredno dokazovanje virusa v klopih in naravnih gostiteljih (Avšič-Županc in Poljak, 1993).
Druga neposredna metoda dokazovanja virusa je metoda osamitve virusa iz kliničnih vzorcev bolnikov, predvsem krvi, likvorja, redkeje urina in blata (Avšič-Županc in sod., 1995; Avšič-Županc in Poljak, 1993; Holzmann, 2003; Jääskeläinen in sod., 2003).
Zaradi nizke občutljivosti, časovno zamudne in tehnično zahtevne izvedbe, ta metoda ni primerna za rutinsko diagnostiko KME.
2.5.1.3 Posredne metode dokazovanja okužbe s KMEV
V rutinski diagnostiki se za dokazovanje okužbe s KMEV najpogosteje uporabljajo posredne serološke metode, ki temeljijo na dokazovanju virusno specifičnih protiteles.
Danes najpogosteje uporabljena serološka metoda za dokazovanje virusno specifičnih protiteles je t.i. encimsko-imunski test (angl. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), ki je visoko občutljiva in omogoča hiter dokaz specifičnih protiteles tako razreda IgM kot razreda IgG. Ta so ob nastopu nevrološke faze bolezni pri večini bolnikov že prisotna in zaznavna v serumu (slika 15). Protitelesa razreda IgM se namreč pojavijo do šestega dne od začetka nevroloških znakov bolezni in dosežejo svoj vrh med devetim dnem in šestim tednom bolezni, v krvi pa vztrajajo vsaj 10 mesecev ali več po preboleli bolezni. Po drugi strani pa protitelesa razreda IgG dosežejo svoj vrh nekoliko kasneje in zagotavljajo doživljenjsko zaščito pred okužbo (Holzmann in sod., 2003). Potrditev akutne okužbe temelji na prisotnosti tako protiteles IgM kot IgG. V primeru, ko je v serumu možno dokazati le protitelesa IgM, je potrebno testiranje ponoviti čez 1‒2 tedna.
V primeru, ko pa so v serumu prisotna le protitelesa razreda IgG, je pri interpretaciji rezultatov seroloških metod potrebno upoštevati podatke o predhodnem cepljenju ali preboleli okužbi s KMEV ali prisotnost navzkrižno reaktivih protiteles, ki nastanejo po cepljenju ali okužbi z drugimi flavivirusi (Donoso Mantke in sod., 2007; Holzmann, 2003; Venturi in sod., 2009). V takih primerih je za potrditev okužbe s KMEV priporočljivo izvesti nevtralizacijski test (angl. neutralisation test, NT), ki velja za najbolj tipsko specifičen serološki test (Holzmann, 2003).
0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD
6OLND6KHPDWVNLSULND]SRMDYDNOLQLþQLKVLPSWRPRY.0(UD]PQRåHYDQMDYLUXVDLQQDVWDQNDYLUXVQR VSHFLILþQLKSURWLWHOHVSULUHMHQRSR'REOHULQVRG
.OLQLþQHSUHLVNDYH
0DJQHWQD UHVRQDQFD 05, UDþXQDOQLãND WRPRJUDILMD VWD PHWRGL VOLNDQMD NL VH XSRUDEOMDWD ]D RFHQMHYDQMH EROQLNRY V NDWHUR NROL YUVWR HQFHIDOLWLVD YNOMXþQR V .0(
YHQGDU ]DUDGL UHODWLYQR QL]NHJD GHOHåD EROQLNRY ] YLGQLPL QHQRUPDOQRVWL FHQWUDOQHJDåLYþHYMDPHWRGLQLPDWDSRVHEQHGLDJQRVWLþQHYUHGQRVWLSULRGNULYDQMX.0(
.DLVHU LQ VRG 7DED LQ VRG =D XJRWDYOMDQMH SULVRWQRVWL QHYURORãNLK QHSUDYLOQRVWLVHXSRUDEOMDWXGLHOHNWURHQFHIDORJUDPNLSULRNURJWUHKþHWUWLQDKEROQLNRY V .0( ]D]QD SDWRORãNH Y]RUFH GHMDYQRVWL PRåJDQRY LQ V VSUHPOMDQMHP Y]WUDMDQMD DOL SRMDYD QRYLK QHSUDYLOQRVWL SUHGVWDYOMD SRWHQFLDOQR SURJQRVWLþQR RURGMH ]D RFHQR GROJRURþQLKSRVOHGLFLQVPUWQLKL]LGRYEROH]QL-XKDV]LQ$]LUPDL
35(35(ý(9$1-(2.8ä%6.0(9
=GUDYLO ]D ]GUDYOMHQMH .0( QL ]GUDYOMHQMH EROQLNRY RE RNXåEL MH OH SRGSRUQR 1DMXþLQNRYLWHMãR]DãþLWRSUHGRNXåERV.0(9SUHGVWDYOMDFHSOMHQMHNLSUL FHSOMHQLK OMXGL XVSHãQR VSRGEXGL QDVWDQHN QHYWUDOL]LUDMRþLK SURWLWHOHV +HLQ] LQ VRG /RHZ%DVHOOLLQVRG
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
31 2.6.1 Evropska cepiva proti KME
Prvo profilaktično cepivo proti KME v Evropi je bilo FSME IMMUN Inject, ki je bilo za uporabo odobreno leta 1976. Formulacija cepiva se je spreminjala vse do leta 2001, ko so predstavili še danes uporabljeno formulacijo cepiva, imenovano FSME IMMUN, ki ga proizvaja Pfizer Luxembourg SARL. Cepivo vsebuje KMEV, sev Neudörfl, ki je bil osamljen iz okuženih klopov (Barret in sod., 2003). Od leta 1991 je v Evropi na voljo tudi cepivo Encepur, proizvajalca GSK Vaccines GmbH iz Nemčije, ki ga sestavlja inaktiviran KMEV, sev Karlsruhe (K23) (Girgsdies in Rosenkranz, 1996). Antigenske komponente obeh cepiv so visoko homologne in sprožijo podoben imunski odziv, zato se cepivi lahko uporabljata izmenično (Rendi-Wagner in sod., 2004, Loew-Baselli in sod., 2006). Nastala protitelesa so visoko navzkrižno reaktivna in nudijo zaščito proti vsem podtipom KMEV in večini virusov KME kompleksa (Orlinger in sod., 2011; McAuley in sod., 2017).
2.6.1.1 Sestava cepiva
Cepivi sestavlja s formalinom inaktiviran KMEV, ki je prečiščen z ultracentrifugiranjem in adsorbiran na hidratiran aluminijev hidroksid. Z ultracentrifugiranjem se odstranijo nečistoče iz celičnih kultur, na katerih je bil virus namnožen. To je potrebno, saj lahko t.
i. antigenska kompeticija med nečistočami v cepivu in cepilnim antigenom vodi v zmanjšano imunogenost cepiva (Heinz in sod., 1980). Aluminijev hidroksid velja za najbolj široko uporabljen adjuvans, ki ojača imunski odziv in spodbudi nastanek protiteles. Pomembno vlogo ima pri predstavljanju cepilnega antigena celicam imunskega sistema in tako vpliva na specifičnost nastalih protiteles in uspešnost humoralnega imunskega odziva (Zlatkovic in sod., 2013). Optimalna količina antigena v cepivu je bila določena v prospektivni raziskavi odraslih oseb, starih med 16 in 65 let, ki so prejeli različne doze cepilnega antigena (Ehrlich in sod., 2003). Cepivo FSME IMMUN® tako vsebuje 2,4 µg, cepivo Encepur® pa 1,5 µg antigena. Cepivi pridobivajo v fibroblastih piščančjih zarodkov (angl. chick embryo fibroblasts, CEF). V cepivu je za ohranjanje učinkovitosti cepiva dodan stabilizator, ki je v primeru FSME IMMUN humani serumski albumin, v Encepur® pa saharoza. Poleg stabilizatorjev so v cepivih prisotne tudi druge pomožne snovi, kot so voda, natrijev klorid in pufrska raztopina.
Oba proizvajalca zagotavljata formulacijo cepiva za odrasle in otroke, FSME IMMUN/Encepur ter FSME IMMUN Junior/Encepur Children. Do potrebe po oblikovanju cepiva, primernega za otroke, je prišlo zaradi pogostega pojavljanja neželenih stranskih učinkov, predvsem v obliki povišane telesne temperature po cepljenju otrok s cepivom za odrasle. Pri oblikovanju cepiva za otroke so količino cepilnega antigena in pomožnih snovi v cepivu zmanjšali za polovico. Ugotovili so tudi, da uporaba serumskega albumina v cepivu prepreči dvig vrednosti TNF-α in pojav febrilne faze po cepljenju otrok s cepivom proti KME (Marth in Kleinhappl, 2001). Cepivo FSME
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
32
IMMUN (Junior) je primerno za otroke do 15. leta starosti, Encepur-K® pa za otroke do 11. leta starosti.
2.6.1.2 Program cepljenja
Obstajata dve različni shemi cepljenja proti KME, ki se razlikujeta po hitrosti nastanka zaščitnega nivoja protiteles in trajanju zaščite po cepljenju, t.i. konvencionalna in hitra shema cepljenja (slika 16). Pri cepljenju po hitri shemi cepljenja oseba razvije visoko stopnjo zaščite zelo hitro po drugem odmerku cepiva (Schosser in sod., 2014), zato je cepljenje po tej shemi še posebej priporočljivo za ljudi, ki potujejo v endemična območja in potrebujejo zaščito pred KME v kratkem času. Hitri shemi cepljenja z obstoječima evropskima cepivoma proti KME pa se med seboj razlikujeta po številu odmerkov in razmikom med njimi. S cepljenjem po hitri shemi cepljenja s cepivom Encepur®, mora oseba dobiti štiri odmerke cepiva, in sicer drugi odmerek cepiva sedmi dan, tretji odmerek 21. dan in četrti odmerek 365. dan po prvem odmerku cepiva, medtem ko po hitri shemi cepljenja s cepivom FSME IMMUN osebe prejmejo tri odmerke cepiva, pri čemer drugi odmerek sledi 14 dni, tretji pa na 5–12 mesecev po prvem odmerku cepiva (Jelinek in sod., 2012).
Pri cepljenju po konvencionalni shemi cepljenja je priporočen časovni razmik med prvim
Pri cepljenju po konvencionalni shemi cepljenja je priporočen časovni razmik med prvim