PBMC smo na hitro odmrznili v vodni kopeli pri 37 °C, epruveto prebrisali s 70 % etanolom in celice prenesli v 50 ml epruveto z navojem. Ob neprestanem mešanju vsebine epruvete smo po kapljicah dodali 10 ml hranilnega medija, segretega na 37 °C in suspenzijo celic centrifugirali 5 min na 1600 obratih/min pri sobni temperaturi. Po centrifugiranju smo supernatant odlili ter celice resuspendirali v 10 ml svežega hranilnega medija in ponovili postopek centrifugiranja. Nato smo odlili supernatant in celice resuspendirali v hranilnem mediju ter jih čez noč inkubirali na 37 °C s 5 % CO2.
Naslednji dan smo celice centrifugirali 5 min na 1600 obratih/min pri sobni temperaturi, odlili supernatant ter celice resuspendirali v 1 ml svežega hranilnega medija za PBMC. Z avtomatskim števcem celic Countess Automated Cell Counter smo izmerili koncentracijo celic in z dodajanjem hranilnega medija za PBMC pripravili delovno koncentracijo celic 2 × 106 celic/ml. V posamezno luknjo plošče za gojenje celičnih kultur s 24 luknjami smo odpipetirali po 500 μl celične suspenzije.
3.2.7.2 Stimulacija PBMC in vitro s KMEV in cepivom FSME IMMUN
Pripravljeni celični suspenziji smo dodali bodisi 20 μl KMEV, sev Ljubljana s TCID50=1*108/ml oz. MOI = 2 ali 20 μl cepiva FSME IMMUN oz. redčino 1 : 25 (Pfizer, Luksemburg, Luksemburg) ter jo premešali, da se je stimulant v suspenziji celic enakomerno porazdelil. Optimalna količina KMEV in cepiva FSME IMMUN za stimulacijo PBMC je bila določena na podlagi predhodnih rezultatov analize PBMC posameznika s pretočno citometrijo po stimulaciji z različnimi koncentracijami virusa oz.
cepiva. S KMEV smo stimulirali PBMC 10 cepljenih in 10 necepljenih bolnikov s KME ter PBMC 5 cepljenih zdravih in 5 necepljenih zdravih oseb, s cepivom FSME IMMUN pa smo stimulirali PBMC 5 necepljenih zdravih oseb (slika 17). Preiskovane skupine so bile med seboj usklajene po spolu in starosti. Nestimulirane PBMC vsakega posameznika v vsaki časovni točki poskusa so služile kot negativna kontrola stimulacije PBMC. PBMC smo inkubirali 24h, 48h in 6 dni na 37 °C s 5 % CO2. Časovne točke poskusa stimulacije PBMC so bile določene na podlagi rezultatov analize 7 dnevne stimulacije PBMC s pretočno citometrijo po stimulaciji PBMC posameznika z virusom in cepivom.
0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD
6OLND6KHPDVWLPXODFLMH3%0&EROQLNRYV.0(LQ]GUDYLKRVHEV.0(9LQFHSLYRP)60(,0081
$QDOL]DSURILOD3%0&VSUHWRþQLPFLWRPHWURP
3ULDQDOL]LFHOLFVSUHWRþQLPFLWRPHWURPFHOLFHSRWXMHMRVNR]LVQRSVYHWOREHSULþHPHU SULGHGRORPDDOLRGERMDVYHWOREHVSRYUãLQHFHOLFHDOLSDGRDEVRUEFLMHLQHPLVLMHVYHWOREH V IOXRUHVFHQþQHJD EDUYLQD QD SRYUãLQVNR YH]DQLK PRQRNORQVNLK SURWLWHOHVLK )RWRGHWHNWRU NL PHUL RGERM DOL ORP VYHWOREH L] VPHUL YLUD VYHWOREH DQJOIRUZDUG VFDWWHUHG OLJKW )6& SRGD SRGDWHN R YHOLNRVWL FHOLFH IRWRGHWHNWRU NL ]D]QD VYHWORER SUDYRNRWQR QD YLU VYHWOREH DQJO VLGHVFDWWHUHG OLJKW 66& SD LQIRUPDFLMR R JUDQXOLUDQRVWL LQ SRYUãLQVNL VWUXNWXUL IOXRUHVFHQþQL GHWHNWRUML V ILOWUL SD VSUHMHPDMR VYHWORERHPLWLUDQR]IOXRUHVFHQþQHJDEDUYLODPRQRNORQVNLKSURWLWHOHV6SUHMHWRVYHWORER IRWRSRPQRåHYDONHSUHWYRULMRYHOHNWULþQHVLJQDOHUDþXQDOQLNSDSUHMHWHVLJQDOHJUDILþQR SULNDåHYREOLNLWRþNRYQHJDGLDJUDPDSULNDWHUHPYVDNDWRþNDSUHGVWDYOMDHQRFHOLFR 7DNRVHRYVDNLFHOLFL]EHUHYHþUD]OLþQLSDUDPHWURYNLGDMRSRGDWNHRQMHQLYHOLNRVWL JUDQXOLUDQRVWLWHURYUVWLLQMDNRVWLRGGDQHJDIOXRUHVFHQþQHJDVLJQDOD
9]RUþHQMH3%0&
3RKKLQGQHYLKLQNXEDFLMHVPR3%0&YSORãþL]DJRMHQMHFHOLFUHVXVSHQGLUDOLY JRMLWYHQHPPHGLMXMLKSUHQHVOLYHSUXYHWRWHUFHQWULIXJLUDOLPLQQDREUDWLKPLQ SULVREQLWHPSHUDWXUL6XSHUQDWDQWVPRVKUDQLOLQD&GRQDGDOMQHXSRUDEHSHOHWSD UHVXVSHQGLUDOLYȝOJRMLWYHQHJDPHGLMD]D3%0&1DFHOLFHNLVRVHPHGLQNXEDFLMR SULWUGLOHQDSORãþR]DJRMHQMHVPRGRGDOLPOOHGHQRKODGQHJDP0('7$Y3%6LQ LQNXELUDOLPLQQDOHGX&HOLFHVPRSUHEUL]JDOLQDUDKORSRVWUJDOL]QDVWDYNRP]DSLSHWR LQVXVSHQ]LMRFHOLFSUHQHVOLYHSUXYHWRWHUFHQWULIXJLUDOLPLQQDREUDWLKPLQSUL VREQLWHPSHUDWXUL3RFHQWULIXJLUDQMXVPRRGVWUDQLOLVXSHUQDWDQWMLKUHVXVSHQGLUDOLY ȝOJRMLWYHQHJDPHGLMD]D3%0&WHUMLK]GUXåLOLVFHOLFDPLL]SUYHHSUXYHWH&HOLFHVPR
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
48
dobro premešali, nato pa smo 250 μl celične suspenzije shranili na -80 °C do nadaljne uporabe, 250 μl vzorca pa smo takoj pripravili za analizo na pretočnem citometru.
3.2.8.2 Označevanje PBMC
Pred označevanjem celic smo na Countess II Automated Cell Counter (Thermo Fisher Scientific, Kalifornija, ZDA) izmerili koncentracijo in živost stimuliranih in nestimuliranih PBMC po navodilih proizvajalca. Za označevanje PBMC smo uporabili kombinacije različnih fluorescenčno označenih monoklonskih protiteles, ki so prikazane v preglednici 3. Za analizo aktivacije dendritičnih celic smo uporabili 150 μl suspenzije PBMC, pobrane po 24h in 48h od začetka stimulacije, za analizo aktivacije limfocitov T in diferenciacije limfocitov B pa 100 μl PBMC, pobranih po 6 dnevih stimulacije.
Suspenziji PBMC smo dodali ustrezne volumne monoklonskih protiteles, vse dobro premešali in inkubirali v temi pri sobni temperaturi. Po 20 min inkubacije smo dodali 2 ml lizacijskega pufra (Becton Dickinson, New Jersey, ZDA) in inkubirali še 10 min v temi pri sobni temperaturi, da je potekla fiksacija celic. Sledilo je 5 min centrifugiranja na 1600 obratih/min pri sobni temperaturi. Po centrifugiranju smo odlili lizacijski pufer in označene PBMC sprali z 2 ml PBS. Postopek spiranja smo ponovili dvakrat. Po drugem centrifugiranju smo vzorec resuspendirali v 200 μl PBS in suspenzijo PBMC analizirali na pretočnem citometru FACS Canto II (BD Biosciences, San Jose, ZDA).
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
49
Preglednica 3: Kombinacije uporabljenih fluorescenčno označenih monoklonskih protiteles (mAb).
ime kombinacije
mAb mAb s fluorescenčnim
barvilom klon proizvajalec kataloška
številka volumen mAb (μl)
PANEL 1- dendritične celice
CD303 FITC AC144 Milteny Biotec 130-113-192 2
CD86 PE 2331 BD Biosciences 557344 15
CD3 PerCP-Cy5.5 SK7 BD Biosciences 332771 10
CD19 PerCP-Cy5.5 SJ25C1 BD Biosciences 332780 10
CD14 PerCP-Cy5.5 M5E2 BD Biosciences 550787 5
CD16 PerCP-Cy5.5 3G8 BD Biosciences 338440 10
CD123 PE Cy7 7G3 BD Biosciences 560826 4
CD11c APC MJ4-27G12 BD Biosciences 560895 5
HLA-DR APC Cy7 L243 BD Biosciences 335831 5
CD141 VioBlue AD5-14H12 Milteny Biotec 130-113-882 2
CD1c BV510 F10/21A3 BD Biosciences 742747 2
PANEL 2- limfociti T
CD69 FITC FN50 BD Biosciences 557049 10
CD127 PE Hil-7R-M21 BD Biosciences 557938 4
HLA-DR PerCP-Cy5.5 L243 BD Biosciences 339216 10
CD3 PE Cy7 UCHT1 Ebioscience 25-0038-42 4
3.2.8.3 Analiza PBMC s pretočnim citometrom
Označene PBMC smo analizirali na pretočnem citometru BD FACS Canto II s programsko opremo BD FACS Diva 8.0.1 (BD Biosciences, San Jose, ZDA). Na pretočnem citometru smo izmerili 100 000 celic in na podlagi podatkov o njihovi velikosti in granuliranosti, izražanju površinskih molekul, na katera so se vezala izbrana monoklonska protitelesa in jakosti njihove fluorescence, določili deleže in obseg aktivacije podvrst celic imunskega sistema.
Panel 1: določanje svetilnosti aktivacijskih markerjev DC
Najprej smo med vsemi celicami na podlagi informacije o velikosti določili posamične celice, ki niso bile v skupkih, nato pa smo na podlagi o velikosti in granuliranosti ločili mononuklearne celice. Med mononuklearnimi celicami smo določili DC (CD3-CD19-CD14-CD16-HLA-DR++) in izmerili svetilnosti aktivacijskih molekul HLA-DR in CD86 (slika 18).
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
50
Slika 18: Določanje svetilnosti aktivacijskih markerjev na DC. A-ločitev posameznih celic od celičnih skupkov. B-ločitev mononuklearnih celic. C-ločitev DC od preostalih mononuklearnih celic na podlagi odsotnosti linijskih markerjev CD3, CD19, CD14, CD16 in izražanju HLA-DR. D-svetilnost HLA-DR na DC. E-svetilnost CD86 na DC.
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
51 Panel 2: določanje deleža aktiviranih limfocitov T
Med vsemi celicami smo določili limfocite, med katerimi smo nato zajeli limfocite T (CD3+) in med limfociti T določili delež celic Th (CD3+CD4+) in Tc (CD3+CD8+). Med celicami Th smo določili deleže celic, ki izražajo enega od aktivacijskih markerjev CD69, CD25 in HLA-DR, med celicami Tc pa deleže celic, ki izražajo CD69 in HLA-DR. Med populacijo celic Th smo izmerili tudi odstotek regulatornih celic T (CD25++CD4+) (slika 19).
Slika 19: Določanje deleža aktiviranih in regulatornih limfocitov T. A-ločitev limfocitov od monocitov in granulocitov na podlagi velikosti in granuliranosti. B-ločitev limfocitov T (CD3+) od limfocitov B. C-določanje deleža celic Th (CD4+) in Tc (CD8+) med limfociti T. D-C-določanje deleža aktiviranih celic Th in Tc, ki izražajo aktivacijski marker CD69. E-določanje deleža aktiviranih celic Th in Tc, ki izražajo aktivacijski marker CD25. F-določanje deleža aktiviranih celic Th in Tc, ki izražajo aktivacijski marker HLA-DR. G-določanje deleža regulatornih limfocitov T (Treg) (CD4+CD25++CD127-).
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
52
Panel 3: določanje deleža diferenciranih limfocitov B v plazmatke
Med limfociti smo označili limfocite B (CD19+) in med njimi izmerili odstotke spominskih limfocitov B (CD27+CD19+), med katerimi smo določili delež plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) (slika 20).
Slika 20: Določanje deleža plazmablastov. A-ločitev limfocitov od ostalih vrst levkocitov glede na velikost in granuliranost. B-ločitev limfocitov B (LIM B) od limfocitov T na podlagi izražanja molekule CD19. C-določanje spominskih limfocitov B (P2) na podlagi izražanja CD27. D-C-določanje plazmablastov (CD19+CD27+CD38+) glede na izražanje molekule CD38 med spominskimi limfociti B.
3.2.9 Določanje koncentracije citokinov in kemokinov z metodo sočasne analize