Prvi primer KME v Sloveniji so potrdili že leta 1953, ko so povzročitelja virusnega meningoencefalitisa prvič uspešno osamiti iz krvi bolnika z značilnimi nevrološkimi znaki bolezni (Vesenjak-Zmijanac in sod., 1955), leta 1955 pa so virus uspeli osamiti tudi iz klopa vrste I. ricinus (Likar in sod., 1956). Od leta 1977 je bolezen v Sloveniji obvezno prijavljiva, podatki o pojavnosti bolezni pa se zbirajo v sistemu nadzora nalezljivih bolezni Nacionalnega inštituta za javno zdravje Slovenije (NIJZ).
Letna incidenca KME se v Sloveniji nenehno spreminja, kar je posledica spreminjanja okoljskih dejavnikov, ki vplivajo na prisotnost virusa na posameznem območju (Eržen in Kraigher, 1993; Knap in Avšič-Županc, 2015). Primeri KME v Sloveniji se pojavljajo sezonsko z nekajtedensko zakasnitvijo od pričetka biološke aktivnosti klopov I. ricinus.
Ocenjujejo, da je v Sloveniji okuženih 0,47 % klopov, deleži okuženih klopov na posameznih območjih pa sovpadajo s stopnjo obolevnosti na teh območjih (Durmiši in sod., 2011). Največ primerov KME v Sloveniji zaznamo med aprilom in novembrom, z glavnim vrhom pojavljanja v juniju in juliju, velikokrat pa sledi drugi vrh v septembru in oktobru (slika 8).
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
13
Slika 8: Prijavljeni primeri KME v Sloveniji po mesecih v letih 2016-2018. (NIJZ, 2019)
V obdobju med leti 1983 in 2016 je bilo število letno prijavljenih primerov KME v Sloveniji med 62 in 531 (stopnja incidence med 3,0 in 26,6 primeri/100.000 prebivalcev), kar v povprečju znaša 206 primerov na leto s povprečno letno stopnjo incidence 10,3 primerov/100.000 prebivalcev, kar uvršča Slovenijo v sam vrh obolevnosti za KME. V letu 2018, ko je bilo prijavljenih 153 primerov KME, so največ primerov bolezni zabeležili v okolici Kranja (20,1 primer/100.000 prebivalcev), na območju Raven na Koroškem (14,2 primera/100.000 prebivalcev) in v okolici Ljubljane (9,3 primera/100.000 prebivalcev) (NIJZ, 2019).
Tveganju za okužbo so izpostavljene osebe vseh starostnih skupin, vendar se je v zadnjih letih povečalo število primerov bolezni pri starejših osebah (slika 9). Od leta 1994 je bila stopnja obolevnosti za KME najvišja v starostni skupini 55–64 let, bolezen pa je pogosteje prizadela moške kot ženske (Grgič-Vitek in Klavs, 2011). Otroci redkeje zbolevajo za KME, le 5-13 % vseh primerov KME je diagnosticiranih pri otrocih, mlajših od 15 let (Arnez in Avšič-Županc, 2009). Za razliko od incidence KME, pa je bila pri otrocih, starih od 5 do 14 let, invalidnost, prilagojena na življenjska leta, večja kot v skupini odraslih, starih od 50 do 74 let (Fafangel in sod., 2017). Večje tveganje za okužbo in bolezen imajo ljudje, ki bivajo na endemičnih območjih in tisti, ki so zaposleni v poklicih, ki zaradi narave dela predstavljajo večje tveganje za stik s prenašalcem bolezni, kot so gozdarstvo, lesnopredelovalna industrija ter gradbeništvo. Opazno višja incidenca KME je bila ugotovljena pri ljudeh, ki gozdove obiskujejo zaradi rekreacije in nabiranja gozdnih sadežev (Blasko-Markic in Socan, 2012).
0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD
6OLND 3ULMDYOMHQH LQFLGHQþQH VWRSQMH NORSQHJD PHQLQJRHQFHIDOLWLVD .0( Y OHWX SR VSROX LQ VWDURVWQLKVNXSLQDKY6ORYHQLML1,-=
3$72*(1(=$.0(
.ORSQL PHQLQJRHQFHIDOLWLV .0( MH HQD L]PHG QDMSRPHPEQHMãLK YLUXVQLK RNXåE FHQWUDOQHJDåLYþHYMDY(YURSLLQ$]LML6SRY]URþLWHOMHPEROH]QL.0(9VHOMXGMHODKNR RNXåLMRREYERGXRNXåHQHJDNORSDDOL]]DXåLWMHPQHSDVWHUL]LUDQHJDPOHNDDOLPOHþQLK L]GHONRYRNXåHQHåLYLQHVOLND+XGRSLVNLQVRG
6OLND6KHPDWVNLSULND]SUHQRVD.0(9]QRWUDMåLYOMHQMVNHJDFLNODNORSRYLQQDþORYHNDSULUHMHQRSR 5X]HNLQVRG
0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD
5D]LVNDYHVHURSUHYDOHQFHQDYLVRNRHQGHPLþQLKREPRþMLK.0(9QDND]XMHMRQDWRGD YHOLNDYHþLQDRNXåE]HYURSVNLPSRGWLSRP.0(9SRWHNDEUH]RSD]QLKNOLQLþQLK]QDNRY EROH]QL .DLVHU *XVWDIVRQ LQ VRG %RJRYLþ LQ 6WUOH SUL SULEOLåQR GYHKWUHWMLQDKVLPSWRPDWVNLKRNXåESDEROH]HQSRWHNDYGYHKID]DKVOLND
6OLND6KHPDWVNLSULND]GYRID]QHJDSRWHND.0(SULUHMHQRSR%ORPLQVRG
2EYERGXRNXåHQHJDNORSDVHYLUXVSUHQHVHYWHORVOLND.ORSREKUDQMHQMXQDPHVWR YERGDL]ORþDVOLQRNLNRWIDUPDNRORãNRDNWLYQDVSRMLQD]PDQMãXMHEROHþLQRLQVUEHQMHQD PHVWX YERGD WHU V VYRMLP DQWLNRDJXODWRUQLP YD]RGLODWRUQLP LQ LPXQRPRGXODWRUQLP GHORYDQMHP RODMãD SUHQRV YLUXVD Y WHOR LQ QMHJRYR ãLUMHQMH /DEXGD LQ VRG .D]LPLURYDLQVRG9LUXVRNXåLYNRåLSULVRWQHILEUREODVWHQHYWURILOFHPRQRFLWH LQGHQGULWLþQHFHOLFH'&NRåH/DQJHUKDQVRYHFHOLFHLQVHYQMLKSRPQRåXMH/DEXGD LQ VRG 7KDQJDPDQL LQ VRG .RPSRQHQWH NORSRYH VOLQH PRþQR SRYHþDMR GRY]HWQRVW'&]DRNXåERWHU]QLåDMRQMLKRYRVSRVREQRVWL]ORþDQMDFLWRNLQRY)LDORYDLQ VRG NL EL ODKNR ]DPHMLOL SRPQRåHYDQMH YLUXVD 3UHGYLGHYDMR GD RNXåHQH '&
SUHQHVHMRYLUXVYOLPIQHYR]OHNMHUVHOHWDSRPQRåXMHQDSUHM,QNXEDFLMVNLGRELNLWUDMD GQL .DLVHU VOHGL SUYD R] W L YLUHPLþQD ID]D NL VRYSDGD V SRMDYRP QHVSHFLILþQLK NOLQLþQLK ]QDNRY NRW VR YURþLQD EROHþLQH Y PLãLFDK JODYRERO VSORãQR VODERSRþXWMHLQXWUXMHQRVWVOLND/RJDULQVRG/RWULF)XUODQLQVRG 7RPDåLþLQVRG9WHMID]LEROH]QLVHYLUXVUD]QHVHSRWHOHVXLQYVWRSLWXGLYGUXJH RUJDQHNRWVRYUDQLFDMHWUDLQNRVWQLPR]HJNMHUVHYLUXVSRPQRåXMHQDSUHM6SURãþDQMH YLUXVD L] WHK RUJDQRY RPRJRþD YHþGQHYQR YLUHPLMR +DJOXQG LQ *XQWKHU /LQGHQEDFK LQ VRG 5X]HN LQ VRG PHG NDWHUR MH YLUXVQR 51$ YVH GR SRMDYDYLUXVQRVSHFLILþQLKSURWLWHOHVYNUYLLQOLNYRUMXPRåQR]D]QDWLYNUYL]PHWRGR YHULåQHUHDNFLMHVSROLPHUD]RDQJOSRO\PHUDVHFKDLQUHDFWLRQ3&56DNVLGDLQVRG 6DNVLGDLQVRG
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
16
Med viremijo virus vstopi v osrednje živčevje (slika 12), vendar natančna pot še ni poznana. Do sedaj je bilo predlaganih več mehanizmov vstopa v osrednje živčevje: (i) z okužbo in retrogradnim transportom po perifernih živcih, (ii) z okužbo visoko občutljivih vohalnih živcev in aksonskim transportom; (iii) z okužbo endotelnih celic možganskih kapilar in transcitozo v možganski parenhim; (iv) s citokini/kemokini posredovano porušenje krvno-možganske pregrade; (v) s transportom virusa v centralno živčevje z okuženimi levkociti (t.i. mehanizem Trojanskega konja), ki so sposobni prehajati krvno-možgansko pregrado. Po vstopu v osrednje živčevje, virus okuži predvsem nevrone (Gelpi in sod., 2005), vendar so za okužbo s KMEV dovzetni tudi astrociti (Palus in sod., 2014; Potokar in sod., 2014). Astrociti, in v nekoliko manjšem obsegu tudi nevroni, se na okužbo odzovejo z močnim protivirusnim odzivom ter izločanjem kemokinov, ki lahko na mesto okužbe privabijo imunske celice (Fares in sod., 2020). Poleg neposrednega vpliva virusa, k obsežnemu propadu nevronov najverjetneje prispeva tudi infiltracija aktiviranih imunskih celic v CŽS (Tomažič in Ihan, 1996), ki predstavljajo možni vir vnetnih citokinov, ki so povišani v likvorju bolnikov ob pojavu nevroloških znakov bolezni (Lepej in sod., 2007; Grygorczuk in sod., 2017; Grygorczuk in sod., 2018;
Bogovič in sod., 2019). Tako obdobju brez vidnih kliničnih znakov bolezni, ki navadno traja en teden, sledi druga ali t.i. nevrološka faza s pojavom nevroloških znakov bolezni, vse od blažje oblike meningitisa, do hujše oblike meningoencefalitisa ali meningoencefalomielitisa. Meningitis se pojavi pri okrog 50 % odraslih bolnikov, meningoencefalitis pri 40 % in meningoencefalomielitis pri 10 % (Kaiser, 2008).
Meningitis se kaže z znaki, kot so visoka vročina, glavobol, otrdel vrat, slabost in bruhanje. Znaki vnetja možganskih ovojnic se lahko pojavijo, vendar navadno niso zelo izraziti. Encefalitis spremljajo motnje zavesti, ki se lahko kažejo vse od občutka zaspanosti do skorajšnje izgube zavesti, v redkih primerih celo do kome. Drugi klinični znaki, ki spremljajo encefalitis, so še nemir, tremor udov ter drgetanje mišic jezika, vrtoglavica in motnje kognitivnih funkcij. Najhujšo obliko bolezni pa predstavlja meningoencefalomielitis, pri čemer se bolezenskim znakom encefalomielitisa pridružijo še znaki, ki nakazujejo na poškodbo hrbtenjače, kot so ohromitve mišic udov in dihal (Bogovič in sod., 2014). Bolezen navadno v hujši obliki poteka pri odraslih v primerjavi z otroci ter pri starostnikih v primerjavi z mlajšimi odraslimi osebami (Logar in sod., 2000; Logar in sod., 2006). Po preboleli bolezni večina kliničnih znakov izzveni, kar pri 46 % bolnikov z nevrološkimi znaki bolezni pa ostanejo dolgotrajne posledice, med njimi okrog 5 % bolnikov trpi za trajnimi parezami, tretjina obolelih pa razvije postenecefalitični sindrom z nevropsihiatričnimi motnjami (Kaiser, 2008; Bogovič in sod., 2018). Smrtnost pri okužbi z evropskim podtipom virusa je nizka in prizadene le 1-2 % bolnikov (Kaiser, 1-2008).
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
17
Slika 12: Shematski prikaz okužbe gostitelja s KMEV (prirejeno po Ruzek in sod., 2019:26)
Ob okužbi z zaužitjem nepasteriziranega mleka viremične živali, bolezen poteka podobno kot po vbodu okuženega klopa, le da so nevrološki znaki bolezni v drugi fazi manj izraziti, bolniki pa v večini primerov nimajo trajnih posledic (Balogh in sod., 2010; Gritsun in sod., 2003).
0DUXãLü0,PXQVNLRG]LYLQIXQNFLRQDOQRVW«UHFHSWRUMHYSULEROQLNLKVNORSQLPPHQLQJRHQFHIDOLWLVRPFHSOMHQLKSURWLWHMEROH]QL 'RNWGLVHUWDFLMD/MXEOMDQD8QLYHU]DY/MXEOMDQL%LRWHKQLãNDIDNXOWHWD
3UL YHþLQL EROQLNRY ] HQRID]QLP SRWHNRP EROH]QL VH SRMDYLMR ]QDNL SUL]DGHWRVWL RVUHGQMHJDåLYþHYMDEUH]SUHGKRGQHIHEULOQHID]H5HGNHMHSDEROH]HQSRWHNDYDERUWLYQL DOLIHEULOQLREOLNLSULNDWHULEROQLNLUD]YLMHMROHQHVSHFLILþQHEROH]HQVNH]QDNH]QDþLOQH ]DSUYRID]REROH]QL9WHKSULPHULKEROH]HQRELþDMQRWUDMDOHQHNDMGQLLQQHSXãþDWUDMQLK SRVOHGLF/RWULF)XUODQLQVRG%RJRYLþLQVRG
9]URNL]DWDNRUD]QROLNHNOLQLþQHVOLNHSRRNXåELV.0(9ãHQLVRSRSROQRPDUD]MDVQMHQL YHQGDU JUH QDMYHUMHWQHMH ]D NRPELQDFLMR YLUXVQLK LQ JRVWLWHOMVNLK GHMDYQLNRY 9LUXVQL GHMDYQLNL ]DMHPDMR NROLþLQR YLUXVD LQ QMHJRYR YLUXOHQFR UHSURGXNFLMVNR VSRVREQRVW QDþLQYVWRSDYLUXVDYWHORJRVWLWHOMDLQVWUXNWXUQRKHWHURJHQRVW6KHYWVRYDLQVRG SRWHN EROH]QL SRYH]DQ V VWDURVWMR LQ UHVQRVWMR EROH]HQVNLK ]QDNRY Y SUYLID]L EROH]QL QL]NLPL WLWUL QHYWUDOL]DFLMVNLK SURWLWHOHV LQ QL]NR UDYQLMR ,J0 SURWLWHOHV Y OLNYRUMX /LQGTXLVWLQVRG3UHGLVSR]LFLMR]DUD]YRMNOLQLþQHREOLNHEROH]QLSRYH]XMHMRV ãWHYLOQLPLSROLPRUIL]PLJHQRYNRWVRSROLPRUIL]HP&&5ǻ.LQGEHUJLQVRG V IXQNFLRQDOQLP UHFHSWRUMHP 7/5 .LQGEHUJ LQ VRG %DUNKDVK LQ VRG 0LFNLHQH LQ VRG UD]OLþQLK 613 Y ] LQWHUIHURQL VSRGEXMHQLK SURWLYLUXVQLK EHOMDNRYLQDK 2$6 LQ 2$6 %DUNKDVK LQ VRG 613 Y SURPRWRUVNL UHJLML
&'%DUNKDVLQVRGLQ613Y,/%LQ,/%DUNKDVLQVRGWHU613 UV Y JHQX 003 NL JD SRYH]XMHMR ] YHþMLP WYHJDQMHP ]D QDVWDQHN SRãNRGE FHQWUDOQHJDåLYþHYMD%DUNKDVKLQVRG1DSRWHNEROH]QLSROHJYLUXVQLKYSOLYDMR SDWRJHQH]L .0( LQ SULURMHQHP LPXQVNHP RG]LYX QD RNXåER V .0(9 ]DWR L]KDMD SUHGYVHPL]UD]LVNDYQDPRGHOQLKåLYDOLKLQLQYLWURVLVWHPLKWHUL]UD]LVNDY]QDUDYQR RVODEOMHQLP/*79
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
19 2.4.1.1 Interferonski odziv na okužbo s KMEV
Hitra in učinkovita aktivacija prirojenega imunskega sistema in oblikovanje interferonskega (IFN) odziva igra pomembno vlogo pri zgodnji zamejitvi okužbe s patogenimi mikroorganizmi. Celice s pomočjo receptorjev za prepoznavo molekularnih vzorcev (angl. pathogen recognition receptor, PRR) prepoznajo patogenom pridružene molekularne vzorce (angl. pathogen associated molecular patterns, PAMP), kar sproži hitro aktivacijo prirojenega imunskega sistema in nastanek interferonskega odziva tipa I (IFN I). Med PRR, ki prepoznajo virusno RNA molekulo, spadajo Toll-u podobni receptorji, (angl. Toll-like receptor, TLR) TLR3, TLR7 in TLR8, ki se nahajajo v endosomih in plazmalemi (slika 13), ter RIG-I podobni receptorji (angl. RIG-I like receptors, RLR), receptor RIG-I (angl. retinoic acid-inducible gene I) in MDA-5 (angl.
melanoma differentiation-associated protein-5), ki se nahajajo v citoplazmi (slika 14).
TLR3 receptorji prepoznajo dvoverižno RNA (angl. double stranded RNA, dsRNA), ki nastane med pomnoževanjem KMEV, medtem ko TLR7 in TLR8 vežeta enoverižno RNA (angl. single stranded RNA, ssRNA), ki gradi genom virusa. Vezava dsRNA na TLR3 povzroči dimerizacijo in aktivacijo receptorja, ki preko adaptorske molekulo TRIF, aktivira zaporedje kinaz in povzroči aktivacijo transkripcijskih faktorjev nuklearnega faktorja kappa B (angl. Nuclear factor kappa B, NFκB), aktivatorskega proteina 1 (angl.
activator protein 1, AP-1) in interferon regulatornega faktorja 3 (angl. interferon regulatory factor 3, IRF3). NFκB in AP-1 spodbudita prepisovanje genov za vnetne citokine, medtem ko IRF3 aktivira prepisovanje genov za IFN-β. Vezava ssRNA na TLR7 in TLR8 preko adaptorske molekule diferenciacijskega mieloidnega proteina 88 (angl.
myeloid differentiation primary-response protein 88, MyD88), aktivira kinazi, povezani z receptorjem interlevkin 1 in 4 (angl. IL-1R-associated kinase, IRAK-1, IRAK-4). Sledi aktivacija TRAF6, ki aktivira NF-κB in sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, aktivacija TRAF3 pa preko IRF7, spodbudi prepisovanje genov IFN-α. RIG-I in MDA5 po vezavi virusne ssRNA/dsRNA, vežeta adaptorski protein interferon beta promotor stimulator (angl. interferon-beta promoter stimulator1, IPS-1), ki aktivira signalne poti za translokacijo NFκB in IRF3, ki spodbudita prepisovanje vnetnih citokinov in IFN- β (Jensen in Thomsen, 2012). Vezava IFN I (IFN-α, IFN-β) na interferon-α/β receptor (angl. interferon-α/β receptor, IFNAR), sproži od kinaze Janus ter signalnega prenašalca in aktivatorja transkripcije (JAK/STAT) odvisno signalno pot v kateri se aktivirata kinaza Janus 1 (Jak1) in tirozinska kinaza 2 (Tyk2), ki fosforilirata transkripcijska proteina STAT-1 in STAT-2, kar vodi v aktivacijo in translokacijo faktorja stimulacije interferona 3 (angl. interferon-stimulated gene factor 3, ISGF3) v jedro celice. Transkripcijski faktor ISGF3 sproži prepisovanje več kot 300 z interferoni spodbujenih genov (ISG; angl.
interferon stimulated gene) z zapisom za različne beljakovine, ki imajo bodisi sposobnost moduliranja IFN odziva ali pa s svojim neposrednim protivirusnim delovanjem zamejijo pomnoževanje virusa (Schneider in sod., 2014). IFN I obenem tudi aktivirajo makrofage in celice naravne ubijalke (angl. natural killer cell, NK-celice) (Ortaldo in sod., 1983) ter
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
20
ojačajo diferenciacijo in preživetje limfocitov T in spodbujajo nastajanje protiteles, ki jih tvorijo limfociti B (Kadowaki in Liu, 2002).
Slika 13: Signalna kaskada aktivacije TLR receptorjev (prirejeno po Jensen in Thomsen, 2012:2902)
Tako poskusi na miših, kot poskusi in vitro so pokazali, da ima interferonski odziv zaščitno vlogo pri okužbi s KMEV. Miši brez delujočega IFNAR, so po okužbi s KMEV in LGTV, razvile obsežno sistemsko viremijo in močan vnetni odziv na pomnoževanje virusa v možganih ter hude bolezenske znake in so podlegle okužbi (Weber in sod., 2014).
Nedavna raziskava je pokazala, da so v oblikovanje imunskega odziva na okužbo s KMEV pri ljudeh, vključeni tako TLR kot RLR receptorji (Signorazzi in sod., 2021).
Pomembno vlogo pri okužbi s KMEV in LGTV pri miših ima tudi IPS-1, adapterski protein receptorjev RIG-1 in MDA5, saj so pri miših z izbitim genom za IPS-1 po okužbi z LGTV opazili obsežnejše pomnoževanje virusa, povišano izločanje vnetnih citokinov
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
21
in obsežno infiltracijo imunskih celic v centralni živčni sistem (CŽS) (Kurhade in sod., 2016). IPS-1 je tudi pomemben pri lokalnem IFN I odzivu v možganih, saj ga povezujejo z zmanjšanjem virusnega bremena in razširjanjem LGTV (Kurhade in sod., 2016;
Zegenhagen in sod., 2016). Aktivacija RIG-I sicer ne prispeva pomembno k proizvodnji IFN I pri pDC, je pa ključnega pomena pri oblikovanju IFN I odziva v DC in drugih antigen predstavitvenih celicah (APC) (Carletti in sod., 2017).
Slika 14: Signalna kaskada aktivacije RIG-I receptorjev (prirejeno po Jensen in Thomsen, 2012:2906)
Tudi poskusi in vitro so potrdili pomen IFN I odziva na okužbo s KMEV, saj so pokazali, da astrociti s hitrim protivirusnim odzivom z IFN I na okužbo s KMEV, uspešno zamejijo njegovo pomnoževanje in širjenje (Lindqvist in sod., 2016). Raziskave na nevronskih celičnih linijah pa so pokazale, da je okužba celic s KMEV povzročila povišanje ekspresije genov za receptor RIG-1 in določenih ISG, kot sta TRIM79α in viperin, ki so pomembno vplivali na zamejitev virusnega razmnoževanja. Ugotovili so, da TRIM79α
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
22
povzroči razgradnjo virusne beljakovine NS5 in spodbudi protivirusno delovanje IFN-β (Taylor in sod., 2011), viperin pa povzroči razgradnjo virusne beljakovine NS3 ter ob njegovi prisotnosti zmanjša stabilnost drugih virusnih beljakovin, kot so prM, E, NS2A in NS2B, kar neugodno vpliva na pomnoževanje virusa (Panayiotou in sod., 2018). Velik pomen prirojenega imunskega odziva na okužbo s KMEV potrjujejo tudi raziskave enonukleotidnih polimorfizmov (angl. single nucleotid polymorphism, SNP) genov, vključenih v prirojeni imunski odziv. Pet različnih SNP v genih OAS2 ter OAS3 z zapisom za oligoadenilatne sintaze, ki z aktivacijo encimov povzročijo razgradnjo enoverižne RNA ter zavrejo pomnoževanje virusa, povezujejo s kliničnim potekom KME (Barkhash in sod., 2010). Vloga receptorjev TLR je bila v manjši meri raziskana pri okužbah z drugimi flavivirusi, o pomenu receptorjev TLR pri okužbi s KMEV pa je znanega izredno malo. Funkcionalni receptor TLR3 je bil predlagan kot dejavnik tveganja za klinični potek KME, vendar zgolj pri odraslih bolnikih (Kindberg in sod., 2011; Barkhash in sod., 2013; Mickiene in sod., 2014). TLR7 receptor naj bi imel pomembno vlogo pri zamejevanju razmnoževanja LGTV, saj so pri miših z nedelujočim receptorjem TLR7 zaznali povišano virusno breme v možganih ter znižane koncentracije vnetnih citokinov (Baker in sod., 2013). Po drugi strani pa so po okužbi primarnih nevronov brez receptorjev TLR7 s KMEV, izmerili povišane vrednosti IFN-β (Baker in sod., 2013), kar nakazuje na pomen TLR7 pri regulaciji vnetnega odziva v možganih. Funkcionalnost receptorjev TLR7 in TLR8 povezujejo z obsegom viremije, nastankom vnetnega odziva, sintezo protiteles ter potekom bolezni tudi pri okužbi z drugimi flavivirusi (Sariol in sod., 2011; Sabouri in sod., 2014; Town in sod., 2009; Xie in sod., 2013). Funkcionalnost TLR receptorjev upada s staranjem in posledično vpliva na uspešnost imunskega odziva na okužbo in cepivo pri starejših osebah (Panda in sod., 2010).
2.4.1.2 Antagonistično delovanje KMEV na imunski odziv gostitelja
Kot odgovor na protivirusno delovanje prirojenega imunskega sistema, je KMEV razvil različne strategije izogibanja. Virus ob okužbi gostiteljske celice, izzove prerazporejanje znotrajceličnih membran in svojo dvoverižno RNA, ki nastane med pomnoževanjem virusa, skrije v znotrajcelične membranske vezikle (Overby in sod., 2010). Tako skrita dsRNA je nedostopna za citosolne PRR, kar pripelje do približno 24-urne inhibicije aktivacije transkripcijskega faktorja IRF-3 in pričetka izločanja IFN I. Zakasnelo izločanje IFN I pa omogoči nemoteno pomnoževanje KMEV v začetni fazi okužbe (Overby in sod., 2010). Poleg izogibanja receptorjem prirojenega imunskega sistema, pa virus pred imunskim sistemom ščiti tudi antagonističnim delovanje njegovih proteinov, ki inhibirajo signalizacijo, posredovano z IFN. Raziskave z LGTV so pokazale, da beljakovina NS5 z zaviranjem fosforilacije transkripcijskih faktorjev STAT1, STAT2, Tyk2 in Jak1, preprečuje JAK-STAT signalno transdukcijo in nastanek IFN odziva (Best in sod., 2005). Do podobnih ugotovitev so prišli tudi pri proučevanju antagonističnega delovanja beljakovine NS5 KMEV, ki z vezavo na gostiteljski membranski protein hScrib prepreči fosforilacijo STAT1 in inhibira IFN signalizacijsko pot (Werme in sod., 2008).
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022
23
Interakcija virusnega proteina NS5 z gostiteljskim PEPD pa vodi v znižano ekspresijo receptorjev IFN I-IFNAR1 in posledično v nižjo ekspresijo ISG (Lubick in sod., 2015).
2.4.1.3 Prirojeni celični odziv na okužbo s KMEV
Pomembno vez med prirojenim in pridobljenim imunskim sistemom predstavljajo dendritične celice, saj so sposobne hitre prepoznave patogenov in sproženja nastanek vnetnega imunskega odziva, obenem pa s predstavljanjem antigenov in izražanjem kostimulatornih molekul na svojo površino, aktivirajo celice pridobljene imunosti.
Fagocitoza antigenov in prepoznava patogenov sproži aktivacijo signalnih poti, ki vodijo do preklopa kemokinskih receptorjev, povišanja ekspresije kostimulatornih molekul CD80 in CD86 na površino celic ter izločanja številnih citokinov, vključenih v oblikovanje imunskega odgovora. Nastale dozorele DC nato migrirajo iz tkiv v limfne vozle, kjer preko MHC molekul na svojo površino predstavljajo fagocitiran antigen, da ga lahko prepoznajo specifični limfociti T. Vezava kompleksov MHC molekul in peptidov s T celični receptorjem (TCR) ter kostimulatornih molekul CD80 in CD86 z molekulo CD28 na limfocitih T, sproži aktivacijo limfocitov T in nastanek T celičnega odziva. Poleg predstavljanja antigenov, so DC pomembne proizvajalke citokinov, predvsem IFN I, ki imajo poleg vloge v prirojenem imunskem odzivu, številne funkcije v pridobljeni imunosti, saj spodbujajo proliferacijo in aktivacijo limfocitov T, izotipski preklop limfocitov B in njihovo diferenciacijo v plazmoblaste (Van Gool in sod., 1996).
Številni flavivirusi, vključno z LGTV, so sposobni okužiti DC in vitro (Robertson in sod.
2014; Libraty in sod., 2001; Zimmerman in sod., 2019). Raziskave na miših so potrdile, da je tudi KMEV zmožen okužiti DC in monocite, prisotne na mestu hranjenja klopa, kar nakazuje na to, da bi te celice lahko olajšale razširjanje virusa po telesu (Labuda in sod., 1996). Čeprav raziskave odziva DC na okužbo s flavivirusi kažejo zapoznelo dozorevanje DC in posledično kasnejšo aktivacijo in manj obsežno proliferacijo limfocitov T, pa so z raziskavami na mišjih DC, ki so jih okužili z dvema različnima sevoma KMEV, ugotovili povišano izražanje kostimulatornih in MHC II molekul na površino celic (Shevtsova in sod., 2016).
Poleg DC so pomembne celice prirojenega imunskega sistema, ki sodelujejo pri zamejitvi okužbe, tudi celice naravne ubijalke (angl. natural killer; NK). Ob stiku z antigenom ter dvigu specifičnih citokinov, kot so IL-2, IL-15 in IL-18, pride do aktivacije NK celic.
Aktivirane NK celice na svojo površino izrazijo marker proliferacije Ki67, obenem pa pričnejo z izločanjem efektorskih citokinov IFN-γ in TNF-α, ki z direktnim protivirusno delovanjem zavrejo virusno pomnoževanje ali pa aktivirajo druge celice imunskega sistema, z izločanjem encimov perforin in grancim pa delujejo citotoksično na tarčne celice. Poleg obrambne funkcije, naj bi obseg aktivacije NK celic po okužbi prispeval k poteku in izhodu iz KME, vendar mehanizmi še niso poznani (Blom in sod., 2018).
Marušić M. Imunski odziv in funkcionalnost … receptorjev pri bolnikih s klopnim meningoencefalitisom, cepljenih proti tej bolezni.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022