DIPLOMSKO DELO

U

L

F

DIPLOMSKO DELO

Michelle Oletič

Ljubljana, 2021

U

L

F

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Izražanje mutiranih različic antitoksina 1067 iz cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 v E. coli

DIPLOMSKO DELO

Michelle Oletič

M

: doc. dr. Marina Klemenčič

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Michelle Oletič sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Izražanje mutiranih različic antitoksina 1067 iz cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 v E. coli.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr.

Marine Klemenčič;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 27. 8. 2021 Podpis avtorice:

Iskrena zahvala gre mentorici doc. dr. Marini Klemenčič, da me je z odprtimi rokami sprejela v skupino. Zahvaljujem se ji za številne strokovne nasvete, pomoč pri opravljanju diplomskega dela in podroben pregled diplomskega dela. Zahvaljujem se tudi doktorski študentki Katarini Petri van Midden, ki me je vpeljala v laboratorijsko delo in mi bila vedno na voljo za pomoč. Nenazadnje se zahvaljujem za vso prejeto znanje iz strani celotne raziskovalne skupine. Zahvala gre tudi prof. dr. Marku Dolinarju za temeljit in kritičen pregled diplomskega dela.

Navsezadnje hvala prijateljem ter družini za podporo in vso spodbudo tekom študija.

Izražanje mutiranih različic antitoksina 1067 iz cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 v E. coli

Povzetek: Majhni genski elementi toksin-antitoksin (TA) so razširjeni v mnogih bakterijah, med njimi tudi med tistimi, ki izvajajo fotosintezo: cianobakterijami. V različnih celicah imajo različne vloge, kot so ohranjanje plazmida v celici, programirana celična smrt in inhibicija rasti celic. Zato je raziskovanje sistemov TA namenjeno tudi iskanju alternativi antibiotikom. Inhibicijo rasti in smrt celice povzroči toksin, ko se osvobodi iz kompleksa z antitoksinom. Antitoksin deluje kot nevtralizirajoči faktor v sistemu TA.

Genom cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 vsebuje več zapisov za sisteme TA. Eden izmed njih pred zapisom za antitoksin vsebuje tudi zapis za cisteinsko proteazo, ortokaspazo, imenovano MaOC1.

Nedavno so ugotovili, da lahko ortokaspaza cepi antitoksin, kar pomeni, da bi lahko v celici uravnavala raven prostega toksina. Mesta, kjer ortokaspaza cepi antitoksin, še niso bila natančno določena. V sklopu te raziskave smo izrazili in očistili divji tip antitoksina 1067 ter še tri njegove mutirane različice. Mutacije so bile na skupkih bazičnih aminokislinskih ostankov, mestih, kjer smo predvidevali, da MaOC1 cepi antitoksin.

Ključne besede: Microcystis aeruginosa PCC 7806, antitoksin, toksin, MaOC1

Expression of mutated versions of antitoxin 1067 from cyanobacteria Microcystis aeruginosa PCC 7806 in E. coli

Abstract: The small genetic elements of the toxin-antitoxin are spread in many bacteria, including those that perform photosynthesis: cyanobacteria. In different cells they also have different functions: plasmid stability in the cell, programmed cell death and growth inhibition. Because of them, research into TA systems is also aimed at finding alternatives to antibiotics. Inhibition of cell growth and cell death is caused by a toxin, when it is released from the TA complex. Antitoxin acts as a neutralizing factor in the TA system.

The genome of Microcystis aeruginosa PCC 7806 contains one toxin-antitoxin system next to the orthocaspase MaOC1 transcript, which was found to be responsible for degrading the antitoxin.

It has recently been shown that orthocaspase can cleave an antitoxin, meaning that it could regulate the level of free toxin in the cell. The sites of orthocaspase cleavage on antitoxin have not yet been determined. We expressed and purified the wild-type antitoxin and its three mutated forms. The mutations were at clusters of basic amino acid residues on antitoxin, because MaOC1 prefers to cleave after clusters of basic amino acid residues.

Keywords: Microcystis aeruginosa PCC 7806, antitoxin, toxin, MaOC1

KAZALO

1 Uvod ... 1

1.1 Microcystis aeruginosa ... 1

1.2 Sistemi toksin-antitoksin ... 2

1.3 Funkcije in lastnosti sistemov TA ... 2

1.4 Antitoksin 1067 ... 4

1.5 Ortokaspaza MaOC1 ... 4

2 Namen dela in hipoteza ... 7

3 Materiali ... 9

3.1 Materiali za delo z bakterijskimi kulturami ... 9

3.1.1 Vektorji ... 9

3.1.2 Bakterijske kulture in sevi ... 9

3.1.3 Gojišča in uporabljeni antibiotiki ... 9

3.1.4 Pomembnejša oprema za delo z bakterijskimi kulturami ... 10

3.1.5 Kemikalije za delo z bakterijskimi kulturami... 10

3.2 Materiali za analizo izražanja in izolacijo rekombinantnih proteinov ... 11

3.2.1 Materiali za tricinsko poliakrilamidno elektroforezo ... 11

3.2.2 Materiali za nikljevo afinitetno kromatografijo ... 11

3.2.3 Materiali za kromatografijo z ločevanjem po velikosti ... 12

3.2.4 Materiali za cepitev z MaOC1 ... 12

3.2.5 Laboratorijska oprema za delo z rekombinantimi proteini ... 12

4 Metode ... 13

4.1 Transformacija kompetentnih celic E. coli ... 13

4.2 Indukcija izražanja rekombinantnih proteinov z IPTG ... 13

4.3 Izolacija proteinov z nikljevo afinitetno kromatografijo ... 13

4.4 Priprava vzorcev za tricinsko poliakrilamidno eletroforezo... 14

4.5 Ločevanje proteinov s tricinsko poliakrilamidno eletroforezo ... 14

4.6 Detekcija proteinov v gelu z barvilom Coomassie Brilliant Blue (CBB) ... 16

4.7 Čiščenje rekombinantnih proteinov z gelsko filtracijo ... 16

4.8 Cepitev proteinov z MaOC1 ... 16

5 Rezultati in razprava ... 17

5.1 Analiza izražanja zapisov za rekombinantne antitoksine ... 17

5.2 Izolacija rekombinantnih variant antitoksina 1067 ... 18

5.2.1 Rezultati čiščenja z nikljevo afinitetno kromatografijo ... 18

5.2.2 Rezultati čiščenja s kromatografijo z ločevanjem po velikosti ... 22

5.3 Rezultati cepitve variant antitoksina 1067 z MaOC1 ... 28

6 Zaključek ... 31

7 Literatura ... 33

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

A280 absorbanca pri valovni dolžini 280 nm AGE agarozna gelska elektroforeza

CBB barvilo Comassie Brilliant Blue bp bazni par bazni par

Da dalton; enota za molekulsko maso dH20 deionizirana voda

DNA deoksiribonukleinska kislina EDTA etilendiamintetraocetna kislina E. coli bakterija Escherichia coli

FPLC hitra proteinska tekočinska kromatografija; angl. fast protein liquid chromatography

His6 histidinska oznaka; zaporedje šestih histidinov IPTG izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid

kb kilobazni par; 1 kb = 1000 bp LB

MaOC1

gojišče ''lysogeny broth''

ortokaspaza iz cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806; angl.

Microcystis aeruginosa ortocaspase 1 mRNA informacijska RNA; angl. messenger RNA OD600 optična gostota pri valovni dolžini 600 nm PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza RNA ribonukleinska kislina

TAE pufer Tris - acetat - EDTA TA sistem toksin - antitoksin

TE pufer Tris - EDTA

TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin

Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol

U encimska enota

V volt

× g mnogokratnik gravitacijskega pospeška

% (w/V) delež snovi v raztopini, določen kot razmerje med maso snovi in volumnom raztopine

1

1 Uvod

1.1 Microcystis aeruginosa

Cianobakterije so prokarionti, ki lahko energijo pridobivajo s fotosintezo. Klorofil a, ki ga vse cianobakterije sintetizirajo, in voda kot najpogostejši donor elektrona pri fotosintezi sta zaslužna za nastanek kisikove atmosfere [1]. Poleg tega pa so tudi nepogrešljivi dejavniki ogljikovega in dušikovega cikla biosfere [2]. Kot nezahtevne bakterije, ki rabijo le vodo, ogljikov dioksid, anorganske snovi in svetlobo, lahko zasedajo zelo različne ekološke niše. Živijo tako v vodi kot na kopnem, kjer kolonizirajo skale in tla. Prebivajo lahko v sladkovodnem okolju ali morski vodi. Rastejo lahko v toplih in mrzlih vrelcih oz. drugod, kjer ostale mikroalge ne obstajajo [3]. Ko pa so razmere za rast zelo ugodne, pride do množičnega razrasta teh organizmov na površju voda, kar imenujemo cvetenje voda. Cianobakterije vsebujejo toksine, ki so škodljivi za ljudi, za živali in druge mikroorganizme. Cvetenja voda zaradi tega predstavlja resen problem z vidika zdravja in preživetja teh organizmov [1].

Poleg tega, da je njihovo okolje zelo razširjeno, so nekatere cianobakterije sposobne rasti pri zelo visokih in zelo nizkih temperaturah [3]. To je tudi eden izmed razlogov, da jih vedno bolj uporabljajo v biotehnološki industriji za čiščenje odpadnih voda, proizvodnjo hrane, gnojil ter proizvodnjo sekundarnih metabolitov, kot so vitamini, toksini, eksopolisaharidi in encimi [4].

Med cianobakterijami, ki cvetijo, je mnogo takih, ki proizvajajo toksine. Ena izmed teh je Microcystis aeruginosa. Toksina, povezana s to vrsto, ki predstavljata nevarnost za vodne ekosisteme, sta mikrocistin in hepatoksin. Oba sta povzročila množično smrtnost vodnih živali, mikrocistin v pitni vodi pa predstavlja tudi potencialno tveganje za zdravje ljudi [5]. Da bi raziskovalci dobili širšo sliko dogajanja na ravni genoma, so sekvencirali 124 sevov M. aeruginosa [6]. Med temi sevi se najbolj razlikujejo genske regije, ki so sevno specifične in so pomembne, da sev preživi v določenem habitatu. Podobnosti v genomu pa lahko pripišemo lateralnemu genskemu prenosu [2].

Eden od sevov, ki ga označujemo kot Microcystis aeruginosa PCC 7806, ima genom z dolžino 5.172.804 bp. Sestavlja ga 76 % zapisov za sevno specifične proteine. Genom vsebuje 5292 protein kodirajočih zaporedij. Med njimi je tudi 21 genov, ki verjetno predstavljajo zapise za restrikcijske encime. Poleg 11,7 % dolgih ponovitev po približno 1000 bp najdemo tudi večje število atipičnih genov, pridobljenih z lateralnim prenosom [7]. Relativno veliko pa je tudi zapisov za sisteme toksin-antitoksin [2].

2

1.2 Sistemi toksin-antitoksin

Sistem toksin-antitoksin (TA) je genski element, ki lahko pomaga bakteriji pri adaptaciji na spremembe v okolju. Take sisteme v cianobakterijah najdemo tako na kromosomu kot tudi na plazmidih. Kje so, pa je odvisno od njihove celične funkcije. Za vse sisteme TA je značilno, da ju sestavljata dva proteina ali protein in molekula RNA. Prvi je toksin, ki zavira rast celice, drugi pa antitoksin, ki je lahko tudi v obliki RNA. Najverjetnejša vloga antitoksina je inaktivacija toksina. Sistemi TA so razvrščeni v 6 tipov (I - VI) glede na vlogo toksina v celici. Toksin najpogosteje inhibira sintezo peptidoglikana, zavira homeostazo membrane ter ovira translacijo ali replikacijo DNA. M. aeruginosa NIES- 843 vsebuje kar 113 sistemov TA v svojem genomu, le-ti pa večinoma spadajo v sistem tipa II, ki je tudi najbolje okarakteriziran sistem. Za tip II je značilno, da sta tako toksin kot antitoksin proteina, kar olajša raziskovanje njunih vlog v celici. Ena izmed družin TA tipa II je družina RelBE. Toksini, podobni RelE, spadajo v razširjeno naddružino RelE/ParE tipa II [6].

Za sisteme TA tipa II na splošno velja, da jih sestavljata škodljiv majhen encim: toksin, in majhen proteinski ''protistrup'', ki se povežeta v nevtralni kompleks. V ugodnih pogojih ostajata tesno povezana in v taki obliki tudi neaktivna. Pri izgubi plazmida, spremembi okolja ali drugih stresnih pogojih pa pride do aktivacije toksina. To naj bi bila posledica razgradnje antitoksina, za kar so odgovorni proteolitični encimi [8]. Medtem ko so sisteme TA prvotno odkriti na plazmidih, ki so delovali kot moduli postsegregacijskega ubijanja, se je kasneje izkazalo, da so množično prisotni v bakterijskih kromosomih.

Pogosto jih na kromosomih najdemo v povezavi z mobilnimi genskimi elementi [9].

1.3 Funkcije in lastnosti sistemov TA

Prehodna narava toksičnosti, ki jo povzročajo toksini, je bistvena za razumevanje njihove fiziološke vloge [10]. Poleg tega, da so ključni akterji pri prilagajanju na stres, so raziskovalci predlagali še veliko različnih vlog v celici. Prva ugotovljena vloga sistemov TA je bila postsegregacijsko ubijanje. Če je gen, ki kodira TA, na plazmidu, se lahko med delitvijo zgodi, da ena od hčerinskih celic tega plazmida ne podeduje. V teh celicah proteinov TA ni mogoče dopolniti zaradi odsotnosti genov TA. Antitoksin se bo kmalu zaradi proteolitičnih encimov razgradil ter osvobodil toksin, katerega koncentracija bo v celicah brez plazmida vedno večja in bo povzročila celično smrt [9]. Ugotovili so tudi, da nekatere bakterije para TA nimajo, ker rastejo v stabilnih nišah, kjer se okolje ne spreminja in ne potrebujejo faktorja, ki se odziva na stres. Zato se moduli TA z evolucijo odpravijo. To dokazuje tudi dejstvo da iste celice z evolucijo izgubijo tudi gene, ki kodirajo encime za uravnavanje metabolizma v stresnem obdobju [9].

3

Kot že omenjeno, so lahko zapisi za sisteme TA tudi na kromosomih. Raziskovalci so predlagali teorijo, ki govori, da so sistemi TA na kromosomih na zelo spremenljivih mestih, kar kaže na to, da so bili pridobljeni s horizontalnim prenosom genov. Druga pa ji nasprotuje in predlaga, da so njihove lokacije na genomu ohranjene. [9].

Naslednja vloga modula TA, ki je bila opisana pri lokusu relBE Escherichia coli, je splošna inhibicija translacije. Pri lokusu hipAB E. coli pa poročajo o fosforilaciji glutamil-tRNA sintetaze, pri čemer se začne kopičiti tRNA brez vezanega ATP-ja.

Sistemi TA lahko vplivajo tudi na nastanek biofilma ali virulenco. Motijo lahko tudi pomembne celične procese, kot so replikacija in transkripcija z zaviranjem topoizomeraz ter integriracijo z β drsno vponko DNA-polimeraze III. Delujejo tudi kot interferaze RNA ali neposredno zavirajo delovanje ribosoma. Ovirajo sintezo celične stene ali celično delitev [8]. Bolj konkretna vloga v celici ene od 9 naddružin sistemov TA tipa II RelE/ParE, o kateri so že razpravljali, je prav tako zaviranje translacije s cepitvijo DNA zaradi toksinov družine RelE. Toksini družine ParE z zaviranjem giraze motijo replikacijo DNA v celici. Za nekatere toksine iz naddružine RelE/ParE velja, da imajo aktivnost endonukleaz, ki lahko na DNA naredijo zareze. Vsem toksinom iz skupine RelE/ParE pa je skupno, da ob deleciji C-konca izgubijo svojo funkcijo in celice ne morejo več ''zastrupiti'' [6].

TA sistemi so tudi obetavne terapevtske tarče, katerih raziskovanje je izredno pomembno v časih, ko je bakterij, odpornih na antibiotike, vedno več. Ker toksini sistemov TA ciljajo na bistvene procese v celici za preživetje bakterij, so jih označili kot "molekularne časovne bombe", ki se aktivirajo v neugodnih pogojih. Spojine, ki imajo zmožnost umetno aktivirati toksine, bi lahko predstavljale protimikrobna zdravila kot morebitno alternativo antibiotikom. Poznanih je že več vrst obetavnih pristopov. Eden izmed teh temelji na posrednem aktiviranju sistemov TA z uporabo proteaz. Proteaze, ki jih je potrebno najprej aktivirati, lahko sprostijo toksin in tako vplivajo na neravnovesje občutljive stehiometrije TA v celici. Drugi pristop pa je neposreden, pri tem se raziskovalci osredotočajo na iskanje peptidov, ki imajo visoko afiniteto do TA sistema.

Dokazano je bilo, da na tak način sprostijo toksin, ta pa povzroči inhibicijo celične proliferacije. Učinkovito so osvobodili toksin iz kompleksa, tako da so inhibirali translacijo antitoksina, kar je možno, saj imata vsak svoje Shine-Dalgarnovo zaporedje [11].

4

1.4 Antitoksin 1067

V genomu M. aeruginosa PCC 7806 je gen, ki kodira ortokaspazo MaOC1. Za tem genom pa sta dva gena, ki se delno prekrivata. IPF_1067 predstavlja zapis za antitoksin, IPF_1065 pa je zapis za morebiten toksin tipa II, ki spada v družino RelE/ParE podobnih toksinov. Ta situacija je prikazana na sliki 1. Toksin in antitoksin skupaj tvorita kanoničen bicistronski operon. TA modul na vsaki strani obdajata krajši obrnjeni ponovitvi. Dolgi sta 152 bp, med njima pa je 16 bp dolgo zaporedje GGGCGAAGCATTCGGA. Orodja za napovedovanje sekundarnih in tercialnih struktur predlagajo, da antitoksin v odsotnosti toksina tvori homodimer, ki ga sestavljajo 4 α-vijačnice, ki tvorijo sveženj. Kot monomer je predvidoma velik 8,4 kDa. Antitoksin običajno sestavljata dve funkcionalno različni domeni. N-končna domena ima dobro opredeljeno zvitje in zagotavlja vezavo DNA ter dimerizacijo antitoksina. C-končni del pa je v večini primerov intrinzično neurejen in nevtralizira svoj tarčni toksin, ko se z njim poveže [12]. Pri sobni temperaturi je antitoksin prisoten kot dimer približne velikosti 17,4 kDa. Ugotavljajo pa, da bi v kompleksu s toksinom lahko tvoril heterotrimer v razmerju 2:1 [6].

Slika 1: Genomski konteks Microcystis aeruginosa PCC 7806 z zapisom za MaOC1 in bližnji par TA. Prva puščica predstavlja gen, ki kodira ortokaspazo MaOC1, za tem pa sta gena, ki zapisujeta antitoksin 1067 in toksin 1065. Na sliki ni prikazano, vendar se ta gena malo prekrivata.

1.5 Ortokaspaza MaOC1

Edine doslej znane proteaze, ki cepijo antitoksine, so bile serinske proteaze iz družin Lon in ClpP [6]. M. aeruginosa PCC 7806 ne vsebuje homolognega gena, ki bi kodiral Lon proteazo, vsebuje pa gene za 6 ortokaspaz MaOC (MaOC1-MaOC6). Ortokaspaza MaOC1 je aktiven proteolitičen encim, za katerega domnevajo, da je povezan s programirano celično smrtjo. Na splošno je za kaspaze značilno, da so cisteinske proteaze, ki cepijo peptidno verigo za aspartatom. Sintetizirajo se kot neaktivni prekurzorji, sestavljeni iz prodomene, velike katalitične domene p20 in majhne domene p10.

Cianobakterije vsebujejo domeni p20 podobno domeno, zato so te proteine najprej poimenovali metakaspazam podobni proteini, kasneje pa so jih preimenovali v ortokaspaze [13]. Kot sorodni encimi se tudi MaOC1 sintetizira kot cimogen in se aktivira z avtoprocesiranjem. Aktivna ortokaspaza je endopeptidaza, ki preferenčno cepi za skupki bazičnih aminokislinskih ostankov [13]. Gen MaOC1 je v genomu M. aeruginosa

5

PCC 7806 v neposredni bližini ene kopije modula antitoksin-toksin, kar napoveduje, da bi lahko bilo oboje povezano v procesu celične smrti [2]. Antitoksin 1067 v svojem aminokislinskem zaporedju vsebuje dva skupka bazičnih aminokislinskih ostankov, ki bi lahko bila tarča ortokaspaze MaOC1. Prvi tak skupek je na predvideni vijačnici α3, to so trije Arg ostanki. Naslednji skupek pa je bližje C-koncu zapisa, na vijačnici α4, kjer sta zapored dva Arg ostanka [6]. Neposredno bližino MaOC1 in sistema TA v genomskem kontekstu bi lahko pojasnili z proteolitično vlogo cisteinske proteaze, ki morebiti uravnava koncentracijo toksina v celici z razgradnjo antitoksina [2]

7

2 Namen dela in hipoteza

Cianobakterije Microcystis aerugonisa PCC 7806 vsebujejo v svojem genomu zapis za proteazo MaOC1 in sistem TA. V predhodnih raziskavah so pokazali, da lahko proteaza MaOC1 cepi antitoksin 1067. Zato smo v sklopu diplomske naloge želeli izraziti in izolirati divji tip antitoksina 1067 (A1067) in mutirane oblike antitoksina 1067, in sicer:

A1067_R48/49/50A, A1067_R71/72A in A1067_R48/49/50/71/72A.

Proteine smo želeli izraziti v E. coli s C-končno oznako His6, da bi jih lahko očistili z nikljevo afinitetno kromatografijo in kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Očiščene proteine smo nato nameravali inkubirati z ortokaspazo MaOC1. S primerjavo cepitvenih vzorcev antitoksina divjega tipa ter vseh treh mutiranih oblik smo želeli ugotoviti, ali pride do cepitve na predvidenih z arginini bogatih mestih.

Hipotezi, ki smo ju postavili, sta bili:

1. Mutirane oblike antitoksina 1067 (A1067_R48/49/50A, A1067_R71/72A in A1067_R48/49/50/71/72A) je možno izraziti v E. coli v topni obliki.

2. MaOC1 cepi A1067 na predvidenih z arginini bogatih mestih.

9

3 Materiali

3.1 Materiali za delo z bakterijskimi kulturami

3.1.1 Vektorji

Prejela sem vektorje pET-28(+) (Gatc Biotech) z že skloniranimi vključki različnih mutiranih različic antitoksina 1067 in antitoksinom 1067 divjega tipa. Aminokislinska zaporedja vseh 4 proteinov so prikazana na sliki 2. Vse mutacije so na želenih mestih vsebovale zamenjave argininskih ostankov z alaninskimi.

Slika 2: Aminokislinska zaporedja A1067 (antitoksin divjega tipa), A1067_R48/49/50A, A1067_R71/72A in A1067_R48/49/50/71/72A.

3.1.2 Bakterijske kulture in sevi Escherichia coli BL21DE3

Sev BL21DE3 (Novagen) je ekspresijski sev, ki se uporablja za izražanje rekombinantnih proteinov. Zaradi RNA-polimeraze T7 in indukcijskega sistema IPTG nam omogoča učinkovito izražanje proteinov. Zapis za RNA-polimerazo je v bakterijskem genomu. Sev vsebuje mutacije v zapisu za Lon proteazo, zato te ne morejo cepiti rekombinantih proteinov, kar pripomore k večji množini izražanja rekombinantnih proteinov.

3.1.3 Gojišča in uporabljeni antibiotiki Gojišče LB

Tekoče gojišče LB z dodanim antibiotikom kanamicinom je v splošnem bogato s peptidi, vitamini, minerali in elementi v sledeh. Pred uporabo smo gojišče avtoklavirali.

10

 Sestava gojišča LB: 10 g NaCl, 5 g kvasnega ekstrakta in 10 g kazeinskega hidrolizata, dH2O do 1 l.

Če v gojišče LB dodamo antibiotik kanamicin dobimo gojišče LBK.

 Sestava gojišča LBK: 400 ml gojišča LB, 400 l založne raztopine kanamicina (c= 50 mg/ml), dodamo ga aseptično.

Trdno gojišče LBK sestavljajo enake sestavine kot tekoče gojišče LBK, razlika je le v dodanem agarju, ki smo ga dodali pred avtoklaviranjem.

 Sestava trdnega LBK gojišča: 1,5 g agarja na 100 ml LB gojišča, 100 l založne raztopine kanamicina (dodan aseptično).

3.1.4 Pomembnejša oprema za delo z bakterijskimi kulturami V tabeli 1 je prikazana oprema za delo z bakterijskimi kulturami.

Tabela 1: Pomembnejša oprema za delo z bakterijskimi kulturami

tehtnica WLC 2/A2 Radwag

stresalnik in inkubator Orbital Incubator Shaker Sanyo

3.1.5 Kemikalije za delo z bakterijskimi kulturami

Tabela 2 prikazuje kemikalije, ki smo jih uporabili pri delu z bakterijskimi kulturami.

Tabela 2: Kemikalije za delo z bakterijskimi kulturami

agar Sigma-Aldrich

IPTG Sigma-Aldrich

kanamicin Thermo Scientific

kazeinski hidrolizat Sigma-Aldrich

kvasni ekstrat Sigma-Aldrich

11

natrijev klorid Grem-Mol

3.2 Materiali za analizo izražanja in izolacijo rekombinantnih proteinov

3.2.1 Materiali za tricinsko poliakrilamidno elektroforezo

Za pripravo tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS smo potrebovali kemikalije in pufre za pripravo gela. Te so prikazane v tabeli 3.

Tabela 3: Kemikalije potrebne za gel tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS

40 % akrilamid:bisakrilamid Sigma-Aldrich

10 % APS Serva

TEMED Serva

urea Fluka

glicerol Fisher Scientific

3 × gel pufer (3 M Tris/HCl, pH 8,45, 0,3 % NaDS)

Tris, HCl, NaDS: Sigma-Aldrich

Za izvedbo procesa potrebujemo še 1 × anodni pufer (1 M Tris, pH 8,5) in 1 × katodni pufer, izopropanol za izravnavanje fronte, nanašalni pufer za vzorce, proteinski standard (Thermo Scientific), ki je potreben za oceno velikosti proteinov na gelu, barvalno (0,1 % CBB, 40 % etanol, 10 % ocetna kislina) in razbarvalno tekočino (40 % etanol, 10 % ocetna kislina) po končanem potovanju proteinov na gelu.

3.2.2 Materiali za nikljevo afinitetno kromatografijo

Afinitetno kromatografijo nam je omogočila oznaka His6, ki smo jo dodali k aminokislinskem zaporedju predvidenega proteina. Ta oznaka se je vezala na His-Trap (Thermo Scientific) s sefaroznim nosilcem z imobiliziranimi Ni²⁺ ioni. Za to, da so se proteini na kolono vezali, smo uporabili IMAC vezavni pufer, ko pa smo jih želeli eluirati pa IMAC elucijski pufer.

12

 IMAC vezavni pufer: 20 mM HEPES, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 7,5

 IMAC elucijski pufer: 20 mM HEPES 500 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 7,5 3.2.3 Materiali za kromatografijo z ločevanjem po velikosti

Dodatno čiščenje proteinov je potekalo z napravo FPLC. Za kromatografijo z ločevanjem po velikosti smo uporabili kolono Superdex 200. Pred nanosom proteinov na kolono smo proteine po nikljevi afinitetni kromatografiji skoncentrirali s koncentratorjem z membrano, ki prepušča proteine, manjše od 3 kDa. Kot mobilno fazo smo uporabili 20 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7,5.

3.2.4 Materiali za cepitev z MaOC1

Za pripravo cepitvene mešanice smo potrebovali ustrezen antitoksin, ustrezen pufer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) in proteazi MaOC1 ter MaOC1_C169A. Ta proteaza vsebuje mutacijo v aktivnem mestu, zato je proteolitično neaktivna [6].

3.2.5 Laboratorijska oprema za delo z rekombinantimi proteini Tabela 4 vsebuje laboratorijsko opremo za delo z rekombinantnimi proteini.

Tabela 4: Pomembnejša laboratorijska oprema za delo z rekombinantnimi proteini

stresalnik GyroTwister 3-D Shaker Labnet

centrifuga Sorvall RC6 PLU Thermo Scientific

ultrazvočni razbijalnik Labsonic 2000 B. Braun

naprava za PAGE Bio-Rad

laboratorijski vir napetosti Biometra Power Pack P25 Bio-Rad

His-Trap Thermo Scientific

koncentrator Millipore

kolona za FPLC SEC 200 Increase

filter z porami velikosti 0,45 µm Sartorius

13

4 Metode

4.1 Transformacija kompetentnih celic E. coli

Za svoje delo sem prejela že vnaprej pripravljene vektorje pET-28(+) z vključenimi zapisi za antitoksin 1067 v 4 različicah. En vektor je vseboval zapis za divji tip antitoksina: A1067, trije pa so vsebovali zapis za antitoksin z različnimi mutacijami:

A1067_R48/49/50A, A1067_R71/72A in A1067_R48/49/50/71/72A. Za transformacijo smo uporabili kemično kompetente celice E. coli seva BL21[DE3].

Celice omenjenega seva, ki so bile shranjene pri -80 C, smo odtalili na ledu in jim nato dodali 1 l ustreznega vektorja. Mešanico smo 30 minut inkubirali na ledu, nato pa izvedli toplotni šok (45 sekund, 42 C). Celice smo dali nazaj na led, da so si opomogle.

Dodali smo jim 900 l tekočega gojišča LB in jih eno uro stresali pri 37 C. Temu je sledilo centrifugiranje (3 minute, 3000  g), nato smo odstranili gojišče (900 l). 150 l kulture smo nanesli na ploščo LBK. To ploščo smo inkubirali pri 37 C preko noči. 150

l kulture pa smo prenesli v tekoče gojišče ter inkubirali preko noči pri 37 C s stresanjem 120 rpm.

4.2 Indukcija izražanja rekombinantnih proteinov z IPTG

Po transformaciji celic z vektorji je sledilo izražanje vstavljenih zapisov za posamezne proteine. Vektorji, ki smo jih transformirali v celice, so imeli močan promotor T7, na katerega se veže RNA-polimeraza iz faga T7. Indukcijo izražanja smo dosegli z dodatkom IPTG-ja, ki povzroči sprostitev represorja lacI iz operatorja lac.

10 ml prekonočne kulture smo prenesli v 400 ml tekočega gojišča LBK. Celice smo stresali pri 37 C do željene optične gostote (OD600=0,4-0,8). Izražanje smo inducirali, ko so celice dosegle logaritemsko fazo rasti, z dodatkom IPTG do končne koncentracije 0,5 mM. Celice smo nadalje stresali 4 ure pri 37 C, hkrati pa smo pri isti temperaturi inkubirali tudi neiducirane (kontrolne) vzorce.

4.3 Izolacija proteinov z nikljevo afinitetno kromatografijo

Po indukciji izražanja je sledilo centrifugiranje 10 minut pri 8000 rpm. Supernatant smo odstranili in usedlini dodali 15 ml vezavnega pufra (IMAC vezani pufer) ter raztopili pelet.

14

Celice smo razbijali z ultrazvokom 3  5 minut, med serijami smo počakali 3 minute.

Sledilo je centrifugiranje, ki je potekalo 20 min pri 25 000 rpm. Supernatanta tokrat nismo odlili, ker smo v njem pričakovali rekombinanten protein. Prelili smo ga v koničasto centrifugirko. Vzorec smo pred nanosom na kolono filtrirali skozi 0,45 m pore, da smo odstranili vse morebitne agregate.

Izolacija proteinov z nikeljevo afinitetno kromatografijo temelji na tem, da imajo rekombinantni proteini v zapisu na C-koncu aminokislinskega zaporedja dodano oznako His6, ki ima visoko afiniteto do Ni²⁺ ionov. Ti so imobilizirani na nosilec kolone. Kolono smo pred nanosom vzorcev najprej sprali z destilirano vodo, potem pa še z vezavnim pufrom. Pri tem smo nastavili hitrost toka tako, da je ustrezala kapljici na sekundo. Po nanosu vzorcev smo skozi kolono še enkrat spustili vezavni pufer (10 ml), s čimer smo odstranili nespecifično vezane proteine. Temu je sledila elucija vezanih proteinov, ki smo jo izvedli z elucijskim pufrom. Elucijo smo dosegli, ker je elucijski pufer vseboval višjo koncentracijo imidazola, ki ima prav tako afiniteto do Ni²⁺ ionov in zato izpodrine nanje vezane rekombinantne proteine. Zbirali smo 8 frakcij po približno 0,5 ml. Te frakcije elucije smo analizirali s tricinsko poliakrilamidno elektroforezo v prisotnosti NaDS.

4.4 Priprava vzorcev za tricinsko poliakrilamidno eletroforezo

Za nanos na poliakrilamidni gel v prisotnosti NaDS smo imeli 8 frakcij po nikljevi afinitetni kromatografiji in lizat, ki smo ga shranili po sonificiranju. Iz vseh teh vzorcev smo vzeli po 10 l in dodali 4 l nanašalnega pufra (z reducentom DTT). Tako pripravljene proteine smo pred nanosom na gel kuhali 5 min pri 100 C.

4.5 Ločevanje proteinov s tricinsko poliakrilamidno eletroforezo

PAGE v prisotnosti NaDS je metoda poliakrilamidne gelske elektrofereze, ki temelji na potovanju proteinov v električnem polju glede na velikost. NaDS je anionski detergent, ki je potreben za to, da proteine denaturira in obenem tudi negativno nabije. Kot taki potujejo proteini proti anodi. Zamreženost gela izberemo glede na velikost tarčnega rekombinantnega proteina. Ker je protein, ki smo ga izražali majhen, je temu primeren odstotek zamreženosti. Spodnji del gela je zato 16 % zamrežen, zgornji pa 4 %.

15

PRIPRAVA GELA

Tricinska poliakrilamidna elektroforeza v prisotnosti NaDS je namenjena ločevanju majhnih proteinov. Zanj smo potrebovali koncentracijski (4 %) in ločevalni (16 %) poliakrilamidni gel. Koncentracijski je potreben, da zagotovi enako začetno linijo. Ko ga proteini zapustijo, se ločijo glede na maso. Komponentne in volumni potrebni za pripravo gela so podani v tabeli 5.

Tabela 5: Sestavine za pripravo gela tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS.

Gel je razdeljen na ločevalni in koncentracijski gel, ki se naredita vsak posebej, na koncu pa se v model najprej nalije ločevalni, nato pa koncentracijski gel.

ločevalni gel (16 %) koncentracijski gel (4 %)

voda (MQ) 0,69 ml 2,6 ml

3x gel pufer (3M Tris/HCl, pH 8,45, 0,3% NaDS)

2 ml 1 ml

70 % glicerol 0,8 ml /

40 % akrilamid:bisakrilamid 2,4 ml 0,4 ml

10 % APS 30 l 30 l

TEMED 3 l 3 l

urea 2,4 g na 10 ml /

Pri mešanju vseh komponent smo pazili na to, da smo dodali katalizatorje (TEMED in APS) nazadnje, saj se po njunem dodatku gel začne polimerizirati. Zato smo najprej pripravili ločevalni gel, ki gre na dno. Nalili smo ga do višine 2 cm pod robom. Nanj pa vlili izopropanol, ki izravna površino in odstrani morebitne zračne mehurčke. Ko se je ločevalni gel strdil smo izopropanol odlili in dodali koncentracijski gel, vanj pa na vrh položili glavniček, ki oblikuje žepke za nanos vzorcev. Ko se je strdil še koncentracijski gel smo odstranili glavniček in stekelci z gelom vpeli v stojalo z elektrodama ter to postavili na sredino kadičke. V kadičko smo nato vlili katodni in anodni pufer, tako, da je bila kadička do vrha polna, gel pa v celoti potopljen. Katodni pufer gre v del kadičke z gelom, anodni (10 ) pa okrog. Nato smo začeli z nanašanjem vzorcev v žepke, en žepek

16

je bil vedno namenjem nanosu proteinskega standarda velikosti. Elektroferezo smo priključili na napetost 250 V in tok 1 mA. Spremljali smo fronto barvila in ko je prišla do dna gela, smo elektroforezo ustavili.

4.6 Detekcija proteinov v gelu z barvilom Coomassie Brilliant Blue (CBB)

Po elektroforezi smo gel previdno ločili od stekelc ter ga dali v raztopino ocetne kisline in CBB. Slednje je anionsko barvilo, ki se veže na pozitivno nabite aminokislinske ostanke. Po inkubaciji gela v raztopini ocetne kisline in CBB smo to raztopini odlili in gel dali v raztopino za razbarvanje, ki odstrani nevezan CBB. Tako so obarvani samo proteini, ki jih vidimo kot modre lise.

4.7 Čiščenje rekombinantnih proteinov z gelsko filtracijo

Še pred začetkom ločevanja proteinov po velikosti smo proteine skoncentrirali s koncentratorjem (3 kDa) do volumna 500 µl. To smo opravili s centrifugiranjem pri 7500 × g, 5 min pri 4 °C ter tako centrifugiranje ponavljali tolikokrat, dokler nismo dobili željenega volumna. Da bi proteine še bolj očistili smo izvedli kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Vzorce smo nanesli na kolono (Superdex 200). Sistem temelji na tem, da delci različnih velikosti potujejo skozi kolono z različno hitrostjo. Velike molekule se eluirajo hitreje. Uporabili smo pretok 0,5 ml/min. Zanimale so nas le frakcije, kjer smo pričakovali proteine. To smo lahko predpostavili s spremljanjem vrednosti A280. Zbrane frakcije smo nato analizirali s tricinsko poliakrilamidno elektroforezo v prisotnosti NaDS. Želene frakcije smo shranili do uporabe pri -80 °C.

4.8 Cepitev proteinov z MaOC1

Da bi ugotovili, če proteaza cepi na predvidenih mestih, smo vse štiri očiščene proteine inkubrali z proteazo MaOC1 ali z njeno neaktivno obliko. Za cepitveno mešanico smo potrebovali 3 g antitoksina, volumen smo izračunali na podlagi masne koncentracije, ki pa smo jo dobili preko absorbance, izmerjene na spektrofotometru Nano Drop. V mešanico smo dodali tudi ustrezen pufer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4). Zadnja komponenta, ki smo jo potrebovali za cepitev, je 1 l proteaze MaOC1 z masno koncentracijo 0,1 mg/ml. Cepitveno mešanico smo inkubirali 3 ure pri sobni temperaturi, nato pa smo tudi reakcijski mešanici dodali nanašalni pufer ter jo analizirali s tricinsko poliakrilamidno elektroforezo v prisotnosti NaDS.

17

5 Rezultati in razprava

5.1 Analiza izražanja zapisov za rekombinantne antitoksine

Izhajali smo iz vektorja z zapisom za A1067, ki je divji tip antitoksina, in treh vektorjev, ki so vsebovali mutacije argininov na C-koncu zapisa: A1067_R48/49/50A, A1067_R71/72A in A1067_R48/49/50/71/72A. S temi vektorji smo transformirali celice E. coli BL21[DE3] in inducirali izražanje z dodatkom IPTG do končne koncentracije 0,5 mM. Po 4 urah indukcije pri 37 °C smo določili gostoto celične kulture. Z merjenjem absorbance, ki je znašala 1,280 za divji tip antitoksina in podobno za mutirane različice, smo lahko ugotovili, da mutacije v zapisu za antitoksine A1067_R48/49/50A, A1067_R71/72A in A1067_R48/49/50/71/72A niso bile kritične za rast celic E. coli. Rast absorbance kulture teh bakterij po indukciji zapisa za divji tip antitoksina 1067 so raziskovalci že opazovali. Njihove izmerjene vrednosti po 4 urah inkubacije po indukciji z IPTG so bile precej višje. Absorbanca je znašala okoli 3,5. Krivulja, ki je spremljala absorbanco pri 600 nm, se je pri njih po 8 urah inkubacije povzpela celo do 4 [6].

Rezultati izražanja vseh različic antitoksina so bili v skladu s pričakovanimi, saj je ob dodatku IPTG-ja začela delovati RNA-polimeraza T7. Antitoksini so nezahtevni proteini ter se kot rekombinantni proteini dokaj enostavno izrazijo in pravilno zvijejo. Izražanje antitoksina v bakterijah kot recimo E. coli ne predstavlja tako velikih težav, kot izražanje toksina, saj ko toksin ni v kompleksu, vodi celice v smrt. Zato se je tega lotilo že veliko raziskovalcev [14]. Še več pa jih je antitoksin izražalo v paru z toksinom, kjer rezultati vedno znova pričajo o tem, da je interakcija TA ključna za nevtralizacija toksina [14][15].

Izraziti toksin 1065 brez faktorja, ki ga nevtralizira, avtorjem še ni uspelo, saj je zato potreben izjemen nadzor nad rastjo celic [6]. To je uspelo raziskovalcem, ki so toksine ParE izražali v E. coli, kjer so te za svoje preživetje spremenile svojo morfologijo in začele tvoriti filamente. To je nepravilna rast, ko se celice nimajo več zmožnosti deliti [16].

18

5.2 Izolacija rekombinantnih variant antitoksina 1067

5.2.1 Rezultati čiščenja z nikljevo afinitetno kromatografijo

Čiščenje rekombinantnih proteinov smo izvedli v dveh stopnjah. Prva je bila nikljeva afinitetna kromatografija. Vzorce smo najprej filtrirali skozi filter s porami velikosti 0,45 µm. Po dodatku IMAC vezavnega pufra smo filtrirane bakterijske lizate nanesli na kolono. Rekombinantne proteine smo po tem, ko so se sprali proteini, ki niso imeli afinitete do Ni²⁺ ionov, sprostili iz kompleksa z IMAC elucijskim pufrom. Med elucijo smo zbrali 8 frakcij po 0,5 ml. Te smo nato nanesli na tricinsko poliakrilamidno elektroforezo v prisotnosti NaDS, s katero smo preverili čistost rekombinantnih proteinov. To prikazujejo slike 3-6.

Izhajala sem iz članka, kjer so ugotovili, da antitoksin 1067 brez mutacij pripotuje na elektroforezi do velikosti malo pod 10 kDa. Ker gre za elektroferezo v denaturirajočih pogojih, vemo, da ta velikost ponazarja monomer s končno oznako His6, ki je velik nekaj več kot 8,4 kDa (z oznako približno 9,9 kDa). Odkrili so, da je antitoksin v raztopini prisoten kot dimer z velikostjo 17,4 kDa, zato smo bili pozorni tudi na liso pri tej velikosti [6].

Slika 3: Slika ločevanja proteinov A1067 po eluciji z nikljevo afinitetno kromatografijo na gelu tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree. (1) proteinski standard velikosti, (2) lizat, (3) eluat 1, (4) eluat 2, (5) eluat 3, (6) eluat 4, (7) eluat 5, (8) eluat 6, (9) eluat 7, (10) eluat 8.

19

Lisa, ki ustreza velikosti približno 10 kDa A1067 je vidna v vseh progah. Lisa velikosti približno 10 kDa, ki je najverjetneje ustrezala antitoksinu, je vidna že v celičnem lizatu po izražanju (slika 3, proga 2). Če primerjamo lizat z ostalimi stolpci (3-10), ki prikazujejo po vrsti sledeče si eluate z nikljeve afinitetne kromatografije, je opazno, da je v lizatu več endogenih proteinov. V progah z eluati se sicer lise za te nevezane proteine še pojavljajo, vendar jih je izrazito manj. V progi 5 je največ prisotnega A1067, veliko ga je prav tako v stolpcih 4 in 6, kjer so lise vidno širše. Opazimo pa lahko tudi slabše vidne lise pri približni velikosti 17 kDa, ki bi lahko nakazovale na dimer antitoksina 1067 (proge 3, 4, 5 in 6).

Na sliki 4 so frakcije rekombinantnega proteina po nikljevi afinitetni kromatografiji.

Rekombinanten protein je v tem primeru antitoksin z zamenjanimi arginini v alanine na mestih R48, R49 in R50 na tricinskem NaDS-PAGE. Kot na prejšnji sliki je tudi v primeru tega proteina vidno, da je bilo izražanje uspešno, saj so na gelu vidne široke lise, ki ustrezajo A1067_R48/49/50A pri velikosti 10 kDa. Mutacije, ki smo jih vnesli v zapis za antitoksin 1067, niso povzročile slabšega izražanja proteina, saj kot na gelu na sliki 3 vidimo izražanje pri pričakovani velikosti. Spet pa je vidno, da je protein A1067_R48/49/50A prisoten že v lizatu ter vseh ostalih progah, ki predstavljajo zaporedne eluirane frakcije. Opazimo lahko tudi endogene proteine, ki so v lizatu prisotni Slika 4: Slika ločevanja proteinov A1067_R48/49/50A po eluciji z nikljevo afinitetno kromatografijo na gelu tricinske poliakrilamide elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree. (1) proteinski standard velikosti, (2) lizat, (3) eluat 1, (4) eluat 2, (5) eluat 3, (6) eluat 4, (7) elucija 5, (8) elucija 6, (9) elucija 7, (10) elucija 8.

20

v večji meri kot v eluatih, saj smo se jih z učinkovitim čiščenjem v večji meri znebili.

Lise, ki bi naj ponazarjale dimer, so sicer vidne pri približni velikosti 17 kDa, vendar zaradi ostalih lis v bližini težko rečemo, da gre za antitoksin.

Slika 5 prikazuje ločevanje rekombinantnega proteina A1067_R71/72A po eluciji s kolone za nikljevo afinitetno kromatografijo. Najmočnejše lise so v vseh žepkih pri pričakovani velikosti okoli 10 kDa. Čeprav je proteinski standard velikosti nekoliko ukrivljen, lahko predvidevamo, da gre za želeni protein. Lise, ki predstavljajo nevezane proteine, so prisotne v lizatu, kakor tudi v elucijskih frakcijah, čeprav vidno manj. Med njimi težko razločimo, če je prisoten tudi dimer antitoksina pri velikosti 17 kDa, ker skoraj da ne moremo določiti velikosti.

Slika 5: Slika ločevanja proteinov A1067_R71/72A po eluciji z nikljevo afinitetno kromatografijo na gelu tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree. (1) proteinski standard velikosti, (2) lizat, (3) eluat 1, (4) eluat 2, (5) eluat 3, (6) eluat4, (7) eluat 5, (8) eluat 6, (9) eluat 7, (10) eluat 8.

21

Na sliki 6 je prikazana ločitev rekombinantnega antitoksina A1067_R48/49/50/71/72A pri nikljevi afinitetni kromatografiji. Najmočnejša lisa v lizatu pri približni velikosti 10 kDa nakazuje na rekombinanten antitoksin. Tudi v tem primeru smo protein s to metodo dokaj dobro očistili endogenih proteinov, saj so lise, ki le-te ponazarjajo, v eluiranih frakcijah manj vidne v primerjavi z lizatom.

Slika 6: Slika ločevanja proteinov A1067_R48/49/50/71/72A po eluciji z nikljevo afinitetno kromatografijo na gelu tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree. (1) proteinski standard velikosti, (2) lizat, (3) eluat 1, (4) eluat 2, (5) eluat 3, (6) eluat 4, (7) eluat 5, (8) eluat 6, (9) eluat 7, (10) eluat 8.

22

5.2.2 Rezultati čiščenja s kromatografijo z ločevanjem po velikosti

Da bi izražene rekombinantne antitoksine še bolj očistili, smo po čiščenju z nikljevo afinintetno kromatografijo uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti, pri čemer smo uporabili kolono Superdex 200. Pred nanosom smo elucijske frakcije skoncentrirali na 0,5 ml. Frakcije smo zbirali glede na absorbanco pri valovni dolžini 280 nm.

Slika 7 prikazuje elucijski diagram ločevanja A1067 z gelsko filtracijo. Vrhovi absorbance pri 280 nm nakazujejo elucijo proteinov. Zato smo začeli zbirati frakcije, čim je vrednost A280 presegla 100 mAU. Frakcije smo začeli zbirati pri 15 ml in jih zbirali do 17,5 ml. Če bi bilo na grafu vidnih več vrhov, bi to pomenilo, da je bilo v vzorcu po nikljevi afinitetni kromatografiji prisotnih več proteinov. Vendar je iz elucijskega diagrama razvidno, da je večinsko prisoten le en protein. Glede na elucijski volumen, ki ustreza proteinom z maso 15 kDa, sklepamo, da gre za antitoksin 1067. Frakcije, ki smo jih zbrali, smo nato analizirali s tricinskim NaDS-PAGE.

Slika 7: Elucijski graf rekombinantnega proteina A1067 po gelski filtraciji na koloni Superdex 200. Črna črta sledi absorbanci pri 280 nm.

Slika 8 prikazuje elektroferezno analizo rekombinantnega proteina A1067, ki smo ga v drugem koraku izolacije ločili s kromatografijo z ločevanjem po velikosti, kjer se proteini eluirajo glede na velikost in obliko. Opazno veliko ga je v vseh frakcijah, kar pomeni, da smo glede na elucijski diagram pravilno zbrali frakcije. Viden je pri velikosti približno 10 kDa, kakor smo ga tudi videli pri elektroforezi po čiščenju z nikljevo afinitetno kromatografijo (slika 3). Ostalih lis, ki nakazujejo na endogene proteine, je v elucijskih frakcijah (3-8) vidno manj kakor na sliki 3, zato pride tukaj bolj do izraza lisa pri približni velikosti 17 kDa, ki je opazna v vseh progah. Glede na predhodne analize raziskovalcev sklepam, da gre za protein A1067 v obliki dimera [6].

-200,00 0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00

mAU

ml

23

Na naslednjem elucijskem diagramu (slika 9), ki prikazuje ločevanje antitoksina A1067_R48/49/50A, je prav tako razviden en vrh, kar nakazuje na to, da je bil protein pred tem čiščenjem že dokaj čist. Ker gre za približno enako velik protein kot nemutiran A1067, smo vrh dobili med 14 in 18 ml. Frakcije smo zbirali od 15 ml do 17,5 ml. Tudi te smo analizirali z elektroforezo na poliakrilamidnem gelu.

Slika 9: Elucijski graf rekombinantnega antitoksina A1067_R48/49/50A po gelski filtraciji na koloni Superdex 200. Črna črta sledi absorbanci pri 280 nm.

0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00

mAU

ml

Slika 8:Slika ločevanja proteinov A1067 po eluciji pri kromatografiji z ločevanjem po velikosti na gelu tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree. (1) proteinski standard velikosti, (2) vzorec pred kromatografijo z ločevanjem po velikosti, (3) eluat 1, (4) eluat 2, (5) eluat 3, (6) eluat 4, (7) eluat 5, (8) eluat 6.

24

Slika 10 prikazuje ločitev antitoksina A1067_R48/49/50A, očiščenega s kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Spet je vidno, da se nahaja pri višini približno 10 kDa, lise so prav tako zelo široke, vendar pa so za razliko od prejšnje elektroforeze (antitoksin divjega tipa) tukaj bolj opazne lise drugih proteinov, kar pomeni, da je protein slabše očiščen. Kot na sliki 8 so tudi na sliki 10 opazne lise pri približni velikosti 17 kDa, vendar zaradi lis, ki predstavljajo druge proteine, niso tako očitne.

Slika 10: Slika ločevanja proteinov A1067_R48/49/50A po eluciji pri kromatografiji z ločevanjem po velikosti na gelu tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree.

(1) proteinski standard velikosti, (2) vzorec pred kromatografijo z ločevanjem po velikosti, (3) eluat 1, (4) eluat 2, (5) eluat 3, (6) eluat 4, (7) proteinski standard velikosti, (8) eluat 5, (9) eluat 6.

Graf na sliki 11 prikazuje elucijski diagram rekombinantnega antitoksina A1067_R71/72A. Ta mutirana oblika se je eluirala med 15 in 18 ml. Kot pri prejšnjih elucijah tudi v tem primeru opazimo en elucijski vrh. Frakcije smo analizirali s tricinskim NaDS-PAGE.

25

Slika 12 prikazuje rezultat elektroforezne ločbe frakcij po gelski filtriciji, prikazani na sliki 11. Čiščenje je bilo uspešno, saj so lise pri velikosti 10 kDa, ki je predvidena velikost rekombinantnega proteina A1067_R71/72A, zelo odebeljene. Lise pri tej velikosti so vidne na vsaki progi, razen na progi 3, kjer je najverjetneje prišlo do napake pri nanosu vzorca na gel. Ostali proteini oz. lise pri drugih velikostih so prisotne, vendar so slabše vidne. Zato tudi lise z velikostjo 17 kDa, ki bi lahko nakazovale na dimer antitoksina A1067_R71/72A, ne izstopajo. Kljub temu pa lahko rečemo, da je v primerjavi z vzorcem tega proteina po nikljevi afinitetni kromatografiji (slika 5) tukaj protein bolj čist.

0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00

mAU

ml

Slika 11: Elucijski graf rekombinantnega antitoksina A1067_R71/72A po gelski filtraciji na koloni Superdex 200. Črna črta sledi absorbanci pri 280 nm.

26

Slika 12: Slika ločevanja proteinov A1067_R71/72A po eluciji pri kromatografiji z ločevanjem po velikosti na gelu tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree. (1) proteinski standard velikosti, (2) vzorec pred kromatografijo z ločevanjem po velikosti, (3) eluat 1, (4) eluat 2, (5) eluat 3, (6) eluat 4, (7) eluat 5, (8) eluat 6.

Zadnji diagram (slika 13) v seriji prikazuje elucijo rekombinantnega proteina A1067_R48/49/50/71/72A. Vrh absorbance A280 je pri volumnih 15-18 ml, kar pomeni, da se je protein takrat eluiral iz kolone. Frakcije pri teh volumnih smo zbrali in jih analizirali s tricinskim NaDS-PAGE.

Slika 13:Elucijski graf rekombinantnega A1067_R48/49/50/71/72A po gelski filtraciji na koloni Superdex 200. Črna črta sledi absorbanci pri 280 nm.

0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 1600,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00

mAU

ml

27

Rekombinantni antitoksin A1067_R48/49/50/71/72A smo po sliki 14 sodeč prav tako v večji meri dobro očistili in izolirali od večine drugih proteinov. V elucijskih frakcijah 2-5 je lisa izoliranega proteina A1067_R48/49/50/71/72A zelo odebeljena. Proga 2 predstavlja vzorec proteina po nikljevi afinitetni kromatografiji. Za razliko od ostalih prog, ki prikazujejo eluate po kromatografiji z ločevanjem po velikosti, je tu veliko več lis, ki so tudi bolj debele. V elucijskih frakcijah 2-5 pa je spet vidna lisa pri približni velikosti 17 kDa, s katere lahko sklepamo na dimerno obliko rekombinantnega proteina.

Slika 14: Slika ločevanja proteinov A1067_R48/49/50/71/72A po eluciji pri kromatografiji z ločevanjem po velikosti na gelu tricinske poliakrilamidne elektroforeze v prisotnosti NaDS z dodatkom uree. (1) proteinski standard velikosti, (2) vzorec pred kromatografijo z ločevanjem po velikosti, (3) proteinski standard velikosti, (4) eluat 1, (5) eluat 2, (6) eluat 3, (7) eluat 4, (8) eluat 5, (9) eluat 6.

Čiščenje majhnih proteinov, kot so antitoksini, se je izkazalo kot učinkovito v kombinaciji z nikljevo afinitetno kromatografijo in kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čeprav poročajo, da je obsežna proizvodnja velikih količin antitoksina zaradi njegove kratke življenjske dobe in vivo težka naloga, mi med in vitro izolacijo nismo imeli težav. Več raziskovalcev je že uporabilo obe metodi za izolacijo antitoksinov iz drugih bakterij [17].

Nekaterim je uspelo tudi izraziti tesen kompleks TA ter ga nato ločiti na antitoksin in toksin z nikljevo afinitetno kromatografijo pod denaturirajočimi pogoji [12].

Nedavne raziskave so pokazale, da z metodo sipanja večkotno razprševalne svetlobe (MALS) lahko določimo, da je antitoksin 1067 v raztopini v obliki dimera z velikostjo približno 17,4 kDa. O dimerni naravi antitoksinov v raztopini so že poročali za antitoksine

28

ParD, HigA in RelB [6]. Glede na to, da smo poliakrilamidno elektroforezo izvajali v prisotnosti denaturantov NaDS in uree, dimera v teh primerih ne pričakujemo, saj naj bi bila povezava med dvema antitoksinoma nekovalenta. Da bi lahko določili, ali lise vseeno ustrezajo antitoksinu, bi lahko izvedli imunodetekcijo s protitelesi proti oznaki His6.

5.3 Rezultati cepitve variant antitoksina 1067 z MaOC1

Zadnja stopnja diplomske naloge je bila ugotoviti, če MaOC1 res cepi na z arginini bogatih mestih. Izvedli smo dve seriji cepitev vseh antitoksinov, ki smo jih izrazili in očistili. Za prvo serijo smo uporabili MaOC1 z mutacijo cisteina 169 v alanin v aktivnem mestu. Predvidevali smo, da do cepitve ne bo prišlo, zato nam je serija služila kot negativna kontrola. V drugi seriji cepitev smo uporabili encim MaOC1 brez mutacije. Po triurni inkubaciji ustreznega antitoksina in MaOC1 v pufru smo vse cepitvene mešanice analizirali s tricinskim NaDS-PAGE z dodatkom uree. Rezultati so prikazani na slikah 15 in 16.

Slika 15: S tricinskim NaDS-PAGE z ureo ločeni proteini antitoksinov po cepitvi z encimom MaOC1 z mutacijo v aktivnem mestu. Prvi stolpec ponazarja proteinski velikostni standard. (AT B) A1067 brez encima, (AT Z) A1067 po inkubaciji z MaOC1_C169A, (AT1 B) A1067_R48/49/50A brez encima, (AT1 Z) A1067_R48/49/50A po inkubaciji z MaOC1_C169A, (AT2 B) A1067_R7172A brez encima, (AT2 Z) A1067_R71/72A po inkubaciji z MaOC1_C169A, (AT3 B) A1067_R48/49/50/71/72A brez encima, (AT3 Z) A1067_R48/49/50/71/72A po inkubaciji z MaOC1_C169A.

29

Slika 15 predstavlja analizo cepitev rekombinantnih antitoksinov z neaktivnim encimom MaOC1. Kot pričakovano, encim zaradi mutacije v aktivnem mestu ni deloval. Vidimo, da do cepitve nobenega od antitoksinov ni prišlo, saj je v vsakem stolpcu le ena lisa pri velikosti 10 kDa, ki predstavlja celoten antitoksin. Na tej sliki lahko opazimo primerjavo velikosti mutiranih različic antitoksina z divjim tipom. Ker gre za majhen protein, so tudi tako majhne spremembe kot je zamenjava treh večjih aminokislinskih ostankov za manjše, opazne pri potovanju proteina skozi elektroforezni gel. Razlog za razlike v velikosti lahko pripišemo tudi naboju aminokislin. Arginin je za razliko od alanina pozitivno nabit, kar je pri elektroforeznem ločevanju proteinov prav tako pomembno.

Razlike v naboju sicer zaradi dodatka NaDS ne bi smeli opaziti.

Slika 16: S tricinskim NaDS-PAGE z ureo ločeni proteini antitoksinov po cepitvi z encimom MaOC1. Prvi stolpec ponazarja proteinski velikostni standard. (AT B) A1067 brez encima, (AT Z) A1067 po inkubaciji z MaOC1, (AT1 B) A1067_R48/49/50A brez encima, (AT1 Z) A1067_R48/49/50A po inkubaciji z MaOC1, (AT2 B) A1067_R71/72A brez encima, (AT2 Z) A1067_R71/72A po inkubaciji z MaOC1, (AT3 B) A1067_R48/49/50/71/72A brez encima, (AT3 Z) A1067_R48/49/50/71/72A po inkubaciji z MaOC1.

Drugačni rezultati so prikazani na sliki 16, kjer smo uporabili aktivno ortokaspazo. Kot v prvem poskusu smo za vsak rekombinanten antitoksin imeli tudi kontrolo. To je bil ustrezen antitoksin brez dodatka encima, za primerjavo potovanja antitoksinov z dodatkom proteaze.

30

Po inkubaciji A1067 z MaOC1 lahko na tricinskem poliakrilamidnem gelu v prisotnosti NaDS vidimo štiri lise. Najmočnejša lisa, pri velikosti 10 kDa, ki je enaka lisi necepljenega antitoksina, nakazuje na to, da je po cepitvi ostalo še nekaj necepljenega antitoksina. Tri slabše vidne lise, ki so pod velikostjo 10 kDa, nakazujejo na to, da je prišlo do cepitve na 2 mestih. Pri cepitvi antitoksina A1067_R48/49/50A je na gelu vidna lisa, ki predstavlja ostanek necepljenega proteina in dve slabše vidni lisi. Zaradi tega lahko predvidevamo, da cepitev za R48, R49, R50 ni potekla in je ortokaspaza antitoksin cepila le za dvema argininoma na mestu R71, R72. Vzorec cepitve za A1067_R71/72A je zelo podoben vzorcu cepitve antitoksina divjega tipa. Pod liso pri 10 kDa so tri slabše vidne lise. Te lahko nakazujejo, da je MaOC1 kljub mutaciji dveh argininov na mestih R71, R72 uspela cepiti antitoksin na dveh različnih regijah. Zato najverjetneje cepi na nekem drugem delu in ne na tem predvidenem mestu. Kot zadnje pa smo z encimom cepili rekombinanten antitoksin A1067_R48/49/50/71/72A. Predvidevali smo, da antitoksin ne bo cepljen, saj smo onesposobili predvidena cepitvena mesta. Vendar pa sta pod liso, ki ustreza necepljenemu antitoksinu vidni še dve tanjši lisi, ki nakazuje na to, da obstaja še neko drugo mesto na antitoksinu, ki je specifično za ortokaspazo.

Že dlje časa je znano, da so proteaze kot sta Lon in ClpP odgovorne za razgradnjo intrinzično neurejenih C-koncev antitoksinov različnih tipov, to pa ne velja za antitoksin 1067 iz cianobakterije M. aeruginose PCC 7806, ki teh proteaz nima [18]. Ugotovljeno je bilo, da MaOC1 cepi antitoksin, ko ta še ni v tesnem kompleksu z toksinom, ter da MaOC1 cepi za skupki bazičnih aminokislinskih ostankov na C-koncu [13]. Ravno zaradi tega so predvidevali, da so ti skupki dva oz. trije arginini na α4 oz. α3 [6].

31

6 Zaključek

V sklopu diplomskega delu smo želeli ugotoviti, ali ortokaspaza MaOC1 cepi antitoksin 1067 na katerem izmed prej identificiranih z arginini bogatih mest. Pripravili smo tri mutirane različice antitoksina z mutacijami na mestih, za katera smo predvidevali, da so specifična za encim. V E. coli smo uspešno izrazili vse različice antitoksinov (A1067, A1067_R48/49/50A, A1067_R71/72A in A1067_R48/49/50/71/72A) in jih nato tudi očistili. Za čiščenje smo uporabili nikljevo afinitetno kromatografijo in kromatografijo z ločevanjem po velikosti, ki sta se predhodno izkazali kot ustrezni za antitoksin. Ob tem smo ugotovili tudi, da lahko mutirane oblike antitoksina pridobimo v velikih količinah, saj so se v celicah E. coli BL21[DE3] po indukciji z IPTG učinkovito izražale. S tem smo potrdili prvo hipotezo, da se vse mutirane oblike antitoksina, tako kot divji tip, izražajo v topni frakciji

Ker smo uspešno pripravili tako proteine z mutacijami kot tudi divji tip antitoksina, smo lahko vsakega posebej inkubirali z ortokaspazo MaOC1. Predvidevali smo, da so skupki argininov na C-koncu tisti, za katerimi MaOC1 cepi antitoksin 1067. Hipoteze, da MaOC1 cepi A1067 na predvidenih mestih na C-koncu, nismo uspeli v celoti dokazati.

MaOC1 cepi za trojico R48, R49, R50 ne pa za parom R71, R72.

V nadaljnih raziskavah bi bilo potrebno identificirati še ostale aminokislinske ostanke, ki jih specifično cepi MaOC1 in postopek od kloniranja do cepitve antitoksina z MaOC1 ponoviti. Pri tem bi poleg zamenjave R71 in R72 za alanin lahko zamenjali še L73. Lizin je prav tako bazična aminokislina, za katerimi MaOC1 preferenčno cepi.

33

7 Literatura

[1] B. A. Whitton in M. Potts, “The ecology of cyanobacteria,” Cyanobacteria and limestone, št. 1, str. 257-279, 2002.

[2] M. Klemenčič in M. Dolinar, “Orthocaspase and toxin-antitoxin loci rubbing shoulders in the genome of Microcystis aeruginosa PCC 7806,” Curr. Genet., vol.

62, št. 4, str. 669–675, 2016.

[3] P. A. Jenkins, “Mycobacteria in the environment,” J. Appl. Bacteriol. Symp.

Suppl., št. 20, 1991.

[4] R. M. M. Abed, S. Dobretsov, in K. Sudesh, “Applications of cyanobacteria in biotechnology,” J. Appl. Microbiol., vol. 106, št. 1, str. 1–12, 2009.

[5] K. Black, M. Yilmaz, in E. J. Phlips, “Growth and toxin production by microcystis aeruginosa PCC 7806 (Kutzing) Lemmerman at elevated salt concentrations,” J.

Environ. Prot., vol. 02, št. 06, str. 669–674, 2011.

[6] M. Klemenčič, A. Halužan Vasle, in M. Dolinar, “The cysteine protease MaOC1, a prokaryotic caspase homolog, cleaves the antitoxin of a type II toxin-tntitoxin system,” Front. Microbiol., vol. 12, št. 02, str. 1–13, 2021.

[7] L. Frangeul et al., “Highly plastic genome of Microcystis aeruginosa PCC 7806, a ubiquitous toxic freshwater cyanobacterium,” BMC Genomics, vol. 9, str. 1–20, 2008.

[8] A. Rocker in A. Meinhart, “Type II toxin: antitoxin systems. More than small selfish entities?,” Curr. Genet., vol. 62, št. 2, str. 287–290, 2016.

[9] Fraikin N, Goormaghtigh F in Van Melderen L, “Type II toxin-antitoxin systems:

evolution and revolutions,” Journal of Bacteriology, vol 202, št. 7, str. e00763-19, 2020.

[10] A. M. Hall, B. Gollan, in S. Helaine, “Toxin–antitoxin systems: reversible toxicity,” Curr. Opin. Microbiol., vol. 36, str. 102–110, 2017.

[11] M. Równicki, R. Lasek, J. Trylska, in D. Bartosik, “Targeting type II toxin–

antitoxin systems as antibacterial strategies,” Toxins (Basel)., vol. 12, št. 9, str. 1–

16, 2020.

[12] A. Garcia-Pino, Y. Sterckx, G. Vandenbussche, in R. Loris, “Purification and crystallization of Phd, the antitoxin of the phd/doc operon,” Acta Crystallogr. Sect.

F Struct. Biol. Cryst. Commun., vol. 66, št. 2, str. 167–171, 2010.

[13] M. Klemenčič, M. Novinec, in M. Dolinar, “Orthocaspases are proteolytically active prokaryotic caspase homologues: The case of Microcystis aeruginosa,” Mol.

Microbiol., vol. 98, št. 1, str. 142–150, 2015.

34

[14] M. Thomet, A. Trautwetter, G. Ermel, in C. Blanco, “Characterization of HicAB toxin-antitoxin module of Sinorhizobium meliloti,” BMC Microbiol., vol. 19, št. 1, str. 1–12, 2019.

[15] C. Galvani, J. Terry, in E. E. Ishiguro, “Purification of the RelB and RelE proteins of Escherichia coli: RelE binds to RelB and to ribosomes,” Journual of Bacteriology, vol. 183, št. 8, str. 2700–2703, 2001.

[16] J. R. Ames, M. Muthuramalingam, T. Murphy, F. Z. Najar, in C. R. Bourne,

“Expression of different ParE toxins results in conserved phenotypes with distinguishable classes of toxicity,” Microbiologyopen, vol. 8, št. 10, str. 1–19, 2019.

[17] Q. Fei, E. Bin Gao, B. Liu, Y. Wei, in D. Ning, “A toxin-antitoxin system vapBC15 from synechocystis sp. PCC 6803 shows distinct regulatory features,” Genes (Basel)., vol. 9, št. 4, 2018.

[18] I. Brzozowska and U. Zielenkiewicz, “Regulation of toxin-antitoxin systems by proteolysis,” Plasmid, vol. 70, št. 1, str. 33–41, 2013.