UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
SELENA PAVŠIČ
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
SELENA PAVŠIČ
OPTIMIZACIJA IZRAŽANJA IN ČIŠČENJA REKOMBINANTNE GLIKOZILTRANSFERAZE O-β-N-ACETILGLUKOZAMIN TRANSFERAZE
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
EXPRESSION AND PURIFICATION OPTIMIZATION OF RECOMBINANT O-LINKED β-N-ACETYLGLUCOSAMINE TRANSFERASE
UNIFORM MASTER'S STUDY PROGRAMME PHARMACY
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Katedri za farmacevtsko biologijo Fakultete za farmacijo, Univerze v Ljubljani pod mentorstvom izr. prof. dr. Tomaža Bratkoviča.
Meritve določanja aktivnosti proteina so bile opravljene na Katedri na farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo.
Zahvala
Za možnost izdelave magistrske naloge se iskreno zahvaljujem mentorju izr. prof. dr.
Tomažu Bratkoviču, kot tudi za ves naklonjen čas, razpoložljivost, strokovno pomoč in usmeritve pri pisanju naloge. Hvala dr. Krištofu Bozovičarju za vso predano znanje, strokovne in praktične nasvete pri delu v laboratoriju, vedno prisotno dobro voljo in sproščeno raziskovalno vzdušje. Posebej se zahvaljujem prof. dr. Borutu Štruklju, ki me je za področje farmacevtske biotehnologije izjemno navdušil ter v meni prepoznal osebo željno novih znanj. Hvala vsem ostalim članom katedre za Farmacevtsko biologijo za nadvse prijazen sprejem, nesebično pomoč in prijetno delovno okolje. Zahvale gredo tudi moji družini in prijateljem, ki mi vseskozi nudijo oporo in me opogumljajo.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja izr. prof.
dr. Tomaža Bratkoviča.
Ljubljana, 2021 Selena Pavšič
Predsednik komisije: prof. dr. Marko Anderluh Mentor: izr. prof. dr. Tomaž Bratkovič
Članica komisije: doc. dr. Martina Gobec
KAZALO VSEBINE
POVZETEK... VII ABSTRACT ... VIII SEZNAM OKRAJŠAV ... IX
1. UVOD ... 1
1.1. O-GlcNAc-transferaza in N-acetilglukozaminilacija ... 1
1.2. Strukturne značilnosti in izoforme ... 3
1.3. Heksozaminska biosintezna pot... 5
1.4. Celične regulatorne funkcije in pomen pri kroničnih boleznih ... 5
1.4.1. Sladkorna bolezen... 6
1.4.2. Nevrodegenerativne bolezni in nevrorazvojne motnje ... 7
1.4.3. Kardiovaskularne bolezni ... 8
1.4.4. Rakava obolenja ... 8
1.5. OGT kot terapevtska tarča ... 9
1.6. Izražanje rekombinantnih proteinov z redkimi kodoni v E. coli ... 10
2. NAMEN DELA... 14
3. MATERIALI IN METODE ... 15
3.1. Materiali... 15
3.1.1. Laboratorijska oprema ... 15
3.1.2. Reagenti ... 17
3.1.3. Komplet ... 18
3.1.4. Pufri in raztopine ... 19
3.1.5. Bakterijska gojišča ... 20
3.1.6. Geli ... 21
3.2. Biološki material... 22
3.2.1. Plazmida ... 22
3.2.1.1. Plazmid pET28b(+) ... 22
3.2.1.2. Plazmid pRARE2 ... 23
3.2.2. Bakterijski sevi ... 23
3.2.2.1. E. coli NiCo21(DE3) ... 23
3.2.2.2. E.coli Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS ... 24
3.2.2.3. E. coli SHuffle® T7 Express lysY ... 25
3.3. Metode ... 26
3.3.1. Izolacija plazmida pET28b-OGT in pRARE2... 26
3.3.2. Spektrofotometrična določitev koncentracije in čistote izolirane plazmidne
DNA……. ... 27
3.3.3. Transformacija kompetentnih celic E. coli NiCo21(DE3) in SHuffle® T7 Express lysY s plazmidoma pET28b-OGT in pRARE2 ter kompetentnih celic E. coli Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS s plazmidom pET28b-OGT ... 27
3.3.4. Priprava prekonočnih in trajnih kultur... 28
3.3.5. Priprava kemijsko kompetentnih celic NiCo21(DE3) pET28b-OGT, SHuffle® T7 Express lysY in Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS ... 29
3.3.6. Testno izražanje rekombinantnega proteina pri različnih koncentracijah induktorja . ... 29
3.3.7. Ocena količine proteina s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata ... 31
3.3.8. Izražanje rekombinantnega proteina v povečanem obsegu ... 32
3.3.9. Kromatografske metode za čiščenje proteinov ... 32
3.3.9.1. Kovinsko-kelatna afinitetna kromatografija... 33
3.3.9.2. Hidrofobna interakcijska kromatografija ... 35
3.3.9.2.1. Izolacija nečistot s hitinskimi paramagnetnimi kroglicami ... 36
3.3.9.3. Gelska filtracija ... 36
3.3.10. Koncentriranje z ultrafiltracijo ter ocena koncentracije proteina ... 37
3.3.11. Ocena čistote proteina ... 38
3.3.12. Določanje aktivnosti proteina ... 38
4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 40
4.1. Rezultati ... 40
4.1.1. Izolacija plazmida, spektrofotometrična ocena koncentracije izolirane plazmidne DNA in transformacija kompetentnih celic ... 40
4.1.2. Ekspresijski sistem NiCo21(DE3) pET28b-OGT ... 40
4.1.3. Ekspresijski sistem NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT ... 45
4.1.4. Ekspresijski sistem Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS pET28b-OGT... 55
4.1.5. Ekspresijski sistem SHuffle® T7 Express lysY pRARE2 pET28b-OGT .... 56
4.2. Razprava ... 58
5. SKLEP ... 61
6. LITERATURA ... 63
7. PRILOGE ... 68
Priloga 1: Heksozaminska biosintezna pot ... 68
Priloga 2: Prisotnost redkih kodonov v sinteznem genu OGT za izražanje v E. coli ... 69
KAZALO SLIK
Slika 1: Dinamični in povratni proces N-acetilglukozaminilacije. ... 1
Slika 2: Proteoliza HCF-1... 3
Slika 3: Shematski prikaz strukture OGT in terciarne strukture katalitične domene človeške OGT (hOGT4,5). ... 4
Slika 4: Shematski prikaz izoform OGT. ... 5
Slika 5: Genska karta plazmida pET28b(+). ... 22
Slika 6: Genska karta plazmida pRARE2... 23
Slika 7: Dvostopenjsko čiščenje tarčnega proteina, izraženega v bakterijskem sevu E. coli NiCo21(DE3)... 24
Slika 8: Tvorba disulfidnih vezi v citoplazmi bakterijskega seva SHuffle T7 Express lysY. ... 25
Slika 9: Shematski prikaz poteka dela. ... 26
Slika 10: Elucija proteina na koloni Superdex 200 10/300 GL na ledu na kromatografskem sistemu ÄKTAexplorer... 36
Slika 11: Princip neposrednega kvantitativnega encimskega testa na osnovi fluorescence za določanje aktivnosti proteina OGT... 38
Slika 12: Strukturna formula UDP-GlcNAc-BODIPY. ... 39
Slika 13: Analiza s SDS-PAGE testnega izražanja NiCo21 pET28b-OGT. ... 40
Slika 14: Kromatogram IMAC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pET28b-OGT (pristop 1). ... 41
Slika 15: Kromatogram SEC (razsoljevanje) OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pET28b-OGT (pristop 1). ... 41
Slika 16: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pET28b-OGT s SDS-PAGE po kromatografskem čiščenju z IMAC in SEC (pristop 1). ... 42
Slika 17: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pET28b-OGT s SDS-PAGE po kromatografskem čiščenju z IMAC in SEC (pristop 2). ... 43
Slika 18: Kromatogram IMAC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pET28b-OGT (pristop 3). ... 43
Slika 19: Kromatogram HIC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pET28b-OGT (pristop 3). ... 44
Slika 20: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pET28b-OGT s SDS-PAGE po kromatografskem čiščenju z IMAC in HIC (pristop 3) ... 44
Slika 21: Analiza s SDS-PAGE testnega izražanja NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT.
... 45 Slika 22: Kromatogram IMAC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 1). ... 46 Slika 23: Kromatogram HIC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 1) ... 46 Slika 24: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT s SDS-PAGE pred in po uporabi hitinskih paramagnetnih kroglic (pristop 1) ... 47 Slika 25: Kromatogram IMAC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 2). ... 48 Slika 26: Kromatogram HIC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 2). ... 48 Slika 27: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT s SDS-PAGE po kromatografskem čiščenju z IMAC in HIC (pristop 2). ... 49 Slika 28: Kromatogram IMAC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 3). ... 49 Slika 29: Kromatogram SEC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 3). ... 50 Slika 30: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT s SDS-PAGE po kromatografskem čiščenju z IMAC in SEC (pristop 3). ... 50 Slika 31: Kromatogram SEC (razsoljevanje) OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 4). ... 51 Slika 32: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT s SDS-PAGE po kromatografskem čiščenju s SEC (razsoljevanje, pristop 4).. ... 52 Slika 33: Kromatogram IMAC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 5). ... 53 Slika 34: Kromatogram SEC OGT po izražanju v ekspresijskem sistemu NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT (pristop 5). ... 53 Slika 35: Spektrofotometrična ocena koncentracije izoliranega proteina (pristop 5). ... 54 Slika 36: Analiza OGT iz ekspresijskega sistema NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT s SDS-PAGE po kromatografskem čiščenju z IMAC in SEC ter koncentriranju v centrifugirkah Amicon (pristop 5). ... 54 Slika 37: Graf intenzitete fluorescence (FI) v odvisnosti od koncentracije OGT. ... 55
Slika 38: Analiza s SDS-PAGE testnega izražanja Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS pET28b-
OGT. ... 56
Slika 39: Analiza s SDS-PAGE po testnem izražanju ekspresijskega sistema SHuffle® T7 Express lysY pRARE2 pET28b-OGT. ... 57
KAZALO PREGLEDNIC Preglednica I: Redki kodoni petih AK v vseh genih ter podskupini močno izraženih genov. ... 11
Preglednica II: Uporabljena laboratorijska oprema in pribor. ... 15
Preglednica III: Uporabljeni reagenti. ... 17
Preglednica IV: Uporabljen komplet. ... 18
Preglednica V: Sestava uporabljenih pufrov in raztopin. ... 19
Preglednica VI: Sestava bakterijskih gojišč. ... 21
Preglednica VII: Sestava 8 % ločevalnega ter 5 % zbiralnega gela za SDS-PAGE. ... 22
Preglednica VIII: Koncentracije antibiotikov v agarnem gojišču LB potrebne za selekcijo posameznih ekspresijskih sistemov. ... 28
Preglednica IX: Sestava gojišča za testno izražanje rekombinantnega proteina. ... 30
Preglednica X: Meritve OD600 testnega izražanja NiCo21(DE3) pRARE2 pET28b-OGT. 45 Preglednica XI: Meritve OD600 testnega izražanja Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS pET28b- OGT. ... 56
Preglednica XII: Meritve OD600 testnega izražanja SHuffle® T7 Express lysY pRARE2 pET28b-OGT. ... 56
POVZETEK
Protein O-GlcNAc-transferaza (OGT) je edini encim, ki katalizira pripenjanje β-N- acetilglukozamina na hidroksilno skupino aminokislinskih ostankov serina in treonina znotrajceličnih proteinov. N-acetilglukozaminilacija je obsežna dinamična posttranslacijska modifikacija, ki se močno prepleta s signalnimi potmi fosforilacije proteinov. Modificirani proteini so vključeni v mnoge celične procese, motnje v njihovi homeostazi pa so povezane s številnimi kroničnimi boleznimi. Zaradi biološkega pomena OGT predstavljajo zaviralci ključno orodje za razumevanje mehanizmov modifikacije, odkrivanje njenih neznanih vlog ter validiranje OGT kot terapevtske tarče. Učinkovita proizvodnja funkcionalnih proteinov v heterolognih gostiteljskih sistemih je eden izmed glavnih temeljev sodobne biotehnologije.
V magistrski nalogi smo se posvetili optimizaciji izražanja in čiščenja rekombinantnega proteina OGT. Namen naloge je bil pridobiti aktiven in kromatografsko čist protein ustrezne koncentracije z uporabo ekspresijskega sistema E. coli. V prvem delu naloge smo protein testno izražali pri različnih koncentracijah induktorja v treh bakterijskih sevih:
NiCo21(DE3), Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS in SHuffle® T7 Express lysY. Za izboljšanje izražanja smo ekspresijska sistema NiCo21(DE3) ter SHuffle® T7 Express lysY transformirali s plazmidom pRARE2, ki vsebuje sedem tRNA za prepoznavo redkih kodonov. Analiza celičnih lizatov s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata je pokazala, da ima OGT najvišjo stopnjo izražanja v bakterijskem sevu NiCo21(DE3) z vstavljenim pRARE2 pri koncentraciji induktorja 0,2 mM. Drugi del magistrske naloge zajema večstopenjsko čiščenje proteina, pridobljenega z izražanjem v povečanem obsegu. Preskušali smo vplive načina celične lize na ustrezno strukturo proteina, način odstranjevanja nativnih proteinov E. coli ter tehnike koncentriranja proteina za dosego želene količine in čistote. Za najuspešnejše se je izkazala liza bakterijskih celic s soniciranjem, kombinacija izolacije in čiščenja s kovinsko-kelatno kromatografijo in gelsko filtracijo ter končno koncentriranje z ultrafiltracijo. V vse pufre smo dodali 0,1 % Tweena 20. Doseženo ustrezno koncentracijo smo potrdili spektrofotometrično, čistoto z vizualizacijo lise pravilne velikosti na poliakrilamidnem gelu, aktivnost pa s kvantitativnim encimskim testom na osnovi fluorescence.
Ključne besede: OGT, redki kodoni, optimizacija, izražanje, čiščenje
ABSTRACT
Protein O-GlcNAc transferase (OGT) is the sole enzyme to catalyse the attachment of β-N- acetylglucosamine to the hydroxyl group of serine and threonine residues of intracellular proteins. N-acetylglucosamination is an abundant dynamic post-translational modification that shows extensive crosstalk with protein phosphorylation. Modified proteins are involved in a number of important cell processes and the disruption of homeostasis has been reported to be associated with many human diseases. Considering its biological importance, OGT inhibitors are a convenient tool for understanding the mechanisms of modification, discovering its unknown functions and validating OGT as a therapeutic target. The efficient production of functional proteins in heterologous host systems plays a crucial role in modern biotechnology. In the master's thesis, we focused on the optimization of OGT expression and purification. Our aim was to isolate an active and chromatographically pure protein of optimal concentration using the E. coli expression system. In the first part of the task we screened the expression at different inducer concentrations in three bacterial strains:
NiCo21(DE3), Rosetta-gami™ 2(DE3) pLysS and SHuffle® T7 Express lysY. To improve protein expression, NiCo21(DE3) and SHuffle® T7 Express lysY expression systems were transformed with the plasmid pRARE2 harboring seven rare codon tRNAs. Analysis of cell lysates by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis showed that OGT had the highest expression levels in the bacterial strain NiCo21(DE3) transformed with pRARE2 and in the presence of 0.2 mM inducer. The second part represented a multistep purification of the protein obtained by optimized scale-up expression. We probed the effects of the cell lysis methods on the correct protein structure, the removal of native E. coli proteins and techniques for concentrating proteins to achieve the desired amount and purity. We discovered that the purification by immobilized metal affinity chromatography followed by size-exclusion chromatography led to the recombinant product of highest purity. Prior to that, bacterial cells were lysed by sonication. The recombinant enzyme was concentrated by ultrafiltration. All buffers were supplemented with 0.1% Tween 20. Finally, the concentration of protein was determined spectrophotometrically, and its purity was confirmed by polyacrilamide gel visualization. Enzyme's activity was assessed by a direct fluorescent activity assay.
Key words: OGT, rare codons, optimization, expression, purification
SEZNAM OKRAJŠAV
AB Alzheimerjeva bolezen
2×TY obogateno bakterijsko gojišče (ang. triptone yeast broth)
AK aminokislina
APS amonijev persulfat
bp bazni par
CBD hitin-vezavna domena (ang. chitin binding domain)
C-Cat C-končna domena OGT
ddH2O bidestilirana voda (ang. double distilled H2O)
DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid)
DTT ditiotreitol
E. coli Escherichia coli GlcNAc N-acetilglukozamin
GT glikoziltransferaza
GT-B glukoziltransferaza naddružine B HBP heksozaminska biosintezna pot
HCF-1 faktor 1 gostiteljske celice (ang. host cell factor 1)
HIC hidrofobna interakcijska kromatografija (ang. hydrophobic interaction chromatography)
IMAC kovinsko-kelatna afinitetna kromatografija (ang. immobilized metal affinity chromatography)
Int-D vmesna domena (ang. intervening domain) IPTG izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid LB Luria-Bertanijevo gojišče
LD nanašalno barvilo (ang. loading dye)
MM molekulska masa
mOGT mitohondrijska OGT
mRNA informacijska ribonukleinska kislina (ang. messenger ribonucleic acid)
MSC območje z več mesti za kloniranje (ang. multiple cloning site)
N-Cat N-končna domena OGT
ncOGT jedrna in citoplazemska OGT (ang. nucleocytoplasmic OGT) NK kontrola brez indukcije
OD optična gostota (ang. optical density)
OGA O-GlcNAc-hidrolaza
OGT O-GlcNAc-transferaza
ORI mesto začetka podvojevanja (ang. origin of replication)
PB Parkinsonova bolezen
PBS fosfatni pufer s solmi (ang. phosphate-buffered saline) PTM posttranslacijska modifikacija
SDS natrijev dodecilsulfat (ang. sodium dodecyl sulfate)
SDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata
SEC gelska filtracija (ang. size-exclusion chromatography) sOGT kratka OGT (ang. short OGT)
TEMED N, N, N', N' – tetrametiletilendiamin
TPR amino-končne tetratrikopeptidne ponovitve (ang. tetratricopeptide repeats)
tRNA prenašalna ribonukleinska kislina (ang. transfer ribonucleic acid) UDP uridin difosfat (ang. uridine diphosphate)
UDP-GlcNAc uridin difosfat N-acetilglukozamin
XLID intelektualna prizadetost, vezana na kromosom X (ang. X-linked intellectual disability)
ε ekstinkcijski koeficient
Ala A alanin
Arg R arginin
Asn N asparagin
Asp D asparaginska kislina
Cys C cistein
Gln Q glutamin
Glu E glutaminska kislina
Gly G glicin
His H histidin
Ile I izolevcin
Leu L levcin
Lys K lizin
Met M metionin
Phe F fenilalanin
Pro P prolin
Ser S serin
Thr T treonin
Trp W triptofan
Tyr Y tirozin
Val V valin
1. UVOD
1.1. O-GlcNAc-transferaza in N-acetilglukozaminilacija
O-GlcNAc-transferaza (glikoziltransferaza OGT, v nadaljevanju OGT) je edini encim, ki je odgovoren za obsežno posttranslacijsko modifikacijo (PTM) dodajanja β-vezanega N- acetil-D-glukozamina (GlcNAc) na hidroksilne skupine aminokislinskih (AK) ostankov serina (Ser) in treonina (Thr) znotrajceličnih proteinov (1,2). Obstaja tudi zunajcelična OGT (ang. EGF domain-specific OGT, eOGT), ki katalizira adicijo GlcNAc ostankov na zunajcelične domene, vendar ne izkazuje homologije z znotrajcelično OGT (3,4). OGT katalizira edinstven tip glikozilacije, t. i. N-acetilglukozaminilacijo, ki uravnava temeljne celične procese v živalih, pri katerih je široko zastopana (5). To modifikacijo so odkrili v 80. letih prejšnjega stoletja, protein OGT pa so izolirali leta 1992 iz jeter glodalcev (3). Dinamiko N-acetilglukozaminilacije nadzira en sam transferazni/glikozidazni par. Encim OGT katalizira prenos GlcNAc dela z donorskega substrata uridin difosfat N- acetilglukozamina (UDP-GlcNAc) na hidroksilno skupino tarčnega Ser ali Thr ostanka, pri čemer nastane β-glikozidna vez. Mehanizem nastanka vezi poteka s t. i. bi-bi mehanizmom, kar pomeni, da se UDP-GlcNAc v vezavni žep med kataliznima domenama veže prvi, peptidni substrat pa nanj (4,6). Za razliko od ostalih glikoziltransferaz za aktivacijo izstopajoče skupine in nadaljnji potek reakcije OGT ne potrebuje kovinskih ionov, saj aktivacijo izstopajoče skupine UDP doseže preko mehanizmov, s katerimi pride do stabilizacije negativnega naboja na izstopajoči skupini. Stabilizacija obsega interakcije med Lys 842 in Thr 921 OGT ter dvema kisikovima atomoma izstopajoče skupine UDP.
Dodatno stabilizacijo omogoči vodikova vez med β-fosfatom UDP-GlcNAc in N-končnim
Slika 1: Dinamični in povratni proces N-acetilglukozaminilacije. N-acetilglukozamin transferaza (OGT) na hidroksilno skupino aminokislinskih ostankov Ser in Thr proteinov pripenja N-acetilglukozamin (GlcNAc) s pomočjo donorja sladkorja UDP-GlcNAc. Hidrolizo glikozidne vezi vrši N-acetilglukozamin hidrolaza (OGA). Prirejeno po (1,3) s programom
delom α-vijačnice OGT (6,7). Cepitev O-glikozidne vezi omogoča N-acetil-D-glukozamin hidrolaza (O-GlcNAc-hidrolaza, OGA) in je odgovorna za odstranjevanje omenjene modifikacije tekom življenjskega cikla proteina (5,8). V primerjavi s konvencionalnimi oblikami glikozilacije proteinov, ki so stabilne in večinoma omejene na endoplazemski retikulum in Golgijev aparat, je N-acetilglukozaminilacija dinamična in povratna modifikacija, ki se večinoma odvija v citoplazmi, mitohondrijih in jedru (5,9). Reverzibilnost reakcije je analogna večini PTM, ki so vključene v celično signalizacijo in izkazuje obsežno prepletenost s procesom fosforilacije (10). Večina proteinov je lahko tako glikozilirana kot fosforilirana, kar pomeni, da procesa tekmujeta za isti AK-ostanek. To je potrjeno z molekulskim modeliranjem, ki je pokazalo, da naj bi fosforilacija sterično ovirala glikozilacijo in onemogočila tvorbo vodikovih vezi med OGT in njegovim substratom (9,11). Čeprav je N-acetilglukozaminilacija v številnih pogledih podobna fosforilaciji, se aktivnost OGT za številne substrate razlikuje od kinaz (4,6). Primer vpletenosti procesov v iste signalne kaskade je inzulinska signalna pot, ki je podrobneje predstavljena v poglavju 1.4.1. OGT modificira približno 4000 proteinov, vendar vloga O- GlcNAc v večini teh primerov ni pojasnjena, pri čemer je en izmed glavnih razlogov ta, da je fiziološka količina glikoziliranih proteinov nizka in težko zaznavna. Njihova količina se poveča le ob prekomernem delovanju OGT, kar je v večini primerov povezano le s kroničnimi boleznimi. Poleg tega so njihove koncentracije pogosto substehiometrične, saj glikozilacija ne poteče na ustreznem glikozilacijskem mestu pri vseh proteinih (12,13). Kljub dejstvu, da N-acetilglukozaminilacija lahko deluje na proteine neodvisno, je njen medsebojni vpliv s fosforilacijo tisti, ki predstavlja temeljno vlogo v celični signalizaciji
(4,12).
OGT katalizira tudi proteolizno reakcijo, pri kateri je do sedaj edini znani substrat faktor 1 gostiteljske celice (ang. host cell factor 1, HCF-1) (12). HCF-1 je protein, ki je vključen v kontrolo celičnega cikla, celične proliferacije ter številne komplekse, ki spreminjajo kromatin. Do cepitve mora priti na vsaj eni izmed šestih 26 AK-ostankov dolgih proteolitičnih ponovitev, natančneje na zaporedju Cys-Glu-Thr, da pridobi protein polno aktivnost (1,14). Da ima glutaminska kislina ključno vlogo pri proteolizni reakciji dokazuje poskus mutacije glutaminske kisline na cepitvenem mestu v serin, pri čemer ni prišlo do proteolize, temveč glikozilacije (12). Za reakcijo je potreben ko-substrat UDP-GlcNAc, vodi
pa v nastanek N-končnega piroglutamata na HCF-1C produktu in C-končnega cisteina na glikoziliranem HCF-1N produktu (Slika 2) (1,14).
1.2. Strukturne značilnosti in izoforme
Po klasifikacijskem sistemu CAZy (ang. Carbohydrate Active enZyme) je OGT član družine glikoziltransferaz 41 (GT 41), zavzema terciarno strukturo GT-B, mehanizem nastanka glikozidne vezi pa poteka s pomočjo inverzije anomernega atoma (2,6). Gen za OGT se nahaja na kromosomu X, na lokusu blizu centromere (Xq13.1), ki je hkrati tudi regija, povezana s Parkinsonovo boleznijo (4,6). Tarčna delecija gena pri miših povzroči embrionalno smrt, kar dokazuje, da je bistven za življenje (15). OGT nosi zapis za protein, sestavljen iz dveh regij, ki ju povezuje tranzicijska vijačnica H3, to sta (Slika 3):
N-končna domena, ki je sestavljena iz številnih 34 AK-ostankov dolgih motivov, ki so značilno zviti v parne antiparalelne α-vijačnice, imenovane tetratrikopeptidne ponovitve (ang. tetratricopeptide repeats, TPR) (6). Njihovo število je specifično za izoformo, njihova naloga pa je sodelovanje pri posredovanju interakcij med proteini (protein-protein interakcijah) ter substratni specifičnosti (1–3,9,16). Poleg tega je dokazano, da izvorni OGT obstaja kot trimer ter da je domena TPR bistvena za njegovo trimerizacijo, (15)
C-končna domena ima aktivnost glikoziltransferaze in jo razdelimo na tri področja, in sicer N-končno (N-Cat) in C-končno (C-Cat) katalitično domeno ter 120 AK- ostankov dolgo vmesno domeno (Int-D). N-Cat se od C-Cat razlikuje po tem, da ima dve dodatni vijačnici (H1 in H2), ki zagotavljata vezavna mesta za substrat,
Slika 2: Proteoliza HCF-1. Reakcija, ki jo katalizira OGT, poteka med karboksilno skupino glutaminske kisline in UDP- GlcNAc, kjer nastaneta C-končni produkt (HCF-1C) z N-končnim piroglutamatom in N-končni produkt (HCF-1N) s C- končnim cisteinom. Rdeči krogi ponazarjajo šest 26 AK-ostankov dolgih proteolitičnih ponovitev, modri šestkotniki pa predstavljajo glikozilacijo produkta. Prirejeno po (1) s programom BioRender.
sicer pa imata C-Cat in N-Cat enaki zvitji, kar je značilnost naddružine GT-B (1–
3,9,16). Vloga Int-D ni natančno znana, a domnevajo, da zaradi površinskih bazičnih stranskih verig lizina interagira z negativno nabitimi membranami ali nukleinskimi kislinami (14). Poleg tega ena izmed hipotez nakazuje, da je pri inzulinski signalizaciji ključna za interakcijo s fosfatidilinozitol-(3,4,5)-trifosfatom (PIP3) (7). Z analizo kristalne strukture kompleksa OGT z UDP ter peptidnim substratom so ugotovili, da se substrat neposredno veže v režo med TPR in katalitični domeni ter jo razširi (5). Z uporabo metode simulacije molekulske dinamike se je izkazalo, da je med 12. in 13.
zaporedjem TPR gibljivo mesto (ang. hinge region), ki zapira ali odpira aktivno mesto encima, medtem ko se zaporedja 1-10 raztezajo stran od aktivnega mesta (14,17).
Proteinska podatkovna zbirka UniProtKB (UNIversal PROTein Knowledge Base) navaja štiri izooblike OGT (Slika 4), ki se razlikujejo v številu N-končnih TPR, celični lokaciji, fiziološki vlogi ter substratni specifičnosti, (5) in sicer:
jedrna in citoplazemska OGT (ncOGT) z molekulsko maso 116 kDa in 13,5 TPR (izooblika 3 in izooblika 1, ki nastane z alternativnim spajanjem eksonov in se od izooblike 3 razlikuje v manjkajočem zaporedju ostankov 13 – 22) (18),
mitohondrijska OGT (mOGT) z molekulsko maso 103 kDa, 9 TPR in N-končnim mitohondrijskim signalnim peptidom (ang. mitochondrial targeting sequence, MTS), (izooblika 2) ter
kratka izooblika (sOGT) z molekulsko maso 78 kDa in 2,5 TPR (izooblika 4) (5,9,16).
Slika 3: Shematski prikaz strukture OGT (levo) in terciarne strukture katalitične domene človeške OGT (hOGT4,5, desno). N-končni del sestavljajo tetratrikopeptidne ponovitve (TPR, sivo), pri čemer je njihovo število specifično za izoobliko - te so jedrna in citoplazemska (ncOGT), mitohondrijska (mOGT) in kratka OGT (sOGT). N-konec vsake izooblike je označen s številom ostanka, ki ustreza številu v ncOGT. Temno sivi TPR izvirajo iz strukture hOGT4,5, svetlo sivi TPR pa iz strukture ncOGT. C-končno domeno sestavljajo C-katalitična domena (C-Cat, rdeče), N-katalitična domena (N-Cat, modro) in vmesna domena (Int-D, zeleno). Domeni povezuje vijačnica H3. Na prikazu terciarne strukture katalitične domene človeške OGT, ki ima 4,5 TPR (hOGT4,5, desno), je v aktivnem mestu prikazana molekula uridin difosfata (UDP, vijolično) ter glikoziliran peptidni substrat kazein kinaze II (glikoziliran CKII, rumeno). Povzeto po (1,14)
glikoziliran
1.3. Heksozaminska biosintezna pot
Biologije OGT ni mogoče razumeti brez pregleda heksozaminske biosintezne poti (HBP), ki vključuje metabolite presnovnih poti glukoze, aminokislin, maščobnih kislin in nukleinskih kislin za tvorbo končnega produkta UDP-GlcNAc, ključnega za delovanje OGT (1,5). Koncentracija UDP-GlcNAc je torej odvisna od splošne razpoložljivosti hranil v celici in toka skozi različna področja presnove, zato se upravičeno imenuje tudi »hranilni senzor« v celicah (1,12). Glukozo (Glc) iz zunajceličnega okolja prevzame glukozni membranski prenašalec (GLUT). Pri tem se večina le-te v celicah porablja za glikolizo in glikogenezo, približno 2–5 % glukoze pa se usmeri v HBP. Sledi pripenjanje fosfatne skupine na glukozo s heksokinazo (HK) in izomerizacija sladkorne enote z glukoza-6- fosfat izomerazo (GPI). Encim, ki določuje hitrost HBP, je glutamin-fruktoza-6-fosfat amidotransferaza (GFAT) in pretvarja fruktozo-6-fosfat (Fru-6P) v glukozamin-6-fosfat (GlcN-6P). Kasnejše acetiliranje z glukozamin-6-fosfat N-acetiltransferazo (GNPNAT) in izomerizacija (mutarotacija) fosfatne skupine s fosfoglukomutazo (PGM) omogočijo nastanek N-acetilglukozamin-1-fosfata (GlcNAc-1-P), s katerim UDP-N-acetilglukozamin pirofosforilaza (UAP) prispeva donorski substrat za glikozilacijo proteinov. Na tej točki OGT katalizira pripenjanje O-GlcNAc. Produkt delovanja OGA je prosti GlcNAc, ki lahko neposredno vstopi v reciklažno pot HBP (4,5,12). Shema HBP je predstavljena v Prilogi 1.
1.4. Celične regulatorne funkcije in pomen pri kroničnih boleznih
Zaradi vpliva skoraj vsake presnovne poti na biosintezo UDP-GlcNAc ter občutljivosti glikozilacije na inzulin, razpoložljivost hranil in celični stres ni presenetljivo, da je OGT vpletena v uravnavanje številnih celičnih procesov, kot so transkripcija, translacija, celično signaliziranje, apoptoza in presnova (1,4,5). Pri akutnem celičnem stresu, ko so celice izpostavljene npr. vročini, visoki koncentraciji soli, težkim kovinam, UV-svetlobi ali hipoksiji, se glikozilacija proteinov poveča, kar deluje zaščitno (5). Temu v prid govori tudi
Slika 4: Shematski prikaz izoform OGT. Jedrna in citoplazemska (ncOGT), mitohondrijska (mOGT) in kratka (sOGT) izoforma se razlikujejo v dolžini glede na število tetratrikopeptidnih ponovitev (TPR, sivo), skupne imajo katalitični domeni (Cat-1 oz. C-Cat, rdeče in Cat-2 oz. N-Cat, modro) ter vmesno domeno (Int, zeleno). mOGT ima na N-koncu značilen signalni peptid (ang. mitochondrial targeting sequence, MTS), ki encim posttranslacijsko usmerja v mitohondrij. Povzeto po (17) .
raziskava na podganah, kjer je akutno povečana glikozilacija ščitila srčno mišico pred poškodbami tkiva po hemoragičnem šoku (9). N-acetilglukozaminilacija vpliva tudi na funkcije znotrajceličnih proteinov z vidika encimske aktivnosti, aktivnosti transkripcijskih dejavnikov, stabilnosti, lokalizacije, interakcij med proteini ter uravnavanja nekaterih epigenetskih programov (8). Vzdrževanje normalne znotrajcelične ravni N- acetilglukozaminilacije poteka preko medsebojne regulacije OGT in OGA, zato iztirjenje te homeostaze vodi v številna patološka stanja in napredovanje s starostjo povezanih bolezni, kot so sladkorna bolezen, nevrodegenerativne in kardiovaskularne bolezni ter rakava obolenja (5,8). Zaradi razširjenosti omenjenih bolezni so le-te v nadaljevanju predstavljene s patofiziološkega vidika OGT, kar poudarja pomembnost proteina kot potencialne terapevtske tarče.
1.4.1. Sladkorna bolezen
Sladkorna bolezen (SB) je kronična presnovna motnja, za katero je značilna visoka koncentracija krvne glukoze (hiperglikemija). Glede na to, kako je inzulinska signalizacija prizadeta, absolutno ali relativno, ločimo dva tipa bolezni: tip 1 in tip 2. Številne akterje inzulinske signalizacije je mogoče spremeniti z N-acetilglukozaminilacijo, pri čemer so učinki na te proteine v večini primerov nasprotni učinkom inzulina (12,16). Pri kronično povišani koncentraciji glukoze in dolgotrajni izpostavljenosti inzulinski signalizaciji se OGT prenese iz jedra na notranjo stran celične membrane z vezavo na fosfatidilinozitol- (3,4,5)-trifosfatom (PIP3), kjer ga inzulinski receptor (IR) fosforilira in aktivira. To vodi v glikozilacijo signalnih molekul substrata inzulinskega receptorja (IRS1), fosfoinozitid-3- kinaze (PI3K), piruvat dehidrogenazne kinaze 1 (PDK1) in aktivacije Akt, s čimer je onemogočena njihova fosforilacija in olajšana zaustavitev inzulinske signalne poti.
Posledično se zmanjša sinteza glikogena in privzem glukoze preko glukoznega transporterja tipa 4 (GLUT4), kar pripomore k razvoju inzulinske rezistence (16). Geni, za katere je znano, da glikozilacija pripadajočih proteinskih produktov vpliva na njihovo izražanje in s tem večjo sekrecijo inzulina, so NEUROD1 (nevrogeni diferenciacijski dejavnik), PDX1 (promotorski dejavnik 1 inzulinskega gena) ter MAF1 (makrofage aktivirajoči dejavnik 1) (12). Dolgoročno povišana glikozilacija v signalni poti inzulina je neposredno vključena v etiologijo obeh tipov SB in prispeva k razvoju kroničnih zapletov kot so diabetična nefropatija, retinopatija, kardiomiopatija ter nevropatija (12). K razvoju
slednje OGT prispeva tako, da se preko proteina Milton veže na kinezin, ki uravnava aksonski transport in mitohondrijsko gibljivost (4,5).
1.4.2. Nevrodegenerativne bolezni in nevrorazvojne motnje
Nevrodegeneracija sodi med najpogostejše motnje, s katerimi se srečuje starajoče se prebivalstvo in za katere je značilna postopna izguba strukture ter delovanja nevronov (9). Obseg glikozilacije je za trebušno slinavko največji v možganih, saj je približno 40 % vseh nevronskih proteinov in 19 % sinaptosomskih proteinov glikoziliranih, kar kaže na pomembno vlogo OGT tako pri normalnih funkcijah možganov kot pri etiologiji nevrodegeneracije (4,12). Do danes so te bolezni, vključno z Alzheimerjevo (AB), Parkinsonovo (PB) in Huntingtonovo boleznijo, neozdravljive, pri čemer napake v oslabljeni presnovi glukoze v možganih povezujemo tudi s širokim odmiranjem nevronskih celic in nevronskim vnetjem (9). AB je progresivna nevrodegenerativna bolezen, ki postopoma vodi v upad spominskih in drugih intelektualnih sposobnosti, v vedenjske motnje in spremembe osebnosti ter je najpogostejši vzrok za demenco (19). V normalnem fiziološkem stanju je protein tau, ki v nevronih povezuje tubulin v nevrotubule, pomemben za aksoplazemski transport snovi, glikoziliran. Pri AB zaradi zmanjšanega metabolizma glukoze v nevronih in hkratne izgube funkcije OGT nastane hiperfosforiliran protein tau, ki ni več vezan na mikrotubule, ampak se nahaja prosto v citosolu (4,16,19). To podpira tudi raziskava aplikacije visoko specifičnega zaviralca OGA in vivo, ki je povečal bazalno N- acetilglukozaminilacijo in preprečeval hiperfosforilacijo proteina tau pri miših z izzvano AB, kjer so dokazali, da je podlaga za etiologijo nevrodegenerative bolezni neravnovesje med procesoma fosforilacije in glikozilacije (4). Poleg tega OGT v določeni meri deluje tudi nevroprotektivno, saj O-glikozilacija zavira aktivnost γ-sekretaze, s čimer se zmanjša tvorba amiloidnih plakov (12).Vzrok PB je propad dopaminergičnih nevronov v substanci nigri, kar se odraža z motoričnimi simptomi. V normalnem fiziološkem stanju glikozilacija α-sinukleina zmanjša agregacijo proteinov, pri PB pa zaradi zmanjšane funkcije OGT pride do nastanka agregatov, t. i. Lewijevih telesc (9). S poskusi glikoziliranja α-sinukleina preko AK-ostankov Ser in Thr so pokazali, da modifikacija prepreči nastanek toksičnih agregatov
(20). Nedavno se je izkazalo, da nekatere različice v genu OGT vodijo do substitucij aminokislin v proteinu in so povezane z intelektualno prizadetostjo, vezano na kromosom X (ang. X-linked intellectual disability, XLID). Intelektualna prizadetost je zgodnje nevrorazvojno stanje, za katero so značilni pomanjkanje inteligence (IQ < 70) in sočasne
okvare v prilagoditvenem vedenju. Prizadene približno 1 % svetovnega prebivalstva in gre za prirojeno motnjo glikozilacije, saj je bilo do sedaj odkritih sedem aminokislinskih zamenjav v genu OGT, t. i. različic OGT-XLID, ki so klinično izkazovale simptome intelektualne prizadetosti. Trenutno obstaja več hipotez, ki so še predmet raziskav.
Predvidevajo, da imajo različice OGT-XLID zmanjšano katalitično aktivnost OGT in povzročijo napačno zvitje proteina OGT ter posledičen nastanek toksičnih agregatov, možne so tudi motnje v interakcijah med proteini, ki vplivajo na nevrorazvojne poti (21).
1.4.3. Kardiovaskularne bolezni
Pri kardiovaskularnih boleznih, kot so koronarna srčna bolezen, angina pektoris, cerebrovaskularna bolezen in revmatična bolezen srca, ima N-acetilglukozaminilacija različne vloge pri napredovanju bolezni (9). Tako kot paradoksalno nasprotni vlogi glikozilacije pri sladkorni bolezni in nevrodegenerativnih boleznih je tudi akutno povečana glikozilacija zaščitna. Vendar v primeru, ko je kronično povišana na račun hiperglikemije, kot se to zgodi pri diabetesu, le-ta neposredno prispeva h kardiomiopatiji (4). Hiperglikemično izzvana glikozilacija zavira fosforilacijo fosfolambana (PLN), kar zmanjša izražanje sarko(endo)plazmatske kalcijeve ATPaze 2a (SERCA2a), podaljša znotrajcelično prehajanje kalcija, zakasni miokardno relaksacijo in oslabi srčno funkcijo.
Zmanjšanje izražanja SERCA2a je lahko posredovano tudi s hiperglikozilacijo transkripcijskega dejavnika Sp1, saj glikozilacija poveča translokacijo proteina Sp1 v jedro, njegovo stabilnost ter zmanjšana transkripcijsko aktivnost SERCA2a (4,9,12).
1.4.4. Rakava obolenja
Glede na obsežen vpliv med glikozilacijo in fosforilacijo ter znanimi vlogami slednje v različnih mehanizmih, na katerih temelji rak, ni presenetljivo, da je tudi glikozilacija vključena v etiologijo raka (4). Vpliv se kaže na metabolizmu rakavih celic, saj je raven N- acetilglukozaminilacije in OGT povečana pri različnih vrstah raka (dojk, prostate, debelega črevesa) in predlagana kot glavni dejavnik, ki omogoča proliferacijo, odpornost proti apoptozi, ter kot ena izmed najpogostejših biokemičnih sprememb, ki vodijo do učinkovite stabilizacije različnih onkogenih dejavnikov (3). Dokazano je, da so številni glavni onkogeni dejavniki posredno ali neposredno glikozilirani in imajo vpliv na uravnavanje transkripcije. Primer je transkripcijski dejavnik NF-κB, ki je vključen v številne fiziološke in patološke procese. O-glikozilacija p65 zmanjša vezavo NF-κB na njegov zaviralec (IκBα) in s tem poveča translokacijo NF-κB v jedro, njegovo stabilizacijo ter
transkripcijsko aktivnost. Poleg tega O-glikozilacija IKKα zmanjša razgradnjo NF-κB, kar prispeva k zmanjšani celični apoptozi (3,12,22). Podobno vlogo ima OGT tudi v primeru proteina c-Myc, ki se prekomerno izraža v proliferativnih in rakavih celicah, in osrednjega tumorskega supresorja p53, katerega gen je mutiran v več kot 50 % primerov raka. O- glikozilacija ju stabilizira, kar poveča izražanje glikolitičnih encimov in vzdržuje proliferativno signalizacijo v primeru c-Myc oz. spodbuja pridobivanje novih pro- onkogenih aktivnosti v primeru p53 (3,4,12,22). Zanimivo povečana glikozilacija zaščiti celice raka dojke pred apoptozo, ki bi jo povzročil tamoksifen, pri čemer pride do t. i. odpornosti celic proti tamoksifenu (3,12,22). V teku je razumevanje mehanizma N- acetilglukozaminilacije pri uravnavanju dinamike preoblikovanja kromatina in s tem transkripcije genov. Znano je, da je modifikacija del »histonske kode« in je OGT prepoznan kot partner za interakcijo s proteini družine TET (ang. ten eleven translocon), ki vključujejo epigenetske spremembe, povezane z rakom (5,22).
1.5. OGT kot terapevtska tarča
Različne fiziološke vloge OGT in njena vključenost v številna bolezenska stanja poudarjajo pomen odkrivanja natančnih mehanizmov delovanja ter razvoja strategij za terapevtske namene, ki se usmerja predvsem v sintezne spojine, terapevtska protitelesa in aptamere
(1,2,12). Primera sinteznih zaviralcev OGT sta Ac-5SGlcNAc in OSMI-1. Prvi je substratni analog, odporen na hidrolizo, in se ob vstopu v celico pretvori v UDP-5SGlcNAc, ki postane nepermeabilen in se akumulira v celici, ter po nekompetitivnem mehanizmu zavira OGT brez vpliva na celično viabilnost. Druga spojina spada v skupino zaviralcev, nastalih s tehniko rešetanja knjižnice spojin, je permeabilna in visoko specifična na OGT, a slabo vodotopna in vpliva na celično viabilnost (6). Trenutno se sinteza osredotoča predvsem k izboljšanju specifičnosti, izven-tarčnih učinkov, jakosti in membranski permeabilnosti zaviralcev OGT. Problem, ki se pri tem pojavlja, je neselektivno delovanje takšnih spojin na OGT, ki je v organizmu široko prisoten, kar lahko spremeni delovanje številnih celičnih proteinov, tudi tistih, ki niso povezani z bolezenskimi stanji. To lahko vodi v pojav neželenih učinkov ali celo novih bolezni. Rešitev so nove tehnologije, ki bi ciljale na tarčni protein O-GlcNAc, kot primer takšnega pristopa so aptameri in nanotelesa, ki lahko blokirajo točno določeno tarčno mesto za O-GlcNAc na proteinu, in tehnologija genskega urejanja, s katero bi uvedli točkovne mutacije in odstranili mesta na proteinu, ki so dovzetna za O-glikozilacijo (3,12).
1.6. Izražanje rekombinantnih proteinov z redkimi kodoni v E. coli
Osnovni princip pri izražanju proteinov je translacija DNA v mRNA in transkripcija v proteine, pri čemer je ključen nabor tRNA, od katerih vsaka zagotavlja neposredno in specifično povezavo med trojčkom nukleotidov ter ustrezno aminokislino (23). Degeneriran genski kod pomeni, da večino aminokislin kodira več kot en od 64 razpoložljivih kodonov
(24,25). Od tega nabora jih trije ne določajo nobene aminokisline, ampak delujejo kot zaključni kodoni, 18 aminokislin kodira več (2, 3, 4 ali 6) sinonimnih kodonov, po en kodon pa kodirata metionin in triptofan (26). Vsak organizem daje prednost drugačnemu nizu kodonov, kar imenujemo kodonska pristranskost (ang. codon bias), ki se v vsaki celici natančno odraža s koncentracijo analogne tRNA, prisotne v citoplazmi. Ta pojav je ključen pri oblikovanju izražanja genov in celične funkcije zaradi učinkov na različne procese, kot so transkripcija, translacija in zvitje proteinov (23,27). V mnogih primerih je za dosego komercialnih zahtev ciljnih proteinov potrebno heterologno izražanje genov, zato so mikroorganizmi temelj proizvodnje farmacevtskih proizvodov, industrijskih encimov in kemikalij. S tega vidika so razlike v kodonih med organizmi eden izmed glavnih dejavnikov, ki vplivajo na raven izražanja rekombinantnih proteinov, saj lahko prisotnost redkih kodonov zmanjša hitrost transkripcije in povzroči napake translacije, zmanjša učinkovitost in zvitje proteinov, kar pomembno vpliva na donos (28). Izbira kodona, specifičnega za organizem, je povezana z razlikami v populacijah sorodnih oz. sinonimnih tRNA, kar pomeni, da se v določenem organizmu pogosti kodoni prevajajo hitreje kot redki kodoni. Kako natančno naravni izbor oblikuje vzorce kodonov, ostaja neznano (29,30). Escherichia coli je najpogosteje uporabljen gostiteljski organizem za heterologno proizvodnjo rekombinantnih proteinov (31). Izražanje proteinov v E. coli je v biotehnologiji razširjeno predvsem zaradi relativne preprostosti, poceni in hitrega gojenja visoke gostote, dobro znane genetike in velikega števila združljivih orodij. Poleg naštetega je raznolikost razpoložljivih plazmidov, rekombinantnih fuzijskih partnerjev in mutiranih sevov razširila možnosti njene uporabe (27). Kljub temu so stalne ovire pri uporabi tega gostitelja nizko izražanje nekaterih proteinov in tvorba neaktivnih netopnih agregatov (inkluzijskih telesc).
Težave se lahko pojavijo zaradi toksičnosti produkta, nestabilnosti mRNA, pomanjkanja posttranslacijskih sprememb ter nasičenosti sistemov za zvitje proteinov v gostiteljski celici (32). E. coli izkazuje izrazito pristranskost pri rabi kodonov. Razlike v kodonih med prokarionti in evkarionti so pomemben dejavnik pri proizvodnji heterolognih proteinov,
saj prisotnost redkih kodonov v kloniranih genih vpliva na raven izražanja proteinov, translacijske napake, kot so zastoj, prekinitev, zamenjava aminokislin, premik bralnega okvirja in stabilnost plazmidov (33,34). Podskupina kodonov, ki jih zelo redko uporabljamo v visoko izraženih genih E. coli, kodira AK Arg, Ile, Gly, Leu in Pro. Zlasti kodoni za Arg (AGA, AGG in CGA), Ile (AUA) in Leu (CUA) predstavljajo manj kot 8
% pripadajoče populacije, kodoni za Gly (GGA), Arg (CGG) in Pro (CCC) pa manj kot 2 % njihove pripadajoče populacije (Preglednica I). Kodonska pristranskost je izražena kot delež vseh možnih kodonov za dano AK, in sicer "vsi geni" predstavlja delež, ki je zastopan v vseh 4.290 kodirajočih zaporedjih v genomu E. coli. Delež v podskupini močno izraženih genov je delež, ki je zastopan v 195 genih, ki se med eksponentno rastjo močno in konstantno izrazijo. Uporaba kodonov v le-teh kaže na skrajno pristranskost, zato se jih poskušamo izogniti. Ker se običajno
tarčni geni v E. coli izražajo v enakih koncentracijah kot endogeni geni, bi teoretično lahko s spremembami v pogojih gojenja, na primer z znižanjem temperature ali spremembo sestave gojišča, izboljšali kodonsko pristranskost (35).
Za razliko od sesalskih gostiteljskih celic v E. coli primanjkuje endogene aktivnosti OGT, vendar se kljub temu široko uporablja za pridobivanje visokih koncentracij čistega proteina. Glavni nameni so študije spreminjanja substratnega proteina in vitro po O- GlcNAc modifikaciji, proučevanje razlik v aktivnostih in specifičnosti izoform, določanje 3D strukture, raziskovanje encimskega mehanizma in razvoja zaviralcev (8).
Preglednica I: Redki kodoni petih AK v vseh genih ter podskupini močno izraženih genov. Prirejeno po (35).
Kodonska optimizacija je način povečanja izražanja rekombinantnih proteinov (26). Gre za pristop genskega inženiringa, ki optimizira mRNA za izražanje v različnih organizmih z uporabo frekvenc kodonov, specifičnih za organizem. Pri tem z eksperimentalnimi pristopi izboljšuje kodonsko sestavo rekombinantnega gena, brez da bi pri tem spremenila aminokislinsko zaporedje, kar je mogoče, ker skoraj vse aminokisline kodira več kot en kodon. Kodonsko optimizacijo rutinsko uporabljamo tako za potrebe bioprodukcijske kot terapevtske aplikacije. Strategije optimizacije kodona temeljijo na sledečih predpostavkah:
- redki kodoni omejujejo hitrost sinteze proteinov,
- sinonimni kodoni so zamenljivi brez vpliva na strukturo in delovanje proteinov ter - zamenjava redkih kodonov s pogosto uporabljenimi kodoni poveča proizvodnjo
proteinov (36).
Za kodonsko optimizacijo uporabljamo dva pristopa. Prvi temelji na principu »ena aminokislina - en kodon,« kar pomeni, da izberemo najbolj razširjen kodon gostitelja za kodiranje vseh pojavov določene aminokisline v optimiziranem zaporedju (28,37). Povečanje analogne tRNA v gostiteljski celici lahko dosežemo s povečanjem števila kopij posameznega gena tRNA, kar običajno storimo z vstavitvijo več kopij divjega tipa gena tRNA v dodaten plazmid (35). Pomanjkljivost takšnega pristopa je, da močno prepisana mRNA iz gena s tako zasnovo vsebuje visoko koncentracijo podskupine kodonov in povzroči neravnovesje v naboru tRNA (28). Nerešeno ostaja, kako povečanje koncentracije posamezne tRNA vpliva na aminoacilacijo in ali bo sestava povečano izraženih proteinov stabilna. Težava strategije je tudi ta, da so za proizvodnjo popolnoma funkcionalne tRNA potrebne tudi druge celične komponente, ki bi lahko primanjkovale pri povečani proizvodnji zgolj tRNA (25). Poleg tega so za vzdrževanje plazmida, ki izraža tRNA, potrebni dodatni antibiotiki - že uporaba dveh antibiotikov in trajna sprememba ravnovesja različnih vrst tRNA lahko vpliva na sposobnost izražanja gostitelja, kar pripomore k slabšemu donosu (31). Kljub vsemu je ta metodologija privedla do zasnove in komercializacije bakterijskih sevov, ki nosijo plazmide in vsebujejo dodatne kopije problematičnih genov tRNA (32,33). Drug pristop temelji na t. i. »naključnem razvrščanju kodonov« z uporabo translacijskih tabel, ki temeljijo na frekvenčni porazdelitvi kodonov v celotnem genomu ali podskupini močno izraženih genov (kot je na primer Preglednica I). Tabele pripisujejo utež vsakemu kodonu, na podlagi česar te dodelimo naključno z verjetnostjo določene uteži. Ta pristop poleg izboljšanja donosa želenega proteina upošteva
še druge parametre, in sicer, izognitev ponavljajočih se elementov, ki lahko vodijo v delecijo gena, poliadenilacijskih signalov, lokalni kontekst danega kodona, nagnjenost 5'- konca mRNA, da se zvije v stabilno sekundarno strukturo, prisotnost transkripcijskih terminatorjev in vsebnost GC (28,37,38). Kljub vsemu rezultat teh algoritmov ni zagotovilo za uspeh, saj lahko sinonimne mutacije vplivajo na nivo izražanja proteina, četudi ne spremenijo aminokislinskega zaporedja, in sicer lahko vplivajo na posttranslacijske modifikacije, konformacijo, stabilnost in delovanje proteina, zato je zasnova konstrukcije za izražanje heterolognih proteinov v sintezni biologiji pomembna (23,26,39).
2. NAMEN DELA
Vse več dokazov opozarja na vpletenost O-glikozilacije z GlcNAc v številne kronične bolezni, ki predstavljajo velik javnozdravstveni problem. Zaradi potrebe po nadaljnjem odkrivanju vloge OGT ter preučevanju aktivnosti zaviralcev OGT in vitro je njeno rekombinantno izražanje in pridobivanje ključno.
Namen naloge je v ekspresijskem sistemu E. coli optimizirati izražanje in čiščenje proteina OGT tako, da bomo z izražanjem v povečanem obsegu pridobili aktiven rekombinantni protein, ki bo kemijsko in konformacijsko čist ter s tem ustrezen za nadaljnje potrebe testiranja zaviralcev.
Izražanje rekombinantnega proteina bomo primerjali v treh različnih ekspresijskih bakterijskih sevih E. coli, in sicer NiCo21(DE3), Rosetta-gami™ 2(DE3)pLysS in SHuffle® T7 Express lysY. Plazmid pET28b-OGT bomo s toplotnim šokom vnesli v vse omenjene seve in bakterijske kulture namnožili. Nato bomo s ponovnim toplotnim šokom vnesli v bakterijska seva NiCo21(DE3) pET28b-OGT in SHuffle® T7 Express lysY pET28b-OGT še plazmid pRARE2. Izražanje rekombinantnega proteina bomo sprožili z različnimi koncentracijami induktorja izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG), izražanje bo potekalo pri temperaturi 16 °C. Nato se bomo na podlagi analize s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (SDS-PAGE) odločili za najučinkovitejši ekspresijski sistem ter določili pogoje izražanja, to je čas in koncentracija induktorja. Pri izbranih pogojih bomo povečali obseg izražanja proteina in pridobili celični lizat za nadaljnje čiščenje. Za dosego želene čistote proteina (> 90 %), bomo uporabili več kromatografskih korakov ter vmesnih metod. Pri tem se bomo naslonili na afinitetno kromatografijo (IMAC), gelsko filtracijo (SEC), hidrofobno interakcijsko kromatografijo (HIC), ultrafiltracijo ter določili njihovo najučinkovitejše zaporedje.
Čistoto rekombinantnega proteina bomo preverjali z analizo s SDS-PAGE, aktivnost pa z neposrednim kvantitativnim encimskim testom na osnovi fluorescence.
3. MATERIALI IN METODE
3.1. Materiali
3.1.1. Laboratorijska oprema
Preglednica II: Uporabljena laboratorijska oprema in pribor.
laboratorijska oprema model proizvajalec država
analizna tehtnica AB104 Mettler Toledo Švica
aparat za ultračisto vodo Q-POD Milli Q Merck KGaA Nemčija
avtoklav A-63 in A-21 Kambič Slovenija
centrifuga 5418R in 5804R Eppendorf Nemčija
centrifuga Sorvall RC 5C
Plus
Thermo Fisher Scientific
ZDA
centrifuga mini G IKA Werke GmbH Nemčija
centrifugirke za ultrafiltracijo Amicon® Ultra-4 in Ultra-15
Merck KGaA Nemčija
črna mikrotitrska ploščica s 96 vdolbinicami
Nunc™ Thermo Fisher
Scientific
ZDA
električna grelna plošča Single Hotplate SCP 1504BK
Sencor Japonska
filtri za filtriranje ultračiste vode z velikostjo por 0,22 µm
Millipak 40, Gamma Gold
Merck KGaA Nemčija
infrardeči termometer CASON CA380 Sca Pacific ZDA
inkubator Unihood RCS-650 UniEquip
Laborgerätebau un Vertriebs
GmbH
Nemčija
inkubator MIR-S100 Sanyo Japonska
inkubator Wtc Binder
kadička za vertikalno elektroforezo
Mini-PROTEAN®
3 Cell
Bio-Rad Laboratories ZDA
kolona za gelsko filtracijo SuperdexTM 200 10/300 GL
GE Healthcare Bio- Sciences AB
Švedska
kolona za hidrofobno
interakcijsko kromatografijo
HiTrap® Phenyl HP 1 mL
GE Healthcare Bio- Sciences AB
Švedska
kolona za kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo
HiTrap® IMAC HP 1 mL
GE Healthcare Bio- Sciences AB
Švedska
kolona za razsoljevanje proteinov
HiTrap® 5 mL Desalting
GE Healthcare Bio- Sciences AB
Švedska
kromatografski sistem FPLC ÄKTAexplorer 10 S
GE Healthcare Bio- Sciences AB
Švedska
magnetno mešalo Multistirrer VELP Scientifica Italija
magnetno stojalo S1506S New England
BioLabs
ZDA
membranski filter iz acetil celulozne z velikostjo por 0,45 µm
/ Sartorius Nemčija
mikrotitrski čitalec BioTek Synergy HT
Biotek ZDA
orbitalni stresalnik MIR-S100 Sanyo Japonska
peristaltična črpalka Pump P-1 Pharmacia Biotech Švedska
pH-meter pH 1100L
pHenomenal
VWR ZDA
pipete (0,5-10, 10-100, 100- 1000 μL)
Research plus Eppendorf Nemčija
precizna tehtnica Exacta 610 EB Tehtnica Slovenija
sistem za pregled in fotografiranje gelov
G-box Syngene ZDA
sonikator QSonica Sonicators
spektrofotometer NanoDrop ND-
1000
NanoDrop Technologies
ZDA
spektrofotometer UV/VIS Lambda BIO+ Perkin Elmer ZDA sterilni vakuumski filtrski
sistem za enkratno uporabo
Stericup Quick Release
Merck KGaA Nemčija
stresalnik ADV 350 VWR ZDA
ultra nizko temperaturni zamrzovalnik
MDF-U55V-PE Panasonic Japonska
ultrazvočna kadička Sonis 3 Iskra PIO Slovenija
vakuumska črpalka V-500 Büchi Švica
vibracijski mešalnik Vibromix 10 in 104EV
Tehtnica Slovenija
vir napetosti elektroforezne kadičke
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories ZDA
zaščitna mikrobiološka komora z laminarnim pretokom zraka
MC12-2 in LFVP12
Iskra PIO Slovenija
3.1.2. Reagenti
Preglednica III: Uporabljeni reagenti.
reagenti proizvajalec država
akrilamid/bis-akrilamid (37,5:1) 40 % Sigma-Aldrich ZDA
amonijev persulfat (APS) Promega ZDA
amonijev sulfat Carlo Erba Reagents Španija
barvilo Comassie modro Lonza ZDA
biotiniliran HCF-1 Ser Katedra za farmacevtsko kemijo, UL FFA
CaCl2 Sigma-Aldrich ZDA
ditiotreitrol (DTT) Sigma-Aldrich ZDA
etanol 96 % Stella Tech, ECP Slovenija
glicerol Sigma-Aldrich ZDA
glicin Sigma-Aldrich ZDA
HCl Fluka Chemie Švica
HEPES Sigma-Aldrich ZDA
hitinske paramagnetne kroglice New England BioLabs ZDA
imidazol Sigma-Aldrich ZDA
izopropanol J. T. Baker ZDA
izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) Sigma-Aldrich ZDA
kalijev acetat Alfa Aesar Nemčija
kanamicin Sigma-Aldrich ZDA
kloramfenikol Sigma-Aldrich ZDA
KOH Sigma-Aldrich ZDA
kvasni ekstrakt Sigma-Aldrich ZDA
LB agar Carl Roth GmbH + Co. Nemčija
Luria-Bertanijevo gojišče (LB) v prahu Sigma-Aldrich ZDA
MgCl2 Sigma-Aldrich ZDA
MnCl2 Sigma-Aldrich ZDA
N,N,N',N' – tetrametiletilendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich ZDA
NaCl Honexwell Nemčija
NaOH Sigma-Aldrich ZDA
natrijev dodecil sulfat (SDS) Calbiochem Milipore ZDA
ocetna kislina Gram mol Hrvaška
proteinski označevalec velikosti ProSieve Color Protein Marker, Lonza
ZDA
reagent za ekstrakcijo proteinov (BugBuster®) EMD Millipore Corp ZDA s streptavidinom prevlečene magnetne
kroglice
Trilink BioTechnologies ZDA
tetraciklin Sigma-Aldrich ZDA
tripton Sigma-Aldrich ZDA
tris (tris(hidroksimetil)aminometan) VWR ZDA
tris HCl Sigma-Aldrich ZDA
Tween® 20 (polisorbat 20) Merck KGaA Nemčija
UDP-GlcNAc-BODIPY Katedra za farmacevtsko kemijo, UL
FFA
3.1.3. Komplet
Preglednica IV: Uporabljen komplet.
komplet proizvajalec država
komplet za izolacijo plazmida GenElute HP Plasmid Miniprep Kit
Sigma-Aldrich ZDA
3.1.4. Pufri in raztopine
Pufre, namenjene za uporabo na kromatografskem sistemu, smo pripravili z ultračisto vodo in jih z vakuumsko črpalko filtrirali skozi membranske filtre iz acetil celulozne z velikostjo por 0,45 µm. Vse ostale pufre in raztopine smo pripravili z bidestilirano vodo (ddH2O).
Vsem pufrom smo uravnavali pH z 1 M HCl ali 1 M NaOH. Elektroforeznemu pufru za SDS-PAGE pH ne uravnavamo, pufru CCMB80 pa pH lahko uravnavamo le s KOH.
Preglednica V: Sestava uporabljenih pufrov in raztopin.
pufer/raztopina sestava
10× nanašalni pufer pH 7,4
0,5 M HEPES 5 M NaCl
1 mM DTT (pred uporabo) pufer A – pufer za vezavo in spiranje
pH 7,4
50 mM HEPES 500 mM NaCl
1 mM DTT (pred uporabo) pufer B – pufer za elucijo
pH 7,5
50 mM HEPES 500 mM NaCl 250 mM imidazol
1 mM DTT (pred uporabo) pufer C1 (HIC)
pH 7,4
50 mM Tris
1 M amonijev sulfat 150 mM NaCl
1 mM DTT (pred uporabo) pufer D1 (HIC)
pH 7,4
50 mM Tris
1 mM DTT (pred uporabo) pufer C2 (HIC)
pH 7,4
50 mM HEPES 0,7 M amonijev sulfat 500 mM NaCl
1 mM DTT (pred uporabo) pufer D2 (HIC)
pH 7,4
50 mM HEPES
1 mM DTT (pred uporabo)
pufer za lizo celic pH 8,04
150 mM NaCl 0,1 mM EDTA 50 mM Tris HCl
2,5 mM DTT (pred uporabo) Tris · HCl
pufer za zbiralni gel pH 6,8
pufer za ločevalni gel pH 8,8 (SDS-PAGE)
1,5 M Tris
nanašalni pufer za SDS-PAGE (6×LD) pH 6,8
125 mM Tris 20 % (v/v) glicerol 4 % (m/v) SDS
0,005 % (m/v) bromfenol modro elektroforezni pufer za SDS-PAGE
pH 8,3
25 mM Tris 192 mM glicin 0,1 % (m/v) SDS pufer CCMB80
pH 6,4
10 mM K-acetat 80 mM CaCl2
20 mM MnCl2
10 mM MgCl2
10 % glicerol 1×PBS
pH 7,4
10 mM Na2HPO4
1,8 mM K2HPO4
137 mM NaCl 2,7 mM KCl
reakcijski pufer 1×PBS
12,5 mM MgCl2
1 mM DTT (pred uporabo) raztopina za fiksiranje 30 % (v/v) etanol 96 %
10 % (v/v) ocetna kislina
3.1.5. Bakterijska gojišča
Gojišča smo pripravili po recepturi v Preglednici VI. Tekočim gojiščem smo pH uravnali z 1 M HCl ali 1 M NaOH. Vsa gojišča smo sterilizirali v avtoklavu z 20 minutnim
programom pri 121 °C in nadtlaku 1 bar. Za pripravo trdnega gojišča smo v komori z laminarnim pretokom zraka v petrijevke vlili približno 15 mL gojišča, ko je bilo le-to ohlajeno na 55 °C, kar smo spremljali z infrardečim termometrom. Trdna gojišča smo po strditvi shranili pri 4 °C, tekoča gojišča pa pri sobni temperaturi.
Preglednica VI: Sestava bakterijskih gojišč.
gojišče komponenta količina za 400 mL
tekoče gojišče LB LB v prahu 8 g
pH 7,4 ddH2O do 400 mL
trdno gojišče LB agar gojišče LB agar 14 g
ddH2O do 400 mL
tekoče gojišče 2×TY tripton 6,4 g
pH 7,4 kvasni ekstrakt 4 g
NaCl 2 g
ddH2O do 400 mL
Bakterijska gojišča smo uporabljali za selekcijo bakterij po transformaciji s tujo DNA, ki vsebuje zapis za odpornost proti antibiotiku.
3.1.6. Geli
Za ločevanje proteinov smo uporabili metodo SDS-PAGE in pripravili poliakrilamidne gele, ki so bili sestavljeni iz 8 % ločevalnega in 5 % zbiralnega gela po recepturi, navedeni v Preglednici VII. Najprej smo pripravili zmes 8 % ločevalnega gela in ga vlili med distančno in stekleno ploščo z razmikom 0,75 mm. Takoj zatem smo na gladino vlili 1 mL izopropanola, ki je preprečeval neposredni stik gela z zrakom, s tem dostop kisika, ki bi zaviral polimerizacijo akrilamida. Po 45 min se je gel strdil, nato smo izopropanol odlili, prostor sprali z bidestilirano vodo in obrisali do suhega s filtrnim papirjem. Nato smo pripravili zbiralni gel, ga vlili do vrha steklenih plošč in vstavili glavniček za 15 vdolbinic.
Gel je polimeriziral 45 min pri sobni temperaturi, nato smo ga ovitega v mokre papirnate brisačke shranili v neprodušno zaprti vrečki v hladilniku.
Preglednica VII: Sestava 8% ločevalnega ter 5 % zbiralnega gela za SDS-PAGE.
gel komponenta količina za en gel 0,75
mm
8 % ločevalni gel mQ H2O 2,5 mL
1,5 M Tris·HCl (pH 8,8) 1,25 mL 40 % akrilamid/bis-akrilamid
37,5:1
1,0 mL
10 % SDS 50 µL
10 % APS 50 µL
TEMED (dodali zadnjega) 3 µL
5 % zbiralni gel mQ H2O 1,0 mL
1,5 M Tris·HCl (pH 6,8) 195 µL 40 % akrilamid/bis-akrilamid
37,5:1
188 µL
10 % SDS 15 µL
10 % APS 15 µL
TEMED (dodali zadnjega) 1,5 µL
3.2. Biološki material
3.2.1. Plazmida
3.2.1.1. Plazmid pET28b(+) Ekspresijski plazmid pET28b(+) spada v skupino pET28a-c(+) bakterijskih ekspresijskih sistemov, ki zapisujejo N-končno konfiguracijo His•Tag/trombin/T7•Tag in ponujajo možnost zaporedja His•Tag tudi na C-končnem delu rekombinantnega proteina.
Plazmid pET28b je namenjen izražanju vstavljenega gena v bakterijskih celicah, ki nosijo v genomu zapis za RNA-polimerazo bakteriofaga T7. Ta je pod nadzorom promotorja lacUV5, ki ga aktiviramo z
Slika 5: Genska karta plazmida pET28b(+). Prisotni sta mesti ORI in MCS, pozitivni selekcijski označevalec je gen Kan, ki omogoča odpornost proti kanamicinu.
Povzeto po (40).
dodatkom IPTG. Nadzor nad izražanjem gena, vstavljenega v vektor pET28, izvaja promotor T7lac, ki se nahaja pred območjem z več mesti za kloniranje (MCS), s čimer je omogočena dobra regulacija izražanja tarčnega gena. Plazmid vsebuje pozitivni selekcijski označevalec Kan, ki omogoča odpornost proti kanamicinu (40,41).
Proizvajalec: Merck Millipore, Novagen, Nemčija
Plazmid pET28b-OGT smo prejeli od Katedre za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani.
3.2.1.2. Plazmid pRARE2 pRARE so družina plazmidov, ki nosijo gene za tRNA, komplementarne vsem redkim kodonom (takih, ki kodirajo Arg, Ile, Gly, Leu in Pro, razen Arg CGA). S to serijo plazmidov so transformirani ekspresijski sevi E.
coli RosettaTM (35). Plazmid pRARE2 kodira tRNA za sedem redkih kodonov AUA, AGG, AGA,
CUA, CCC, GGA in CGG ter zapis za odpornost proti kloramfenikolu (42). Celotna kaseta pRARE2 tRNA je dodana tudi plazmidoma pLysS in pLacI, s čimer so pripravili plazmida pLysSRARE2 oz. pLacIRARE2 (35).
Proizvajalec: Merck Millipore, Novagen, Nemčija 3.2.2. Bakterijski sevi
3.2.2.1. E. coli NiCo21(DE3)
Bakterijski sev E. coli NiCo21(DE3) je derivat široko uporabljenega ekspresijskega seva E. coli BL21(DE3), ki ga uporabljamo za izražanje genov pod nadzorom bakteriofagnega promotorja T7. NiCo21(DE3) je zasnovan z namenom izboljšanja čistote rekombinantnih proteinov, ki so kontaminirani z endogenimi proteini E. coli. Slednji izkazujejo afiniteto do dvovalentnih ionov niklja in kobalta predvsem zaradi prisotnosti ostankov histidina.
Ekspresijski sev predstavlja rešitev pri zmanjševanju omenjenih nečistot, ker se
Slika 6: Genska karta plazmida pRARE2. Plazmid oskrbuje celico s tRNA za sedem redkih kodonov (modro), njegov pozitivni selekcijski označevalec je gen Cam, ki omogoča odpornost proti kloramfenikolu.
Povzeto po (35).
