DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Špela Pok

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJA

Preizkus ekstrakcije benzotriazolov iz tal z uporabo vroče vode

DIPLOMSKO DELO

Špela Pok

M

ENTORICA

: prof. dr. Helena Prosen

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Špela Pok sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Preizkus ekstrakcije benzotriazolov iz tal z uporabo vroče vode.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Helene Prosen;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007));

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 22. 6. 2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Zahvala

Svoje diplomsko delo sem opravljala na analizni katedri Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo pod vodstvom mentorice prof. dr. Helene Prosen, zato gre njej največja zahvala. In sicer za vse nasvete, pomoč in vedno odprta vrata pisarne za kakršnakoli vprašanja.

Zahvaljujem se tudi Aleksandru Kravosu za vso pomoč pri eksperimentalnem delu in raznorazne debate o kemijskih tematikah.

Najlepša hvala tudi moji družini in fantu, za vso podporo, potrpežljivost in spodbude, četudi niste razumeli vseh mojih problemov. Navsezadnje pa hvala tudi mojim prijateljem, za vse vaše nasvete, smeh in popestritev študijskih dni, ter, da ste preprosto bili z mano na tej poti.

(8)

(9)

Preizkus ekstrakcije benzotriazolov iz tal z uporabo vroče vode Povzetek:

Benzotriazoli (BZ) so heterociklične spojine, ki jih v vsakdanjem življenju in industriji najdemo predvsem kot inhibitorje korozije ter kot UV stabilizatorje. Kot posledica vedno širših antropogenih dejavnosti so postali praktično svetovno prisotna onesnaževala. BZ so ne le strupeni za rastline in vodne organizme, temveč so tudi endokrini motilci, potencialni karcinogeni, nekateri BZ pa se tudi bioakumulirajo.

Z naraščajočo onesnaženostjo pa iščemo tudi nove, bolj zelene metode za delo v kemiji.

Eno od okolju najbolj prijaznih topil je seveda voda, ki pa pri povišani temperaturi kaže drugačne lastnosti kot pri normalni. Od polarnega topila lahko tako pod ekstremnimi pogoji postane tudi nepolarna, kar pa se z dobrimi rezultati že izkorišča v okoljski znanosti.

V svoji diplomski nalogi sem preizkusila ekstrakcijo z vročo vodo (HWE), pri čemer sem iz tal ekstrahirala osnoven benzotriazol (BTZ). Glede na pregled literature, metoda za ta onesnaževala še ni bila aplicirana, zato sem skozi poskuse iskala optimalne parametre.

Spreminjala sem maso tal, čas kuhanja, količino ekstrakcijskega topila in njegov pH, vendar nobena od teh variacij ni signifikantno spremenila izkoristka. Tako sem na podlagi njegove naloge antikorozijskega sredstva sklepala, da je BTZ v samem vzorcu kompleksiran s kovinskimi ioni. To je torej razlog, da kljub optimizaciji, rezultati niso boljši. V zadnjem poskusu sem vodi dodala EDTA, kateri je služil kot dober ligand za kovinske ione v tleh. S tem je izpodrinil analit, ki je posledično postal prost in na voljo za ekstrakcijo.

Ker sem uporabila dokaj preprosto variacijo HWE – kuhanje v vroči vodi v čaši, pokriti z urnim steklom, sem po ekstrakciji izvedla še dodatno čiščenje z že optimizirano ekstrakcijo na trdno fazo (SPE). Vse vzorce sam analizirala s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, sklopljeno z detektorjem na niz diod (HPLC-DAD) po vnaprej izpopolnjeni metodi.

Ključne besede: benzotriazol, ekstrakcija z vročo vodo, ekstrakcija na trdno fazo, tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

(10)

(11)

Experimental extraction of benzotriazoles from soil using hot water Abstract:

Benzotriazoles (BZ) are heterocycles, that can be found in households and industry as corrosion inhibitors and UV stabilizers. As a consequence of ever-growing anthropogenic activities, they have become globally present pollutants. Not only are BZ toxic for plants and aquatic organisms, but they are also endocrine disrupting chemicals and potential carcinogens. Even furthermore – some of BZ can bioaccumulate.

With increasing pollution, we seek newer and even greener methods for laboratory work.

One of the most environmentally friendly solvents is of course water, which shows altered properties at elevated temperatures. From a polar solvent, it can become nonpolar under extreme conditions, and that is already used in environmental science.

In this work, I tested hot water extraction (HWE), whereby my goal was to determine the simplest benzotriazole (BTZ) in soil. According to available literature, mentioned method hasn’t been applied to this pollutant yet, so I sought the optimal extraction parameters. I varied the soil mass, time of cooking, amount of extraction solvent and its pH, however, none of the variations significantly changed the efficiency. So, on the basis of its anticorrosive function, I concluded that BTZ forms chelates with metal ions in soil and that this is the reason for my poorer results. Therefore, I added good chelating agent – EDTA, in my final experiment. It displaced the analyte, which then became free and available for extraction.

Because a simple variation of HWE was used – cooking in hot water in a beaker covered with a watch glass, I added an additional purification step with an already optimized solid- phase extraction (SPE). All samples were then analyzed with high-performance liquid chromatography with a diode-array detector (HPLC-DAD) by a previously developed method.

Keywords: benzotriazole, hot water extraction, solid-phase extraction, high-performance liquid chromatography (HPLC)

(12)

(13)

Kazalo

1 Uvod ... 1

2 Teoretične osnove ... 3

2.1 Benzotriazoli ... 3

2.1.1 Uporaba BZ ... 4

2.1.2 Prisotnost v okolju ... 4

2.2 Metode za določanje BZ ... 5

2.2.1 Kromatografske metode ... 5

2.2.2 Ekstrakcijske metode ... 6

2.3 Voda kot zeleno topilo ... 7

2.4 Dodatno čiščenje ekstrakta ... 10

3 Namen dela ... 13

4 Eksperimentalni del ... 15

4.1 Uporabljene kemikalije... 15

4.1.1 Standardi ... 15

4.1.2 Topila in mobilne faze ... 15

4.2 Instrumenti in aparature ... 15

4.3 Vzorec ... 16

4.4 Priprava standardnih raztopin ... 16

4.4.1 Priprava osnovne standardne raztopine BTZ... 16

4.4.2 Priprava raztopin za umeritveno premico ... 16

4.4.3 Priprava raztopin za spiranje pri SPE ... 16

4.5 Priprava realnega vzorca ... 17

4.6 Ekstrakcija z vročo vodo ... 17

4.7 Ekstrakcija na trdno fazo ... 18

4.8 HPLC-DAD ... 19

5 Rezultati in razprava ... 21

5.1 Preizkus HPLC-DAD ... 21

5.1.1 Izbira primernega topila... 21

5.1.2 Priprava umeritvenih krivulj ... 22

5.2 Preizkus SPE ... 23

(14)

(15)

5.3 Metoda standardnega dodatka ... 24

5.4 Primerjava variacij postopka ekstrakcije tal ... 25

5.4.1 Vpliv časa kuhanja, mase tal in števila ekstrakcij ... 25

5.4.2 Ekstrakcija s hladno vodo ... 26

5.4.3 Vpliv pH medija ... 26

5.4.4 Vpliv dodatka EDTA ... 26

6 Zaključek ... 29

7 Literatura ... 31

(16)

(17)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

APCI kemijska ionizacija pri atmosferskem tlaku (ang. atmospheric pressure

chemical ionization)

BCF biokoncentracijski faktor (ang. bioconcentration factor)

BTZ benzotriazol (osnoven)

BZ benzotriazoli (kot skupina spojin)

DAD detektor z nizom diod (ang. diode-array detector)

DLLME disperzivna tekočinska mikroekstrakcija (ang. dispersive liquid-liquid

microextraction)

ECD detektor na zajetje elektronov (ang. electron-capture detector)

EDTA etilendiaminotetraocetna kislina (ang. ethylenediaminetetraacetic acid)

EI elektronska ionizacija (ang. electron ionization)

EOC novo ali emergentno onesnaževalo (ang. emerging organic contaminant) ESI elektrorazprševalna ionizacija (ang. electrospray ionization)

FID detektor s plamensko ionizacijo (ang. flame-ionization detector)

FPSE sorptivna ekstrakcija na tkanino (ang. fabric phase sorptive extraction) GC plinska kromatografija (ang. gas chromatography)

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločjivosti (ang. high-performance liquid

chromatography)

HWE ekstrakcija z vročo vodo (ang. hot water extraction) LC tekočinska kromatografija (ang. liquid chromatography) LLE ekstrakcija s topili (ang. liquid-liquid extraction)

MAE mikrovalovna ekstrakcija (ang. microwave assisted extraction)

MQ ultrafiltrirana voda (ang. MilliQ)

MS masna spektrometrija (ang. mass spectrometry)

MS/MS tandemska masna spektrometrija

NPD dušik-fosforjev detektor (ang. nitrogen-phosphor detector)

PHWE ekstrakcija z vročo vodo pod povišanim tlakom (ang. pressurized hot water

extraction)

PLE ekstrakcija s topili pri povišanem tlaku (ang. pressurized liquid extraction) QuEChERS (ang. quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)

SBSE sorptivna ekstrakcija na mešalo (ang. stir-bar sorptive extraction) SCWE ekstrakcija s superkritično vodo (ang. supercritical water extraction) SFE ekstrakcija s superkritičnim fluidom (ang. supercritical fluid extraction) SPE ekstrakcija na trdno fazo (ang. solid-phase extraction)

SPME mikroekstrakcija na trdno fazo (ang. solid- phase microextraction) UAE ultrazvočna ekstrakcija (ang. ultrasound-assisted extraction)

(18)

(19)

Š. Pok: Preizkus ekstrakcije benzotriazolov iz tal z uporabo vroče vode

1

1 Uvod

Vse večja želja po modernizaciji in ustvarjanju udobnejšega življenja je s seboj prinesla veliko napredka na področju znanosti in tehnologije. Preizkušajo se nove ideje, izdelujejo in izboljšujejo se materiali, razvoj se pozna praktično na vseh aspektih človekovega delovanja. Vsa ta industrija, s svojim rastočim številom produktov, pa s seboj prinese tudi onesnaženje, ki se ga ljudje bolj ali manj zavedamo.

Poleg klasičnih organskih onesnaževal se v zadnjih desetletjih vse bolj osredotočamo tudi na tako imenovana nova oziroma emergentna onesnaževala (EOC). To so sintetično ali naravno pridobljene spojine, ki pa velikokrat še niso regulirane z zakoni. Pozornost so pritegnile s svojim negativnim vplivom na človeka in okolje. Najdemo jih lahko tako v gospodinjstvih kot tudi v industrijski dejavnosti, hkrati pa še nimamo ustreznega načina, ki bi le-te škodljive snovi odstranil iz okolja. Glavni cilj številnih znanstvenikov danes je na eni strani, kako zmanjšati negativne vplive antropogenih dejavnikov, in na drugi strani, kako očistiti naravo ter vanjo povrniti ravnotežje [1].

V tem oziru pa se prilagaja tudi sam način dela – iščejo se vedno novi, bolj zeleni načini, ki bi, če se osredotočimo le na področje kemije, zmanjšali količino odpadnega materiala in kemikalij. Sodobni postopki se tako usmerjajo k eksperimentom v manjšem merilu ali pa k uporabi čim manj toksičnih spojin [1].

Kot ena takih metod se uporablja ekstrakcija z vročo vodo, kot naravi najbolj domačim in s tem neškodljivim topilom. V svoji diplomski nalogi sem hotela preizkusiti ta postopek, in sicer iz vzorca tal, ki je vseboval enega od predstavnikov emergentnih onesnaževal – benzotriazol.

(20)

2

(21)

3

2 Teoretične osnove

2.1 Benzotriazoli

Benzotriazoli (BZ) so heterociklične spojine, sestavljene iz dveh obročev – benzenskega in petčlenskega. Slednji si dva ogljika deli z benzenom, ostali trije atomi pa so dušiki.

Poznamo dve tavtomerni obliki osnovnega benzotriazola (BTZ), in sicer 1H- in 2H- benzotriazol, ki sta prikazani na Sliki 1. Pri sobni temperaturi je 1H- oblika prevladujoča (99,9 %) [2], kar je posledica predvsem visokega dipolnega momenta (4,3 D za 1H- in 0,38 D za 2H- glede na teoretične izračune) in tako boljše interakcije s topilom oziroma boljše solvatacije. Enake ugotovitve so potrdili tudi z spektroskopskimi in kristalografskimi študijami [3].

Slika 1: Tavtomerni obliki benzotriazola (1H- na levi in 2H- oblika na desni)

Zaradi ekvivalentnosti vezi med dušikovimi atomi, bi bila struktura BTZ bolj pravilno narisana v resonančni obliki (Slika 2). Proton eksperimentalno dokazano hitro migrira med dušikoma na mestih 1 in 3 ter tako v nobenem trenutku ni popolnoma vezan na katerega koli od njiju [4].

Slika 2: Resonančna oblika BTZ

Posledično je BTZ lahko tako elektron donor kot tudi akceptor. Zaradi prostega elektronskega para na vsakem dušiku torej deluje kot šibka baza (pKa = 8,38), ob oddaji mobilnega vodika pa ima vlogo šibke kisline [3], [5]. Njegove lastnosti so predstavljene v Tabeli 1. BTZ je vsestranska spojina, topna v velikem številu organskih topil, kljub temu pa njegov aromatski obroč kaže veliko termično in kemijsko stabilnost. Poleg tega

(22)

4

pa v primerjavi z ostalimi sorodnimi spojinami ni drag in je enostaven za sintezo. Zaradi vseh zgoraj naštetih lastnosti je BTZ široko uporabljen [3].

Tabela 1: Lastnosti BTZ izmerjene pri T = 25 °C, pH = 7 in tlaku 101,3 Pa (podatki so povzeti po podatkovni bazi SciFinder)

Molska masa 119,12 g/mol T tališča 98,5 °C T vrelišča 359,2 °C

Gostota 1,36 g/cm³ Topnost 21 g/L Parni tlak 3,23 * 10^-3 Pa

pKa 8,38

log Kow 1,44

BCF 7,03

2.1.1 Uporaba BZ

Nepolarne benzotriazole predstavljajo večinoma hidroksifenil derivati in se uporabljajo predvsem kot UV stabilizatorji v plastičnih materialih, produktih za osebno nego in kozmetiki [6], [7].

Polarni benzotriazoli, ki med drugim vključujejo osnovni BTZ, kloro-, metil- in hidroksi derivate [7], pa so se zaradi svoje stabilne koordinacije z nekaterimi kovinami (npr. z bakrom) uveljavili kot antikorozijska sredstva in v manjši meri tudi kot možni reagenti za analizno določevanje srebra. Najdemo jih še v tekočinah proti zmrzovanju, hladilnih sistemih, v detergentih za pomivanje posode in belilnih sredstvih [4], [8].

Benzotriazoli so široko uporabni tudi v sintezni organski kemiji [3], potrjena je bila tudi njihova raba v tekstilni industriji [9] in v procesu razvijanja fotografskih filmov [10].

Zaradi specifičnih bioloških lastnosti nekaterih derivatov, pa so le-ti prisotni tudi v farmacevtski industriji [2], [3].

2.1.2 Prisotnost v okolju

Zaradi svojih fizikalno-kemijskih lastnosti so BZ zelo mobilni predvsem v vodnih sistemih, kjer se ne (bio)razgradijo, čistilne naprave pa jih tudi le pomanjkljivo odstranijo (eliminacija BTZ je le 13-62 % [7]). V površinske vode poleg različnih industrijskih odplak pridejo tudi s prenosom neposredno preko kože (različne kreme, losjoni itd.) med kopanjem v površinskih vodah [6], [8]. S sorbiranjem se del BZ odloži tudi v prst in sedimente rek - v tla se odlagajo tako nepolarni kot tudi polarni BZ, kar je morda v nasprotju s pričakovanji, glede na ostala organska onesnaževala. Velik delež vnosa BZ v okolje predstavlja tudi transport, povišane koncentracije so bile najdene predvsem v tleh okoli letališč, in pa uporaba blata iz čistilnih naprav za kmetijske namene [9].

(23)

5

Vodni krog BZ prenese v pitno vodo, zaznane pa so bile tudi povišane koncentracije v živalskih vrstah (predvsem v ribah), iz česar lahko sklepamo, da se BZ bioakumulirajo [9]. V primeru človeka pa je prisotnost teh onesnaževal v urinu najprej potrdila večina azijskih držav, za njimi pa še Grčija, ZDA, itd. [11]. BZ so torej svetovno prisotni EOC- ji, kar je potrdil tudi Loos s sodelavci. Le-ti so leta 2010 v 23 evropskih državah izvedli raziskavo podtalnic. V njih so preverjali prisotnost izbranih organskih onesnaževal, med drugim tudi BTZ. Pogostost njegovega pojavljanja je bila 53 %, najvišja koncentracija pa je kar osemkrat presegla mejo 0,1 μg/L (to je sicer glede na evropski standard kvalitete podtalnice meja za pesticide) [12].

Ameriška agencija za varstvo okolja je benzotriazole leta 2008 uvrstila na seznam emergentnih organskih onesnaževal [9]. Danes se le-ti obravnavajo kot strupeni za rastline in vodne organizme, kot endokrini motilci, mutageni pri bakterijah, nepolarni BZ pa imajo še že omenjeno dodatno sposobnost bioakumulacije. Prav tako pa se BTZ že omenja kot možen človeški karcinogen [13].

2.2 Metode za določanje BZ

2.2.1 Kromatografske metode

Najbolj uporabljeni metodi za določanje BZ sta plinska (GC) in tekočinska kromatografija (LC) v kombinaciji z visoko selektivno in senzitivno masno spektrometrijo (MS) oziroma s tandemsko masno spektrometrijo (MS/MS). Polarni BZ so v večini nizko hlapni, zato je LC preferenčna, pri določevanju nehlapnih oziroma slabo hlapnih BZ pa se GC in LC uporabljata v približno enaki meri [5], [10].

BZ se največkrat določa skupaj s sorodnimi spojinami, kot so benzotiazoli in benzensulfonamidi. Pogoji so tako optimizirani glede na vse preiskovane spojine, kar lahko posledično da nižje izkoristke posamezne izvzete spojine [11], [14]. V redkejših analizah izključno BZ pa polarne in nepolarne analite zaradi njihovih različnih lastnosti večinoma določujejo ločeno [13].

Tekočinska kromatografija

Pri sami analizi je potrebno upoštevati visoko polarnost obravnavanih spojin in pa možnost prisotnosti izomernih oblik. Tako so se kot najbolj primerne izkazale C18 kolone in take s fenilno stacionarno fazo, preizkušene ter dokazano učinkovite pa so bile tudi C8

kolone. Večina mobilnih faz je zasnovanih na večji vsebnosti vodne faze v začetku in postopnem večanju deleža organske faze med analizo [8].

Poleg že omenjenega najbolj pogosto uporabljenega MS detektorja, so v uporabi še UV- Vis in pa fluorescenčni detektorji, vendar so pogosto njihove meje zaznave previsoke za določanje v kompleksnih matricah oziroma večina BZ sploh ne fluorescira [6], [8]. V

(24)

6

okviru MS sta najbolj v uporabi elektrorazprševalna ionizacija (ESI) in kemijska ionizacija pri atmosferskem tlaku (APCI), pri čemer je ESI bolj občutljiv za polarne analite, APCI pa je manj dovzeten za matrične vplive [6], [15].

Plinska kromatografija

Razlog manj pogoste uporabe GC napram LC je problematičnost v iskanju ustrezne GC kolone za separacijo večjega števila BZ naenkrat. Za še najbolj uporabno se je izkazala monolitska silikagelna kolona modificirana s 5 % difenil/95 % polidimetilsiloksanom [8].

Kot detektor je največkrat omenjen MS z elektronsko ionizacijo (EI), vendar pa je to trda tehnika ionizacije, ki nam da praktično samo fragmente z nizko maso [8]. V izogib temu mnogi uporabljajo GC sklopljen z detektorjem s plamensko ionizacijo (FID), detektorjem na zajetje elektronov (ECD) ali pa celo dušik-fosforjev detektor (NPD) [6].

GC-MS se večinoma uporablja brez dodatne derivatizacije analitov, se pa njena glavna slabost pokaže na nepolarnih stacionarnih fazah, kjer je retencija analitov slaba, na nekaterih polarnih fazah pa vrhovi celo izginejo [13].

2.2.2 Ekstrakcijske metode

Ker BZ najdemo v okolju tipično v koncentracijah ng/L [8], in ker imajo okoljski vzorci kompleksne matrice, je pred določitvijo potreben postopek ekstrakcije analita. S tem se znebimo prisotnih interferenc, hkrati pa metoda čiščenja velikokrat vzorec tudi predkoncentrira in tako ojača signal [5].

Z vidika vzorčenja spadajo tla med bolj zapletene matrice, saj so trdni vzorci po navadi manj homogeni kot tekočine ali plini. Že takoj na začetku je torej potrebno narediti dober načrt vzorčenja, tako po površini kot tudi po globini. Trdni vzorci so nato po navadi dehidrirani ali pa zmrznjeni, presejani (lahko tudi zmleti) in dobro premešani, da se zagotovi čim večja homogenost. Po potrebi se dodajo tudi zaviralci mikrobiološke aktivnosti (npr. natrijev azid) ali pa se v ta namen zniža pH [5], [8].

Po predpripravi vzorca sledi sama priprava – ekstrakcija je pri tem eden najpogostejših načinov. Le-ta temelji na porazdelitvi analita med dve fazi, zato so se glede na lastnosti vzorca razvile številne različice tehnike. Med najbolj uporabljenimi sta ekstrakcija s topili (LLE) in ekstrakcija na trdno fazo (SPE) [16].

Vodni vzorci

Problem vodnih vzorcev je velikokrat velik volumen, zato je zanje SPE s svojo robustnostjo in možnostjo velike predkoncentracije najbolj uporabna metoda. Poleg nje so za ekstrakcijo BZ v rabi tudi miniaturizirane različice – mikroekstrakcija na trdno fazo (SPME), sorptivna ekstrakcija na mešalo (SBSE) in disperzivna tekočinska mikroekstrakcija (DLLME). Mikroekstrakcijske tehnike so se izkazale za dobro rešitev,

(25)

7

če želimo zmanjšati uporabljeni volumen topila in se kot dokaj preprosti ter fleksibilni postopki vse bolj razširjene v različnih analizah. Za nepolarne BZ pa je, poleg že omenjenih metod, v uporabi še sorptivna ekstrakcija na tkanino (FPSE), ki je prav tako ena od novejših zelenih tehnik priprave vzorca. Metoda temelji na sorpciji analitov na celulozno-poliestrski substrat, ki je premazan s sol-gel sorbentom in na desorpciji s topili ter prav tako predstavlja hitro, vsestransko metodo z majhno porabo reagentov [8], [17].

Sama klasična LLE se pri BZ iz tekočih matric kljub velikim izkoristkom vse manj uporablja, saj je časovno zelo potratna in porabi velike volumne topil ter je posledično tudi med dražjimi ekstrakcijskimi tehnikami [6].

Trdni vzorci

Trdne matrice so bolj zahtevne, predvsem zaradi težko predvidljivih interakcij med delci, zato so pogosto tudi metode za določanje BZ bolj rigorozne. Uporabljajo se ultrazvočna ekstrakcija (UAE), mikrovalovna ekstrakcija (MAE), pogosto tudi LLE, predvsem v kombinaciji s povišanim tlakom (PLE), Soxhletova ekstrakcija (največkrat za biološke vzorce) in vse bolj pogosto tudi ekstrakcija s superkritičnim fluidom (SFE) – v uporabi je predvsem CO2 [6]. Kot eno od novejših metod se omenja tudi QuEChERS, metodo s topili v dveh stopnjah, ki pa ji na koncu večinoma sledi še čiščenje s SPE. V začetku je bila omenjena metoda namenjena določevanju pesticidov v hrani, kasneje so jo optimizirali za ekstrakcijo PCB-jev iz trdnih vzorcev, danes pa je uporabna že na širšem krogu onesnaževal [8], [18].

PLE se za trdne matrice omenja kot eno najbolj uporabljenih metod, uveljavila pa se je tudi njena bolj okolju prijazna različica z vodo kot topilom – ekstrakcija z vročo vodo pod tlakom (PHWE) [8].

2.3 Voda kot zeleno topilo

Voda je okolju najbolj naravno topilo - je netoksična za zdravje in naravo, najvarnejša in najcenejša, hkrati pa je njen transport že zagotovljen – vgrajen je praktično v vsako infrastrukturo. Voda v naravi obstaja v vseh treh agregatnih stanjih in predstavlja pomemben način prenosa številnih snovi. Zaradi svoje velike toplotne kapacitete je tudi pomemben temperaturni stabilizator v vseh ekosistemih. Njeno atraktivnost pa povečajo še spremenljive lastnosti ob različnih temperaturah in tlaku [19], [20].

Zanimivo je dejstvo, da se z naraščajočo temperaturo zmanjšajo viskoznost, površinska napetost in dielektrična konstanta. Slednja pove, v kakšni meri se ob prisotnosti zunanjega električnega polja prerazporedi naboj v snovi, torej je z njo praktično neločljivo povezana polarnost snovi [21]. Slika 3 prikazuje odvisnost dielektrične konstante vode v tekoči fazi od temperature. Pri 25 °C ta tako znaša približno 79, voda se tu smatra kot polarno topilo, pri 225 °C pa je znižana že na kar 32,5, kar pa je tudi približno dielektrična konstanta

(26)

8

metanola pri standardnih pogojih – polarnost se je tako signifikantno zmanjšala. Na drugi strani pa se je s tem povečal nabor spojin, ki jih lahko v vodi raztopimo [20].

Slika 3: Dielektrična konstanta vode v odvisnosti od temperature pri konstantnem tlaku 20 MPa (podatki so povzeti po [21], [22], [23])

Vroča voda tudi izboljša difuzijo analita in prenos snovi, se pa lahko zaradi povečane topnosti pojavi problem selektivnosti, termolabilne komponente bi lahko nenadzorovano razpadle, zveča pa se tudi možnost neželenih reakcij v matrici. Za delo z vodo kot topilom so torej, kot posledica vseh naštetih dejstev, najpomembnejši kompromisi in s tem optimalni pogoji dela [20].

Glede na stanje vode ekstrakcije z vodo lahko razdelimo v več skupin:

- vroča voda - temperature do 100 °C (HWE)

- vroča voda pod tlakom oziroma tudi subkritična voda – temperature od 100 do 374 °C s povišanim tlakom (PHWE)

- superkritična voda – temperature nad 374 °C (SCWE)

Z vidika ekstrakcije onesnaževal je SCWE zaradi svojih ekstremnih pogojev najmanj v uporabi. Nasproti njej pa je od vseh treh najbolj uveljavljena PHWE, saj kaže veliko boljše izkoristke kot HWE [24].

PHWE

Glavna ideja tehnike je drastično povečati temperaturo, da bi se v vodi raztopili tudi bolj nepolarni analiti. Povišan tlak pri tem zagotavlja tekoče topilo tudi nad 100 °C. Ima pa metoda svojo zgornjo mejo – kritično točko vode, ki se nahaja pri temperaturi 374 °C in tlaku 22,06 MPa. PHWE se tako imenuje tudi ekstrakcija s subkritično vodo [19], [25].

20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0

0 50 100 150 200 250 300

dielektrična konstanta

temperatura [°C]

(27)

9

Zaradi kompatibilnosti sistema, se PWHE uporablja predvsem za trdne in praškaste vzorce. Hkrati pa je potreba po novi metodi za omenjene matrice izhajala iz dejstva, da imajo tekoči in plinasti vzorci več direktno uporabnih metod, ki pa pri trdninah niso zadovoljujoče. PHWE se tako uspešno uporablja na rastlinskih materialih za ekstrakcijo bioaktivnih in hlapnih komponent (eterična olja oz. vonjave) [26], [27], za določevanje kontaminantov v hrani [20], uspešno pa so jo aplicirali tudi za določevanje v tla vezanih nepolarnih organskih onesnaževal, kot so npr. policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH- i) in poliklorirani bifenili (PCB-ji) [28], [29], [30]. Za koristno se je izkazala tudi pri ekstrakciji aminokislin, herbicidov in pesticidov iz tal [25] ter tudi za benzotriazole in njim sorodne spojine [14].

PHWE se lahko izvaja v dinamičnem ali statičnem načinu. Pri dinamični različici je poleg temperature, tlaka in časa ekstrakcije pomemben parameter tudi pretok vode, saj le-ta pod pritiskom prehaja celico z vzorcem – ravnotežje se tako vedno na novo vzpostavlja. Na drugi strani pa je statičen način praktično kuhanje vzorca pod povišanim tlakom v določenem volumnu vode, kar pomeni, da je efektivnost ekstrakcije močno odvisna od topnosti in ravnotežne konstante [25].

Potreben čas ekstrakcije in ostali optimalni faktorji se razlikujejo glede na posamezen analit, prav tako pa pri PHWE tudi ni točno določene metode dodatnega čiščenja (če je le-to sploh potrebno) ali določenega postopka priprave vzorca. Največkrat zadostuje že drobljenje ali sejanje, kar PHWE omogoča manjšo porabo časa in pogosto tudi denarja napram ostalim tehnikam ekstrakcije. Glavna omejitev omenjene metode je potreba po specifični aparaturi, v kateri se analiza izvede. Le-to je po končanem postopku tudi težko očistiti, oziroma je proces čiščenja časovno zelo potraten [20], [22].

HWE

Razvila se je kot lažje dostopna varianta PHWE, brez dodatne drage laboratorijske opreme. HWE je torej poenostavljena različica, pri kateri ne uporabljamo povišanega tlaka. Posledično smo omejeni na vrelišče vode, kar zmanjša nabor analitov za ekstrakcijo. Glavna slabost HWE je tako njen slab izkoristek, zato se v nizu številnih boljših metod ekstrakcije redko uporablja [22], [24].

V literaturi se HWE z namenom ekstrakcije onesnaževal ne omenja, se pa ta metoda kot ekstrakcija iz tal prvenstveno uporablja za pridobitev lahko razgradljivih organskih snovi, katerim nato določijo vsebnost ogljika in dušika kot parametra kvalitete tal [31], [32]. V viru [31] so metodo preizkusili tudi s hladno vodo in prišli do zaključkov, da HWE daje boljše izkoristke, ekstrakti hladne vode pa so termično bolj stabilni. Na drugi strani pa so v viru [32] na enak princip določali ogljik iz vzorcev tal različnih ekosistemov (travnik, pašnik, njiva itd.) in HWE v svojih sklepih označili kot dobro metodo za spremljanje in določevanje že majhnih sprememb znotraj ekosistema. HWE so uspešno aplicirali tudi na

(28)

10

trdne vzorce rastlin za ekstrakcijo bioaktivnih spojin, [27], [33], sta pa oba vira potrdila PHWE kot superiorno tehniko z vidika izkoristka.

Točen postopek HWE ni predpisan, čas kuhanja je lahko od nekaj minut [34] pa tudi do več ur [32], enako različna pa je tudi optimalna temperatura ekstrakcije. Nekateri postopki vsebujejo stalno stresanje, drugi pa samo občasno mešanje. Izvajajo se lahko v bučkah na gorilniku, pod refluksom ali tudi v Soxhletovi aparaturi. Predpriprava vzorca je odvisna od lastnosti le-tega, imajo pa skoraj vsi viri navedene metode dodatnega čiščenja [33], [35] .

2.4 Dodatno čiščenje ekstrakta

Pri kompleksnejših matricah so zaradi manjše selektivnosti metode čiščenja ekstrakcije zelo pogoste. Največ se uporabljajo tekočinska in gelsko-izključitvena kromatografija, odstranjevanje motečih elementov (npr. žvepla) s specifičnimi reagenti ali pa kar dodatne tehnike ekstrakcije kot so npr. sorptivne mikroekstrakcije, LLE in najpogosteje SPE [35], [36].

Glavne izmed prednosti SPE so preprostost, visoki faktorji predkoncentracije in enostavnost za avtomatizacijo. Metoda je namenjena tekočim vzorcem, ki se prečrpajo skozi kolonico s sorbentom. Le-ta idealno veže samo analit, na matrico, ki potuje čez kolonico, pa ne vpliva. [37]. Glavni štirje koraki postopka so prikazani na Sliki 4.

Slika 4: Postopek SPE (glavni koraki)

(29)

11

V prvem koraku se sorbent aktivira. Skozenj se najprej prečrpa organsko topilo, nato pa še topilo, v katerem so raztopljeni tudi vzorci, da se aktivacijsko topilo spere in na ta način ne moti nadaljnjih korakov. V drugi stopnji se na kolonico nanese vzorec. Pri tem pazimo, da se sorbent ne posuši in da je pretok skozi celotno ekstrakcijo enakomeren. Tretji korak predstavlja spiranje kolone, da se znebimo čim večjega števila šibko vezanih interferenc.

Glavno vlogo tu igra topilo, v katerem se morajo neželene spojine raztopiti in splakniti s kolone, analit pa mora ostati vezan na sorbent ter se eluirati šele v četrtem koraku ekstrakcijskega postopka [37].

Iz velikega nabora sorbentov se odločimo za pravega glede na lastnosti vzorca. V glavnem stacionarne faze delimo na normalne, reverzne in ionsko-izmenjevalne, možne pa so tudi nadaljnje modifikacije za še večjo specifičnost. Glede na količino vzorca pa se je razvilo tudi več oblik sorbentov, vse od različnih diskov pa do kolonic. Slednje so v okoljski kemiji najbolj v uporabi [7], [37].

(30)

12

(31)

13

3 Namen dela

Namen moje diplomske naloge je preizkusiti metodo ekstrakcije osnovnega 1H- benzotriazola iz tal z vročo vodo, in sicer pod normalnim tlakom.

Sama se želim opredeliti do HWE iz dveh razlogov:

1. Ta metoda ne potrebuje neke dodatne posebne opreme, in bi jo lahko opravili praktično v vsakem standardno opremljenem kemijskem laboratoriju.

2. Hkrati pa je temelj HWE voda, ki ne prispeva dodatno k količini odpadnih nevarnih snovi oziroma k onesnaženju, četudi bi porabili ogromne količine le-te.

Za ohranjanje preprostosti metode sem tako preizkusila klasično kuhanje onesnažene prsti v deionizirani vodi in uporabila še SPE kot dodatno čiščenje vzorca. Pri postopku HWE sem spreminjala čas kuhanja in količino zemlje, da bi ugotovila vpliv teh faktorjev na učinkovitost ekstrakcije. Preverila sem tudi vpliv dodatka kisline in EDTA k vodi.

(32)

14

(33)

15

4 Eksperimentalni del

4.1 Uporabljene kemikalije

4.1.1 Standardi

- Benzotriazol, analizni standard, Sigma-Aldrich, ZDA

4.1.2 Topila in mobilne faze

- MilliQ voda, Milli-Q water system, Millipore, ZDA - aceton (HPLC grade), Honeywell, ZDA

- metanol, MeOH, (HPLC grade), J. T. Baker, Velika Britanija - NH3 (25 % vodna raztopina), Sigma-Aldrich, Nemčija - HCOOH (puriss p. a.), Honeywell, Fluka, Nemčija

- acetonitril, ACN (HPLC grade), Fisher Chemical, Velika Britanija - ortofosforna kislina (85 % vodna raztopina), Carlo Erba, Francija - EDTA (že pripravljena 0,1 M raztopina)

4.2 Instrumenti in aparature

V vseh fazah svojega dela sem uporabila več bučk različnih velikosti (5 mL do 250 mL), čaše, kapalke, steklene viale, avtomatske pipete (Brand 2-20 μL, 100-1000 μL in 0,5-5 mL), merilne valje, tehtalno ladjico, spatulo, mikrogramsko tehtnico (Mettler Toledo, ZDA) in hladilnik za hlajenje kemikalij (Kirsch, 5 °C).

Pri pripravi onesnaženega vzorca vrtnih tal, kuhanju in ekstrakciji sem uporabila še večje ter manjše urno steklo, tehtnico (Intertech d.o.o., Poljska), električni grelnik, stekleno palčko, plastično žličko, trinožno stojalo, obroč z mufo, erlenmajerico, steklen lijak za filtracijo in filtrirni papir (beli, IDL GmbH & Co KG).

Za ekstrakcije SPE sem uporabila vakuumsko komoro Visiprep (Supelco, ZDA), priključeno na vodno črpalko. Pri postopku sem uporabila kolonice Oasis MAX Cartridge s 150 mg sorbenta podjetja Waters (ZDA).

Za kromatografske analize pa sem uporabila tekočinski kromatograf visoke ločljivosti z DAD detektorjem (HPLC-DAD) 1100 Series podjetja Agilent Technologies (ZDA), ki je

(34)

16

bil sestavljen iz razplinjevalca, avtomatskega vzorčevalnika, črpalke in DAD detektorja.

Pri tem sem uporabila kolono Kinetex XB-C18 (Phenomenex, ZDA), dimenzij 150 x 4,6 mm, z velikostjo delcev 5 μm in velikostjo por 100 Å.

4.3 Vzorec

Kot vzorec sem uporabila vrtna tla, ki so pred tem že bila očiščena večjih delcev, homogenizirana in potrjena kot neonesnažena.

4.4 Priprava standardnih raztopin

4.4.1 Priprava osnovne standardne raztopine BTZ

Osnovno standardno raztopino benzotriazola sem pripravila iz trdnega standarda, ki je bil predhodno hranjen v hladilniku na 5 °C. Na mikrogramski tehtnici sem natehtala približno 10 mg BTZ na aluminijasto ladjico in ga s pomočjo tehtalne ladjice prenesla v 10 mL bučko, sprala in dopolnila z acetonom do oznake. S tem sem dobila standardno raztopino BTZ s približno koncentracijo 1 mg/mL.

Po enakem postopku sem pripravila tudi osnovno raztopino s koncentracijo 1 mg/L v 250 mL bučki za preizkus SPE brez predhodne HWE, in pa raztopino standardnega dodatka koncentracije približno 50 mg/L, le da sem pri njiju uporabila MQ kot topilo namesto acetona.

4.4.2 Priprava raztopin za umeritveno premico

Z razredčevanjem osnovne standardne raztopine koncentracije 1 mg/mL sem pripravila standardne raztopine za umeritveno premico za HPLC-DAD. Njihove koncentracije so bile v prvi seriji 0,5; 1; 2; 5; 10 in 20 mg/L. Kasneje sem želela preveriti linearnost še pri nižjih koncentracijah, zato sem uporabila koncentracije 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2; 4 in 5 mg/L.

Pripravila pa sem jih v 5 in 10 mL bučkah, tako da sem odpipetirala vnaprej preračunane volumne osnovne raztopine, bučke dopolnila do oznake z MQ in dobro premešala. Vse raztopine sem nato hranila v hladilniku.

4.4.3 Priprava raztopin za spiranje pri SPE

Za metodo SPE sem poleg MeOH in MQ potrebovala tudi 5 % raztopino NH3 v MQ in 5

% HCOOH v MeOH. Obe raztopini sem pripravila v 20 mL bučkah s pipetiranjem ustreznega volumna NH3 oziroma HCOOH in redčenjem do oznake z ustreznim topilom.

Pred uporabo sem vse raztopine dobro premešala in shranila v hladilnik.

(35)

17

4.5 Priprava realnega vzorca

Na analizni tehtnici sem natehtala 25 g tal, jih enakomerno razporedila na večje urno steklo in jih s pomočjo steklene kapalke enakomerno poškropila z mešanico 25 mL MeOH in 25 mL MQ, v kateri sem predhodno raztopila približno 0,5 mg trdnega standarda BTZ. Zmes je tako vsebovala 0,02 mg BTZ na 1 g tal.

Tako onesnaženo prst sem dobro premešala s stekleno palčko in enakomerno razporedila po urnem steklu. Vzorec sem nato čez noč (približno 12 h) pustila v digestoriju, da je topilo izhlapelo. Suho mešanico sem naslednje jutro spravila v stekleni kozarec s pokrovom in dobro premešala, da sem dobila čim bolj homogeno zmes.

4.6 Ekstrakcija z vročo vodo

Poskuse sem izvajala v paralelkah in tako za en cikel porabila 2 ali 5 g pripravljenih onesnaženih tal. Potrebno maso prsti sem natehtala na analizni tehtnici.

Za sam osnovni poskus sem na električnem grelniku v čaši zavrela 100 mL deionizirane vode, dodala natehtan vzorec in kuhala 5 min. Za manjše izhlapevanje vode sem čašo pokrila z urnim steklom, vsake toliko pa sem mešanico premešala s stekleno palčko.

V naslednjih paralelah sem nato spreminjala količino tal, čas kuhanja, količino vode ali pa sem vodi dodala še drugo raztopino. Variacije poskusa so zbrane v Tabeli 2, pri čemer je poskus z dodatkom EDTA povzet po viru [38].

Tabela 2: Variacije poskusa ekstrakcije

oznaka masa tal medij čas kuhanja Opombe

a 5 g 100 mL dH2O 5 min /

b 5 g 100 mL dH2O 10 min /

c 2 g 100 mL dH2O 5 min /

d 2 g 2x50 mL dH2O 5 min /

e 2 g 100 mL dH2O / 5 min v hladni dH2O

f 2 g 100 mL dH2O / en dan v hladni dH2O

g 2 g 100 mL 2 % H3PO4 5 min /

h 2 g 100 mL 0,2 mM EDTA 5 min /

Po ekstrakciji z vročo vodo sem mešanico še vročo filtrirala skozi filtrirni papir beli trak v erlenmajerico. Dobljeni ekstrakt sem nato prenesla v 100 mL bučko in hladno raztopino dopolnila do oznake z MQ. 0,5 mL raztopine sem odvzela za direktno injiciranje v HPLC- DAD, ostalo pa prečistila s SPE.

(36)

18

4.7 Ekstrakcija na trdno fazo

Ekstrakcijsko kolono Oasis Max sem namestila na komoro, kar je prikazano tudi na Slika 5, na katero sem priključila vodno vakuumsko črpalko, da se je ustvaril ustrezen podtlak za črpanje vzorca.

Metodo sem povzela po doktorski disertaciji dr. I. Kraševec [13]. Kolono sem tako najprej kondicionirala z 10 mL MeOH in z 10 mL MQ (Slika 5a). Kot naslednjega sem čez kolono prečrpala 100 mL vzorca, takoj za njim pa še 5 mL 5 % NH3 in 2 mL MeOH, da sem sprala morebitne šibko vezane komponente, saj je bil sam analit močno vezana komponenta. Zatem je sledilo 5 min sušenja, pri čemer je bila vodna črpalka še zmeraj odprta. Na koncu sem sprostila tlak, v komoro vstavila epruveto in analit eluirala s 5 mL 5 % HCOOH v MeOH (Slika 5b). Pri celotnem postopku podtlak v komori ni smel preseči 60 kPa, hitrost padanja kapljic pa sem ohranjala približno na eni kapljici na sekundo.

(a) (b)

Slika 5: Ekstrakcija SPE. (a) kondicioniranje kolonic in (b) elucija analita

Po ekstrakciji sem topilo posušila v toku dušika, pri čemer sem si pomagala še s kopeljo tople vode (Slika 6). Analit v suhi epruveti sem nato ponovno raztopila, in sicer v 2 mL MQ. Od te količine sem 1 mL prenesla direktno v vialo in injicirala v HPLC-DAD, ostalo pa zmešala z enakim volumnom standardnega dodatka BTZ ter analizirala prav tako 1 mL raztopine. Koncentracija dodatka je bila 54,15 mg/L, pripravila pa sem ga v 10 mL bučki z raztapljanjem ustrezne mase trdnega standarda in redčitvijo do oznake z MQ.

(37)

19

Slika 6: Koncentriranje raztopine z nadpihovanjem dušika

4.8 HPLC-DAD

Kot mobilni fazi sem pri analizah uporabljala acetonitril in 0,1 % HCOOH v MQ, pri čemer je gradient naveden v Tabeli 3 in je prav tako povzet po doktorski disertaciji dr. I.

Kraševec [13]. Sama meritev je tako trajala 20 min, dodatnih 5 min pa je bilo namenjenih še čiščenju in vrnitvi razmerja mobilnih faz v prvotno stanje (kondicioniranje). Pretok mobilne faze je bil 0,7 mL/min, volumen injiciranja pa 10 μL.

Tabela 3: Gradient mobilne faze (MF1 - acetonitril, MF2 - 0,1 % HCOOH v MQ) Čas [min] % MF1 % MF2

0 5 95

0,5 15 85

13 35 65

20 100 0

Pri izbranih pogojih je bil retencijski čas BTZ-ja približno 7,2 min.

Pri UV-detekciji sem uporabljala DAD detektor, ki je omogočal merjenje absorbanc pri večjem številu valovnih dolžin, vendar sem za nadaljnje obdelave podatkov izbrala le eno – 260 nm.

(38)

20

(39)

21

5 Rezultati in razprava

5.1 Preizkus HPLC-DAD

Analizna metoda je že bila optimizirana, zato sem jo le preizkusila. Po postopku opisanem v točki 4.4.2 sem pripravila raztopine za umeritveno premico in kot topilo za standardne raztopine najprej uporabila 100 % acetonitril (Slika 7a). Le-ta se je, zaradi nesimetričnih vrhov, izkazal kot neprimeren, zato sem naslednjega preverila 100 % MQ (Slika 7b). Ker se vrhovi tu niso močno razpotegnili, in ker je bil tudi faktor simetrije dober, sem MQ kot topilo uporabila tudi v vseh nadaljnjih raztopinah, ki sem jih analizirala s HPLC.

(a) (b)

Slika 7: Vpliv topil na obliko kromatografskega vrha. (a) acetonitril in (b) MQ

5.1.1 Izbira primernega topila

Vsako spojino sem v kromatograf injicirala trikrat. Tabela 4 prikazuje izmerjene povprečne vrednosti ploščin s pripadajočimi relativnimi standardnimi odmiki v % (%RSD) za vse točke umeritvenih premic. Ker so vsi %RSD manjši od 5 % (večina je celo manjših od 2 %), lahko trdim, da je ponovljivost injiciranja in integriranja zelo dobra.

(40)

22

Tabela 4: Povprečne ploščine kromatografskih vrhov (Spovp.) z relativnimi standardnimi odmiki v % (%RSD) glede na koncentracije raztopin umeritvenih premic

 [mg/L] Spovp. %RSD 0,1 2,37 2,44 0,25 9,27 0,62 0,5 17,97 1,40 1 34,50 0,00 2 69,17 0,44 4 145,10 0,18 5 175,37 0,48

0,5 15,43 0,37 1 38,17 0,30 2 70,27 0,43 5 201,47 0,21 10 378,30 0,19 20 760,97 0,13

5.1.2 Priprava umeritvenih krivulj

Slika 8 in Slika 9 prikazujeta umeritveni premici za obe koncentracijski območji. Obe imata R²> 0,99, torej lahko trdim, da je izbrana metoda HPLC-DAD v izbranem območju linearna. Ker pa sem pri meritvah poleg variacij v koncentracijskem območju naredila še razliko v času merjenja (umeritev pri nižjih koncentracijah sem delala 14 dni kasneje), lahko trdim, da je metoda robustna in linearna vse od 0,1 mg/L do 20 mg/L. Enačbi premic imata namreč primerljiva smerna koeficienta in odseka na y osi.

Slika 8: Umeritvena premica v koncentracijskem območju od 0,1 do 5 mg/L

y = 35,572x - 0,481 R² = 0,9993

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 180,0 200,0

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

ploščina

koncentracija [mg/L]

(41)

23

Slika 9: Umeritvena premica v koncentracijskem območju od 0,5 do 20 mg/L

5.2 Preizkus SPE

Za dodatno čiščenje s SPE sem se odločila zaradi velikih matričnih vplivov in majhne koncentracije analita. Slika 10 prikazuje dva kromatograma, pri čemer sem enkrat ekstrakt injicirala takoj po HWE (črna krivulja), drugič pa sem postopku dodala še SPE (modra krivulja). Za boljšo preglednost sem intenziteto signala prvega pomnožila z 10.

Slika 10: Primerjava kromatogramov poskusa brez SPE (črn) in z SPE (moder)

Na podlagi primerjave lahko trdim, da je SPE močno povečala jakost signala. Ker pa se na sorbent ni vezal samo analit, so se skoncentrirale tudi nekatere interference. Večina

y = 38,128x - 0,5562 R² = 0,9996

0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0 600,0 700,0 800,0 900,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

ploščina

koncentracija [mg/L]

(42)

24

ostalih odstranjenih neželenih spojih pa je skrita v ozadju, zato se tu eksplicitno ne vidi njihove eliminacije z dodatno ekstrakcijo. Trdim pa lahko, da je bila SPE ustrezna in uspešna metoda čiščenja.

Vzorec je bil po HWE dokaj intenzivno rumene barve, kar najverjetneje nakazuje prisotnost huminskih snovi. Ekstrakt po SPE pa je bil bolj svetlo rumen, torej bi lahko že vizualno potrdila, da je dodatna ekstrakcija vsaj deloma očistila vzorec.

5.3 Metoda standardnega dodatka

Za dodatno uravnavanje vplivov matrice sem uporabila še metodo standardnega dodatka.

Z njim sem namreč dobila povečanje jakosti signala samo pri analitu pripadajočem retencijskem času in s tem dodatno potrdila ustrezen vrh. Hkrati pa je bila metoda standardnega dodatka moj postopek kvantifikacije.

Vsak vzorec sem po SPE razdelila na dva dela – enega sem injicirala direktno v HPLC, enemu pa sem dodala enako količino standardnega dodatka z znano koncentracijo (postopek je opisan v drugem delu točke 4.7). Pri tem se je količina analita močno povečala, kar je razvidno tudi iz vrha analita (tR = 7,2 min) na Sliki 11. Modra krivulja pri tem predstavlja sam vzorec, rdeča pa vzorec s standardnim dodatkom. S to metodo sem torej prišla do bolj stabilnih meritev oz. rezultatov. Vse izkoristke, ki so navedeni v nadaljevanju te diplomske naloge, sem nato izračunala glede na omenjeni dodatek.

Slika 11: Primerjava kromatogramov vzorca (moder) in vzorca s standardnim dodatkom (rdeč)

(43)

25

5.4 Primerjava variacij postopka ekstrakcije tal

Metoda HWE za BTZ praktično še ni bila razvita, zato sem naredila več poskusov z variiranjem parametrov. Tako sem spreminjala čas kuhanja, maso tal, volumen topila in pH, dodala pa sem tudi EDTA, kot je opisano v točki 4.6 v Tabeli 2. V spodnji Tabeli 5 so predstavljeni skupni izkoristki vseh postopkov, pri čemer se oznake navezujejo na poskuse iz omenjene Tabele 2.

Tabela 5: Izkoristki poskusov, pri čemer se oznake navezujejo na Tabelo 2

oznaka izkoristek [%]

a 58,1

b 55,7

c 65,1

d 69,5

e 50,7

f 62,4

g 63,9

h 65,0

Poskus a je bil moj osnoven eksperiment in izkoristek 58,1 % lahko že ocenjujem kot dober. Bi ga pa lahko pripisali tudi dejstvu, da je BTZ polarno in v osnovi onesnaževalo vod ter je zato uspešnost metode velika. Kljub temu, da voda z naraščajočo temperaturo izgublja na polarnosti, pa se v območju do 100 °C še zmeraj smatra kot polarno topilo in se v njej BTZ relativno dobro raztaplja.

Ponovljivost metode je bila pri eksperimentih preizkušena le pri enem od realnih vzorcev, in sicer pri poskusu c (5 min kuhanja 2 g zemlje v 100 mL dH2O). %RSD treh paralel je 2,21 %, ponovljivost je torej dobra.

5.4.1 Vpliv časa kuhanja, mase tal in števila ekstrakcij

V poskusu a sem tla kuhala 5 min, v b-ju pa čas podvojila, pri čemer so vsi ostali parametri ostali enaki. Iz primerjav izkoristkov v Tabeli 5 je razvidno, da čas kuhanja ni signifikantno vplival na ekstrakcijo. Tako majhne napake lahko namreč pripišem merilni negotovosti postopka.

Do enake ugotovitve sem prišla tudi pri ekstrakciji različnih mas tal (a 5 g in c 2 g). Kljub velikemu povečanju razmerja med maso tal in volumnom topila, večjega skoka v izkoristku ni. Iz tega sem sklepala, da je bilo že prvotno razmerje 5 g tal proti 100 mL dH2O dovolj veliko, vendar pa sem nadaljnje poskuse zaradi ekonomičnosti izvajala z manjšo izmed mas vzorca, torej 2 g.

(44)

26

Poskusa c in d se med seboj razlikujeta v količini topila. Pri c sem 2 g tal kuhala 5 min v 100 ml dH2O in prefiltrirala. V eksperimentu d pa sem enako količino tal kuhala 5 min v 50 mL dH2O, prefiltrirala in nato usedlo prst skupaj s filter papirjem še enkrat prekuhala (5 min v novih 50 mL dH2O), filtrirala ter na koncu združila oba ekstrakta. Ekstrakcije z enakim volumnom, vendar v več korakih, večinoma dajejo veliko boljše izkoristke.

Posledično sem to pričakovala tudi v tem primeru, vendar sta bila izkoristka tu prav tako primerljiva.

5.4.2 Ekstrakcija s hladno vodo

Poskusa e in f predstavljata ekstrakcijo s hladno in ne vročo vodo, pri čemer so pri e tla stala v hladni dH2O 5 min, pri f pa približno 22,5 h. Po pričakovanjih je krajši eksperiment dal nekoliko slabše rezultate, daljši pa je bil primerljiv z ostalimi. To potrjuje že prej izpostavljeno dejstvo, da je BTZ pravzaprav polarno onesnaževalo, ki se torej dobro porazdeli v polarno vodo.

5.4.3 Vpliv pH medija

Glede na to, da optimiziran postopek SPE vsebuje eluiranje analita s kislo raztopino, sem kot naslednje preizkusila vzporednico temu – kuhanje v kislem mediju, ki bi po pričakovanju glede na SPE ekstrahiral več BTZ iz tal. Uporabila sem 2 % raztopino fosforjeve kisline, saj le-ta ni hlapna in škodljiva. To variacijo predstavlja poskus g z izkoristkom 63,8 %. V primerjavi z njim ima poskus c (razen medija so vsi ostali parametri enaki) 65,1 % izkoristek – torej pH praktično ni naredil razlike.

Najbolj preprosta od razlag je, da pH medija nima vpliva na ekstrakcijo BTZ. Ker pa se je raztopina od dodatku tal začela močno peniti, bi lahko sklepala, da so bili v prsti karbonati, ki so sami po sebi bazični. S kislino je tako takoj potekla nevtralizacija. To pa bi lahko pomenilo, da je zmanjkalo kisle komponente za samo ekstrakcijo BTZ.

Navedeno možnost bi lahko ovrednotila z dodatnim poskusom z večjo vsebnostjo kisline oziroma s testiranjem pH vrednosti po kuhanju. Še eno pojasnilo pa vključuje samo funkcijo BTZ. Kot že omenjeno, je to dobro antikorozijsko sredstvo, saj se močno koordinira z nekaterimi kovinami. Verjetna razlaga je, da sem s svojimi ekstrakcijami določevala samo prosti del BTZ, in tako v vseh dosedanjih poskusih niti nisem mogla preseči določenega izkoristka. To teorijo sem nato preverila z dodatkom EDTA.

5.4.4 Vpliv dodatka EDTA

V poskusu h sem 2 g tal kuhala v 0,2 mM raztopini EDTA. Le-ta je kelatni ligand, ki se zelo efektivno veže na kovinske ione. Pri tem izpodrine prej šibko vezane BTZ, kar pomeni, da le-ti postanejo prosti. Količino uporabljenega kompleksanta za svoj poskus sem povzela po viru [38], v katerem so določevali BZ v vodnih vzorcih.

(45)

27

Primerjava izkoristkov eksperimenta h z analognim poskusom c iz Tabele 5 pokaže, da se praktično ne razlikujeta. Iz tega bi lahko sklepala, da BTZ morda le ni kompleksiran s kovinskimi ioni v tako veliki meri, kot sem sklepala v prejšnji točki. Bolj verjetna razlaga pa je, da sem pri poskusu uporabila premajhno količino EDTA. Koncentracija le-tega je bila enaka kot v viru [38], vendar so pri slednjem, kot že omenjeno, določevali onesnaževalo v vodi, kjer pa je koncentracija kovinskih ionov veliko manjša kot v prsti.

Za uspešen poskus bi tako verjetno morala zelo povečati količino EDTA.

(46)

28

(47)

29

6 Zaključek

Naraščajoča uporaba onesnaževal, hkrati pa želja po bolj zeleni kemiji, sta pripeljali do novih metod za določanje analitov v raznovrstnih matricah okolja. Ena od preprostejših in dostopnejših je ekstrakcija z vročo vodo, ki, kot že ime pove, uporablja naravi najbolj neškodljivo topilo – vodo.

V svojem diplomskem delu sem se torej želela opredeliti do HWE, ki sem jo tudi uspešno preizkusila na vzorcu tal. Ker pa je to za benzotriazole relativno neraziskana metoda, sem pri svojih poskusih skušala odkriti optimalne parametre postopka. Za primaren poskus ekstrakcije osnovnega benzotriazola sem uporabila preprosto kuhanje tal v vroči deionizirani vodi v čaši na kuhalniku in v naslednjih paralelkah spreminjala maso tal, čas kuhanja, volumen topila ter njegov pH. Ker pa noben od teh dejavnikov ni signifikantno vplival na izkoristek reakcije, sem topilu dodala še EDTA. BZ so, zaradi svoje dobre koordinacije s kovinskimi ioni, v uporabi kot antikorozijska sredstva. Namen EDTA je bil torej izpodriniti analit, ki bi s tem postal prost in na voljo za HWE ter bi bil izkoristek posledično boljši. V svojem preizkusu sem najverjetneje uporabila premajhno količino EDTA, zato teh svojih predvidevanj nisem mogla potrditi. Na tej točki se je moje eksperimentalno delo zaključilo, vsekakor pa ta poskus predstavlja dobro iztočnico za nadaljnje raziskave.

Pri svojih eksperimentih sem kot analit uporabila samo osnoven polaren BTZ, zato je področje ekstrakcije z vročo vodo vseh ostalih derivatov ostalo neraziskano. Za samo HWE prsti bi bili najbolj zanimivi nepolarni BZ, torej optimizacija pogojev eksperimentov in primerjava med njimi. Za daljše segrevanje bi lahko modificirali tudi samo aparaturo in namesto čaše z urnim steklom uporabili bučko s povratnim hladilnikom ali pa morda kar Soxhletovo aparaturo.

(48)

30

(49)

31

7 Literatura

[1] D. Yadav, S. Rangabhashiyam, P. Verma, P. Singh, P. Devi, P. Kumar, C. M.

Hussain, G. K. Gaurav, K. S. Kumar: Environmental and health impacts of contaminants of emerging concerns: Recent treatment challenges and approaches.

Chemosphere 2021, 272, 129492.

[2] V. Ji Ram, A. Sethi, M. Nath, R. Pratap: Five-Membered Heterocycles. In The Chemistry of Heterocycles; 2019; 369–374.

[3] E. Loukopoulos, G. E. Kostakis: Recent advances in the coordination chemistry of benzotriazole-based ligands. Coord. Chem. Rev. 2019, 395, 193–229.

[4] C. Sease: Benzotriazole: A review for conservators. Stud. Conserv. 1978, 23, 76–

85.

[5] S. Montesdeoca-Esponda, M. E. Torres-Padrón, Z. Sosa-Ferrera, J. J. Santana- Rodríguez: Fate and distribution of benzotriazole UV filters and stabilizers in environmental compartments from Gran Canaria Island (Spain): A comparison study. Sci. Total Environ. 2021, 756, 144086.

[6] S. Montesdeoca-Esponda, T. Vega-Morales, Z. Sosa-Ferrera, J. J. Santana- Rodríguez: Extraction and determination methodologies for benzotriazole UV stabilizers in personal-care products in environmental and biological samples.

TrAC - Trends Anal. Chem. 2013, 51, 23–32.

[7] I. Kraševec, H. Prosen: Solid-phase extraction of polar benzotriazoles as environmental pollutants: A review. Molecules 2018, 23, 1–14.

[8] P. Herrero, F. Borrull, E. Pocurull, R. M. Marcé: An overview of analytical methods and occurrence of benzotriazoles, benzothiazoles and benzenesulfonamides in the environment. TrAC - Trends in Analytical Chemistry.

2014, 62, 46–55.

[9] Z. Q. Shi, Y. S. Liu, Q. Xiong, W. W. Cai, G. G. Ying: Occurrence, toxicity and transformation of six typical benzotriazoles in the environment: A review. Sci.

Total Environ. 2019, 661, 407–421.

[10] M. G. Cantwell, J. C. Sullivan, R. M. Burgess: Benzotriazoles: History, Environmental Distribution, and Potential Ecological Effects. In Comprehensive Analytical Chemistry; Elsevier, 2015; Vol. 67, 513–545.

[11] A. G. Asimakopoulos, L. Wang, N. S. Thomaidis, K. Kannan: Benzotriazoles and benzothiazoles in human urine from several countries: A perspective on occurrence, biotransformation, and human exposure. Environ. Int. 2013, 59, 274–

281.

[12] R. Loos, G. Locoro, S. Comero, S. Contini, D. Schwesig, F. Werres, P. Balsaa, O.

Gans, S. Weiss, L. Blaha, et al.: Pan-European survey on the occurrence of selected

(50)

32

polar organic persistent pollutants in ground water. Water Res. 2010, 44, 4115–

4126.

[13] I. Kraševec: Razvoj analiznih metod za določanje benzotriazolnih spojin v okoljskih vzorcih, Doktorska disertacija, UL FKKT. 2019.

[14] P. Herrero, F. Borrull, R. M. Marcé, E. Pocurull: A pressurised hot water extraction and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry method to determine polar benzotriazole, benzothiazole and benzenesulfonamide derivates in sewage sludge. J. Chromatogr. A 2014, 1355, 53–60.

[15] A. Wick, G. Fink, T. A. Ternes: Comparison of electrospray ionization and atmospheric pressure chemical ionization for multi-residue analysis of biocides, UV-filters and benzothiazoles in aqueous matrices and activated sludge by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2088–

2103.

[16] A. T. Bell: Chemistry and chemical engineering; 1997; Vol. 52.

[17] N. Azwanida: A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants, Principle, Strength and Limitation. Med. Aromat. Plants 2015, 04, 3–8.

[18] D. Megson: Polychlorinated biphenyls, 3rd ed.; Elsevier Inc., 2019.

[19] M. Plaza, M. L. Marina: Pressurized hot water extraction of bioactives. TrAC - Trends Anal. Chem. 2019, 116, 236–247.

[20] M. Castro-Puyana, M. L. Marina, M. Plaza: Water as green extraction solvent:

Principles and reasons for its use. Curr. Opin. Green Sustain. Chem. 2017, 5, 31–

36.

[21] C. G. Malmberg, A. A. Maryott: Dielectric constant of water from 0 to 100 C. J.

Res. Natl. Bur. Stand. (1934). 1956, 56, 1.

[22] J. Zhang, C. Wen, H. Zhang, Y. Duan, H. Ma: Recent advances in the extraction of bioactive compounds with subcritical water: A review. Trends Food Sci.

Technol. 2020, 95, 183–195.

[23] D. Luong, M. A. Sephton, J. S. Watson: Subcritical water extraction of organic matter from sedimentary rocks. Anal. Chim. Acta 2015, 879, 48–57.

[24] K. Hartonen, M. L. Riekkola: Water as the First Choice Green Solvent; Elsevier Inc., 2017.

[25] C. C. Teo, S. N. Tan, J. W. H. Yong, C. S. Hew, E. S. Ong: Pressurized hot water extraction (PHWE). J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2484–2494.

[26] M. Z. Ozel, H. Kaymaz: Superheated water extraction, steam distillation and Soxhlet extraction of essential oils of Origanum onites. Anal. Bioanal. Chem.

2004, 379, 1127–1133.