DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Rebeka Dajčman

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Vpliv cinkovih soli in piritionskih derivatov na aktivnost katepsina L

DIPLOMSKO DELO

Rebeka Dajčman

M

ENTOR

: prof. dr. Iztok Turel

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

Diplomskega dela

Spodaj podpisana Rebeka Dajčman sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Vpliv cinkovih soli in piritionskih derivatov na aktivnost katepsina L.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Iztok Turela, analizo vzorcev z jedrsko magnetno resonanco je opravila dr.

Jerneja Kladnik;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 31.8.2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

ZAHVALA

Najprej bi se zahvalila mentorju prof. dr. Iztok Turelu za zaupanje in dano priložnost, da sem lahko bila del skupine. Iskrena zahvala gre tudi delovni mentorici dr. Ani Dolinar, za vso pomoč pri izvedbi in reševanju problemov, ki so nastali tekom eksperimentalnega dela naloge. Zahvalila bi se tudi dr. Jerneji Kladnik za pomoč pri analizi vzorcev z jedrsko magnetno resonanco. Prav tako se zahvaljujem za vso prejeto znanje iz strani celotne raziskovalne skupine. Zahvaljujem se tudi Katedri za anorgansko kemijo za topel sprejem.

Zahvalila bi se tudi vsem profesorjem na Katedri za biokemijo, ki so mi pomagali vzljubiti snov in učenje ter mi predali ogromno novega znanja.

Najlepša hvala vsem kolegom in kolegicam s katerimi smo preživeli čudovita leta šolanja na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo ter vsem prijateljem in prijateljicam, ki so mi stali ob strani. Zahvalila bi se rada tudi svojemu fantu, ki mi je nudil oporo, ko mi je bilo najtežje ter verjel vame, da mi bo uspelo.

Nenazadnje bi se rada zahvalila mami Alenki, očetu Dejanu in predvsem bratu Urošu za vso podporo, motivacijo in nasvete tekom mojega celotnega šolanja. Hvala za vzpodbudo, razumevanje in potrpežljivost. Brez njih ne bi dosegla to, kar si v življenju želim.

Še enkrat hvala vsem naštetim in še marsikomu, saj je vsak prispeval delček k nastajanju tega diplomskega dela.

(8)

(9)

Vpliv cinkovih soli in piritionskih derivatov na aktivnost katepsin L Povzetek:

Encimi so pomembne tarče zdravil v boju proti patogenim organizmom in tudi organizmu lastnim motnjam, ki privedejo do bolezenskih stanj. Na prvi pogled se zdi, da proteaze ne sodijo v to skupino encimov, saj le razgrajujejo proteine, kar pa je povsem napačno. Cisteinski katepsini, ki se preferenčno nahajajo v lizosomu, sodelujejo pri veliko več celičnih procesih kot le pri normalni razgradnji zunajceličnega materiala in antigenskem procesiranju. Eden takšnih encimov je katepsin L, ki med drugim sodeluje v razvoju hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS). Tudi cisteinski katepsini so postali zanimiva tarča za preučevanje inhibitornega učinka raznih molekul.

Eden najbolj raziskanih cinkovih kompleksov je cinkov pirition, ki je že dolgo znan po svojem antimikrobnem delovanju in je ključna komponenta v komercialnih šamponih proti prhljaju. Poleg antimikotičnega delovanja izkazuje tudi protivirusno delovanje, zaradi česar je potencialno zdravilo v boju proti virusnim infekcijam. Le malo je znanega o njegovem učinku na katepsin L, po drugi strani pa so cinkovi ioni znani po tem, da inhibirajo katepsin B, ki prav tako sodi v CA1 družino papainu podobnih proteaz.

Iz tega razloga smo se odločili, da preverimo vpliv piritiona v kombinaciji s cinkovimi solmi na aktivnost katepsina L. Najprej smo določili stabilnost vseh testiranih komponent z UV/VIS spektroskopijo. Po analizi stabilnosti smo izvedli encimski test, kjer smo s pomočjo fluorogenega substrata merili intenziteto fluorescence. Iz dobljenih podatkov smo določili vrednosti EC50 preiskovanih komponent in ugotovili, da se inhibitorni efekt cinkovih soli poveča ob dodatku piritiona. Takšno znanje je uporabno predvsem pri načrtovanju eksperimentov, ki bi lahko pospešili tekmo iskanja potencialnih inhibitorjev encimov.

Ključne besede: katepsin L, encimska aktivnost, pirition, cink

(10)

Effect of zinc salts and pyrithione derivates on cathepsin L activity Abstract:

Enzymes are important targets in drug research to fight against pathogens and the body’s own disorders that lead to diseases states. At first, it seems that proteases do not belong to this group of enzymes, because they are only involved in protein turnover, which is completely wrong. One group of proteases; cysteine proteases, which are preferentially found in the lysosome, are also involved in many other cellular processes than just normal degradation of extracellular material and antigen processing. One of these enzymes is cathepsin L., which is involeved, among other things, in the development of severe acute respiratory syndrome (SARS). In the last decades, cysteine cathepsins have also become an interesting topic for studying the inhibitory effect.

One of the most studied zinc complexes is zinc pyrithione, which has been long known for its antimicrobial properties and it is a key component in commercially available anti- dandruff shampoos. Beside antifungal activity, zinc pyrithione exhibits antiviral activity, making it a potential drug against viruses. Little is known about its effect on cathepsin L, but on the other hand, zinc ions are known to inhibit cathepsin B, which also belongs to CA1 family of papain-like proteases.

For this reason, we have decided to examine the effect of pyrithione in combination with zinc salts on the cathepsin L activity. We first determined the stability of all tested components by UV/VIS spectroscopy. After that, we performed enzyme test, where the fluorescence intensity was measured using a fluorogenic substrate. From the obtained data, we determined the EC50 values of the tested components and found out that the inhibitory effect of zinc salts increases with the addition of pyrithione. Such knowledge is especially useful in designing an experiments, that would speed up the search for potential enzyme inhibitors.

Keywords: cathepsin L, enzymatic activity, pyrithione, zinc

(11)

Kazalo vsebine

1 Uvod ... 1

1.1 Cisteinski katepsini ... 1

1.1.1 Struktura ... 1

1.1.2 Katepsin L ... 2

1.1.3 Vloga cisteinskih katepsinov v celici ... 4

1.1.4 Vloga katepsina L ... 5

1.2 Regulacija encimske aktivnosti ... 5

1.2.1 Regulacija katepsinov ... 6

1.2.2 Inhibitorji katepsina L ... 6

1.3 Pirition ... 8

1.3.1 Učinek cinka ... 8

1.3.2 Cinkov pirition ... 9

2 Namen dela in hipoteze ... 11

3 Materiali in metode ... 13

3.1 Materiali ... 13

3.1.1 Testirane spojine ... 13

3.1.2 Encim ... 13

3.1.3 Substrat ... 14

3.1.4 Reagenti ... 14

3.1.5 Laboratorijska oprema ... 14

3.2 Metode ... 14

3.2.1 Priprava založnih raztopin ... 14

3.2.2 Določanje stabilnosti z spektrofotometrijo ... 15

3.2.3 Merjenje encimske aktivnosti katepsina L s fluorimetrijo ... 15

4 Rezultati ... 19

4.1 UV/VIS spektroskopija ... 19

4.1.1 Stabilnost ... 19

(12)

4.1.2 Sledenje stabilnosti z jedrsko magnetno resonanco ... 21

4.2 Encimski test ... 22

4.2.1 Rezultati krivulj ... 22

4.2.2 Vrednosti inhibicije ... 25

5 Razprava ... 27

6 Zaključek ... 31

7 Literatura ... 33

(13)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

DMSO dimetilsulfoksid

DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid) DTT ditriotreitol

E-64 L-trans-epoksisukcinil-levcilamino(4-gvanidino)butan

FDA uprava za hrano in živila (ang. food and drug administration) HIV virus humane imunske pomanjkljivosti (ang. human

immunodeficiency virus)

Km Michaelisova konstanta

MHC poglavitni histokompatibilnostni kompleks (ang. major histocompatibitity complex)

NMR jedrska magnetna resonanca

PDB zbirka proteinskih struktur (ang. Protein Data Bank)

Pth pirition

RNA ribonukleinska kislina (ang. ribonucleic acid)

SARS hudi akutni respiratorni sindrom (ang. severe acute respiratory syndrome)

Zn(Pth)2 cinkov pirition

Z-LR-AMC benziloksikarbonil-levcil -arginil-7-amino-4-metilkumarin

aminokislina Tričrkovna oznaka

Enočrkovna oznaka

aminokislina Tričrkovna oznaka

Enočrkovna oznaka

Alanin Ala A Izolevcin Ile I

Arginin Arg R Levcin Leu L

Asparagin Asn N Lizin Lys K

Aspartat Asp D Metionin Met M

Cistein Cys C Prolin Pro P

Fenilalanin Phe F Serin Ser S

Glutamin Gln Q Treonin Thr T

Glutamat Glu E Triptofan Trp W

Glicin Gly G Tirozin Tyr Y

Histidin His H Valin Val V

(14)

(15)

Rebeka Dajčman, Vpliv cinkovih soli in piritionskih derivatov na aktivnost katepsina L

1

1 Uvod

1.1 Cisteinski katepsini

Izraz katepsin se uporablja za vse proteaze, ki katalizirajo lizo proteinov in so najbolj aktivni v kislem okolju [1]. Med katepsine prištevamo serinske, aspartatne in cisteinske proteaze [2]. Človeški genom nosi zapis za enajst lizosomskih cisteinskih katepsinov (B, C, F, H, K, L, O, S, V, W, X) [3, 4], ki zaradi svoje strukturne in evolucijske podobnosti s papainom sodijo v C1 družino papainu podobnih proteaz. Katepsina V in L sta si strukturno zelo podobna, sorodnost drugih pa ni povsem jasna [1]. Večino sesalskih katepsinov lahko razdelimo v dve večji skupini, in sicer katepsinu L podobni in katepsinu B podobni cisteinski katepsini. Glavna razlika je v dolgi zapiralni zanki, ki je odgovorna za eksopeptidazno aktivnost in jo najdemo le pri katepsinu B podobnih cisteinskih katepsinih. Zaradi odsotnosti te zanke imajo katepsinu L podobni cisteinski katepsini le endopeptidazno aktivnost (slika 1) [5]. Razlike v aktivnosti so posledica terciarne strukture v aktivnem mestu [6], vsi pa imajo cisteinski ostanek, kateremu sledita še histidinski in asparaginski ali redkeje aspartatni ostanek [7].

Slika 1: Strukturna poravnava katepsina L (sivo, PDB: 3kse) in katepsina B (modro, PDB: 3cbj) pri pogledu od zgoraj v aktivno mesto na sredini. Neporavnana dolga modra zanka, daje katepsinu B podobnim cisteinskim katepsinom eksopeptidazno aktivnost. Na desni sliki je s sivim plaščem prikazana površina katepsina L.

1.1.1 Struktura

Že leta 1968 so določili strukturo papaina, temu pa so sledili drugi encimi iz družine papainu podobnih proteaz [5]. Čeprav so si cisteinski katepsini med seboj različni tako po aktivnosti kot po strukturi, imajo vendarle vsi tipično papainsko zvitje. Zgrajeni so iz dveh domen: L (leva) in R (desna) (slika 2). Domena L je sestavljena iz treh alfa vijačnic, domeno R pa sestavljajo beta trakovi, ki se zlagajo v beta ploskev. Ta je na dnu zaprta z še eno alfa vijačnico. Na stičišču obeh domen se nahaja aktivno mesto, ki

(16)

2

ga tvorijo aminokislinski ostanki obeh domen [6]. Katalitično aktivnost imata Cys25, ki deluje kot nukleofil in His163, ki služi kot baza (štetje po katepsinu L) [4, 8]. Ta dva aminokislinska ostanka tvorita tiolat-imidazolni ionski par, ki je ključen za delovanje encima [6]. D. Turk et al. je s pomočjo tvorbe kristalnega kompleksa katepsina B z majhnimi molekulami, inhibitorji in substratno mimetiko pokazal, da se substrat veže v aktivno mesto v iztegnjeni konformaciji [9].

Slika 2: Struktura papainu podobnih proteaz na primeru strukture papaina (PDB 1ppn). Na levi strani je domena L, na desni strani pa domena R. Med njima je označeno aktivno mesto, ki je v obliki črke V. V njem se nahaja katalitično aktiven cisteinski ostanek. Alfa vijačnice so označene z zeleno barvo, beta trakovi pa z oranžno.

1.1.2 Katepsin L

Eden izmed papainu podobnih katepsinov je katepsin L, podobnost pa lahko vidimo s prileganjem strukture katepsina L na strukturo papaina (slika 3). Med vsemi cisteinskimi katepsini velja za najbolj nestabilnega v nevtralnem pH [10]. Mason et al. v članku iz leta 1985 pravi, da je katepsin L najbolj aktiven pri pH 5,5. Encim je še stabilen pri pH med 4,5 in 5,5, pomiki v bolj kislo ali bolj alkalno območje pa lahko encim inaktivirajo. Pri pH nad 6,0 začne njegova aktivnost tako padati, da je pri pH 7,0 že praktično neaktiven [11].

domena R domena L

aktivno mesto

(17)

3

Slika 3: Poravnava dvoverižnega človeškega katepsina L in papaina. Na sliki je katepsin L obarvan sivo (PDB koda 3bc3), papain pa je obarvan modro (PDB koda 1ppn). Pri katepsinu je s črtkano črto predstavljena zanka, ki se cepi pri prehodu iz enoverižne v dvoverižno obliko encima.

Človeški gen za katepsin L kodira 333 aminokislinskih ostankov dolg pre-pro-peptid (slika 4). Ta je sestavljen iz 17 ostankov dolgega signalnega peptida, ki mu sledi pro- peptid (aktivacijski peptid). Nato je na genu zapis za težko (H) in lahko (L) verigo zrelega katepsina L, ki ju ločuje kratko zaporedje pro-peptida [12]. Če se signalni peptid ne prepiše, ta varianta katepsina L ostane v jedru, kjer sodeluje pri regulaciji celičnega cikla [13]. Po drugi strani pa se po odcepitvi signalnega peptida prokatepsin L posttranslacijsko modificira. Pro-peptidni del se veže v aktivno mesto v nasprotni smeri kot substrat in s tem inaktivira encim. Aktivacija zrelega katepsina L je posledica avtokatalizne reakcije ali aktivnosti katepsina D v kislem okolju (pH 5,5). Pri tem se odstrani pro-peptidni del, kar vodi v nastanek dvoverižne oblike katepsina L (slika 3).

Ta je sestavljen iz H in L verige, ki ju povezuje disulfidni mostiček [12]. Ti verigi skupaj gradita tako domeno L kot domeno R, ki je značilna struktura papainu podobnih proteaz (slika 2) [8].

domena L domena R

(18)

4

Slika 4: Aminokislinsko zaporedje človeškega prokatepsina L. Z rumeno barvo so označene aminokisline signalnega peptida, z rdečo pa pro-peptidni del. Temno modra predstavlja težko verigo, svetlo modra pa lahko verigo [12, 14].

Strukturi zrele domene prokatepsina L in zrelega katepsina L se le malenkostno razlikujeta. Ena takšnih razlik je položaj Gln21 (štetje po zrelem katepsinu L) v kratki zanki, kjer je le-ta pri zrelem encimu premaknjen proti središču aktivnega mesta, zaradi česar je aktivno mesto ožje [8].

1.1.3 Vloga cisteinskih katepsinov v celici

Izraz katepsin se uporablja za vse proteaze, ki so najbolj aktivne v kislem okolju [1].

Takšno okolje najdemo v lizosomu, ki, poleg cisteinskih proteaz, vsebuje celo vrsto drugih encimov. Klaudia Brix v svojem članku opisuje, da je za normalno življenje celice pomembno njihovo naključno in prepleteno delovanje [15].

Sprva je veljalo prepričanje, da se cisteinski katepsini nahajajo le v lizosomih, kjer sodelujejo pri degradaciji proteinov. Kasneje so ugotovili, da je delovanje katepsinov K, S in W tkivno specifično in celo boljše pri rahlo višjem pH [16]. Kasneje so tudi ostale cisteinske katepsine locirali zunaj lizosoma in sicer v citosolu, jedru, celični membrani in celo v zunajceličnini [6, 13, 17]. Danes vemo, da je vloga cisteinskih katepsinov veliko večja, saj poleg razgradnje zunajceličnega materiala sodelujejo tudi pri antigenski predstavitvi. Katepsini z močno elastolitično in kolagenolitično aktivnostjo sodelujejo pri preurejanju zunajceličnega matriksa. Katepsini sodelujejo tudi pri kostni reabsorbciji in igrajo pomembno vlogo pri različnih boleznih, kot sta na primer rak in revmatoidni artritis [6, 16]. Nekateri katepsini so povezani z zaviranjem rakavega stanja v celici preko mitohondrijsko inducirane apoptoze celice [6].

10 20 30 40 50 MNPTLILAAF CLGIASATLT FDHSLEAQWT KWKAMHNRLY GMNEEGWRRA

60 70 80 90 100 VWEKNMKMIE LHNQEYREGK HSFTMAMNAF GDMTSEEFRQ VMNGFQNRKP

110 120 130 140 150 RKGKVFQEPL FYEAPRSVDW REKGYVTPVK NQGQCGSCWA FSATGALEGQ

160 170 180 190 200 MFRKTGRLIS LSEQNLVDCS GPQGNEGCNG GLMDYAFQYV QDNGGLDSEE

210 220 230 240 250 SYPYEATEES CKYNPKYSVA NDTGFVDIPK QEKALMKAVA TVGPISVAID

260 270 280 290 300 AGHESFLFYK EGIYFEPDCS SEDMDHGVLV VGYGFESTES DNNKYWLVKN

310 320 330 SWGEEWGMGG YVKMAKDRRN HCGIASAASY PTV

(19)

5

1.1.4 Vloga katepsina L

Koncentracija katepsina L je višja v tkivih in celicah, kjer mora biti razgradnja snovi hitra, kot so recimo jetra in makrofagi. Skupaj s katepsinom B sodeluje pri preoblikovanju tkiva, razgradnji zunajceličnega materiala in antigenskem procesiranju [7]. Pri tem specifično razgrajuje invariantno verigo poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa tipa II (MHC tipa II) in tako pomaga pri njegovem zorenju [8]. Enoverižno obliko katepsina L najdemo v jedru, kjer sodeluje pri proteolitičnem procesiranju N-terminalnega konca histonskega repa histona H3 [17].

Vse več raziskav poroča o vpletenosti katepsina L v različne bolezni (jetrna fibroza, diabetes, srčne in kostne bolezni ter ledvične in imunske motnje) [12]. V zadnjih dveh letih je naraslo tudi število člankov o vpletenosti katepsina L pri vstopanju oz.

procesiranju virusnih delcev koronavirusa hudega akutnega respiratornega sindroma oz.

SARS-CoV-2 (iskanje v Pub Med, 2.8.2021). Zunajcelični katepsin L je sposoben razgrajevati številne strukturne komponente, med drugim tudi elastin. Rakave celice izločajo kar 200-krat več katepsina L kot normalne celice, kar jim pomaga pri uspešnejšem širjenju in invaziji v druga tkiva [6, 12].

1.2 Regulacija encimske aktivnosti

Regulacija encimov je pomembna pri vzdrževanju homeostaze v celici in organizmu.

Tok skozi encimsko katalizirano reakcijo je lahko reguliran na dva načina, in sicer z zmanjšanjem števila encimskih molekul ali z zmanjšanjem njihove aktivnosti.

Sprememba aktivnosti je med drugim odvisna od koncentracije majhnih molekul, ki povzročajo skoraj neopazne alosterične spremembe. Takšna molekula je lahko substrat, produkt, kofaktor ali sekundarni prenašalec. Specializirano vlogo regulacije v celici imajo alosterični efektorji, kovalentni modifikatorji in regulatorni encimi [18].

Alosterični regulator je lahko aktivator ali inhibitor, ki se za razliko od kompetitivnih inhibitorjev veže na alosterično mesto na encimu, ki je oddaljeno od aktivnega mesta, kamor se veže substrat. S svojo vezavo povzroči konformacijske spremembe, ki vplivajo na aktivnost encima [4]. Regulacija encimske aktivnosti lahko poteka tudi s pomočjo dejavnikov okolja, kot je recimo pH [19].

Najpogostejša regulacija encimov je s pomočjo endogenih molekul, ki so v večini kompetitivni inhibitorji. Inhibicija encimov je lahko reverzibilna ali ireverzibilna, to pa je odvisno od izbire inhibitorja. Ena izmed najpreprostejših oblik inhibicije je interakcija med encimom (E) in inhibitorjem (I), pri čemer nastane kompleks (EI) (slika 5). Razmerje med hitrostjo disociacije in hitrostjo asociacije nam podaja konstanta inhibicije (Ki). Ti inhibitorji se lahko vežejo v aktivno mesto [4] ali pa na neko drugo mesto na encimu in njegovo aktivnost regulirajo preko alosterije [20].

(20)

6

𝐸 + 𝐼

𝑘𝑑𝑖𝑠𝑜𝑐𝑖

← 𝑘𝑎𝑠𝑜𝑐𝑖

→

𝐸𝐼

Slika 5: Shema inhibicije encima s tvorbo kompleksa. Simbol E predstavlja encim, simbol I pa inhibitor. Simbola kasoci in kdisoci sta hitrosti asociacije in disociacije kompleksa EI, ki predstavljata kompleks med encimom in inhibitorjem [4].

1.2.1 Regulacija katepsinov

Regulacija proteazne aktivnosti je še posebej pomembna, saj ti encimi ireverzibilno cepijo peptidno vez. Neučinkovita regulacija lahko povzroči različna nefiziološka stanja ali celo lizo celice. Poleg zgoraj naštetih načinov encimske regulacije organizem regulira aktivnost katepsinov tudi s pretvorbo cimogena v aktiven encim [20].

V prvi vrsti se aktivnost katepsinov regulira prav preko cimogenske aktivacije pri čemer je pro-peptid vezan v aktivno mesto v nasprotni smeri kot substrat in s tem blokira njegov dostop. Ta se odstrani ob delovanju katepsina D ali pa z avtokatalizo [6]. Ena od možnosti regulacije lizosomske encimske aktivnosti je nedvomno pH, saj so ti encimi najbolj aktivni v rahlo kislem okolju. To pa ni edina kontrolna točka, saj nekaterih katepsinov višji pH okolja ne inaktivira oz. se njihova aktivnost celo poveča (npr.

katepsin S). Najpogostejši inhibitorji cisteinskih proteaz so cistatini, stefini, kinogeni, tiropini in pro-peptidu podobne molekule [4].

1.2.2 Inhibitorji katepsina L

Encimi so ena glavnih tarč zdravilnih učinkovin, zato je razumevanje njihove strukture in delovanja ključno pri odkrivanju in izboljševanju potencialnih inhibitorjev. Te molekule so lahko ključne pri zdravljenju različnih bolezenskih stanj [20].

Poznamo že nekaj inhibitorjev katepsina L, ki pa niso povsem specifični, saj inhibirajo tudi druge cisteinske katepsine. Eden takšnih inhibitorjev je L-trans-epoksisukcinil- levcilamino(4-gvanidino)butan (E-64), ki se s svojim epoksidnim obročem ireverzibilno veže na cisteinski ostanek v aktivnem mestu. Pri tem se veže v nasprotni smeri kot substrat, kar smo zasledili že pri cistatinu in pro-peptidnemu delu nezrelega katepsina, ki delujeta kot endogena regulativna inhibitorja cisteinskih katepsinov. Med triindvajsetimi preučevanimi sintetičnimi inhibitorji proti katepsinu L nobeden ni pokazal selektivnosti proti katepsinu L, saj so visoko inhibitorno moč pokazali tudi proti katepsinom B, H, K in S [12].

Med desetimi zbranimi endogenimi inhibitorji katepsina L, ki so jih omenili v članku pod vodstvom D. Dana, je najmočnejšo inhibicijo dosegel p41 fragment MHC II kompleksa, temu pa je sledil cistatin C, ki prav tako kot substrat tekmuje za vezavo v aktivnem mestu [12]. Poleg endogenih inhibitrojev poznamo tudi eksogene inhibitroje.

(21)

7

V zbirki MEROPS je zbranih več kot devedeset endogenih in eksogenih inhibitorjev katepsina L, vendar konstante inhibicije niso pri vseh znane [21]. Inhibitorji so v večini peptidne molekule, poznamo pa tudi male molekule, ki imajo enak učinek.

Tabela 1: Zbrani inhibitorji katepsina L in njihove konstante inhibicije (Ki) [12, 21].

inhibitor Ki (nM)

cistatin B 0,23

cistatin C >0,005

cistatin D 25

kalpain inhibitro I 0,5

kininogen 0,017

p41 fragment invariantne verige MHC II kompleksa 0,0017

pro-peptid katepsina L 0,12

rekombinantni pro-peptid katepsina L 0,088

T-kininogen 0,18

testikan-1 0,7

Do sedaj so odkrili številne izooblike katepsina L ter tudi številne zunaj lizosomske predelke njegovega delovanja, zato je pomembno, da je inhibitor katepsina L zelo selektiven, saj bi v nasprotnem primeru porušil funkcije ne tarčnih katepsinov pri zdravljenju bolezni. V ospredje prihajajo tako alosterični inhibitorji, ki specifično ciljajo na razlike med katepsini in različnimi oblikami katepsina L [12].

(22)

8

1.3 Pirition

Pirition (slika 6) je ciklična tiohidroksamična kislina, ki se v raztopini pojavlja v dveh tavtomernih oblikah in sicer kot 1-hidroksipiridin-2(1H)-tion ter kot 2-merkaptopiridin- N-oksid [22]. Najbolj je poznan po svojem antimikotičnem delovanju, vse več študij pa kaže tudi na njegove proti rakave učinke [23].

Slika 6: Skeletna formula piritiona (Pth).

1.3.1 Učinek cinka

Pirition služi kot cinkov ionofor, kar pomeni, da izboljša vnos cinka v celico. Med podobne spojine sodita tudi hinokitol in pirolidin ditiokarbamat, ki sta po tem delovanju že dolgo poznana [24]. Prisotnost cinka v celici je ključna za njeno normalno delovanje, saj sodeluje pri prenosu signala, sintezi DNA, prepisovanju genov ter je na splošno ojačevalec imunskega sistema [23]. Čeprav mehanizem ni popolnoma jasen, cink in njegove soli sodelujejo pri zvijanju proteinov in encimski aktivnosti, saj so pomembni kofaktorji tako organizmu lastnih encimov kot tudi virusnih proteaz [24].

Ob dodatku cinkovih ionoforov se koncentracija cinka ne poveča samo v celici, ampak tudi v lizosomu, kjer bi naj le-ta inhibiral od RNA odvisno RNA polimerazo virusov [23]. Nekatere in vitro študije so pokazale, da dodatek cinka bistveno poslabša življenjski cikel tako RNA (virus influence, respiratorni sincicijski virus, pikornavirus, SARS-Cov) kot tudi DNA (virus humane imunske pomanjkljivosti 1, virus vakcinije, poliovirus) virusov [23–25].

Kljub vsem dobrim lastnostim piritiona ga terapevtsko le malo ali sploh ne uporabljamo več, zaradi slabe topnosti in s tem povezane nizke biološke uporabnosti. V te namene se vse več pozornosti usmerja v bolje topne piritionske komplekse [23] z raznimi kovinami (železo, galij, bizmut, platina, paladij, vanadij in nikelj). Pirition se na kovinske ione veže preko kisikovega in žveplovega atoma ter tako tvori kelatne kovinske komplekse, med katerimi je najbolj znan kompleks cinka s piritionom oz. cinkov pirition [22].

(23)

9

1.3.2 Cinkov pirition

Cinkov pirition je kelatni kompleks med ionom cinka na katerega sta preko kisikovega in žveplovega atoma vezani dve molekuli piritiona v anionski obliki (slika 7). Kompleks je v raztopini bolje topen od samega piritiona [23].

Slika 7: Skeletna formula cinkovega piritiona (Zn(Pth)2).

Najpogosteje opisujejo njegovo antimikotično delovanje. Poleg antimikotičnega delovanja so dokazali tudi protivirusno in protibakterijsko delovanje. Čeprav cinkovi ionofori učinkujejo predvsem na Gram negativne bakterije, je cinkov pirition pokazal tudi nevtralizacijski učinek na Gram pozitivno bakterijo Staphylococcus Aureus, ki je glavna povzročiteljica okužbe ran. Znan je tudi sinergističen učinek cinkovega piritiona s sulfadiazinom, zdravilno učinkovino, ki se uporablja za zdravljenje površinskih infekcijskih ran [23].

Kompleks cinka s piritionom deluje tudi protitumorsko in antidiabetično [26-28]. FDA (food and druge administration) je odobrila uporabo cinkovega piritiona pri zdravljenju UVB-inducirane epidermalne hiperplazije. Njegovo nizko topnost izkoriščajo v šamponih proti prhljaju, saj zaradi tega ostane dalj časa na lasišču, kjer zavira rast glive Malassezia in s tem nastanek prhljaja [23, 26, 29].

Zaradi antimikrobnega delovanja lahko cinkov pirition najdemo v raznih kozmetičnih izdelkih [28] ter kot biocid v antivegetativnih premazih za ladje kjer zavira rast alg in plesni [22, 26].

V eni izmed študij vpliva različnih inhibitorjev na proteazo 3CL virusa SARS-CoV, so uporabili tudi 1-hidroksipiridin-2-tion obliko piritiona v kovalentnem kompleksu s cinkom. Ta je med sedmimi testiranimi organskimi komponentami pokazal najučinkovitejši inhibitorni učinek. Ista raziskava je preučevala tudi vpliv kovinskih soli na proteazo 3CL, pri čemer se je najbolje obnesla živosrebrova sol, ki ji je sledila cinkova sol. V tem primeru je cinkov pirition deloval kot kompetitivni inhibitor proteaze, ion cinka pa je zaradi svoje velikosti odražal nekompetitivno inhibicijo. To je eden izmed dokazov protivirusnega delovanja cinkovega piritiona [25].

(24)

(25)

11

2 Namen dela in hipoteze

Pri pregledu literature smo opazili, da primanjkuje raziskav o vplivu piritiona ali cinkovega piritiona na cisteinske katepsine, sploh pa na katepsin L. Zato smo se odločili, da bomo v sklopu diplomskega dela preverili vpliv izbranih inhibitorjev na katepsin L v in vitro pogojih.

V prvi vrsti smo želeli preveriti vpliv cinkove soli na pirition v odsotnosti encima. Ta podatek nam bi pomagal pri interpretaciji nadaljnjih rezultatov. Nato smo želeli določiti moč inhibicije, ki jo imajo čisti pirition, čisti cinkov pirition in čista cinkova sol na katepsin L ter rezultate primerjati z močjo inhibicije, ki jo dosežeta pirition in cinkova sol pri in vitro mešanju.

Glede na pregledano literaturo smo v sklopu diplomskega dela postavili eno hipotezo.

Znano je, da pirition stimulira vnos cinka v celico in da cink inhibira cisteinske proteaze, med katere sodi tudi katepsin L. Prav tako je znano, da tudi cinkovi konjugati inhibirajo cisteinske proteaze [24], nikjer pa ni zabeleženo ali lahko tak kompleks nastane tudi pri in vitro mešanju. Ena od študij je pokazala, da kombinacija cinka in piritiona zmanjša replikacijo nidovirusov v celični kulturi [24]. Pri drugi študiji so proučevali vpliv inhibitorjev na proteazo 3CL virusa SARS-CoV, pri čemer se je cinkov konjugat obnesel bolje kot samo cinkova sol. Iz tega ne moremo sklepati ali je kombinacija cinka in piritiona močnejši inhibitor kot cinkov konjugat [25].

HIPOTEZA 1: Kombinacija cinka in piritiona inhibira katepsin L bolj kot samo pirition ali samo cinkova sol, ne pa močnejše kot sintetiziran kompleks cinka s piritionom.

(26)

(27)

13

3 Materiali in metode

3.1 Materiali

3.1.1 Testirane spojine

Testirali smo pet različnih spojin (tabela 2); pirition, sintetiziran cinkov pirition, cinkov klorid, cinkov bromid in cinkov jodid ter kasneje še mešanice cinkovih soli s piritionom.

Tabela 2: Seznam uporabljenih spojih. Spojine in njihove kombinacije so bile uporabljene pri testiranju inhibitornega učinka na katepsin L.

Spojina Molska

masa [g/mol]

Ime Proizvajalec

Pth 127,6 Pirition

(2-merkaptopiridin-N- oksid)

Fluorochem, Velika Britanija

Zn(Pth)2

317,7 Cinkov pirition Jerneja Kladnik, Maša Masič

(Katedra za anorgansko kemijo, UL

FKKT)

ZnCl2 136,29 Cinkov klorid Acros organics,

Belgija

ZnBr2 225,20 Cinkov bromid Sigma Aldrich,

ZDA

ZnI2 319,22 Cinkov jodid Fluorochem,

Velika Britanija

3.1.2 Encim

Inhibitorni učinek spojin smo testirali na rekombinantnemu človeškemu katepsinu L, ki so ga pripravili v skupini izr. prof. dr. Marka Novinca na Katedri za biokemijo (Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo (UL FKKT)).

(28)

14

3.1.3 Substrat

Za merjenje encimske inhibicije smo kot substrat uporabili benziloksikarbonil-levcil- arginil-7-amino-4-metilkumarin (Z-LR-AMC). Po cepitvi amidne vezi se fluorogena skupina amino-4-metil-kumarin (AMC) sprosti iz substrata in fluorescira. Eksperiment smo izvedli pri takšni koncentraciji substrata, da je bila le-ta enaka Km in sicer 2 μM.

3.1.4 Reagenti

Tabela 3: Seznam kemikalij in namen uporabe.

Kemikalija Proizvajalec Uporaba

Pufer: 50 mM natrijev acetat, pH 5,5

Sigma Raztapljanje cinkovih soli, reakcijski pufer DMSO (ditriotreitol) Thermo Fisher Raztapljanje piritiona in

cinkovega piritiona

DTT (dimetilsulfoksid) Thermo Fisher Reducent

3.1.5 Laboratorijska oprema

Tabela 4: Seznam pomembnejših naprav uporabljenih pri izvedbi eksperimenta.

Naprava Model in proizvajalec

spektrofotometer Lambda 750 UV/VIS Spectrometer Perkin Elmer, ZDA

fluorimeter Luminescence Spectometer LS 50B

Perkin Elmer, ZDA

3.2 Metode

Hipotezo smo preverili z merjenjem encimske aktivnosti v realnem času s pomočjo flourogenega substrata. Še pred izvedbo biološkega testa pa nas je zanimala stabilnost spojin v mešanici, kar je ključno pri interpretaciji rezultatov. Prav tako pa smo, s pomočjo spektroskopske analize, preverili vpliv cinkovih soli na pirition v odsotnosti encima.

3.2.1 Priprava založnih raztopin

Za spektroskopske analize smo pripravili 20 mM pirition in cinkov pirition, ki smo ga raztopili v DMSO, ter 10 mM cinkove soli, raztopljene v pufru.

Za izvedbo encimskega testa smo pirition raztopili v DMSO in redčili do koncentracij 2 mM in 20 mM, cinkov pirition smo prav tako raztopili v DMSO in redčili do

(29)

15

koncentracije 1 mM. Cinkov klorid, cinkov bromid in cinkov jodid smo raztopili v pufru in redčili do koncentracije 1 mM in 10 mM. Vnaprej pripravljen katepsin L smo redčili 100 krat in raztopini dodali 0,5 μL 1 M DTT.

3.2.2 Določanje stabilnosti z spektrofotometrijo

Z UV/VIS spektrofotometrom smo določali stabilnost spojin in njihovih kombinacij (tabela 5) z merjenjem absorbance proti slepemu vzorcu, ki je vseboval 20 μL DMSO in 1980 μL pufra. Najprej smo v spektrofotometer vstavili dve epruveti s slepim vzorcem, nato pa smo en slepi vzorec zamenjali z vzorcem, ki je vseboval preiskovano spojino (tabela 5). Za določanje stabilnosti piritiona v prisotnosti soli smo spojini zmešali in vitro, pri čemer smo se držali molarnega razmerja 1:2 (cinkova sol:pirition). V kiveto smo odpipetirali po 20 μL vsake spojine in dodali ustrezno količino pufra do končnega volumna 2 mL. Za vsako meritev smo izvedli 10 ciklov in merili absorbanco v 5 minutnih intervalih pri valovni dolžini med 250 in 800 nm. Prvi cikel je stekel takoj, ko smo vstavili kiveto v spektrofotometer.

Tabela 5: Sestava vzorcev za določanje stabilnosti spojih s spektrofotometrom.

Vzorec Sestava

1 20 μL piritiona, 1980 μL pufra

2 20 μL cinkovega piritiona, 1980 μL pufra

3 20 μL piritiona, 20 μL cinkovega klorida, 1960 μL pufra 4 20 μL piritiona, 20 μL cinkovega bromida, 1960 μL pufra 5 20 μL piritiona, 20 μL cinkovega jodida, 1960 μL pufra

3.2.3 Merjenje encimske aktivnosti katepsina L s fluorimetrijo

Pri določanju aktivnosti katepsina L smo uporabili fluorogen substrat Z-LR-AMC, ki ob razpadu fluorescira, le-to pa smo detektirali s fluorimetrom. Intenziteto posameznega vzorca smo merili 120 sekund, s časovnim intervalom 0,2 sekunde pri valovni dolžini ekscitacijske svetlobe 370 nm in emisijske svetlobe 455 nm. Meritve so potekale pri 25 ºC ob stalnem mešanju s pomočjo magneta v kiveti in magnetnega mešala v fluorimetru.

Najprej smo izmerili aktivnost encima v odsotnosti potencialnih inhibitorjev, nato pa za vsako spojino koncentracijo inhibitorja postopno zviševali. Program FLWinLab je iz meritev intenzitete fluorescence v odvisnosti od časa izračunal naklone premic pri posameznih koncentracijah inhibitorja, nato pa smo z računalniškim programom2 GraphPad Prism (verzija 5) določili stopnjo inhibicije v obliki vrednosti EC50 (tabela 7).

(30)

16

Končni volumen v kiveti je bil 2 mL in tako smo dosegli, da je koncentracija substrata enaka Km. Začetna reakcijska mešanica brez inhibitorja je vsebovala 1900 mL pufra, 2 μL substrata Z-LR-AMC ter 1 μL razredčenega encima, ki smo mu dodali 0,5 μL 1 M DTT. K ostalim mešanicam smo dodali ustrezen volumen inhibitorja, tako da je končna koncentracija inhibitorja v kiveti postopno naraščala (tabela 6). Glede na preliminarne meritve smo izbrali za vsak vzorec osem primernih koncentracij, pri in vitro mešanju cinkovih soli z piritionom pa smo se držali molarnega razmerja 1:2 (cinkova sol:pirition).

Tabela 6: Razpredelnica končnih koncentracij inhibitorja v reakcijski mešanici.

Pri vsakem vzorcu sem pomerila aktivnost encima v odsotnosti inhibitorja. Pri vzorcih 6, 7 in 8 smo uporabili molarno razmerje med soljo in piritionom 1:2.

Vzorec Inhibitor Koncentracija inhibitorja [μm] v kiveti

1 Pirition

(Pth)

0; 15; 30; 120; 160; 200; 300; 500 2 Cinkov pirition

(Zn(Pth)2) 0; 0,25; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 5

3 Cinkov klorid

(ZnCl2) 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 20; 30

4 Cinkov bromid

(ZnBr2)

0; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 20; 30

5 Cinkov jodid

(ZnI2)

0; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 20; 30 6 Cinkov klorid in pirition

(ZnCl2+Pth)

Sol: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 20; 30 Pirition: 0; 1; 2; 3; 3; 10; 40; 60 7 Cinkov bromid in pirition

(ZnBr2+Pth) Sol: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 20; 30 Pirition: 0; 1; 2; 3; 3; 10; 40; 60 8 Cinkov jodid in pirition

(ZnI2+Pth)

Sol: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 20; 30 Pirition: 0; 1; 2; 3; 3; 10; 40; 60

Glede na graf fluorescence v odvisnosti od časa, smo sklepali o hitrem mehanizmu inhibicije, saj krivulja kaže trend linearne odvisnosti. Za izračun vrednosti EC50 iz eksperimentalnih podatkov je računalniški program GraphPad Prism uporabil naslednjo logistično enačbo (enačba 1):

(31)

17

v

_i

= v

₀

− (v

₀

− v

_∞

)[I]

^h

EC

₅₀

+ [I]

^h

Enačba 1: Logistična enačba s štirimi parametri. Simbol vi predstavlja hitrost reakcije pri določeni koncentraciji inhibitorja I, vo pa hitrost reakcije brez inhibitorja.

Simbol v predstavlja hitrost reakcije v neskončnosti, ko dosežemo nasičenje encima z inhibitorjem. Simbol h predstavlja Hillov koeficient, za katerega vrednost smo nastavili na 1. EC50 vrednost predstavlja koncentracijo inhibitorja, pri kateri dosežemo polovico maksimalnega učinka oziroma v našem primeru inhibicijo 50% encimskih molekul v vzorcu.

(32)

(33)

19

4 Rezultati

V okviru diplomske naloge smo preučevali vpliv piritiona, cinkovega piritiona in cinkovih soli ter njihovega sinergističnega delovanja na katepsin L. Zaradi omejenega obsega dela v času epidemije nam ni uspelo preizkusiti vpliva drugih piritionskih derivatov na encimsko aktivnost. Iz rezultatov spektrofotometrične analize smo lahko sklepali o medsebojnem vplivu spojin in njihovi stabilnosti. Vse analizirane spojine so pokazale učinek na katepsin L, vendar so se te razlikovale v moči inhibicije. Vrednosti EC50 smo pridobili s pomočjo računalniškega programa GraphPad Prism, ki je analiziral začetne hitrosti encimske reakcije pri vzorcih z inhibitorjem in brez njega ter iz njih določil vrednosti EC50.

4.1 UV/VIS spektroskopija

4.1.1 Stabilnost

Podani so grafi stabilnosti različnih vzorcev soli s piritionom v primerjavi s stabilnostjo piritiona in cinkovega piritiona (slika 8, slika 9 in slika 10).

Slika 8: UV/VIS spekter piritiona v prisotnosti ZnCl2 v primerjavi s spektroma čistega piritiona (Pth) in kompleksa cinkovega piritiona (Zn(Pth)2). Na vertikalni osi je nanešena absorbanca A, na horizontalni pa valovna dolžina v nm.

ZnCl2+Pth Pth

Zn(Pth)₂

(34)

20

Slika 9: UV/VIS spekter piritiona v prisotnosti ZnBr2 in v primerjavi s spektroma čistega piritiona (Pth) in kompleksa cinkovega piritiona (Zn(Pth)2). Na vertikalni osi je nanešena absorbanca A, na horizontalni pa valovna dolžina v nm.

Slika 10: UV/VIS spekter piritiona v prisotnosti ZnI2 in v primerjavi s spektroma čistega piritiona (Pth) in kompleksa cinkovega piritiona (Zn(Pth)2. Na vertikalni osi je nanešena absorbanca A, na horizontalni pa valovna dolžina v nm.

Iz rezultatov smo po pričakovanju razbrali, da je pirition skozi ves čas testiranja stabilen. Za kompleks cinkovega piritiona je iz literature znano, da ni dobro topen [29, 30], kar lahko vidimo tudi na grafih odvisnosti absorbance od valovne dolžine (slika 8, slika 9 in slika 10). Njegova koncentracija skozi čas pada, pri čemer je eden izmed

ZnBr₂+Pth Pth

Zn(Pth)₂

ZnI2+Pth Pth

Zn(Pth)₂

(35)

21

možnih vzrokov izločanje trdnega kompleksa v raztopini. Raztopine piritiona v prisotnosti cinkovih soli so v preučevanem časovnem okviru, ki zajema tudi časovno obdobje bioloških testov, stabilne in kemijsko nespremenjene.

Iz vseh treh grafov lahko opazimo, da so se absorpcijski vrhovi premaknili, ko smo piritionu dodali cinkovo sol. Zanimivo pa je dejstvo, da se ti vrhovi nahajajo pri enakih valovnih dolžinah kot vrhovi čistega cinkovega piritiona. Iz teh rezultatov lahko sklepamo, da se je v raztopini tvoril analog kompleksa cinkovega piritiona iz čistega piritiona in čiste cinkove soli.

4.1.2 Sledenje stabilnosti z jedrsko magnetno resonanco

Po analizi UV/VIS spektrov smo stabilnost piritiona, njegovega cinkovega kompleksa in kombinacije piritiona z različnimi cinkovimi solmi preverili še z jedrsko magnetno resonanco (NMR), saj ta metoda omogoča podrobnejši strukturno vpogled, kaj se dogaja s testirano spojino v enostavnih vodnih raztopinah. V NMR cevki smo v mediju 1% DMSO-d6/devteriran acetatni pufer raztopini preučevano spojino oz. Kombinacijo piritiona in izbrane cinkove soli ter nato izvedli meritev ob času t = 0, t = 1 h in t = 24 h.

Ugotovili smo, da so bili vsi vzorci razen kompleksa cinkovega piritiona pri testiranih pogovij ves čas stabilni, saj ob izbranih časih snemanja ni prišlo s spektrih do nobenih sprememb. Slika 11 tako prikazuje le spektre, posnete takoj po pripravi vzorcev (t = 0).

Slika 11: Izbrani ¹H NMR spektri vzorcev v raztopini 1% DMSO-d?devteriran acetatni pufer ob času t = 0. Pomembnejši premiki so označeni s pravokotniki [spektre je posnela dr. Jerneja Kladnik]. 1 – sintetiziran cinkov pirition, 2 – raztopina piritiona in ZnCl2, 3 – raztopina piritiona in ZnBr2, 4 – raztopina piritiona in ZnI2, 5 – raztopina piritiona (od spodaj navzgor).

(36)

22

Kot pri UV/VIS stabilnosti so bili tudi pri NMR analizi vsi vzorci razen cinkovega piritiona stabilni skozi ves čas snemanja, kar še dodatno potrdi opaženo stabilnost z UV/VIS spektroskopijo. Glede na dobljene NMR spektre lahko sklepano, da izbrane cinkove soli (ZnCl2, ZnBr2, ZnI2) in pirition v NMR cevki med seboje reagirajo, saj lahko opazimo, da je prišlo do kemijskih premikov v primerjavi s spektrom samega piritiona (Slika 11). Na podlagi posnetega spektra cinkovega piritiona pa lahko splepamo, da se je v raztopinah piritiona in izbranih cinkovih soli verjetno tvoril analog kompleksa cinkovega piritiona, saj se štirje vrtovi v teh raztopinah, označeni s pravokotniki, prekrivajo z vsemi širimi vrhovi na spektru samega kompleksa cinkovega piritiona (Slika 11). Kljub temu pa ne moremo popolnoma nedvoumno trditi, da je takšen kompleks enak sintetiziranemu kompleksu cinka s piritionom. V spektrih piritiona s cinkovimi solmi lahko opazimo še druge vrhove, katerih identitete nismo uspeli pojasniti.

4.2 Encimski test

Testirali smo štiri skupine potencialnih inhibitorjev katepsina L (pirition, cinkove soli, raztopine piritiona in cinkovih soli ter sintetiziran cinkov pirition) in pri tem smo pripravili osem različnih vzorcev (tabela 6). Hitrosti padanja encimske reakcije so podane na relativni skali vi/v0 v odvisnosti od koncentracije z namenom lažje primerljivosti rezultatov.

4.2.1 Rezultati krivulj

Slika 12: Graf odvisnosti relativne hitrosti encimske reakcije od koncentracije inhibitorja piritiona (Pth) in cinkovega piritiona (Zn(Pth)2). Krivulja predstavlja prileganje logistične enačbe s štirimi parametri (enačba 1) na eksperimentalne podatke.

Za pirition je bila hitrost v neskončnosti nastavljena med 0 in 1, za cinkov pirition pa je bila več kot 0.

(37)

23

Kompleks cinka s piritionom (Zn(Pth)2) je bistveno močneje inhibiral katepsin L kot sam pirition (Pth), zato smo morali parameter hitrosti v neskončnosti le temu prilagoditi. V primeru kompleksa cinka s piritionom smo skoraj popolno inhibicijo dosegli že pri mikromolarnih koncentracijah (slika 12).

Slika 13: Graf odvisnosti relativne hitrosti encimske reakcije od koncentracije cinkovih soli (ZnCl2, ZnBr2 in ZnI2). Krivulja predstavlja prileganje logistične enačbe s štirimi parametri (enačba 1) na eksperimentalne podatke. Hitrost v neskončnosti je bila pri vseh soleh nastavljena med 0 in 1.

(38)

24

Slika 14: Graf odvisnosti relativne hitrosti encimske reakcije od koncentracije kombiniranih inhibitorjev. Krivulja predstavlja prileganje logistične enačbe s štirimi parametri (enačba 1) na eksperimentalne podatke. Na horizontalni skali je podana koncentracija dodane cinkove soli, medtem ko je koncentracija dodanega piritiona dvakrat večja kot koncentracija soli. Hitrost v neskončnosti je bila pri vseh vzorcih nastavljena med 0 in 1.

(39)

25

4.2.2 Vrednosti inhibicije

Tabela 7: Seznam eksperimentalno določenih vrednosti EC50 za preiskovane vzorce na katepsin L. Vrednosti so bile izračunane na podlagi logistične enačbe s štirimi parametri (enačba 1). Inhibitorji so razdeljeni v štiri skupine (samo kompleks cinkovega piritiona, cinkove soli v kombinaciji s piritionom, samo cinkove soli ter samo pirition).

Vzorec EC50 (μM) Zn(Pth)2 0,24 ± 0,08 ZnCl2+Pth 0,89 ± 0,13 ZnBr2+Pth 1,07 ± 0,05 ZnI2+Pth 1,15 ± 0,17 ZnCl2 9,75 ± 1,86 ZnBr2 4,72 ± 0,43 ZnI2 6,47 ± 0,57 Pth 184,2 ± 59,8

Iz rezultatov lahko povzamemo, da kompleks cinka s piritionom najmočneje inhibira katepsin L. Tej inhibiciji sledi inhibicija, ki je nastala zaradi sinergističnega delovanja cinkove soli in piritiona in je močnejša kot inhibicija soli in piritiona ločeno (slika 5).

Slika 15: Shematska razvrstitev testiranih komponent glede na moč inhibicije na aktivnost katepsina L.

Dobljene vrednosti EC50 sovpadajo z razdelitvijo inhibitorjev v štiri skupine (sintetiziran cinkov pirition, raztopina cinkove soli s piritionom, cinkova sol in pirition).

Opazimo lahko, kako vrednosti EC50 v vsaki naslednji skupini zrastejo za približno faktor 10. Znotraj ene skupine ni bilo opaženih bistvenih razlik. Za natančnejše rezultate bi morali meritve ponoviti in tako zmanjšati napako. S tem bi lahko tudi ugotovili razlike znotraj skupine.

Zn(Pth)₂ > (ZnCl₂/ZnBr₂/ZnI₂)+Pth. > (ZnCl₂/ZnBr₂/ZnI₂) > Pth

PADANJE MOČI INHIBICIJE

(40)

(41)

27

5 Razprava

Katepsin L je papainu podobna proteaza in eden izmed enajstih cisteinskih katepsinov, ki jih lahko najdemo v človeškem telesu. Sprva so mislili, da se nahaja le v lizosomu, kasneje pa so številne študije pokazale njegovo lokalizacijo tudi v drugih delih celice.

Lizosomska varianta katepsina L sodeluje pri razgradnji proteinov in dozorevanju MHC kompleksa tipa II ter pri predstavitvi antigenov na površju celice, medtem ko jedrska varianta sodeluje pri regulaciji celičnega cikla [3, 4, 5, 8, 17].

Zaradi velike pomembnosti njegove funkcije mora biti koncentracija katepsina L striktno uravnavana. Telo za to poskrbi z regulatornimi encimi, endogenimi inhibitorji ali fizikalno-kemijskimi dejavniki [18, 19]. Različne variante katepsina L se med seboj le malo razlikujejo. Enako velja za vse cisteinske katepsine, ki so si strukturno zelo podobni [6, 12].

Na tržišču še ni selektivnega inhibitorja katepsina L, je pa vse več študij usmerjenih v njegovo iskanje. Najbolj znan inhibitor cisteinskih proteaz je E-64, ki katepsin L sicer popolnoma inhibira, inhibira pa tudi katepsin K, B in druge. Predlagana so tudi različna zdravila, ki naj bi selektivno inhibirala katepsin L, kot je recimo klorokin, a noben mehanizem in delovanje nista bila popolnoma potrjena [12, 18, 19, 31].

V diplomski nalogi smo določili vrednosti EC50 kompleksu cinkovega piritiona, ligandu piritionu, cinkovim solem (ZnCl2, ZnBr2, ZnI2) ter sočasni aplikaciji piritiona in omenjenih cinkovih soli ter jih razvrstili po moči inhibicije na katepsin L (tabela 7). Kot najučinkovitejši inhibitor katepsina L se je izkazal kompleks cinkovega piritiona z vrednostjo EC50 = 0,24 ± 0,08 μM. Temu so sledile raztopine cinkovih soli v kombinaciji s piritionom. Kot smo lahko videli iz UV/VIS in NMR analize stabilnosti (slika 8, slika 9, slika 10 in slika 11), imajo cinkove soli vpliv na pirition in morda z njim celo reagirajo, pri čemer v določenem obsegu nastane verjetno tudi kompleks cinka s piritionom. V našem primeru smo tako opazili sinergističen učinek raztopine cinkovih soli s piritionom na katepsin L, ki je močnejši kot posamezne komponente. Za nekoliko slabše inhibitorje ketepsina L so se izkazale cinkove soli, katerim jim je sledil sam pirition z najvišjo vrednostjo EC50, med testiranimi spojinami, ki je znašala 184,2 ±

59,8 μM.

V študiji iz leta 2004 so podoben poskus naredili na proteazi 3CL virusa SARS-CoV, ki spada med cisteinske proteaze. Določili so inhibitorni učinek sedmih organskih in treh anorganskih spojin na izbran encim, kjer so, podobno kot mi, njegovo aktivnost merili s pomočjo fluorogenega substrata. Tudi pri njih se je najbolje izkazal analog cinkovega piritona (1-hidroksipiridin-2-tion cink) s konstanto inhibicije 0,17 ± 0,07 μM [25].

Omeniti velja, da so avtorji v tem delu formulo cinkovega kompleksa narisali v obliki,

(42)

28

kjer je pirition enoverižno vezan na cink, ni pa videti kake razlage ali eksperimentalnega rezultata, ki bi tako strukturo potrjeval. Konstanta inhibicije cinkovega iona je bila, podobno kot pri naši raziskavi, večja za približno faktor 10 in sicer 1,1 ± 0,4 μM.

Razliko v moči inhibicije med kompleksom in cinkovim ionom pripisujejo njuni specifičnosti, saj se lahko večji kompleks veže v aktivno mesto, kjer onemogoči vezavo substrata in mu zato pripisujejo lastnosti kompetitivnega inhibitorja. Dodatno pa seveda drži tudi to, da so lastnosti prostega cinka drugačne od cinka vezanega v kompleksu. Po drugi strani se kovinski ioni vežejo na katalitični cisteinski ostanek le zaradi interakcije z nukleofilnim žveplovim atomom [25]. Proteaza 3CL in katepsin L spadata v isto skupino encimov, in sicer med cisteinske proteaze. Zato lahko podobno razlago rezultatov učinkovanja cinkovega kompleksa s piritionom in cinkovih soli uporabimo tudi za eksperimente s katepsinom L v našem primeru (slika 12, slika 13). Za podrobnejše razumevanje so nedvoumno potrebne še nadaljnje raziskave.

V sklopu diplomskega dela smo prav tako ugotovili, da raztopina cinkove soli skupaj s piritionom učinkoviteje inhibira katepsin L kot samo cinkova sol ali samo pirition (tabela 7). Podobna kombinacija cinka in cinkovega ionofora ima analogen inhibitorni učinek na replikacijo nidovirusov v celičnih kulturah [24]. Tega učinka ne moremo pripisati direktni interakciji cinka in piritiona, saj vemo, da pirition v celici deluje kot prenašalec cinka v predelke, kot je na primer lizosom [24]. Pri našem poskusu smo z UV/VIS analizo raztopin pokazali, da ima cinkova sol neposredni učinek na pirition, saj so se absorpcijski vrhovi raztopine piritona ob dodatku soli premaknili proti nižjim valovnim dolžinam. Spremembe v spektrih smo zaznali tudi pri NMR analizi vzorcev.

Iz analize stabilnosti smo videli, da se v raztopini, kjer smo cinkovo sol in pirition zmešali in vitro, pojavijo zvrsti, ki so podobne kompleksu-cinkovemu piritionu (slika 8, slika 9, slika 10 in slika 11). Seveda pa je možno, da nastanejo tudi druge zvrsti (različno razmerje kovina:ligand, protonirane zvrsti, itd.); skratka sestava takšnih raztopin in ravnotežja v njih so zelo kompleksna. Iz encimskega testa pa smo ugotovili, da takšne raztopine inhibirajo katepsin L slabše kot raztopine v katerih smo raztopini sintetiziran cinkov pirition (tabela 7). Manjša inhibitorna moč bi lahko nastopila zaradi nizke sposobnosti tvorbe kompleksa in vitro, prav tako pa bi lahko kompleks ob tvorbi tudi hitro razpadel in bi bilo dinamično ravnotežje doseženo pri nižji koncentraciji, kot je bila koncentracija dodanih začetnih spojin v raztopino. Po drugi strani pa bi lahko cinkov ion in pirition neodvisno drug do drugega inhibirala katepsin L, boljša inhibicija pa bi nastopila zaradi istočasnega delovanja dveh spojin.

Manj učinkovita inhibicija katepsina L s piritionom (slika 15) je lahko posledica nespecifične vezave molekule v aktivno mesto. Pirition je premajhen, da bi z vezavo v aktivno mesto preprečil vezavo substrata, prav tako pa nima elektrofilnih lastnosti, ki bi mu omogočale interakcijo s cisteinom. Na podlagi rezultatov lahko sklepamo o alosterični inhibiciji ali nasičenosti aktivnega mesta s piritonom pri dovolj veliki

(43)

29

koncentraciji spojine. Glede na rezultate, ki smo jih dobili pri analizi encimske aktivnosti, lahko sklepamo, da je vezava cinkovih ionov na katalitični cistein učinkovitejša kot nespecifična inhibicija večje molekule piritiona.

Iz analize grafov fluorescence v odvisnosti od časa s programom FLWinLab, ki smo jih dobili pri merjenju encimske aktivnosti, smo lahko sklepali o hitrem mehanizmu inhibicije. Za določitev drugih lastnostih inhibitorja, kot je reverzibilnost ali ireverzibilnost, pa bi morali izvesti še dodatne eksperimente. To vprašanje ostaja odprto in je dobra iztočnica za nadaljnje raziskave.

Pri encimskem testu smo opazili trend naraščanja vrednosti EC50, ko smo se pomikali po štirih nadskupinah testiranih komponent (pirition, sol, pirition in sol, kompleks cinkovega piritionom) (tabela 7 in slika 15). Če bi testirali še kakšne druge spojine (npr.

rutenijev kompleks s pirition) po enakem postopku in bi se trend obdržal, bi lahko pri iskanju potencialnih inhibitorjev privarčevali veliko pomembnega časa, saj je mešanje komponent in vitro ter preverjanje učinka na encimsko aktivnost hitrejše kot že sama sinteza kompleksov. Z dovolj velikim številom eksperimentov bi na takšen način lahko selekcionirali spojine z najobetavnejšim rezultatom z mešanjem ligandov in soli oz.

kovinskih prekurzorjev in vitro ter šele nato sintetiziralipotencialno najbolj učinkovite komplekse (doc. dr. Jakob Kljun, osebna komunikacija).

Potencialni inhibitorji katepsina L bi lahko bili dobra terapevtska učinkovina pri zdravljenju bolezenskih stanj. Visoko koncentracijo katepsina L so zabeležili v bližini rakavih celic, kjer naj bi pomagal pri širjenju v druga tkiva. Pomembno vlogo ima tudi pri vstopanju SARS-CoV-2 v celico in njegovem procesiranju v lizosomu, pri čemer naj bi bil odgovoren za cepitev peptidne vezi, ki povezuje podenoto S1 proteina bodic z ostalim delom virusa ter tako omogoča fuzijo virusne in gostiteljske membrane [31]. Po drugi strani je njegovo nemoteno delovanje pomembno za normalno razgradnjo proteinov in učinkovito delovanje imunskega sistema. Zato je pomembno, da so inhibitorji katepsina L čim bolj specifični in da delujejo samo na tarčno varianto v tarčnih celicah [12].

Prav nizka strukturna raznolikost in velika raznolikost funkcij katepsina L predstavljata težave pri iskanju selektivnih inhibitorjev. Druga težava je velika podobnost z ostalimi cisteinskimi proteazami in cisteinskimi katepsini, ki imajo v celici prav tako pomembne funkcije. Iskanje razlik v strukturi in odzivu na različne komponente je gonilna sila pri iskanju učinkovitih selektivnih inhibitorjev [6, 12].

Cinkov pirition je pokazal dobro inhibicijo delovanja katepsina L, študije na drugih katepsinih pa še niso bile izvedene. Na tem področju je še veliko odprtih in neraziskanih vprašanj.

(44)

(45)

31

6 Zaključek

Iz rezultatov diplomskega dela lahko zaključimo, da imajo vse testirane spojine in njihove kombinacije vpliv na aktivnost katepsina L. Iz analize stabilnosti testiranih raztopin lahko zaključimo, da gre pri in vitro mešanju za dinamične in naključne procese, ki temeljijo na podlagi elektrostatskih, vsekakor pa ne samo kovalentnih interakcij. Potrdimo lahko, da testirane cinkove soli vplivajo na obnašanje piritiona v raztopini in obratno pri čemer lahko nastanejo različne zvrsti. Iz tega lahko sicer sklepamo, da v manjši meri nastajajo analogi cinkovega piritiona, vsekakor pa v celoti ne nastane kompleks, ki bi bil enak sintetiziranemu cinkovemu piritionu.

Do sedaj so mislili, da cinkov pirition deluje na lizosomske katepsine samo preko distribucije cinka, niso pa pokazali neposrednega inhibitornega učinka na lizosomske katepsine [32]. V diplomskem delu smo pokazali, da cinkov pitirion inhibira katepsin L.

Prav tako smo pokazali, da kombinacija cinka in piritiona inhibira katepsin L bolj kot samo pirition ali samo cinkova sol, ne pa močneje kot sintetiziran kompleks cinka s piritionom in s tem potrdili postavljeno hipotezo.

Na tem področju ostaja še veliko prostora za nadaljnje raziskave, ki bi lahko vodile v odkritje selektivnih inhibitorjev katepsina L in tako pomagale v boju proti nekaterim boleznim.

(46)

(47)

33

7 Literatura

[1] A. Barrett, J. Woessner in N. Rawlings, Eds.: Handbook of Proteolytic Enzymes.

2nd ed., vol. 1. Amsterdam: Elsevier 2004.

[2] Cathepsin-enzyme. Sino Biological.

https://www.sinobiological.com/research/enzymes/cathepsin/ (pridobljeno 20.

jul. 2020).

[3] A. Rossi, Q. Deveraux, B. Turk in A. Sali: Comprehensive search for cysteine cathepsins in the human genome. Biol. Chem. 2004, 358, 363–372.

[4] B. Turk, D. Turk in G. S. Salvesen: Regulating Cysteine Protease Activity:

Essential Role of Protease Inhibitors As Guardians and Regulators. Curr. Pharm.

Des. 2002, 8, 1623–1637.

[5] R. Coulombe, P. Grochulski, J. Sivaraman, R. Ménard, J. S. Mort in M. Cygler:

Structure of human procathepsin L reveals the molecular basis of inhibition by the prosegment. EMBO J. 1996, 15(20), 5492–5503.

[6] V. Turk, V. Stoka, O. Vasiljeva, M. Renko, T. Sun, B. Turk in D. Turk: Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Biochim.

Biophys. Acta - Proteins and Proteomics 2012, 1824(1), 68–88.

[7] D. P. Dickinson: Cysteine Peptidases of Mammals: Their Biological Roles and Potential Effects in the Oral Cavity and Other Tissues in Health and Disease.

Crit. Rev. Oral Biology & Medicine 2002, 13(3), 238–275.

[8] G. Gunčar, G. Pungerčič, I. Klemenčič, V. Turk in D. Turk: Crystal structure of MHC class II-associated p41 Ii fragment bound to cathepsin L reveals the structural basis for differentiation between cathepsins L and S. EMBO J. 1999, 18(4),793–803.

[9] D. Turk, G. Gunčar, M. Podobnik in B. Turk: Revised Definition of Substrate Binding Sites of Papain-Like Cysteine Proteases*. Biol. Chem. 1998, 379, 137–

147.

[10] B. Turk, I. Dolenc, V. Turk in J. G. Bieth: Kinetics of the pH-Induced Inactivation of Human Cathepsin Lt. Biochemistry 1993, 32, 375–380.

[11] R. W. Mason, G. D. J. Green in A. J. Barrett: Human liver cathepsin L. Biochem.

J. 1985, 226, 233–241.

[12] D. Dana in S. K. Pathak: A review of small molecule inhibitors and functional probes of human cathepsin L: Molecules 2020, 25(3):696.

[13] B. Goulet, A. Baruch, N. Moon, M. Poirier, L. L. Sansregret, A. Erickson, M.

Bogyo in Alain Nepveu: A Cathepsin L Isoform that Is Devoid of a Signal Peptide Localizes to the Nucleus in S Phase and Processes the CDP/Cux Transcription Factor terminal degradation of proteins in the lysosomes, but the specific phenotypes resulting from gene inactivation of different cathepsin genes have suggested that dis-tinct cathepsins may play specific, nonredundant, phys- iological functions involving particular tissues or cell. Mol. Cell 2004, 14, 207–

219.

[14] UniProtKB-P07711 (CATL1_HUMAN). UniProt,

https://www.uniprot.org/uniprot/P07711/ (pridobljeno 17. jul. 2020)

[15] K. Brix: Lysosomal Proteases: Revival of the Sleeping Beauty. Georgetown, Texas: Lysosomes, Springer, 2005.