UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
TJAŠA CAR
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
TJAŠA CAR
RAZVOJ PERORALNEGA ORGANOGELA IZ NANOCELULOZE Z ATORVASTATINOM
DEVELOPMENT OF NANOCELLULOSE ORAL ORGANOGEL WITH ATORVASTATIN
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Mirjane Gašperlin, mag. farm. in somentorstvom asist. dr. Katarine Bolko Seljak, mag. farm.
Zahvala
Iskrena zahvala mentorici, prof. dr. Mirjani Gašperlin, mag. farm. in somentorici, asist. dr.
Katarini Bolko Seljak, mag. farm., za vso pomoč, posredovano znanje in strokovno pomoč tako pri raziskovalnem delu kot tudi izdelavi magistrske naloge.
Zahvala asist. Katarini Rede, mag. farm. za pomoč pri izvedbi reakcij lipolize, prav tako zahvala strokovnima sodelavkama na Katedri za farmacevtsko tehnologijo za pomoč pri delu v laboratoriju.
Iz srca pa se zahvaljujem vama, draga mama in ati, za vso podporo in spodbudo za dosego tega cilja, za kar vama bom vedno hvaležna. Fala vama.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod vodstvom mentorice prof. dr.
Mirjane Gašperlin, mag. farm. in somentorice asist. dr. Katarine Bolko Seljak, mag. farm.
Tjaša Car
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Igor Locatelli, mag. farm.
Član komisije: izr. prof. dr. Matej Sova, mag. farm.
I
KAZALO VSEBINE
POVZETEK ... VI ABSTRACT ... VIII SEZNAM OKRAJŠAV ... X
1 UVOD ... 1
1.1 ORGANOGEL ... 1
1.1.1 Organogeli kot dostavni sistemi ... 2
1.1.2 Prednosti in pomanjkljivosti organogelov kot dostavnih sistemov ... 4
1.2 CELULOZA ... 6
1.3 NANOCELULOZA ... 7
1.4 KRISTALINIČNA NANOCELULOZA ... 8
1.5 IN VITRO LIPOLIZA ... 11
1.5.1 Proces in vivo lipolize ... 12
1.5.2 Zasnova metode in vitro lipolize ... 14
2 NAMEN DELA ... 17
3 MATERIALI IN METODE ... 18
3.1 MATERIALI ... 18
3.2 METODE ... 22
3.2.1 Določanje nasičene topnosti atorvastatina v različnih oljnih fazah ... 22
3.2.2 Določanje nasičene topnosti atorvastatina v mediju pH 1,2, pufru pH 6,8 ter prebavnem pufru ... 22
3.2.3 Priprava vodnih disperzij kristalinične nanoceluloze z različnimi masnimi deleži ... 22
3.2.4 Liofilizacija pripravljenih vodnih disperzij kristalinične nanoceluloze ... 23
3.2.5 Priprava organogelov z atorvastatinom ... 24
3.2.6 Priprava vzorcev, ki so vsebovali Capmul MCM EP in atorvastatin ... 24
3.2.7 In vitro sproščanje atorvastatina ... 25
3.2.8 In vitro lipoliza ... 28
3.2.8.1 Določanje aktivnosti encima pankreasna lipaza ... 28
3.2.8.2 In vitro lipoliza pripravljenih vzorcev z atorvastatinom ... 32
2.3.9 Določanje koncentracij atorvastatina z metodo HPLC ... 35
4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 39
II
4.1 Določitev nasičene topnosti atorvastatina v oljni fazi organogela... 39
4.2 Priprava organogelov s kristalinično nanocelulozo ... 40
4.3 Nasičena topnost atorvastatina v medijih pri izvajanju in vitro sproščanja in lipolize ... 42
4.4 In vitro sproščanje atorvastatina iz organogelov ... 44
4.5 In vitro lipoliza pripravljenih organogelov z atorvastatinom ... 49
4.5.1 Titracija sproščenih prostih maščobnih kislin med in vitro lipolizo ... 49
3.5.2 Sproščanje atorvastatina iz formulacij organogelov med procesom in vitro lipolize ... 51
5 SKLEPI ... 54
6 VIRI IN LITERATURA ... 56
III
KAZALO SLIK
Slika 1: Strukturna formula celuloze (20). ... 6 Slika 2: Število objavljenih raziskovalnih člankov od 01. 01. 2010 do 31. 12. 2020, ki kot ključne besede vsebujejo naslednje izraze: (“nanocrystalline cellulose” or “cellulose nanocrystals” or “nanowhiskers”) and (“drug delivery” or “drug carrier” or “carriers” or
“drug release”). Podatki so bili pridobljeni iz iskalnika PubMed. ... 9 Slika 3: Model pH-stat lipolize, ki se uporablja za in vitro oceno lipidnih dostavnih sistemov.
Privzeto po (30). ... 11 Slika 4: Shematski prikaz prebave lipidov ter raztapljanja in absorpcije ZU v želodcu in tankem črevesu. Želodec, dvanajstnik in začetni del tankega črevesa so prikazani v levem kotu zgoraj, povečavi spodnjega dela želodca in črevesnega lumna pa sta prikazani zgoraj desno oz. spodaj. Transportne poti čez epitelijsko plast: (A) paracelularna pasivna difuzija, (B) transcelularna pasivna difuzija, (C-F) dotok/iztok olajšanega transporta z membranskimi beljakovinami, (G) transcitoza in (H) endocitoza. Privzeto po (30). ... 13 Slika 5: Strukturna formula atorvastatina (39). ... 18 Slika 6: Zmleti produkt liofilizacije 2,3 % vodne disperzije gNCC. ... 23 Slika 7: Organogel, pripravljen iz 5 % (m/m) 2 % pNCC in 95 % oljne faze z atorvastatinom.
... 24 Slika 8: Različne trdne kapsule napolnjene z oljno fazo in atorvastatinom. ... 25 Slika 9: Aparatura za in vitro sproščanje. Na levi strani slike vidimo aparature z vesli, na desni strani pa avtomatski vzorčevalnik. ... 26 Slika 10: Hidroliza tributirina (50). ... 28 Slika 11: Aparatura za izvajanje in vitro lipolize: (a) termostatirana reakcijska posoda, (b) kombinirana steklena elektrode, (c) titrator, (č) mešalo, (d) bireta za avtomatsko dodajanje NaOH, (e) 0,6 M NaOH, (f) termostat in (g) računalniška oprema LabXPro. ... 29 Slika 12: Krivulja odvisnosti volumna porabljenega NaOH od časa pri izvedbi tributirinskega testa. ... 31 Slika 13: Umeritvena premica za določevanje koncentracije atorvastatina. Koncentracije standardnih raztopin so bile pripravljene v intervalu od 0,001 mg/mL do 1 mg/mL. ... 36 Slika 14: Nasičena topnost atorvastatina v različnih polarnih tekočinah, izražena v mg atorvastatina/ g snovi. ... 39
IV
Slika 15: Nasičena topnost atorvastatina v različnih medijih, izražena kot mg atorvastatina/
mL medija. ... 42 Slika 16: Profili sproščanja atorvastatina iz različnih formulacij v mediju pH 1,2. Profil sproščanja čistega atorvastatina so določili s predhodnim delom na Katedri za farmacevtsko tehnologijo (46). ... 44 Slika 17: Profili sproščanja atorvastatina iz formulacij v pufru pH 6,8. Profil sproščanja čistega atorvastatina so določili s predhodnim delom na Katedri za farmacevtsko tehnologijo (46). ... 46 Slika 18: Povprečen volumen porabe 0,6 M NaOH v odvisnosti od časa pri titraciji sproščenih prostih maščobnih kislin iz testiranih formulacij organogelov. ... 49 Slika 19: Količina v vodno fazo sproščenega atorvastatina iz formulacij med in vitro lipolizo. ... 51 Slika 20: Količina sproščenega atorvastatina iz formulacij organogelov v celokupni medij med in vitro lipolizo. ... 52
V
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Dejavniki, ki vplivajo na tvorbo organogelov (7). ... 5 Preglednica II: Povzetek raziskovalnih člankov na temo uporabe NCC kot dostavnega sistema. ... 10 Preglednica III: Osnovni podatki atorvastatina. ... 18 Preglednica IV: Vneseni parametri za metodi AKT1 in AKT2 v programu LabXPro za izvedbo pH- stat metode za določanje aktivnosti pankreasne lipaze... 30 Preglednica V: Parametri metod LIPO1 in LIPO2 v programu LabXPro za izvedbo in vitro lipolize. ... 33 Preglednica VI: Pogoji za izvajanje HPLC... 35 Preglednica VII: Nasičena topnost atorvastatina v polarnih tekočinah pridobljena iz literature, izražena v mg atorvastatina/g snovi. ... 40 Preglednica VIII: Prikaz pripravljenih vodnih disperzij NCC in sestave organogelov dveh različnih proizvajalcev NCC. ... 41 Preglednica IX: Območje LVO pripravljenih formulacij organogelov glede na izmerjen elastični modul pri 0,01 % amplitudi strižne deformacije (57). ... 47
VI
POVZETEK
Peroralna aplikacija predstavlja najprimernejši in najprijaznejši način jemanja zdravil. A danes velik delež na novo odkritih zdravilnih učinkovin (ZU) izkazuje slabo vodotopnost in/ali slabo permeabilnost, ki nakazujeta slabo biološko uporabnost slednjih pri peroralni aplikaciji. Posledično je zadnja leta naraslo zanimanje za lipidne dostavne sisteme, ki omogočajo aplikacijo teh ZU v že raztopljeni obliki, kar pripelje do večje absorpcije in biološke uporabnosti slabo vodotopnih ZU.
Prav tako je družba prepoznala pomen varovanja okolja in našega planeta. V tem ne zaostaja niti farmacevtska industrija, ki poskuša v čim večji meri vpeljati obnovljive in biološko razgradljive vire surovin. Takšen primer predstavlja kristalinična nanoceluloza (NCC), ki smo jo v naši magistrski nalogi inovativno uporabili kot 3D ogrodje organogela za dostavo ZU.
Tekom magistrske naloge smo z indirektno metodo izdelali organogele z različnimi formulacijami, ki so vsebovali atorvastatin kot modelno slabo vodotopno ZU, raztopljeno v tekoči fazi gela. Najprej smo preizkusili, v kateri tekoči oljni fazi izkazuje atorvastatin največjo topnost. Najboljše rezultate smo pridobili v polarnih oljih, sestavljenih iz srednjeverižnih mono- in digliceridov. Tako se je kot najboljši vehikel izkazal Capmul MCM EP. Da je NCC, ki je hidrofilen polimer, lahko s Capmulom MCM EP tvorila organogel, smo vodne disperzije NCC najprej liofilizirali, pogače zmleli in na pridobljen prah nato adsorbirali olje z ZU. Ker je NCC naravni material, ki variira glede na izvor in način pridobivanja, smo liofilizirali NCC dveh proizvajalcev v različnih koncentracijah. V organogele smo uspeli vgraditi 10 mg atorvastatina na 600 mg organogela. Sproščanje atorvastatina iz organogelov smo vrednotili z metodo in vitro sproščanja in in vitro lipolize.
Pri tem smo ugotovili, da že aplikacija atorvastatina, raztopljenega v oljni fazi, poveča obseg njegovega sproščanja. Tekom in vitro lipolize je vgradnja atorvastatina v organogel z NCC pomenila večjo količino v vodno fazo sproščenega in tako za absorpcijo pripravljenega atorvastatina, v primerjavi s samo v olju raztopljenim atorvastatinom.
V magistrski nalogi nam je uspelo pokazati, da so organogeli z NCC perspektivni dostavni sistemi za slabo vodotopne ZU, s katerimi še izboljšamo sproščanje ZU v primerjavi s samo oljno raztopino (lipidnim dostavnim sistemom tipa I).
VII
Ključne besede: organogel, kristalinična nanoceluloza, atorvastatin, in vitro lipoliza, in vitro sproščanje
VIII
ABSTRACT
Oral administration represents the most appropriate and kindest way to apply medicine.
However, a high proportion of newly discovered active ingredients (AI) demonstrate poor water solubility and/or poor permeability, indicating poor bioavailability of the AI when administered orally. As a result, in recent years there has been an increased interest in lipid- based drug delivery systems that allow AIs to be administered in an already dissolved form, leading to higher absorption and bioavailability of poorly water-soluble AIs.
Society has also recognized the importance of protecting the environment and our planet.
The pharmaceutical industry, which must not fall behind, is trying to introduce renewable and biodegradable sources of raw materials wherever possible. An example of a green material is nanocrystalline cellulose (NCC), which we presented in our master's thesis as an innovatively used 3D cross-linked network of organogel for the delivery of AI.
In the master's thesis, organogels with various formulations containing atorvastatin as a model for poorly water-soluble AI dissolved in the liquid phase of the organogel were produced, using the indirect method. First, we tested in which liquid oil phase atorvastatin exhibited maximum solubility. The best results were obtained in polar oils consisting of medium-chain mono- and di-glycerides, so Capmul MCM EP proved to be the best solvent.
In order for NCC, which is a hydrophilic polymer, to form an organogel with Campul MCM EP, the aqueous dispersions of NCC were first lyophilized, the cakes ground and the obtained powder was then absorbed with oil containing AI. Since NCC is a natural material that varies according to the origin and method of production, we have lyophilized different aqueous dispersions of NCC, which differ in concentration and were provided by two different manufacturers. We were able to incorporate 10 mg of atorvastatin per 600 mg of organogel. We evaluated the release of atorvastatin from organogels using an in vitro release and in vitro lipolysis. In doing so, we found that the application of atorvastatin dissolved in the oil phase increases the extent of its release. During in vitro lipolysis, the incorporation of atorvastatin in organogel with NCC meant a higher amount in the aqueous phase released and thus for the absorption prepared atorvastatin when compared to oil solution of atorvastatin.
IX
In the master's thesis, we were able to show that organogels with NCC are promising delivery systems for poorly water-soluble AI. With organogels, we further improve the release of the AI compared to the oil solution itself (lipid-based drug delivery system - type I).
Key words: organogel, nanocrystalline cellulose, atorvastatin, in vitro lipolysis, in vitro release
X
SEZNAM OKRAJŠAV
BCS Biofarmacevtski klasifikacijski sistem CTAB cetil trimetilamonijev bromid
GHS Sistem razvrščanja in označevanja nevarnih kemikalij (ang.
»Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals«)
gNCC Nanocrystacell NCC®, gelska NCC
GRAS splošno prepoznano kot varno (ang. »generally recognized as safe«) HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
LDL lipoprotein majhne gostote LVO linearni viskoelastični odziv
mNCC magnetno modificirana NCC
NC nanoceluloza
NCC kristalinična nanoceluloza
NVP nemešajoča vodna plast
pNCC CelluForce NCC®, praškasta NCC TBU tributirinska enota
ZU zdravilna učinkovina
12-HSA 12-hidroksistearinska kislina 4-BPBA 4–bromo fenil boronska kislina
1
1 UVOD
Peroralna uporaba predstavlja najprimernejšo in najcenejšo pot apliciranja zdravil. Težave z vpeljavo peroralnih aplikacij so se v večjem obsegu pokazale z uporabo tehnik rešetanja visoke zmogljivosti in kombinatorne kemije pri odkrivanju novih zdravilnih učinkovin (ZU).
Le te so privedle do odkritja ZU, ki izkazujejo izrazito hidrofobne lastnosti in slabo topnost v vodi. Takšne ZU uvrščamo po biofarmacevtskem klasifikacijskem sistemu (BCS) v razred II (slaba topnost, visoka permeabilnost) ter IV (slaba topnost, slaba permeabilnost). Za ZU v teh dveh razredih velja, da pri peroralni aplikaciji dosegajo slabo biološko uporabnost (1, 2).
Kot modelno učinkovino smo v naši magistrski nalogi izbrali atorvastatin, ki spada v II.
razred BCS. Zaradi neustreznega raztapljanja atorvastatina naj bi se ga po peroralni aplikaciji absorbiralo zgolj 30 %, njegova absolutna biološka uporabnost pa naj bi znašala 12 % (3).
Poleg nizke biološke uporabnosti slaba topnost ZU in vivo vodi do velikih inter- in intra- variacij med osebki (večje variabilnosti med bolniki), večje verjetnosti vpliva hrane, nepopolnega sproščanja ZU iz dostavnega sistema itd. (4) Slednje smo želeli preprečiti z vgradnjo atorvastatina v lipofilni dostavni sistem, v katerem bi bil atorvastatin že raztopljen in pripravljen na absorpcijo, odraz tega pa bi bila višja biološka uporabnost.
Atorvastatin smo tako vgradili v lipidni dostavni sistem tipa I in preverili, ali se je s tem sprostila večja količina atorvastatina v primerjavi s čisto ZU v prahu. Lipidni dostavni sistemi tipa I so preproste oljne raztopine, v katerih je ZU raztopljena v trigliceridih ali mono- in digliceridih (5). Te tekoče farmacevtske oblike pa imajo tudi pomanjkljivosti: nižja stabilnost in krajši rok uporabnosti v primerjavi s trdimi farmacevtskimi oblikami, posledične nevšečnosti, povezane s transportom in shranjevanjem, neprijeten okus tekoče farmacevtske oblike je bolj opazen v primerjavi s trdno farmacevtsko obliko itd. (6) Zavoljo teh pomanjkljivosti smo se odločili kot prvi iz lipidnega dostavnega sistema tipa I pripraviti organogel z optimalno sestavo in ovrednotiti njegov vpliv na sproščanje atorvastatina kot modelne slabo vodotopne ZU.
1.1 ORGANOGEL
Gel lahko opredelimo kot poltrdi sistem, v katerem trdno snov, tako imenovani gelator, uporabimo v nizkih koncentracijah (< 15 % m/v) za imobilizacijo tekoče faze v elastičen ali viskoelastičen premrežen sistem. Gel stabilizirajo medmolekulske interakcije, kot so
2
vodikove, π-π in Van der Waalsove vezi ali pa kovalentne vezi, kot predstavnice kemijskih interakcij. Glede na naravo vpletene tekoče faze lahko gele razvrstimo med hidrogele ali organogele. Prvi vsebujejo hidrofilne tekočine, drugi pa lipofilne tekočine (7).
Organogele, ki so viskoelastični, termoreverzibilni in termostabilni sistemi, lahko obravnavamo kot poltrdi sistem z imobilizirano zunanjo nepolarno fazo. Organska faza je imobilizirana v prostorih tridimenzionalne strukture, ki nastane zaradi fizikalnih ali kemijskih interakcij med strukturami spojin, ki veljajo za organogelatorje. Organogelatorje lahko glede na molekulsko maso razdelimo v dve skupini: polimerne organogelatorje in organogelatorje z nizko molekulsko maso. Slednji so snovi, ki imajo molekulsko maso nižjo od 1000 Da in s fizikalnimi interakcijami tvorijo ogrodje organogela. Njihovi predstavniki so derivati L-alanina, 12-hidroksistearinska kislina (12-HSA) itd. Polimerni ogranogelatorji so vsestranski gelatorji z molekulsko maso, večjo od 2000 Da, ki ogrodje organogela tvorijo bodisi s fizikalnimi ali kemijskimi interakcijami. Predstavniki le teh so: polietilen glikol, polikarbonati, poliestri itd. V začetnih letih razvoja organogelov so se kot organska topila uporabljali alkani (število ogljika > 5), kot so heksan in cikloheksan, alken skvalen pa tudi mineralna in rastlinska olja. Slednja dva prevladujeta tudi danes, pridružila pa so se jima tudi biokompatibilna topila, katerih predstavniki so izopropilmiristat, srednjeverižni trigliceridi in drugi. Trenutno obstajata dva glavna pristopa za pripravo organogelov: neposredna organogelacija z gelatorji v oljni fazi in posredna metoda z uporabo emulzij kot predlogo (7−12).
1.1.1 Organogeli kot dostavni sistemi
Uporaba toksičnih organskih topil je v preteklosti predstavljala oviro za uporabo organogelov. Razvoj biokompatibilnih organskih topil pa je spodbudil uporabo organogelov razen v farmaciji tudi na različnih drugih področjih, kot so barve, čistilni materiali, izdelki za osebno nego, nutricevtiki, predelava hrane itd. (12, 13).
Organogeli zaradi možnosti vezave raznovrstnih ZU veljajo za perspektivne dostavne sisteme v farmaciji. Kot farmacevtske oblike se organogeli uporabljajo in razvijajo za različne vrste aplikacij: dermalno in transdermalno, parenteralno, peroralno, rektalno, nazalno in okularno (12, 13).
3 Dermalna in transdermalna aplikacija
Biološka uporabnost ZU pri dermalni in transdermalni aplikacije je odvisna od njene lipofilnosti, saj ji glavno oviro pri prehodu skozi kožo predstavlja poroženela plast (stratum corneum), ki jo definira njena lipofilnost in debelina. Tako organogeli – lipofilni, nedražeči sistemi, enostavni za uporabno, predstavljajo obetavni dostavni sistem za te ZU. Dermalni in transdermalni organogeli so bili razviti in proučevani v širokem obsegu za zdravljenje nevropatij, diabetesa in od hormonov odvisne oblike raka (7).
Kot primer lahko opišemo ex vivo študijo organogela z lecitinom, v katerega so vgradili fenretinid, ki velja za preventivno in kemoterapevtsko ZU za zdravljenje raka dojk, prostate, pankreasa in nevroblastoma. Predlagan pa je tudi za zdravljenje kožnega raka. Raziskovalci so odkrili, da je bila difuzija ZU iz organogela približno 20-krat višja v primerjavi s konvencionalno farmacevtsko obliko, ki je bila v tem primeru mazilo (o/v emulzija).
Fenretinid je hitro razgradljiv derivat retinoida, zato so bili spodbudni tudi rezultati stabilnostne študije. Ti so pokazali, da se je v organogelu po 4 mesecih ohranilo 90 % fenretinida (14).
Parenteralna in situ aplikacija
Parenteralna aplikacija se odlikuje po številnih lastnosti, med katere štejemo visoko biološko uporabnost, izogibanje metabolizmu prvega prehoda, hitro delovanje itd. Zavoljo le teh so aktualne raziskave parenteralnih organogelov, ki se tvorijo in situ, za različne bolezni, kot so na primer tumorji in shizofrenija. Po vbrizgu organogelov v podkožje so le-ti podvrženi sol-gel prehodu, ki ga lahko sprožijo številni dejavniki, kot so sprememba pH in/ali temperature, mehanski stres, kovinski anioni, izmenjava topil itd. Molekule ZU se pri sol- gel prehodu ujamejo v strukturo organogela, njihovo kinetiko sproščanja pa nato ureja več fizikalno-kemijskih in biokemičnih mehanizmov, kot so difuzija, raztapljanje in razgradnja z endogenimi lipazami (7).
Wang in sodelavci so in vitro in in vivo ovrednotili optimizirano formulacijo in situ termosenzitivnega organogela, v katerega so vključili ZU paliperidon, ki sodi v skupino antipsihotičnih zdravil in se uporablja za zdravljenje shizofrenije. Organogel se je obnašal kot in situ depo, ki je ZU enakomerno sproščal v intervalu sedmih dni brez primerov »burst release-a«. Mehanizem sproščanja ZU je bil sestavljen iz difuzije ZU in erozije ogrodja (15).
4 Peroralna aplikacija
Peroralna aplikacija velja za najpogostejši, najvarnejši in najbolj ekonomičen način aplikacije zdravil, a poseduje tudi slabe lastnosti, kot sta metabolizem prvega prehoda in uničenje ZU s prebavnimi encimi. Pri uporabi organogelov kot dostavnih sistemov v farmaciji moramo omeniti vpliv njihove sestave na sproščanje ZU. Organogeli, ki temeljijo na kovalentnih vezeh, ki krepijo mrežo organogela, na splošno in vitro izkazujejo precej linearen profil sproščanja, ki je značilen za kinetiko sproščanja ničtega reda. Nasprotno pa se fizikalni organogeli pri sproščanju ZU zanašajo na mehanizma difuzije in erozije.
Posledično so njihovi in vitro profili sproščanja po navadi dvofazni, saj erozija zahteva več časa kot difuzija. Samo sproščanje lahko časovno traja od nekaj ur do skoraj tedna dni, odvisno od viskoznosti organogela ali koncentracije organogelatorja v njem (7).
Iwanaga in sodelavci so v organogele z 12-HSA vgradili hidrofilne (teofilin, ofloksacin) ali lipofilne (ibuprofen, antipirin) ZU. In vitro so ugotovili, da so se hidrofilne ZU iz organogelov sprostile bistveno počasneje (približno 21–29 % v 6 urah) v primerjavi z lipofilnimi ZU (72–77 % v 6 urah). Slednje so pripisali temu, da so bile lipofilne ZU že raztopljene v organogelu in so se sproščale po mehanizmu difuzije, medtem ko je hidrofilne ZU še prej čakal proces raztapljanja. Organogele so ovrednotili tudi in vivo, in sicer so jih intraduodenalno aplicirali v podgane. V primerjavi z vodnimi suspenzijami ZU, kjer so se ZU hitro absorbirale, so z organogeli dosegli podaljšano sproščanje, pri katerih so se nižje koncentracije ZU v primerjavi z vodnimi suspenzijami ohranile v plazmi 10 ur (16, 17).
1.1.2 Prednosti in pomanjkljivosti organogelov kot dostavnih sistemov
Organogeli kot dostavni sistemi imajo kar nekaj pozitivnih lastnosti: (a) enostavna priprava in aplikacija, (b) sestavlja jih manj sestavin, kar ima za posledico manjše proizvodne stroške, (c) delujejo kot dobri ojačevalci prepustnosti skozi kožo, (č) pri uporabi pacienti izkazujejo dobro adherenco zaradi nestrupene in nedražeče narave organogelov, (d) kot dostavni sistem lahko vključujejo tako hidrofilne kot lipofilne ZU in (e) termoreverzibilnost in termostabilnost omogočata stabilnost organogela v številnih temperaturnih intervalih za daljše časovno obdobje. Ena izmed pomembnejših lastnosti je tudi njihova protimikrobna, protiglivična in celo protivirusna aktivnost, ki jim še posebej razširi možnost uporabe za zdravljenje ran in opeklin brez morebitne kontaminacije (7, 12).
5
Največja pomanjkljivost organogelov je pomembnost čistosti njegovih sestavin, saj lahko kakršna koli kontaminacija vpliva na želene lastnosti organogela. V preglednici I so povzeti dejavniki, ki vplivajo na tvorbo organogela ter do sedaj ugotovljene posledice. Tu velja še posebej omeniti kontaminacijo tekoče faze, ki ima za posledico vpliv na stabilnost 3D ogrodja organogela, saj pride do motenj pri fizikalno-kemijskih interakcijah. Kljub uveljavljenim proizvodnim procesom težnja tekoče faze po geliranju za zdaj ostaja nepredvidljiva in odvisna od natančnih pogojev proizvodnje (7, 12).
Preglednica I: Dejavniki, ki vplivajo na tvorbo organogelov (7).
Parameter organogela Faktor Vpliv
tekoča faza
izvor
morfologija 3D konformacija
optične lastnosti prisotnost sotopila morfologija
3D konformacija prisotnost vode 3D konformacija
stabilnost
organogelator
topnost mehanske in reološke lastnosti 3D konformacija koncentracija mehanske in reološke lastnosti
stabilnost
naboj mehanske in reološke lastnosti 3D konformacija
adjuvant
dodatek soli morfologija
3D konformacija dodatek površinsko
aktivne snovi
morfologija 3D konformacija
Pod omejitve za uporabo organogelov kot dostavnih sistemov lahko še prištejemo: (a) nekatere surovine, še niso na voljo v širokem obsegu, (b) sinerezo (ang. »syneresis«) – krčenje organogela, ki ga spremlja odvajanje tekoče faze, (c) organogel deluje mastno (9).
6 1.2 CELULOZA
Nabor biokompatibilnih organogelatorjev je skromen, zato za strukturiranje olja znanstveniki iščejo nove primerne materiale (18). V magistrski nalogi smo kot organogelator želeli uporabiti kristalinično nanocelulozo (NCC), ki se pridobiva iz makromolekule celuloze. Za ta inovativni način uporabe NCC smo se odločili, saj se današnja družba čedalje bolj zaveda okoljskih in ekoloških posledic uporabe nafte in njenih produktov, zato sinteza funkcionalnih materialov iz naravnih virov pridobiva svojo vrednost. NCC se tako zaradi obnovljivosti in obilne količine izkazuje kot eden najbolj obetavnih zelenih materialov sodobnega časa (19). Zato smo se kot prvi odločili vpeljati NCC v lipidni dostavni sistem in tako izboljšati biološko uporabnost slabo topnih ZU.
Celuloza je najbolj razširjen naravni polimer na Zemlji, čigar vir so rastline, alge, bakterije in tudi nekatere morske živali, npr. plaščarji. Zanj je značilno, da je biološko razgradljiv, biokompatibilen in obnovljiv naravni polimer, ki predstavlja alternativo polimerom na osnovi fosilnih goriv (20).
Slika 1: Strukturna formula celuloze (20).
Na sliki 1 opazimo, da je celuloza linearni homopolimer, sestavljen D-glukopiranoznih enot, kovalentno povezanih z β-1,4-glikozidnimi vezmi. Vsaka glukopiranozna enota ima tri hidroksilne skupine, zavoljo katerih pride do nastanka intra- in intermolekularnih vodikovih vezi, ki zagotavljajo celulozi hidrofilne lastnosti. Kljub temu je celuloza netopna v vodi. Le- to naj bi bila posledica amfifilnih lastnosti celuloze. Odraz močnih vodikovih vezi sta tudi kohezivna narava celuloze in njena hierarhična organizacija, saj celulozo sestavljajo tako kristalne kot amorfne frakcije (20, 21).
7 1.3 NANOCELULOZA
S separacijo amorfnih regij in ob hkratnem ohranjanju kristalnih domen nastane nova oblika kristalne celuloze, ki jo imenujemo nanoceluloza (NC). Slednja ima velikost v nanometrskem merilu in poseduje številne privlačne lastnosti, kot so raznolika morfologija vlaken, hidrofilnost, možnost enostavne modifikacije površine zaradi prisotnih hidroksilnih skupin, velika površina ter razmerje stranic. Obstajajo tri vrste NC: NCC, nanofibrilirana celuloza in bakterijska nanoceluloza (22, 23).
Najobsežneje se NC proizvaja iz celuloze iz rastlinskih celic. V rastlinskih celicah je celuloza pomembna sestavina celične stene, ki ima ključno vlogo pri vzdrževanju njene strukture. Samo steno rastlinskih celic sestavlja lignoceluloza, ki je v glavnem zgrajena iz celuloze, hemiceluloze in lignina. Obstaja več tehnik za pridobivanje NC, ki pa v glavnem spadajo v tri kategorije: mehansko, kemijsko in biološko (20, 21).
Kemijske tehnike izkoriščajo kemična sredstva, ki amorfna in neurejena področja celuloze hidrolizirajo, kristalinična – območja z večjo odpornostjo na napad − pa ostanejo nedotaknjena in rezultirajo kot NC. Glavna predstavnica teh tehnik je kislinska hidroliza. Pri bioloških tehnikah potekajo reakcije z mikroorganizmi (npr. glive, bakterije) ali neposredno z encimi, ki razgrajujejo lignin in hemicelulozo, hkrati pa ohranjajo celulozne dele. Primera takih encimov sta ligninaza in ksilanaza. Mehanske tehnike pa vključujejo visokotlačno homogenizacijo, ultrazvočno obdelavo, drobljenje, radiacijo itd. Proizvodnja NC z uporabo kislinske hidrolize na splošno vodi do NCC, medtem ko mehanske tehnike v glavnem tvorijo nanofibrilirano celulozo. NC se proizvaja od laboratorija do industrijskega obsega, in sicer od 140 g/dan do 50 ton/leto (21, 24).
Kot že prej omenjeno, ima vsaka monomerna enota glukoze tri hidroksilne skupine. Poleg teh lahko površina NC vsebuje še druge funkcionalne skupine, katerih prisotnost na površini je neposredno povezana s pogoji priprave in obdelave. Pogosto prisotni skupini sta sulfatna (-OSO3-) in karboksilna (-COO-), katerih prisotnost je posledica kisle hidrolize z žveplovo in klorovodikovo kislino. Z dodatnimi blagimi reakcijami pa se lahko po hidrolizi izvedejo površinske funkcionalizacije NC, kot so esterifikacija, eterifikacja, oksidacija, amidacija, karbamacija, nukleofilna substitucija itd. Glavna prednost funkcionalizacij je v tem, da se z njimi na površino NC vnese negativne ali pozitivne elektrostatične naboje, ki zagotavljajo boljšo disperzijo v katerem koli topilu ali polimeru (20, 22).
8
Številne prednosti NC so prepričale raziskovalce, da proučujejo uporabo NC v različnih panogah kot so na primer čiščenje vode, tkivno inženirstvo, kozmetika, 3D-tiskanje, embalažni materiali itd. (21−23).
1.4 KRISTALINIČNA NANOCELULOZA
NCC predstavlja segmente celulozne verige v skoraj popolni kristalinični strukturi.
Sestavljena je iz togih delcev paličaste oblike s širino več nanometrov in dolžino do sto nanometrov. Na razmerje stranic NCC vpliva tako izvor same celuloze kot tudi pogoji priprave le te (20, 22).
Osnovo za izdelavo NCC predstavlja delo Nickersona in Habrlea (1947), ki sta odkrila, da je razgradnja celuloznih vlaken v toplotno obdelanih kislih raztopinah po določenem času obdelave dosegla limit. Iz tega sta raziskovalca predvidevala, da je kislina prednostno napadla odseke celuloze, ki povezujejo kristalinične odseke le te. To delo je nato privedlo do pionirskih prizadevanj Ranbyja in sodelavcev, ki so preučevali nadzorovano hidrolizo celuloze, katalizirano z žveplovo kislino (23).
NCC sicer s strani FDA še ni bil podeljen status splošno priznane varne snovi − GRAS (ang.
»generally recognized as safe«), vendar so v do sedaj objavljeni znanstveni literaturi opisane njene lastnosti, kot so netoksičnost, biokompatibilnost, dobre mehanske lastnosti, veliko razmerje med površino in prostornino ter vsestranskost zaradi zmožnosti kemijske modifikacije površine NCC, spodbudile zanimanje za njeno uporabno v farmaciji (21, 23).
Slednje je lepo razvidno iz grafa na sliki 2, ki prikazuje število objavljenih člankov na temo uporabe NCC kot dostavnega sistema za ZU. Število znanstvenih člankov se vsako leto veča, obenem pa tudi opazimo, da je uporaba NCC v farmaciji šele v nastajajoči fazi, saj so bili prvi članki na to temo objavljeni šele leta 2010. V preglednici II so strnjeni izsledki raziskovalnih člankov na temo dostavnih sistemov, ki vsebujejo NCC, za različne učinkovine. Iz člankov je razvidno, da so mnogi raziskani dostavni sistemi z NCC v dosedanji literaturi izkazovali podaljšano sproščanje. Takšno vedenje je lahko posledica tvorjenja vodikovih vezi ZU s hidroksilnimi skupinami na površini NCC. NCC lahko tudi zapolni pore v dostavnih sistemih in tako podaljša difuzijsko pot za ZU, pri tem pa je potrebno upoštevati tudi morebitni vpliv same ZU in pomožnih snovi. Opažena pa je bila tudi zmožnost NCC, da lahko v nekaterih formulacijah poveča absolutno količino sproščene ZU.
9
Slika 2: Število objavljenih raziskovalnih člankov od 01. 01. 2010 do 31. 12. 2020, ki kot ključne besede vsebujejo naslednje izraze: (“nanocrystalline cellulose” or “cellulose nanocrystals” or “nanowhiskers”) and (“drug delivery” or “drug carrier” or “carriers”
or “drug release”). Podatki so bili pridobljeni iz iskalnika PubMed.
Z večanjem potreb po NCC se hkrati po svetu odpirajo številni proizvodni obrati za izdelavo NCC. Nekateri izmed teh so: Celluforce − 1000 kg/dan (Kanada), American Process − 500 kg/dan (ZDA), Holmen − 100 kg/dan (Švedska), Alberta Innovates − 20 kg/dan (Kanada) itd. (22) Iz teh podatkov lahko sklepamo, da sama dobavljivost NCC v prihodnje v primeru registracije dostavnih sistemov, ki vsebujejo NCC, ne bi smela predstavljati problema.
0 5 10 15 20 25 30 35 40
2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020
število objavljenih člankov
leto
10
Preglednica II: Povzetek raziskovalnih člankov na temo uporabe NCC kot dostavnega sistema.
ZU FO Sproščanje ZU Ugotovitve
goveji serumski albumin (25)
gel iz NCC in celuloze
t50% = 175 min (0.00 NCC) t50% = 350 min
(0.20 NCC) t50% = 250 min
(0.50 NCC)
- molekule celuloze predstavljajo matrico, katere zamreženje z vodikovimi vezmi ojačajo molekule NCC
- podaljšano sproščanje po Fickovem difuzijskem zakonu
- povečana količina NCC v gelu ne pomeni podaljšanega sproščanja
doksorubicin,
tetraciklin (26) suspenzija z NCC t85% = 4 h t90% = 4 h
- velika površina in negativni naboj NCC, vezava ZU z ionsko interakcijo - podaljšano sproščanje – večina ZU je bila sproščena po 4 urah, medtem ko je do popolnega sproščanja prišlo po približno 24 urah
etopozid, docetaksel, paklitaksel (26)
NCC-CTAB*
nanokompleks
t75% = 30 h t60% = 24 h t45% = 24 h
- *kationska površinsko aktivna snov (cetil trimetilamonijev bromid)
- modificirana površina NCC na hidroksilnih skupinah s CTAB – omogočena vezava hidrofobnih učinkovin (ustvarjena hidrofobna domena)
- podaljšano sproščanje – v prvih dveh dneh se je sprostilo 40 – 75 % ZU, nato je sledila izredno počasna hitrost sproščanja
ibuprofen (27)
hidrogel iz alginata in magnetno modificirano NCC
(mNCC)
t80% = 245 min
- priprava mNCC z obarjanjem Fe (II) in Fe (III) ionov v vodni disperziji, ki je vsebovala NCC in NaOH
- izboljšanje mehanske trdnosti alginatnega hidrogela z dodatkom mNCC - »burst release« od 0 do 30 minute (sproščene od 45 – 60 % ZU), nato podaljšano sproščanje od 30 do 330 minute
- Fickova difuzija (do 35 % sproščane ZU), zatem nabrekanje (po ≥ 65 % sproščene ZU)
11 1.5 IN VITRO LIPOLIZA
Olja, kot tekoča faza organogelov za dostavo ZU, so v in vivo okolju podvržena lipolizi in različnim absorpcijskim potem, kar je predstavljeno v naslednjem podpoglavju, zato preprosti testi sproščanja niso zmožni dovolj natančno napovedati obnašanja teh sistemov in vivo. Naraščajoča priljubljenost lipidnih dostavnih sistemov v zadnjem desetletju je izkazala potrebo po učinkovitih metodah za njihovo in vitro oceno, ki bi služile kot orodje za napovedovanje vedenja in vivo. Za uveljavitev teh potreb je bil razvit model in vitro lipolize, ki uporablja encime trebušne slinavke, žolč in fosfolipide v temperaturno nadzorovani reakcijski posodi za simulacijo prebave in vivo (Slika 3) (28, 29). Z in vitro lipolizo smo tudi mi ovrednotili naše organogele, določili smo količino sproščenega atorvastatina in dobljene rezultate primerjali s tistimi, ki smo jih pridobili z in vitro sproščanjem.
Slika 3: Model pH-stat lipolize, ki se uporablja za in vitro oceno lipidnih dostavnih sistemov.
Privzeto po (30).
12 1.5.1 Proces in vivo lipolize
Za boljše razumevanje sestave in delovanja modela in vitro lipolize moramo najprej usvojiti proces lipolize, ki poteka in vivo. Lipoliza je opredeljena kot hidrolitska cepitev estrskih vezi v trigliceridih, ki povzroči nastanek prostih maščobnih kislin in glicerola (31).
Prebava vključuje dva glavna procesa, ki potekata sočasno, tj. mehansko in encimsko prebavo. V ustih zaužito hrano prežvečimo − mehansko razgradimo in zmešamo, da nastane mehka masa, pripravljena za požiranje, imenovana bolus. Skozi požiralnik bolus preide v želodec. Iz želodčnega svoda in telesa želodce se izločajo želodčni sokovi, ki vsebujejo pepsin in želodčno lipazo, ki je odgovorna za prebavo 5–40 % zaužitih trigliceridov. V piloričnem antrumu želodca je bolus izpostavljen nadaljnjemu mehanskemu stresu, preden poltekoča masa delno prebavljene hrane, ki se sedaj imenuje himus, zapusti želodec in vstopi v dvanajstnik. V dvanajstniku se himus premeša z žolčem in prebavnim sokom trebušne slinavke za dodatno prebavo pred vstopom v jejunum in ileum. Žolč vsebuje endogene površinsko aktivne snovi v obliki žolčnih soli in fosfolipidov, ki odstranijo lipolizne produkte s stičišča lipaza – substrat, stabilizirajo emulgirane oljne kapljice ter tako pomagajo pri prebavi lipidov. Prebavni sok trebušne slinavke vsebuje lipaze, amilaze in proteaze, ki podprejo encimsko prebavo različnih sestavin zaužite hrane. Sok trebušne slinavke vsebuje tudi visoko koncentracijo bikarbonatnih ionov, ki nevtralizirajo kislo tekočino, ki prihaja iz želodca. Slika 4 prikazuje proces prebave lipidov ter raztapljanja in absorpcije ZU v želodcu in tankem črevesu (28, 30, 31).
Med prebavo lipidov nastajajo različni koloidni delci, kot so unilaminarni in multilaminarni vezikli ter mešani miceli. Znotraj koloidnih delcev se nahaja tudi raztopljena ZU in ravno ti delci preprečijo obarjanje ZU in tako sočasno povečajo njeno absorpcijo. Mešani miceli, sestavljeni iz ZU, soli žolčnih kislin, fosfolipidov in produktov lipolize v obliki monogliceridov in prostih maščobnih kislin, difundirajo skozi nemešajočo se vodno plast (NVP) na površino črevesne membrane, kjer pride do absorpcije posameznih sestavin micelov. Raztopljena prosta ZU je sposobna prodirati skozi NVP, ki pokriva črevesno steno, in se absorbirati čez epitelij. Transportne poti ZU čez epitelij so prikazane na sliki 4. Če koncentracija ZU preseže mejo nasičenja, se le ta obori v kristalni ali amorfni obliki.
Oborjena ZU se mora pred procesom absorpcije ponovno raztopiti. Ko enkrat ZU preide skozi bazolateralno membrano, se transportira naprej po portalni veni. V primeru lipofilne
13
ZU z logP > 5 in topnostjo v lipidih > 50 mg/g, pa se ta transportira v limfnem sistemu naprej do sistemske cirkulacije (28, 30, 31).
Slika 4: Shematski prikaz prebave lipidov ter raztapljanja in absorpcije ZU v želodcu in tankem črevesu. Želodec, dvanajstnik in začetni del tankega črevesa so prikazani v levem kotu zgoraj, povečavi spodnjega dela želodca in črevesnega lumna pa sta prikazani zgoraj desno oz. spodaj. Transportne poti čez epitelijsko plast: (A) paracelularna pasivna difuzija, (B) transcelularna pasivna difuzija, (C-F) dotok/iztok olajšanega transporta z membranskimi beljakovinami, (G) transcitoza in (H) endocitoza. Privzeto po (30).
14 1.5.2 Zasnova metode in vitro lipolize
Za in vitro modele se pričakuje, da zahtevajo nizko intenziteto dela, so hitri, robustni in poceni ter da je njihova končna zasnova običajno kompromis med zapletenostjo in preprostim. Zaradi zapletenosti človeškega telesa ni popolnega in vitro modela za ocenjevanje učinka ZU in vivo, oblikovanje in izbira le tega pa mora biti vedno narejena na podlagi predhodnega poznavanja človeške fiziologije, dostavnega sistema in fizikalno- kemijskih značilnosti vgrajene ZU (30).
Pri izdelavi magistrske naloge smo izvajali pH-stat metodo in vitro lipolize, ki kvantificira stopnjo prebave lipidov posredno iz količine porabljenega natrijevega hidroksida, ki je potreben za nevtralizacijo padca vrednosti pH, ki ga povzročijo proste maščobne kisline, ki predstavljajo produkt encimske hidrolize trigliceridov. Stehiometrično razmerje med slednjima dvema je 1:1. pH-stat metoda predstavlja razmeroma preprosto in poceni simulacijo za oceno lipidnih dostavnih sistemov, omogoča pa tudi izboljšanje našega razumevanja raztapljanja in sproščanja ZU. Glavna prednost pH-stat metode je tako zmožnost hitrega preverjanja učinkov sestave lipidnih dostavnih sistemov na prebavljivost lipidov (28, 30, 32).
Kalcijevi ioni
Med in vitro lipolizo se sproščene proste maščobne kisline začnejo kopičiti na površini oljne kapljice in zavirajo aktivnost lipaze. Posledično se v reakcijsko posodo dodajo Ca2+ ioni, ki s prostimi maščobnimi kislinami tvorijo kalcijevo milo − oborino, ki simulira in vivo absorpcijo prebavljenih lipidov. Glede na dodajanje Ca2+ ionov ločimo dva in vitro modela lipolize: model, pri katerem se na začetku poskusa doda vsa količina Ca2+ ionov in model, pri katerem se Ca2+ ione dodaja neprekinjeno skozi celoten potek poskusa. Pri prvi metodi, ki smo jo uporabili tudi mi, se na začetku reakcije po navadi doda približno 5 mM Ca2+
ionov, reakcija pa se ustavi, ko se ves dodani kalcij kompleksira z nastalimi prostimi maščobnimi kislinami. Običajno to traja manj kot 5 minut, lipoliza pa se ustavi pri 30 minutah (33, 34, 35).
Lipaza
Pankreasna lipaza hidrolizira eno molekulo triglicerida v en 2-monoglicerid in dve maščobni kislini, pri tem pa izkazuje večjo afiniteto do srednje verižnih trigliceridov v primerjavi z dolgo verižnimi trigliceridi. 2-monogliceridi se lahko spontano pretvorijo v 1- ali 3-
15
monogliceride in postanejo substrati lipaze. Lipaza je biološki material, zato se njena katalitična aktivnost razlikuje med serijami in se zmanjša pri daljšem skladiščenju ali visokih temperaturah. Zaradi tega je priporočljivo, da se za vsak izveden poskus pripravi sveža serija lipaze, prav tako pa se analizira tudi njena katalitična aktivnost. Aktivnost lipaze se običajno določi s prebavo fiksne količine standardiziranega lipida – to sta običajno triolein in tributirin, pod standardiziranimi pogoji (temperatura, pH, hitrost mešanja …). pH-stat metode se po navadi izvajajo s prašičjim pankreatinom z encimsko aktivnostjo 1000 tributirinskih enot (TBU)/ mL medija. 1 TBU je enakovreden 1 µmol maslene kisline, sproščene v 1 minuti na 1 g encima. Aktivnost lipaze je opisana v monografijah Evropske (“Pancreas powder” monograph) in Ameriške farmakopeje (“Pancrelipase” monograph) (28, 29).
Pufer
Pufer, ki se uporablja v mediju in vitro lipolize, mora imeti nizko pufrsko kapaciteto, kar zagotavlja, da sproščanje prostih maščobnih kislin povzroči padec pH. Tako se lahko eksperimentalno ovrednoti napredek lipolize. Uravnavanje pH in vivo se doseže z izločanjem bikarbonatnih ionov, ki imajo visoko pufersko kapaciteto. Posledično se zato pri večini in vitro modelov reakcijski zmesi ne dodaja bikarbonata, saj bi puferski učinek bikarbonatnih ionov ogrožal zaznavo tvorjenih prostih maščobnih kislin (29, 32).
Vzorčenje
Lipidni dostavni sistemi se z in vitro medijem ne mešajo, zato je treba reakcijski medij tekom analize mešati s konstantno hitrostjo, da preprečimo nastanek dvofaznega sistema. Mešanje omogoča tudi odvzem homogenih vzorcev za nadaljnje analize. Za prekinitev lipolize v vzorcih se uporablja 4-bromo fenil boronska kislina (4-BPBA) ali orlistat (28).
Če vzorec, odvzet med in vitro lipolizo, centrifugiramo, običajno nastanejo tri različne faze:
oljna, vodna in peletna (Slika 3). Oljno fazo sestavljajo neprebavljeni, neemulgirani lipidi.
Ta faza je po navadi prisotna na začetku metode, s pretečenim časom analize pa se njen volumen zmanjša. Vodna faza vsebuje vezikle in micele. Količina ZU, ki je raztopljena v vodni fazi, predstavlja obseg ZU, ki je na voljo za absorpcijo. Peletno fazo pa predstavlja oborina, ki je sestavljena iz kalcijevega mila, oborin ZU in prebavnih encimov. Delež le te v vzorcu se časom analize povečuje (28, 30, 33).
16
ZU se lahko obori iz dostavnega sistema v in vitro pogojih iz več razlogov. Na primer, nekatere pomožne snovi dostavnega sistema, ki vsebujejo estrske vezi, so lahko predmet hidrolize. Če je ZU v produktih hidrolize manj topna, lahko pride do obarjanja. Tudi samo raztapljanje dostavnega sistema v gastrointestinalnem traktu je lahko razlog za obarjanje, pri čemer je glavni povod izguba hidrofilnih pomožnih snovi, predvsem sotopil. V takem primeru je obarjanje ZU posledica njegove manjše topnosti v dispergiranem dostavnem sistemu. Tu opazimo tudi drug pomemben dejavnik – koncentracijo ZU v dostavnem sistemu. Bližje, kot je točka nasičenosti, večjo dovzetnost ima ZU za obarjanje. Ponovno raztapljanje slabo topnih ZU (razred II. in IV. BCS) je težko in dolgotrajno ter pomeni zmanjšano biološko uporabnost (28, 29).
17
2 NAMEN DELA
Velik delež na novo odkritih ZU izkazuje slabo topnost v vodi, kar je pripeljalo do velikega zanimanja za lipidne dostavne sisteme, ki omogočajo dostavo slabo vodotopnih ZU v raztopljeni obliki, kar vodi do njihove boljše absorpcije in posledično povišane biološke uporabnosti. Namen magistrske naloge je kot prvi razviti peroralni organogel na osnovi NCC za dostavo modelne slabo vodotopne ZU atorvastatina. 3D ogrodje organogela, v katerega se bo ujel v oljni fazi raztopljen atorvastatin, bo sestavljala NCC, ki z današnjimi družbenimi prizadevanji za uporabo obnovljivih in biorazgradljivih materialov pridobiva na pomembnosti tudi v farmacevtski industriji.
V magistrski nalogi želimo še posebej raziskati naslednje hipoteze:
1. Obseg sproščanja atorvastatina izboljšamo z njegovo vgradnjo v primerno oljno fazo – lipidni dostavni sistem tipa I. Z določitvijo nasičene topnosti atorvastatina v različnih lipidnih tekočinah z GRAS statusom bomo poiskali oljno fazo, v kateri preiskovana ZU izkazuje najboljšo topnost. Sproščanje atorvastatina iz te oljne raztopine pa bomo nato določili z metodama in vitro sproščanja po USP II in pa pH-stat in vitro lipolizo.
2. Atorvastatin raztopljen v oljni fazi lahko vgradimo v organogel, ki ga tvori liofilizirana NCC. Pri tem nam bodo osnova na Katedri za farmacevtsko tehnologijo predhodno razviti organogeli iz liofiliziranih vodnih disperzij NCC. Slednje bomo zmleli z mlinčkom in nanje v primerni količini adsorbirali olje z ZU, da bodo nastali organogeli na indirektni način.
3. Z vgradnjo atorvastatina v organogel z NCC povečamo količino sproščenega atorvastatina tako v primerjavi z raztapljanjem same ZU kot s sproščanjem atorvastatina iz oljne raztopine. Pri tem bomo primerjali rezultate dveh metod − in vitro sproščanja in pH-stat in vitro lipolize. Na podlagi rezultatov bomo določili optimalni tip NCC in količino NCC v vodni disperziji pred liofilizacijo za razvoj organogelov za dostavo slabo vodotopnih ZU.
18
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
ATORVASTATIN (v obliki kalcijeve soli) (Slika 5) (KRKA d.d., Novo mesto, Slovenija) je zdravilna učinkovina, ki je indicirana za zdravljenje hiperholesterolemije in preprečevanje srčno-žilnih bolezni. S tem, da zavira reduktazo HMG-CoA, zavira tudi biosintezo holesterola v jetrih, zniža koncentracijo le tega v plazmi in zniža koncentracijo lipoproteinov v serumu. Poveča tudi število jetrnih receptorjev za lipoproteine majhne gostote (LDL) na površini celic, kar vodi v povečan privzem in razgradnjo LDL, katerih zvišana koncentracija v krvi predstavlja dejavnik tveganja za nastanek ateroskleroze (35). Atorvastatin je pri sobni temperaturi bel do skoraj bel kristaliničen prah brez vonja, ki je netopen v vodnih raztopinah s pH vrednostjo < 4, skoraj netopen v vodi, zelo težko topen v fosfatnem pufru s pH vrednostjo 7,4 in acetonitrilu, težko topen v etanolu in zelo lahko topen v metanolu (37, 38).
Osnovni podatki za atorvastatin so predstavljeni v preglednici II.
Slika 5: Strukturna formula atorvastatina (39).
Preglednica III: Osnovni podatki atorvastatina.
Molekulska masa 1155.3 g/mol (37)
Tališče 164−180 °C (40)
Topnost v vodi 0,0000817 mg/mL (25 °C) (37)
logP 5,39 (37)
pKa 4,33 (37)
19
CAPMUL® MCM EP (Abitec Corporation, ZDA) je brezbarvna do rahlo rumena tekoča ali mehka gmota. Sestavljen je iz 45–75 % monogliceridov, 20–50 % digliceridov in < 10 % trigliceridov srednjeverižnih maščobnih kislin, predvsem kaprilne (oktanojske) in kaprinske (dekanojske). Predstavlja odlično topilo za številne organske spojine, prav tako pa se uporablja kot emulgator tipa voda v olju. Aplicira se še lahko kot solubilizator, mehčalo ter vehikel. Vgrajujemo ga lahko v farmacevtske oblike za peroralno, dermalno, transdermalno, parenteralno in okularno aplikacijo (41−43).
CELLUFORCE NCC® (praškasta NCC, pNCC) (Kanada) je napreden večnamenski material, pridobljen iz lesa. Zaradi velike reaktivne površine se lahko uporablja za zmanjšanje permeabilnosti, povečanje trdote in viskoznosti, pa tudi kot emulgator in mazivo.
Po videzu je sivobel prah fine strukture. Iz testov za oceno akutne toksičnosti za peroralno, inhalacijsko in dermalno aplikacijo je ugotovljeno, da CelluForce NCC spada v najmanj toksično kategorijo v Sistemu razvrščanja in označevanja nevarnih kemikalij (GHS) akutne toksičnosti (44).
NANOCRYSTACELL® NCC (gelska NCC, gNCC) (Navitas, Slovenija) je sivozelen vodni gel NCC z gostoto 1,04 g/cm3, ki vsebuje od 5–15 % NCC. Proizvedena je iz bombaža.
Delci imajo premer 10–15 nm in dolžino 150–300 nm (45).
Ostali uporabljeni materiali:
• Sončnično olje (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
• Capmul MCM C8 (Abitec Corporation, ZDA)
• Kolliphor EL (BASF SE, Nemčija)
• Peceol (Gattefossé SAS, Francija)
• Miglyol (Caesar & Loretz GmbH, Nemčija)
• Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
• Laneno olje (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
• Ricinovo olje (Caesar & Loretz GmbH, Nemčija)
• Prečiščena voda (Fakulteta za farmacijo, Slovenija)
• Tekoči dušik (Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Slovenija)
• Dvakrat prečiščena voda (Mili-Q) (Fakulteta za farmacijo, Katedra za biofarmacijo in farmakokinetiko, Slovenija)
20
• Kalijev dihidrogenfosfat (KH2PO4) (Merck KGaA, Nemčija)
• Ortofosforna kislina, 85% (Merck KGaA, Nemčija)
• Acetonitril za HPLC analizo (J.T.Baker, ZDA)
• Metanol (J.T.Baker, ZDA)
• Želatinaste kapsule (Capsugel, ZDA)
• Licaps® (Capsugel, ZDA)
• ConiSnap® (Capsugel, ZDA)
• Klorovodikova kislina, 37 % (HCl) (Merck KGaA, Nemčija)
• Kalijev klorid (KCl) (Merck KGaA, Nemčija)
• Natrijev hidroksid (NaOH) (Merck KGaA, Nemčija)
• Pankreatin iz prašičje trebušne slinavke (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
• Tributirin (1,2,3-tributirilglicerol, glicerol tributirat) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
• Trizma® maleat (tris-(hidroksimetil)-aminometan maleat) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
• L-α-fosfatidilholin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
• Natrijev klorid (NaCl) (Merck KGaA, Nemčija)
• Kalijev klorid dihidrat (CaCl2 ⸱ H2O) (Merck KGaA, Nemčija)
• 4-bromo fenil boronska kislina (4-BPBA) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija)
Naprave in pripomočki, ki smo jih uporabili pri eksperimentalnem delu:
• Ostali pripomočki (čaše, bučke, kapalke, žličke, petrijevke, brizge, kanile, mikrocentrifugirke)
• Magnetno mešalo Tehtnica Železniki, Rotamix 550 MMH, Slovenija
• Magnetno mešalo IKA RCT, Ika, Nemčija
• Ultracentrifuga, Thermo Scientific®, Sorvall WX ULTRA Series Centrifuge, ZDA
• Rotor za ultracentrifugo, Thermo Scienttific® Fiberlite F50L-24Lx 1,5, 50.3Ti, ZDA
• Centrifuga, Eppendorf, Microcentrifuge R415R, Nemčija
21
• Elektronska pipeta, BIOHIT, eLINE® 50-500 μl, Finska
• Elektronska pipeta, BIOHIT, eLINE® 100-5000 μl, Finska
• Analitska tehtnica Mettler Toledo AG245, Švica
• Analitska tehtnica Mettler Toledo XS205, Švica
• Tehtnica Vibra AJ, Shinko Denshi, Japonska
• pH meter, Mettler Toledo, SevenCompact™ pH/Ion S220, Švica
• Ultrazvočna kadička, Sonis 4, Iskra, Slovenija
• HPLC, Agilent 1100 Series, Agilent Technologies, Nemčija
• Kolona za HPLC LiChrospher® 100 RP-18, Merck, Nemčija
• Viale za HPLC, Agilent Technologies, Nemčija
• Liofilizator Christ, Epsilon 2-6D 17083, Nemčija
• Električni mlinček PROFI COOK PC – KSW 1021, Nemčija
• Naprava z vesli za preizkus sproščanja, VK 7010 Dissolution Testing station, VanKel, ZDA
• Avtomatski vzorčevalnik, VanKel, ZDA
• Avtomatski titrator, Mettler Toledo, T70 Titrator, Švica
• Kombinirana steklena elektroda, Mettler Toledo, InLab® Expert Pro ISM, Švica
• Mešalo za titrator, Mettler Toledo, Compact Stirrer, Švica
• Termostat, Huber, Ministat 125-cc-NR, Nemčija
• Vortex, Lab Dancer IKA®, Nemčija
22 3.2 METODE
3.2.1 Določanje nasičene topnosti atorvastatina v različnih oljnih fazah
Nasičeno topnost atorvastatina smo določili v sončničnem olju, Capmul-u MCM C8, Kolliphor-u EL, Paceol-u, Miglyol-u, Tween-u 20, Capmul-u MCM EP in lanenem olju.
Lipofilne tekočine smo razporedili v 10 mL čaše. Vsem čašam smo dodali atorvastatin, magnetno mešalo, jih pokrili s parafilmom ter pustili vzorce mešati na magnetnem mešalu.
Pri tem smo bili pozorni, da smo imeli neprestano prebitek atorvastatina (prenasičeno raztopino). Po 48 urah smo dali vse vzorce centrifugirati 20 minut na 24 °C pri 30000 rpm.
Vzorce smo nato ustrezno razredčili z metanolom, jih prefiltrirali skozi filter z velikostjo por 0,45 μL v viale in zatem analizirali z metodo HPLC, da smo določili koncentracijo atorvastatina v vsakem vzorcu.
3.2.2 Določanje nasičene topnosti atorvastatina v mediju pH 1,2, pufru pH 6,8 ter prebavnem pufru
Nasičeno topnost atorvastatina smo določili v mediju pH 1,2, pufru pH 6,8 in prebavnem pufru, da smo preverili, ali sama topnost atorvastatina v teh medijih vpliva na naše rezultate, dobljene z metodama in vitro sproščanja in lipolize.
Približno 3 mL vsakega medija smo prenesli v čaše, dodali atorvastatin, le te pokrili s parafilmom ter vzorce dali za 48 ur mešati na magnetno mešalo. Pri tem smo bili pozorni, da smo imeli v vzorcih vedno prebitek atorvastatina (prenasičena raztopina). Po 48 urah smo dali vzorce centrifugirat za 20 min na 24 °C pri 30000 rpm. Zatem smo po 100 μL supernatantov prenesli v mikrocentrifugirke, v katere smo že prej odpipetirali 900 μL metanola (redčenje v razmerju 1 : 10). Vzorce smo 30 s vorteksirali ter jih nato filtrirali skozi filter z velikostjo por 0,45 μL v viale. Vzorce smo na koncu analizirali z metodo HPLC.
3.2.3 Priprava vodnih disperzij kristalinične nanoceluloze z različnimi masnimi deleži Izdelali smo 1 %, 2 % in 3 % (m/m) vodne disperzije pNCC. Slednje smo pripravili tako, da smo natehtani pNCC dodali prečiščeno vodo. Masna razmerja pNCC in vode pripravljenih disperzij so bila 1 : 99, 2 : 98 in 3 : 97. Disperzije smo pustili mešati na magnetnem mešalu 24 ur, da se je dispergirala vsa pNCC.
23
Izdelali smo tudi 2,3 % (m/m) vodno disperzijo gNCC. Na Katedri za farmacevtsko tehnologijo so že prej določili, da gel vsebuje 11,68 % NCC. Tako smo za pripravo 100 g 2,3 % vodne disperzije potrebovali 19,7 g gNCC in 80,3 g prečiščene vode. Tudi to disperzijo smo pustili mešati na magnetnem mešalu 24 ur (46).
3.2.4 Liofilizacija pripravljenih vodnih disperzij kristalinične nanoceluloze
Liofilizacija ali sušenje z zmrzovanjem je proces, s katerim smo v našem primeru vodnim disperzijam NCC odstranili vodo s sublimacijo v vakuumu. Proces liofilizacije je sestavljen iz treh korakov: zamrzovanja, primarnega sušenja – čigar glavno vodilo je sublimacija vode ter sekundarnega sušenja, kjer se z desorpcijo odstranijo preostale nezamrznjene vodne molekule (47).
Proces liofilizacije z gNCC smo izpeljali tako, da smo v bučke natehtali približno 10 g vodne disperzije gNCC in jih dali v zamrzovalnik na –50 °C, kjer smo jih pustili za 24 ur. Vodne disperzije s pNCC pa smo odpipetirali po 10 mL v bučke ter jih hitro zamrznili v tekočem dušiku. Zamrznjene vzorce smo nato dali sušit v liofilizator za 24 ur pri tlaku 0,630 bara ter začetni temperaturi –5 °C. Dobljene pogače NCC smo zmleli z mlinčkom, da smo dobili puhaste prahove (Slika 6).
Slika 6: Zmleti produkt liofilizacije 2,3 % vodne disperzije gNCC.
24 3.2.5 Priprava organogelov z atorvastatinom
Za lažje razumevanje magistrske naloge bomo od sedaj naprej produkte liofilizacije zapisovali z novo okrajšavo. Primer: 1 % pNCC pomeni zmleti suhi produkt liofilizacije 1% vodne disperzije pNCC.
Farmakološki učinki atorvastatina so bili dokazani pri minimalnem dnevnem odmerku 10 mg (36). Na podlagi te informacije smo se odločili, da bo naš vzorec v želatinasti kapsuli vseboval 10 mg atorvastatina. Organogeli z 1, 2 in 3 % pNCC so vsebovali 5 % (m/m) suhe NCC in 95 % oljne faze, ki je vsebovala Capmul MCM EP in atorvastatin, medtem ko je organogel z 2,3 % gNCC vseboval 25 % (m/m) NCC in 75 % oljne faze.
Organogele smo izdelali tako, da smo ustrezno količino Capmula MCM EP in atorvastatina mešali na magnetnem mešalu približno 1 uro oz. dokler se ni raztopil ves atorvastatin. Zatem smo dobljeni oljni fazi dodali natehtano NCC in vse skupaj premešali s stekleno paličko (Slika 7). Dobljene organogele smo pustili stati čez noč.
Vzorce smo polnili v želatinaste kapsule. Vsak naš analizirani vzorec je tehtal približno 600 mg in vseboval 10 mg atorvastatina. Le te smo analizirali z metodama in vitro sproščanja in in vitro lipolize, vsako posamezno formulacijo pa smo z vsako metodo analizirali trikrat.
Slika 7: Organogel, pripravljen iz 5 % (m/m) 2 % pNCC in 95 % oljne faze z atorvastatinom.
3.2.6 Priprava vzorcev, ki so vsebovali Capmul MCM EP in atorvastatin
Da smo lahko ugotovili vpliv NCC na sproščanje atorvastatina iz organogela, smo izvedli analizi in vitro sproščanja in in vitro lipolize samo z oljno fazo – to pomeni s Capmul-om MCM EP, v katerem smo raztopili atorvastatin. Oljna faza je v tekočem stanju, zato smo
25
naredili preizkus, če želatinasta kapsula lahko zadrži tekočo vsebino ali pa bomo morali uporabiti drugačne kapsule kot pri analiziranju organogelov. Poleg želatinastih kapsul smo za preizkus izbrali še Licaps® in ConiSnap® kapsule, ki naj bi izkazovale boljšo zmožnost zadrževanja tekoče vsebine kapsule v primerjavi z navadnimi želatinastimi kapsulami.
Preizkus smo izvedli tako, da smo kapsule napolnili s Capmul MCM EP in jih za 24 ur položili v petrijevke (Slika 8). Ugotovili smo, da želatinaste kapsule lahko zadržijo oljno fazo. Posledično smo se odločili za uporabo le-teh, da so rezultati z organogeli čim bolj primerljivi.
Slika 8: Različne trdne kapsule napolnjene z oljno fazo in atorvastatinom.
Oljno fazo z atorvastatiom smo izdelali tako, da smo v čašo natehtali ustrezno količino atorvastatina in Capmul-a MCM EP ter zmes mešali na magnetnem mešalu, dokler se ni raztopil ves atorvastatin. Vzorce smo polnili v želatinaste kapsule. Vsak vzorec je vseboval 10 mg atorvastatina, celoten vzorec pa je tehtal približno 560 mg. Vzorce smo analizirali v treh paralelah z metodama in vitro sproščanja in in vitro lipolize.
3.2.7 In vitro sproščanje atorvastatina
Proces sproščanja je in vitro laboratorijski test, ki vrednoti sposobnost sproščanja ZU (atorvastatina) iz farmacevtske oblike, ki je v našem primeru vzorec z organogelom ali Capmul-om MCM EP in atorvastatinom (48). Teste sproščanja smo izvajali na aparaturi z vesli (USP II) (Slika 9), za vsak vzorec pa smo izvedli po tri paralelke meritev.
26
Slika 9: Aparatura za in vitro sproščanje. Na levi strani slike vidimo aparature z vesli, na desni strani pa avtomatski vzorčevalnik.
Temperatura vodne kopeli je znašala 37,0 °C ± 0,5 °C. Posode smo z merilnim valjem napolnili z 900 mL medija, ki je imel v naših poskusih pH vrednost 1,2 ali 6,8, ter počakali, da se je temperatura medijev izravnala s temperaturo vodne kopeli. Takrat smo v aparaturo dali preiskovano želatinasto kapsulo, ki smo jo predhodno vpeli v kovinsko žičko, zato da kapsula med analizo ne bi splavala na površje. Ko je obtežena kapsula pristala na dnu posode, smo vključili mešanje, s hitrostjo vrtenja vesel 50 obr./min.
Vzorčenje v mediju pH 1,2 je potekalo v naslednjih časovnih točkah: 5, 10, 20, 30, 45, 60 in 120 min. V pufru pH 6,8 pa smo dodali še časovni točki 240 in 360 min. Vzorčenje smo izvedli z avtomatskim vzorčevalnikom, ki je v časovnih točkah odvzel 5 mL medija in ga filtriral skozi vzorčevalni filter z velikostjo por 10 μm. Sami smo nato še s pomočjo brizge in kanile filtrirali vzorec skozi filter z velikostjo por 0,45 μm – pri tem smo prvi mililiter zavrgli, s preostalim vzorcem pa smo napolnili viale. Vzorce smo nato analizirali z metodo HPLC, ki je podrobneje opisana v poglavju 2.3.9.
▪ Priprava medija pH 1,2 za preizkus in vitro sproščanja
Za pripravo medija pH vrednosti 1,2 smo morali najprej izdelati dve raztopini – to sta 0,2 M raztopini HCl in KCl.
27
Priprava 1 L 0,2 M raztopine HCl: V 1000 mL merilno bučko smo nalili približno 300 mL prečiščene vode in ji dodali 82 mL 37 % raztopine HCl ter s prečiščeno vodo bučko dopolnili do oznake. Merilno bučko smo dobro pretresli in tako smo pripravili 1 M HCl. Zatem smo 200 mL pripravljene 1 M HCl raztopine prenesli v 1000 mL merilno bučko in slednjo do oznake dopolnili s prečiščeno vodo ter jo dobro pretresli.
Priprava 1 L 0,2 M raztopine KCl: 14,91 g natehtanega KCl smo kvantitativno prenesli v 1000 mL merilno bučko, dodali približno 100 mL prečiščene vode in mešali. Ko se je raztopil ves KCl, smo merilno bučko do oznake dopolnili s prečiščeno vodo ter bučko ponovno pretresli.
Priprava 1 L medija pH 1,2: 250 mL 0,2 M raztopine KCl smo kvantitativno prenesli v 1000 mL merilno bučko, dolili 425 mL 0,2 M raztopine HCl ter bučko do oznake dopolnili s prečiščeno vodo. Merilno bučko smo dobro premešali ter pH vrednost pripravljenega medija preverili s tremi različnimi pH lističi.
▪ Priprava fosfatnega pufra pH 6,8 za preizkus in vitro sproščanja
Za pripravo fosfatnega pufra pH 6,8 smo morali najprej izdelati 0,2 M raztopini KH2PO4 in NaOH.
Priprava 1 L 0,2 M raztopine KH2PO4: 27,2 g natehtanega KH2PO4 smo kvantitativno prenesli v 1000 mL merilno bučko ter jo dopolnili do oznake s prečiščeno vodo. Bučko smo zatem dobro pretresli, da se je raztopil ves KH2PO4.
Priprava 1 L 0,2 M raztopine NaOH: 8 g natehtanega NaOH smo kvantitativno prenesli v 1000 mL merilno bučko. V bučko smo dodali približno 200 mL prečiščene vode in mešali toliko časa, da se je raztopil ves NaOH. Zatem smo bučko do oznake dopolnili s prečiščeno vodo ter jo še enkrat premešali.
Priprava 1 L raztopine fosfatnega pufra pH 6,8: 250 mL 0,2 M raztopine KH2PO4 smo prelili v 1000 mL merilno bučko, ji dodali 112,4 mL 0,2 M raztopine NaOH ter še približno 500 mL prečiščene vode. Medtem ko se je dobljeni pufer mešal na magnetnem mešalu, smo umerili pH pufra na 0,05 enote natančno in zatem dopolnili bučko s prečiščeno vodo do oznake.
28 3.2.8 In vitro lipoliza
3.2.8.1 Določanje aktivnosti encima pankreasna lipaza
Uporabljena lipaza je pridobljena iz prašičjih eksokrinih celih trebušne slinavke, zato se parameter aktivnosti zaradi različnih vplivov razlikuje na vsako embalažno enoto (49).
Posledično smo pred poskusi in vitro lipolize morali določiti aktivnost encima, kot metodo pa smo uporabili tributirinski test. Tributirin je triglicerid, ki se kot substrat lipaze razgradi na glicerol in tri maslene kisline, zaradi katerih v reakcijski posodi pride do padca vrednosti pH (Slika 10) (50). Pred začetkom analize smo morali pripraviti maleatni pufer in raztopino pankreatina.
Slika 10: Hidroliza tributirina (50).
Priprava 1 L maleatnega pufra: 11,9 g (50 mM) Trizma® maleata, 8,8 g (150 mM) NaCl in 0,74 g (5 mM) CaCl2 • 2 H2O smo kvantitativno prenesli v 1000 mL merilno bučko in jih raztopili v približno 800 mL prečiščene vode. Pufer smo dali mešati na magnetno mešalo in ko v bučki nismo zasledili nobenega trdega delca, smo pH vrednost pufra z 0,1 M in 1 M NaOH umerili na 7,5. Po končanem umerjanju smo merilno bučno do oznake dopolnili s prečiščeno vodo.
Priprava raztopine pankreatina: 10 mg pankreatina smo natehtali v mikrocentrifugirko in s pipeto dodali 2 mL maleatnega pufra. Mikrocentrifugirko smo vorteksirali 5 min in jo zatem centrifugirali 15 min na 5 °C pri 3800 rpm. Pripravljen pankreatin smo shranjevali na ledu in ga porabili še isti dan.
