U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJODIPLOMSKO DELO
Lan Julij Zadravec
Ljubljana, 2021
U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOUNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJSKO INŽENIRSTVO
Uporaba mikropretočnih sistemov za gojenje celic
DIPLOMSKO DELO
Lan Julij Zadravec
M
ENTORICA: prof. dr. Polona Žnidaršič Plazl
Ljubljana 2021
Izjava o avtorstvu
Diplomskega dela
Spodaj podpisani Lan Julij Zadravec sem avtor diplomskega dela z naslovom: Uporaba mikropretočnih sistemov za gojenje celic
S svojim podpisom zagotavljam, da
• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.
dr. Polone Žnidaršič Plazl;
• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v
predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje
predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;
• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, datum Podpis avtorja:
Zahvaljujem se svoji mentorici, prof. dr. Poloni Žnidaršič Plazl, za pomoč in strokovno usmerjanje pri izdelavi diplomskega dela.
Zahvaljujem se doc. dr. Lidiji Kocbek Šaherl za nasvete pri izdelavi diplomskega dela.
Zahvaljujem se lektorici Marjetki Bartol, prof. slov. in špan., za hitro in temeljito lektoriranje.
Zahvaljujem se A. A. E. za omogočanje dostopa do širokega nabora strokovne literature.
Zahvaljujem se družini, ki me je podpirala ob študiju in izdelavi diplomskega dela.
Kazalo
1 Uvod ... 1
1.1 Namen dela ... 3
2 Materiali za izdelavo mikrobioreaktorjev ... 3
2.1 Anorganski materiali ... 3
2.2 Polimerni materiali ... 4
2.2.1 Silikonski elastomeri ... 4
2.2.2 Duroplasti ... 5
2.2.3 Termoplasti ... 5
2.3 Hidrogeli ... 5
2.4 Papir ... 6
3 Delovanje mikropretočnih naprav... 7
3.1 Črpalni mehanizmi ... 7
3.2 Povezave reaktorjev z zunanjostjo ... 8
3.3 Mešanje v mikrobioreaktorjih ... 9
3.3.1 Aktivno mešanje ... 9
3.3.2 Pasivno mešanje ... 10
3.4 Prezračevanje in izhlapevanje ... 11
4 Zaznavanje in nadzor procesnih spremenljivk ... 13
4.1 Temperatura ... 13
4.2 Vrednost pH ... 13
4.3 Koncentracija celic ... 14
4.4 Določanje vsebnosti kisika ... 15
4.5 Določanje vsebnosti ogljikovega dioksida ... 15
4.6 Spektroskopsko določanje koncentracij snovi ... 15
5 Gojenje bakterij v mikrobioreaktorjih ... 17
5.1 Preučevanje bakterijske kemotaksije ... 17
5.1.1 Preučevanje kemotaksije v pretoku... 18
5.1.2 Preučevanje kemotaksije brez pretoka ... 19
5.2 Analiza heterogenosti celičnih kultur ... 20
5.2.1 Vrste mikroreaktorjev za študij posameznih celic ... 21
5.2.2 Preučevanje rasti in morfologije ... 23
5.2.3 Preučevanje metapopulacij ... 24
5.2.4 Posnemanje pogojev v velikih bioreaktorjih na mikrofluidnih čipih... 24
5.3 Preučevanje občutljivosti za antimikrobna sredstva ... 25
6 Kapljični mikrobioreaktorji ... 27
6.1 Prednosti kapljičnih mikrobioreaktorjev ... 27
6.2 Metode za ustvarjanje mikrokapljic... 28
6.2.1 Križišče v obliki črke T... 28
6.2.2 Fokusiranje pretoka ... 28
6.2.3 Uporaba električnega polja ... 29
6.3 Manipulacija kapljic ... 29
6.3.1 Razcepljanje kapljic ... 29
6.3.2 Spajanje kapljic ... 30
6.3.3 Mešanje v kapljicah... 30
6.3.4 Razvrščanje kapljic ... 31
6.4 Uporaba kapljične mikrofluidike ... 31
6.4.1 Zaznavanje in identifikacija mikroorganizmov v kapljicah ... 31
6.4.2 Preučevanje občutljivosti za antimikrobna sredstva v kapljicah ... 31
6.4.3 Ločevanje mikroorganizmov iz mešane kulture ... 32
6.4.4 Uporaba v mikrobni biotehnologiji ... 32
7 Gojenje gliv ... 33
7.1 Preučevanje rasti gliv... 33
8 Gojenje mikroalg ... 35
8.1 Izbor in razvoj sevov ... 35
8.1.1 Identifikacija vrst mikroalg in karakterizacija glede na celično morfologijo in fiziologijo ... 35
8.1.2 Razvrščanje mikroalg... 35
8.1.3 Transformacije celic ... 36
8.2 Mikrosistemi za gojenje mikroalg ... 36
8.2.1 Mikropretočni fotobioreaktorji s kontinuirnim tokom... 36
8.2.2 Kapljični sistemi ... 37
8.3 Uporaba mikroalg kot biosenzorjev... 38
9 Zaključek ... 39
10 Viri ... 41
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
DEP – dielektroforeza (angl. dielectrophoresis)
ISFET – za ione občutljiv tranzistor s poljskim pojavom (angl. ion-sensitive field effect transistor)
MEMS – mikroelektromehanski sistem
nDEP – negativna dielektroforeza (angl. negative dielectrophoresis) OPD – organska fotodioda (angl. organic photodiode)
PC – poli(karbonat)
PDMS – poli(dimetilsiloksan) PMMA – poli(metilmetakrilat) PTFE – poli(tetrafluoroetilen) UV – ultravijolična (svetloba)
Uporaba mikropretočnih sistemov za gojenje celic Povzetek:
Mikropretočne naprave predstavljajo učinkovito platformo za gojenje celic in študij njihovega obnašanja in medsebojnih interakcij. Izdelati jih je mogoče iz različnih materialov, med njimi pa prevladujejo polimeri, za spremljanje procesov v njih pa so potrebne miniaturizirane merilne naprave. Nadzor nad procesnimi spremenljivkami v mikropretočnih napravah je precej boljši kot pri velikih reaktorjih, hkrati pa te naprave omogočajo hitrejše in cenejše izvajanje raznih študij, kot sta preučevanje kemotaksije in testiranje učinkovitosti antimikrobnih sredstev. V mikropretočnih napravah je mogoče gojiti različne vrste mikroorganizmov, od bakterij in gliv do mikroalg, mikroorganizmi pa v njih pogosto uspevajo bolje kot v konvencionalih reaktorjih. Poseben tip mikropretočnih naprav so kapljične mikropretočne naprave, pri katerih se mikroorganizme ujame v kapljice tekočine, ki delujejo kot samostojni reaktorji.
Ključne besede: mikropretočne naprave, gojenje celic, gojenje bakterij, gojenje mikroalg, kapljična mikrofluidika
Use of microfluidic devices for cell culturing Abstract:
Microfluidic devices provide an effective platform for cell culture and the study of their behavior and interactions. They can be made of various materials, among which polymers predominate, and miniaturized measuring devices are needed to monitor the processes in them. The control of process variables in microfluidic devices is much better than in large reactors, and at the same time these devices enable faster and cheaper implementation of various studies, such as studying chemotaxis and testing the effectiveness of antimicrobial agents. Various types of microorganisms can be grown in microfluidic devices, from bacteria and fungi to microalgae, and microorganisms often thrive better in them than in conventional reactors. A special type of microfluidic devices are droplet microfluidic devices, in which microorganisms are trapped in liquid droplets that act as stand-alone reactors.
Kezwords: microfluidic devices, cell culturing, bacteria culturing, microalgae culturing, droplet microfluidics
1
1 Uvod
Mikrofluidika je znanost in tehnologija manipulacije majhnih volumnov tekočin (od 10-9 do 10-18 l), ki je bila prvotno uporabljena za namen kemijske analize zaradi nizke porabe vzorcev in reagentov, kmalu pa se je razširila na številna različna področja uporabe, od uporabe v razvoju in testiranju zdravil ter sinteze posebnih materialov do uporabe v biotehnologiji [1–3]. Gojenje celic se je najprej izvajalo v konvencionalnih bioreaktorskih napravah, kot so namizni bioreaktorji, stresane kulture, petrijevke in mikroplošče, a imajo te metode znatne pomanjkljivosti, in sicer niso uporabne za visokozmogljivostne teste, zavzemajo veliko prostora in porabijo velike količine materialov in reagentov, zahtevajo veliko časa in dela za delovanje (čiščenje, sterilizacija, sestavljanje in razstavljanje), ustvarjajo velike količine odpadkov, poleg tega pa je proces vzorčenja dovzeten za kontaminacijo. Za premagovanje pomanjkljivosti velikih bioreaktorjev so bile razvite mikropretočne naprave, znane tudi pod imenom mikrobioreaktorji (slika 1) [4].
Slika 1: Mikropretočna naprava za preučevanje rasti mikrobnih populacij, ki vsebuje zapletene kanalčke za transport tekočin. Za primerjavo velikosti je zraven postavljen ameriški kovanec za 10 centov [1].
Mikrobi in njihovi metaboliti se uporabljajo na več področjih, kot so kemijska, prehranska in farmacevtska industrija, okoljska remediacija, zelena kemija in energija iz biomase [5].
Pri procesih, pri katerih so kot proizvodni organizem uporabljene mikrobne celice, je skupni donos želenega produkta glavno merilo učinkovitosti procesa [6]. Pri zasnovi procesov je velikega pomena dobro razumevanje samega procesa, za kar so pomembne informacije o delovanju procesa na ravni proizvodnje, poleg tega pa je za razvoj želena čim manjša poraba časa in denarja. Na ravni proizvodnje je te podatke preprosto pridobiti, a je njihovo pridobivanje na ta način zamudno in drago, zato se je pojavila uporaba namiznih bioreaktorjev, vendar tudi ti pogosto nimajo zadostne zmogljivosti za izvajanje vseh potrebnih poskusov [7]. Mikrobioreaktorji omogočajo razvoj miniaturiziranih različic namiznih bioreaktorjev, ki združujejo preprostost uporabe stresanih kultur in sposobnost za sprotno spremljanje in nadzor procesnih spremenljivk namiznih bioreaktorjev [8]. Te naprave so preproste in poceni za izdelavo ter idealne za visokozmogljivostna testiranja, saj omogočajo vzporedno izvedbo velikega števila poskusov. Mikropretočne naprave so tako kot namizni bioreaktorji sposobne delovanja v
2
šaržnem, polšaržnem in kontinuirnem načinu pod širokim naborom različnih procesnih pogojev [7]. Majhnost mikrobioreaktorjev omogoča majhno porabo energije in reagentov, prav tako pa imajo takšne naprave manjše prostorske zahteve [4]. Kot posledica manjših potreb po reagentih in energiji imajo mikrobioreaktorji manjše obratovalne stroške in manjšo generacijo potencialno škodljivih odpadkov kot makroskopske naprave [4, 8]. V primerjavi z namiznimi bioreaktorji mikrobioreaktorji za enkratno uporabo zmanjšajo potrebno delo za pripravo poskusov, saj jih ni treba čistiti in sterilizirati, mogoča pa je tudi avtomatizacija poskusov [8]. Pomembna lastnost mikropretočnih sistemov je ta, da je pretok tekočin po kanalčkih laminaren, kar je idealno za analize celic, ker je mogoče celice izpostaviti nadzorovanim kemičnim gradientom in natančno opazovati njihov odziv, zaradi njihove majhnosti pa je odziv celic na spremembo okolja hiter. Mikrobioreaktorje je mogoče izdelati iz relativno poceni materialov s tehnikami, kot je na primer mehka litografija, prav tako pa je z uporabo površinskih modifikacij in posebnih notranjih struktur naprave mogoče prilagoditi točno določenim specifikacijam [4, 7]. V mikrobioreaktorsko platformo je mogoče vgraditi številne mehanske, elektronske in optične komponente, kar omogoča izdelavo funkcionalnejših sistemov, poleg tega pa je mogoče z mikropretočnimi napravami pridobiti podatke, ki so relevantni za procese na ravni proizvodnje (slika 2) [4].
Slika 2: Delovni prostor mikropretočnih naprav za izvajanje bioprocesov. Ključni izziv je pridobivanje za razvoj procesa želenih podatkov, ki so relevantni za proizvodno raven na hiter in cenovno ugoden način. Na sliki je prikazana relevantnost podatkov, pridobljenih v določeni napravi za procese v odvisnosti od delovnega volumna,
cene in potrebnega vloženega dela za pridobitev teh podatkov [7].
Pri industrijskih procesih, kot je na primer proizvodnja penicilina z glivo Penicillium chrysogenum, se mikroorganizme tipično goji v suspenziji v velikih bioreaktorjih, ki imajo delovne volumne do več sto kubičnih metrov. Ker v teh bioreaktorjih ni mogoče doseči popolnega mešanja, okolje znotraj njih ni homogeno, zato so proizvodni mikroorganizmi izpostavljeni velikim nihanjem vrednosti pH, temperature in koncentracije hranil ter kisika. Izpostavljenost takšnim okoljskim spremembam lahko močno vpliva na fiziologijo in metabolizem celic, kar posledično vpliva na njihovo
3
proizvodnjo želenega produkta in splošno zmogljivost procesa. Zaradi slabega poznavanja vpliva nihanj okoljskih razmer na obnašanje celic proizvodnega organizma se lahko pri prenosu procesa z laboratorijske na industrijsko raven pojavi nepredvidljivo obnašanje proizvodnega organizma in posledično je izkoristek procesa slabši [9].
1.1 Namen dela
V tem diplomskem delu sem predstavil pregled literature s področja uporabe mikropretočnih naprav za gojenje celic mikroorganizmov. Opisal sem različne tipe mikropretočnih naprav za gojenje celic, materiale, iz katerih so zgrajene, spremljanje in nadzor procesov v teh napravah in uporabe takšnih naprav. Poleg tega pa sem opisal tudi gojenje različnih vrste mikroorganizmov v teh napravah ter prednosti tovrstnega gojenja pred tradicionalnimi pristopi.
2 Materiali za izdelavo mikrobioreaktorjev
Materiali imajo pomembno vlogo pri izdelavi mikropretočnih čipov. Izvajanje raznih funkcij pogosto zahteva različne lastnosti materialov, kot so na primer trdota, prevodnost, hidrofobnost in prepustnost za svetlobo [10]. Pomembna zahteva za materiale, ki se uporabljajo pri izgradnji takšnih naprav, je, da so biokompatibilni. Zaradi tega je potrebno, da material ne reagira s tekočino, v kateri se goji celice. Prav tako je potrebno, da je material mogoče sterilizirati, s čimer se uniči bakterije, glive in druge organizme, ki bi lahko motili poskus. Sterilizacijo se lahko izvede na več načinov, npr. s kemično sterilizacijo, vročino, filtracijo ali obsevanjem, pomembno pa je, da izbrana metoda sterilizacije ne vpliva na delovanje naprave. Pogosto se sterilizacijo izvaja z obsevanjem z UV-svetlobo. Mikropretočne naprave je mogoče izdelati iz različnih vrst materialov, kot so keramika, polimeri, kovina, steklo, vosek in papir. Hibridne naprave, izdelane iz kombinacije stekla, polimera in silicija, lahko ponudijo boljše lastnosti kot monolitne naprave, a je njihova izdelava lahko zahtevnejša [4].
2.1 Anorganski materiali
Na začetku je izdelava mikropretočnih čipov temeljila na tehnologiji MEMS (mikro- elektromehanski sistem), vključno z nalaganjem tankega filma, litografijo, jedkanjem in pakiranjem. Za izdelavo mikropretočnih naprav so bili izbrani materiali, kot sta steklo in silicij. Oba imata dobro površinsko stabilnost in kompatibilnost s topili ter sta biokompatibilna, kemijsko inertna in hidrofilna, kar poskrbi za odlično optično prosojnost in odpornost proti visokim tlakom. V zadnjih časih sta se kot nadomestek za silicij pri izdelavi mikropretočnih naprav pogosto začela uporabljati steklo in kvarc. Steklo ima dobre elektroosmotske lastnosti, je prosojen in biokompatibilen ter ga je preprosto obdelovati. Mikropretočni čipi iz kvarca se zaradi svoje dobre prosojnosti za UV-svetlobo in nizke fluorescence v ozadju dobro obnesejo pri analizah z UV-lasersko vzbujeno fluorescenco [10].
4 2.2 Polimerni materiali
Polimeri imajo odlične optične lastnosti, kemijsko inertnost, električno neprevodnost in termalne lastnosti, zaradi česar se pogosto uporabljajo v mikrofluidiki. Poleg tega se da poceni organske materiale preprosto obdelovati z raznimi metodami, prav tako različni razredi polimerov omogočajo preprostejše površinske modifikacije. Polimerni materiali, ki se uporabljajo v mikrofluidiki, se v glavnem delijo v tri skupine, to so silikonski elastomeri, duroplasti in termoplasti [10].
2.2.1 Silikonski elastomeri
Silikonski elastomeri, katerih glavni predstavnik je PDMS (slika 3), so postali eden od najbolj priljubljenih materialov za izdelavo mikrofluidnih čipov [10]. Ti materiali so priljubljeni zaradi nizke cene, preprostega obdelovanja (slika 4), biokompatibilnosti, nestrupenosti, dobre kompatibilnosti s topili in visoke trpežnosti [8]. Prednost materialov, kot je PDMS, pred termoplasti je ta, da ti materiali omogočajo integracijo funkcionalnih enot, kot so mikroventili, mikročrpalke in mešala kot integralni del reaktorjev [8, 10].
PDMS ima visoko prepustnost za kisik in ogljikov dioksid, zaradi česar je zelo primeren za gojenje aerobnih organizmov [8]. Prav tako kaže dobro prepustnost za svetlobo v vidnem delu spektra, kar omogoča optične meritve in opazovanje organizmov v čipu v realnem času [8, 10]. Ima pa tudi določene pomanjkljivosti; njegova prepustnost za pline lahko vodi do pretiranega izhlapevanja, hidrofobnost njegove površine pa lahko povzroči neželeno absorpcijo določenih molekul. Te težave je mogoče rešiti s površinskimi modifikacijami, kot je obdelava s plazmo, surfaktanti, ozonom ali UV-sevanjem [8].
Slika 3: Struktura PDMS [4]
5
Slika 4: Izdelava delov za mikrobioreaktor iz PDMS: na jedkano silicijevo ploščo se nanese sloj tekočega PDMS, ki se nato strdi, za tem se del odlušči s plošče in se ga uporabi pri izdelavi mikropretočne naprave [4].
2.2.2 Duroplasti
Poleg odpornosti proti povišanim temperaturam so duroplasti odporni proti večini topil in so sposobni prepuščati svetlobo. Ob uporabi primernih vezivnih sredstev je mogoče mikropretočne naprave v celoti izdelati iz duroplastov. Zaradi visoke trdnosti duroplastov je mogoče iz njih izdelovati prostostoječe strukture in strukture z visokim presečnim razmerjem. Iz teh snovi je prav tako mogoče izdelovati mikronaprave z vgrajenimi deli, kot so ventili in črpalke [10].
2.2.3 Termoplasti
Za razliko od duroplastov je termoplaste mogoče obdelovati pri povišani temperaturi.
Nekateri pogosto uporabljeni termoplasti, kot so polikarbonat (PC), polistiren (PS), poli- terafluoroetilen (PTFE oz. teflon), PMMA oziroma organsko steklo in polietilen tereftalat (PET) so dobri materiali za izdelavo naprav, ki omogočajo opazovanje celic v mikropretočnih sistemih. Slabost termoplastičnih materialov je ta, da niso odporni proti večini organskih topil, kot so na primer alkani, prav tako pa njihova neprepustnost za pline te materiale naredi neprimerne za dolgoročno gojenje celic. Zaradi njihove težavne uporabe, rigidnosti po oblikovanju in visoke cene se termoplasti ne uporabljajo pogosto pri izdelavi mikropretočnih naprav [10].
2.3 Hidrogeli
Hidrogeli nastanejo ob zamreženju tridimenzionalnih hidrofilnih polimernih verig v vodi.
Takšen material ima številne porozne strukture, ki omogočajo difuzijo bioloških molekul in manjših molekul, kar privede do visoke vsebnosti vode, preprostejšega transporta snovi in boljšega uspevanja celic. V mikropretočnih sistemih so bili uporabljeni naravni in sintetični hidrogeli. Dva pogosta sintetična polimera, ki se uporabljata za te namene, sta polilaktična kislina in polietilen glikol. Naravni materiali, ki se pogosto uporabljajo za ta namen, pa so kolagen, kalcijev alginat, celuloza, želatina in hitozan. Celice se praviloma lažje pritrdijo na hidrogele živalskega izvora in težje na hidrogele rastlinskega in
6
sintetičnega izvora. Hidrogele je mogoče uporabiti tudi za izdelavo kompleksnejših tridimenzionalnih notranjih struktur za vgradnjo v mikropretočne naprave [10].
2.4 Papir
Mikropretočne naprave na osnovi papirja so zanimivo področje zaradi njihove preproste dostopnosti, obdelave, modifikacij in odstranitve. Ta tehnologija ima velik potencial za uporabo v klinični diagnostiki, nadzoru kakovosti hrane in okoljskem monitoringu.
Prednosti papirja so nizka cena, široka dostopnost in preprosta izdelava čipov s tiskanjem in nalaganjem slojev papirja. Papir ima dobro biokompatibilnost, njegova bela barva pa ustvari dobro ozadje za teste, pri katerih je prisotna sprememba barve. Papir ima dober kapilarni učinek, kar omogoča transport tekočin brez potrebe po črpalki. Papirnati čipi so tudi okolju prijazni, saj se jih je po uporabi mogoče znebiti s sežigom ali kompostiranjem.
Papirnati čip priskrbi dobro platformo za hitro in preprosto zaznavanje bakterij, kot so Escherichia coli, Salmonella typhimurium in Listeria monocytogenes [10].
7
3 Delovanje mikropretočnih naprav
Mikropretočni sistemi so v splošnem sestavljeni iz skupine delovnih enot: naprave za dovajanje reagentov in vzorcev, naprav za črpanje teh tekočin po čipu, naprav za mešanje in kombiniranje teh tekočin in merilnih naprav, kot so naprave za mikroskopijo. Preprosti kontrolni sistemi, kot so brizgalke ali regulatorji tlaka, omogočajo nadzor nad tem, kdaj in kako hitro se določene tekočine pretakajo. Poleg zagotavljanja konstantnega pretoka v mikrokanalih kompleksnejše uporabe zahtevajo sistematičen nadzor prostorskih in časovnih parametrov toka znotraj naprave. Eden od mehanizmov preusmerjanja tekočine v čipu je fizično spreminjanje omrežja kanalov z uporabo ventilov. Za ustvarjanje ventilov in črpalk se najpogosteje uporablja večslojna mehka litografija. Poleg aktivnih sistemov za nadzor pretoka so bile razvite tudi naprave, ki uporabljajo pasivne načine za nadzor pretoka, kot sta nadzor smeri toka s kemičnim pogonom in mikroskopski nadzor pretoka z uporabo vodne raztopine viskoelastičnega polimera kot delovne tekočine.
Razvit je bil tudi pristop, ki temelji na pasivnem črpanju tekočine s pomočjo površinske napetosti, a ta tehnika zahteva natančno odmerjanje tekočin, prav tako pa je občutljiva za različne okoljske dejavnike, kot sta vlažnost in temperatura [11].
3.1 Črpalni mehanizmi
Razvoj mikročrpalk je ključnega pomena za izgradnjo dobro delujočih mikropretočnih naprav, ker mikropretočni sistemi zahtevajo učinkovit in zanesljiv sistem za črpanje veliko različnih vrst tekočin in plinov. Na mikropretočni napravi mikročrpalke skrbijo za premikanje gojišča in celic v sistemu in prenos vzorcev od enega predela mikropretočne naprave do drugega. Uporaba mikročrpalk je idealna za pomnoževanje mikrobioreaktorjev. Večina mikročrpalk, ki so bile do zdaj razvite, so mehanske s premikajočimi se deli ali nemehanske brez premikajočih se delov. Mehanske črpalke so opisane kot aktivne, ker porabljajo energijo za boljši nadzor nad povprečnim tokom.
Pretok v teh napravah je pogosto pulzirajoč in njihova izdelava je relativno zapletena.
Večina črpalk te vrste je zunanjih brizgalk ali peristaltičnih črpalk, ki so preproste, poceni in praktične, a niso vedno primerne pri kompleksnejših in paralelnih operacijah.
Nemehanske črpalke proizvajajo pretok, ki ne pulzira, in lahko priskrbijo širok razpon različnih pretokov pri nizkem pritisku. Izdelava nemehanskih črpalk je cenejša in manj kompleksna kot izdelava mehanskih črpalk, zaradi česar so primernejše za masovno proizvodnjo. Te črpalke najpogosteje temeljijo na osmotskem pritisku, izhlapevanju in površinski napetosti. Priljubljen način za premikanje tekočine v mikropretočnih napravah je tudi elektroosmotski tok, ki temelji na aplikaciji razlike med električnima potencialoma na nasprotnih koncih mikropretočne naprave. Uporaba elektroosmotskega toka je preprosta, hitra in mogoča brez uporabe mehanskih elementov in ventilov, a je njena slabost ta, da se zanaša na visoke električne napetosti [4].
Procese v mikrobioreaktorjih je mogoče voditi v šaržnem, polšaržnem in kontinuirnem načinu. S šaržnimi procesi je najlažje ravnati, saj je pri teh procesih treba samo nadomeščati izhlapelo hranilno tekočino. Pri polšaržnih in kontinuirnih pa je poleg nadzora nad izhlapevanjem potrebno tudi nadzirati vtok in iztok iz reaktorja. Če se
8
uporablja pasivno nadomeščanje vode, je potreben ventil, ki preprečuje, da bi bil vtok gojišča potisnjen iz naprave skozi dovod za vodo. Če se uporablja aktivno dovajanje vode s črpalko, pa je potrebno natančno nadziranje hitrosti izhlapevanja, ker bi razlika v dovajanju in izhlapevanju vode pripeljala do pretiranega redčenja ali koncentriranja gojišča. Pri reaktorjih, ki delujejo v kontinuirnem načinu, je nadzor nad dovajanjem vode mogoče voditi tako, da se pretok na vstopu v reaktor izenači s pretokom na izstopu iz reaktorja. Za dovajanje svežega gojišča se najpogosteje uporabljajo zunanje brizgalke ali peristaltične črpalke, to dovajanje pa pri kontinuirnem delovanju zaradi fiksnega volumna reaktorja hkrati potiska enako količino gojišča zunaj reaktorja. Ta sistem je preprost za uporabo v laboratorijskem merilu, a se težave pojavijo pri paralelizaciji. Lahko se uporabi eno črpalko za več reaktorjev, kar privede do enakega pretoka skozi vse reaktorje, če se ne uporabi zapletenejšega sistema za razcep toka. Ena od možnih rešitev je uporaba sistema mikročrpalk in mikroventilov, katerih delovanje se nadzira s stisnjenim zrakom.
To omogoča različne pretoke skozi reaktorje, a tudi znatno zaplete izdelavo sistema [8].
3.2 Povezave reaktorjev z zunanjostjo
Pri reaktorjih, sestavljenih iz slojev polimetilmetakrilata (PMMA) in PDMS, so pretočne povezave večinoma vzpostavljene v trdnem (PMMA) sloju reaktorja, ker to omogoča dobro povezavo. Pri najpreprostejšem pristopu se v sloj PMMA vstavi in prilepi igla, ki je povezana s cevčico ali brizgo. Naprednejša rešitev vključuje okrogle tesnilke, ki so nameščene v sloj PMMA, skozi katere se lahko vstavi rigidne cevčice. Ta metoda omogoča odklapljanje in ponovno vzpostavljanje povezave ter doseganje poljubne globine v reaktorju s cevčico. Mogoča je tudi z uporabo specializiranih konektorjev za standardni sestav cev-matica (slika 5). Tak sistem ima zelo majhen in dobro definiran mrtvi volumen in lahko priskrbi rešitev za preprost priklop povezav na mikrobioreaktorske sisteme, a je relativno drag. Pri reaktorjih, sestavljenih iz PDMS, je mogoče vzpostaviti povezavo tako, da se iglo preprosto potisne skozi sloj PDMS, pri čemer kontaktni pritisk med iglo in materialom samodejno zatesni povezavo (slika 6). Ta rešitev je poceni in preprosta, a lahko nepravilno vstavljanje igle ogrozi pravilno delovanje reaktorja [8].
Slika 5: Povezava med reaktorjem in zunanjostjo z uporabo konektorjev cev-matica [8]
9
Slika 6: Povezava med reaktorjem in zunanjostjo, pri kateri je igla potisnjena skozi sloj PDMS [8]
3.3 Mešanje v mikrobioreaktorjih
Za doseganje pravilnega delovanja tako proizvodnih bioreaktorjev kot mikrobioreaktorjev sta potrebna zadostna prenosa snovi in toplote [8]. Prenos snovi in dovajanje energije močno vplivata na delovanje bioreaktorjev, pri gojenju aerobnih mikroorganizmov pa je še posebej pomemben zadosten prenos kisika [12]. Mešanje je ena od najpomembnejših operacij pri potopljenem gojenju, saj temeljitost mešanja neposredno vpliva na razporejenost substrata in mikroorganizmov znotraj reaktorja ter rast mikroorganizmov in kakovost meritev. Optimalno mešanje zagotavlja enakomerno temperaturo znotraj reaktorja. V manjših reaktorjih postane mešanje težavnejše, ker postane vzpostavitev turbulentnih pogojev, ki so povezani z dobrim mešanjem, nemogoča. Razlog za to je majhno Reynoldsovo število, ki ga povzroča majhna karakteristična dolžina. Poleg tega postane vpliv prostorskih mej bolj opazen zaradi večjega vpliva molekulskih sil in večjega deleža celic, ki rastejo na stenah, v primerjavi z npr. namiznim fermentorjem. Za najboljše mešanje je treba vzpostaviti kompromis med zagotavljanjem homogenih pogojev in izogibanjem poškodb celic. Mešanje je močno odvisno od vrste proizvodnega mikroorganizma, ker se nekateri organizmi posedajo hitreje kot drugi, nekateri pa so bistveno robustnejši kot drugi. Mešanje v mikropretočnih napravah je mogoče izvajati z aktivnimi metodami, ki uporabljajo gibljive dele za mešanje tekočine, in pasivnimi metodami, ki ne uporabljajo gibljivih delov, prav tako pa lahko k mešanju prispeva tudi plavanje mikrobov [8, 13].
3.3.1 Aktivno mešanje
Ko je uporabljeno aktivno mešanje, je treba upoštevati, da je po navadi v mikrobioreaktorjih zapolnjen njihov celotni volumen, zaradi česar bi stresanje celotne naprave premaknilo le majhen delež tekočine. Zaradi tega je v takšnih reaktorjih treba povzročiti mešanje znotraj reaktorske komore, kar hkrati pripomore k ohranjanju mikroorganizmov v suspenziji. Mešala v mikrobioreaktorjih so podobna tistim v večjih reaktorjih in so sestavljena iz prečke, ki je nameščena na rigidnem navpičnem drogu (slika 7). Ti sistemi ustvarjajo dobro mešanje, a jih je treba izdelati zelo natančno, poleg tega pa niso zmožni popolnoma odpraviti mrtvih con. Kot preprostejša alternativa temu sistemu je bila predstavljena zamenjava mešal z jeklenimi kroglicami, s čimer se je
10
mogoče izogniti zahtevam po natančni obdelavi, a se mešanje z jeklenimi kroglicami slabše obnese pri visokih koncentracijah celic. Aktivno mešanje je mogoče doseči tudi s premikanjem sten reaktorske komore, in sicer z vgradnjo napihljivih zračnih blazin v zgornjo steno reaktorske komore. Z napihovanjem in praznjenjem teh blazin se doseže peristaltično premikanje tekočine, kar poskrbi za zadostno mešanje. Ti sistemi so primerni za proizvodnjo velikih količin, a njihova zapletenost prispeva k višjim proizvodnim stroškom [8].
Slika 7: Mešanje barvila fenol rdeče v mikropretočni napravi z uporabo aktivnega mešanja, razporeditev barvila ob injiciranju, 6 sekund po injiciranju, 12 sekund po injiciranju in 30 sekund po injiciranju [8]
3.3.2 Pasivno mešanje
Pasivno mešanje se deli na molekulsko difuzijo in kaotično advekcijo. Pri molekulski difuziji se izkorišča naravno Brownovo gibanje molekul, pri čemer se dobro mešanje dosega z velikimi medfaznimi površinami, velikimi gradienti in visokimi difuzijskimi koeficienti. Velike medfazne površine je mogoče doseči na primer z vzporednim vodenjem več različnih tokov, podobno kot bi nalagali liste papirja enega na drugega, kar poskrbi za to, da postane molekulska difuzija učinkovitejša. Kaotična advekcija še izboljša mešanje z raztegovanjem, prepogibanjem in razdiranjem tokov tekočin, kar je doseženo z vsiljevanjem transverzalnega gibanja glede na tok tekočine; to je mogoče doseči z izdelavo ovir, ki se jih vstavi v kanale. Za pasivno mešanje je potreben tok reakcijske zmesi skozi mikrokanale (slika 8). Molekulsko difuzijo se da ojačati z vzporedno laminacijo, kjer se tok reakcijske zmesi razcepi na več tokov, ki se jih nato združi v različnem redu. To poskrbi za dobro mešanje, a znatno poveča potrebno dolžino kanala. Kaotična advekcija je zmožna znatno zmanjšati potrebno dolžino kanala in posledično izboljšati učinkovitost mešanja. Ena od možnih metod je uporaba mešalne strukture v obliki zamaknjene ribje kosti, ki tekočini vsili transverzalno vrtinčenje. Še ena možna rešitev je povečevanje hitrosti toka tekočine do te mere, da tok ni več laminaren in se približuje prehodnemu območju. To je mogoče v nadaljevanju še izboljšati z ekscentrično namestitvijo vstopne in izstopne odprtine, kar tekočini vsiljuje vrtinčenje in
11
s tem izboljša premešanje. Pasivno mešanje odpravi potrebo po aktivnem mešanju v reakcijski komori, a doda zahteve po napravah, kot so črpalke za premikanje tekočine skozi mešalne elemente in ventili za ločevanje tokov, prav tako pa se je tudi pri pasivnem mešanju potrebno izogibati ustvarjanju mrtvih con [8].
Slika 8: Učinek pasivnega mešalnega elementa v obliki zamaknjene ribje kosti. En cikel mešanja je sestavljen iz dveh zaporednih regij z mešalnimi strukturami. Smer asimetričnosti glede na centralno linijo kanala se spreminja med eno
in drugo regijo [8].
3.4 Prezračevanje in izhlapevanje
Prezračevanje je pomembno za izvajanje aerobnih procesov in se ga izvede pri skoraj vseh mikrosistemih preko tanke membrane iz PDMS, kar omogoča prenos kisika in drugih plinov z zadostnim pretokom, hkrati pa zagotavlja sterilnost reakcijske zmesi. Če so ostali deli reaktorja izdelani iz PDMS, potem postane ravnanje s tanko membrano zelo preprosto, ker jo je mogoče pritrditi neposredno na druge elemente iz PDMS. Ker membrane prepuščajo tudi druge molekule, kot je npr. voda, kar lahko povzroča težave, npr. povečevanje koncentracije celic, substratov in produktov ter pojav plinskih mehurčkov v reaktorju, je treba preprečiti ali minimizirati izhlapevanje vode ali poskrbeti za kontinuirno dovajanje vode, ki nadomesti izhlapeli volumen. V večini primerov se uporabi prvi pristop, in sicer tako, da se celoten reaktor postavi v komoro s povečano vlažnostjo, s čimer se izhlapevanje zniža do zanemarljivih količin, a se hkrati oteži dostop do reaktorja in se zahteva, da so vse povezave do reaktorja speljane v komoro. Druga rešitev je pasivno nadomeščanje izhlapele vode tako, da se reaktor poveže z dvignjenim vodnim rezervoarjem, kar učinkovito drži količino vode v reaktorju na konstantni ravni, a hkrati poveča tveganje za kontaminacijo. Ta način je težaven za uporabo tudi v primeru, da se sistem vodi v kontinuirnem ali polšaržnem načinu, kar ustvari dovod ali odvod z nedefiniranimi lastnostmi. Iz tega razloga je pri kontinuirnih in polšaržnih procesih preprečevanje izhlapevanja boljša rešitev [8].
12
13
4 Zaznavanje in nadzor procesnih spremenljivk
Zaznavanje in nadzor sta ključnega pomena za pridobivanje dobrih rezultatov pri poskusih v mikrobioreaktorjih, saj sta hitrost rasti in produktivnost proizvodnih mikroorganizmov močno odvisna od pogojev, kot sta temperatura in vrednost pH. Nadzor nad temi spremenljivkami je ključnega pomena za zagotavljanje optimalnih pogojev za rast proizvodnega mikroorganizma [8]. Zaznavanje in nadzor razmer v mikrobioreaktorjih sta težavna zaradi prostorskih omejitev, majhnih delovnih volumnov in možnega vpliva same meritve na spremenljivke. Iz teh razlogov se uporablja čim manj invazivne in destruktivne metode, kot so na primer fluorescenčne meritve z optičnimi senzorji, ki odpravijo potrebo po vzorčenju snovi v reaktorjih, spektroskopske metode in slikovna analiza [7, 12, 14].
4.1 Temperatura
Temperatura v mikrobioreaktorjih se najpogosteje meri s pomočjo termistorjev ali termočlenov. Termistorji so poceni in lahko dostopni, ker pa so majhni, jih je preprosto namestiti blizu reaktorske komore za natančno merjenje temperature reakcijske zmesi.
Termistorji so natančni in zmožni dolgotrajnega delovanja. Spremljanje temperature v mikrobioreaktorjih je večinoma preprosto, a je relativno zapleteno zaradi visokega razmerja med površino in delovnim volumnom, zaradi česar je prenos toplote v mikrobioreaktorjih zelo učinkovit in hiter, izguba toplote pa pri takšnih merilih neizogibna. Pomembno je namestiti grelni element na položaj, kjer ne bo ustvarjal velikega temperaturnega gradienta, kar poskrbi za enakomerno temperaturo v reaktorski komori. Namesto grelnega elementa je mogoče temperaturo zelo preprosto nadzirati tako, da se reaktor namesti v sobo ali inkubator, kjer je temperatura konstantna. To omogoča sočasno delovanje velikega števila reaktorjev pri enaki temperaturi, a izvajanje sočasnih eksperimentov pri različnih temperaturah ni mogoče. Druga metoda omogoča nadzor temperature z uporabo vodne kopeli, s pomočjo katere se preko talne plošče reaktorja prečrpava termostatirana voda, a to poveča zapletenost sistema in predstavlja tudi nevarnost puščanja vode. Boljši način nadziranja temperature je mogoč z vgradnjo mikrogrelca na tiskano vezje, ki se ga nato prilepi na spodnjo stran reaktorja tako, da je grelec blizu termistorjev, kar omogoča dobro spremljanje temperature. Ker so reaktorji najpogosteje slabo temperaturno izolirani, je potrebna dobro delujoča povratna zanka za nadzor temperature [8].
4.2 Vrednost pH
Spremljanje vrednosti pH je pomembno, saj so od nje odvisni dejavniki, kot sta aktivnost encimov ter stabilnost substratov in produktov [14]. Standardne sonde pH so prevelike za uporabo v mikrobioreaktorjih, zato se v teh primerih najpogosteje uporabljajo optični senzorji, ki temeljijo na optičnih senzorskih točkah oz. optodah (slika 9). Zaradi njihove preproste vgradnje, neinvazivnosti, nizke cene in odsotnosti potrebe po referenčnem elementu so optični senzorji dobra rešitev. Ta metoda ima relativno ozek dinamični razpon, tipično med 2 in 4 enote pH, a se senzorji s podaljšano izpostavitvijo svetlobi čez čas poškodujejo, kar zmanjšuje njihovo življenjsko dobo. Optični senzorji imajo natančnost merjenja približno 0,01 enote pH in odzivni čas manj kot 90 sekund, zmožni
14
pa so delovanja v temperaturnem območju med 0 in 50 ºC. Večina senzorskih točk ima merilno območje med pH-vrednostma 4 in 9 in nelinearen odziv, ki se kaže v slabi občutljivosti na robovih merilnega območja. Druga možnost za spremljanje vrednosti pH so senzorski čipi ISFET (angl. ion-sensitive, field effect transistor). Te naprave pokrivajo širok razpon vrednosti pH, tipično med 2 in 12, in imajo linearen odziv, podoben odzivu klasične sonde pH. Njihova merilna natančnost je približno 0,01 enot pH, njihov odzivni čas pa je manj kot ena sekunda. Zmožni so delovati v širokem temperaturnem območju (med –45 in 120 ºC) in imajo širši dinamični razpon meritev ter večjo občutljivost kot senzorske točke. Za izvajanje meritev pH potrebuje čip referenčno elektrodo ISFET, kot je na primer elektroda Ag/AgCl. Nadziranje vrednosti pH v reaktorjih je mogoče z uporabo pufra ali z dodajanjem kisline oziroma baze. Uporaba pufra včasih ni najboljša rešitev, saj ima omejeno zmožnost za kompenziranje sprememb vrednosti pH, kar večinoma ni težava pri kontinuirnih procesih, lahko pa je pri šaržnih [8]. Vrednosti pH je mogoče uravnavati z vbrizgavanjem baze ali kisline, a je pri uporabi te metode potrebna pazljivost, ker dodajanje prekomerne količine kisline ali baze lahko razredči gojišče, kar moti meritve koncentracij. Za zmanjševanje potrebnega volumna kisline ali baze se lahko uporabi močnejšo kislino ali bazo, a to lahko še posebej ob slabem mešanju privede do ekstremov vrednosti pH na določenih lokacijah, kar negativno vpliva na celice [8, 15]. Te pomanjkljivosti je mogoče rešiti z uporabo nadzora pH s pomočjo plinov, pri katerem se v reakcijsko zmes dodaja amonijak ali ogljikov dioksid z neposrednim vbrizgavanjem ali prehajanjem skozi polprepustno membrano [8].
Slika 9: Element mikrobioreaktorja z vgrajenimi fluorescenčnimi senzorskimi točkami in organskimi fotodiodami (OPD) [14]
4.3 Koncentracija celic
Pri poskusih v mikrobioreaktorjih se za ocenjevanje koncentracije celic z optičnimi instrumenti najpogosteje uporablja Beer-Lambertov absorpcijski zakon. Izmerjena absorbanca je večinoma povezana s suho težo organizmov ali številom celic v določenem volumnu. Meritve se najpogosteje izvaja z optično sondo, kjer se svetlobo iz LED diod z
15
optičnimi vlakni spelje skozi reaktorsko komoro in nato vodi na fotodetektor. Valovna dolžina, ki se pri teh meritvah uporablja, ima navadno valovno dolžino med 400 in 700 nm. Večina naprav svetlobo pošilja z dna naprave in jo zbira na vrhu, pri čemer je dolžina poti med 0,3 in 2 mm. Za izboljšanje natančnosti meritev pri nizkih koncentracijah biomase je mogoče svetlobo voditi skozi reaktor v vodoravni smeri, kar da daljšo pot svetlobe. Meritev optične gostote je lahko občutljiva za dejavnike, kot so mehurčki v reaktorju in svetloba iz okolice, poleg tega pa meritve optične gostote niso zmožne ločevati med živimi in mrtvimi celicami. Optično merjenje koncentracije celic je mogoče izvajati tudi z bližnjo infrardečo spektroskopijo, a ta metoda zahteva obsežno obdelavo signalov, oprema zanjo pa je relativno draga [8].
4.4 Določanje vsebnosti kisika
Kisik je eden izmed substratov aerobnega metabolizma, zato je nadzor nad njegovo koncentracijo pomemben za pravilno delovanje procesa. Koncentracijo raztopljenega kisika v mikrobioreaktorjih se v večini primerov meri z optičnimi senzorji s pomočjo fluorescenčnih senzorskih točk. Ta metoda meritve je uporabna v celotnem koncentracijskem območju, a se najbolje obnese pri nizkih koncentracijah, kar je v relevantnem obsegu pri večini procesov. Prav tako je poceni, preprosta za integracijo in neobčutljiva za okoliško svetlobo. Druga mogoča metoda za merjene koncentracije raztopljenega kisika je uporaba ultramikroelektrod, to so amperometrični senzorji, ki merijo koncentracijo kisika na podlagi elektrokemične redukcije kisika. Za dovajanje zadostnih količin kisika v sistemu brez mehurčkov je potrebna velika medfazna površina, kar je v mikropretočnih sistemih lahko zagotoviti. Pri dovajanju kisika preko polprepustne membrane je pomemben tudi prenos s kisikom bogatega gojišča proč od membrane, kar je mogoče olajšati z znatnim povečanjem koncentracije kisika v plinasti fazi in s povečevanjem tlaka plinaste faze, kar pospeši difuzijo [8]. Standardna mera za učinkovitost prenosa kisika je volumetrični koeficient prenosa kisika kLa, ki je eden od najpomembnejših dejavnikov pri povečevanju procesov [8, 15].
4.5 Določanje vsebnosti ogljikovega dioksida
Spremljanje količin ogljikovega dioksida v bioprocesih je pomembno, ker ogljikov dioksid na več načinov vpliva na rast mikrobov [16]. Izpuste ogljikovega dioksida se pogosto meri pri namiznih bioreaktorjih, zaradi majhnih količin, proizvedenih v mikrobioreaktorjih, pa je pri takšnih sistemih merjenje težavno. Te meritve je mogoče izvajati s pomočjo senzorskih točk, podobne tistim, ki so opisane pri merjenju vrednosti pH in koncentracije kisika [8]. Razvita je bila tudi neinvazivna metoda za optično zaznavanje ogljikovega dioksida, ki temelji na zaplati fluorescenčnega barvila, naneseni na polprepustno silikonsko membrano [8, 16].
4.6 Spektroskopsko določanje koncentracij snovi
Spektroskopija z optičnimi metodami ponuja možnost ocene koncentracij raznih analitov, kot so na primer glukoza, acetat in laktat. Primerna obdelava signala in evaluacija podatkov s kemometričnimi metodami omogočata oceno koncentracije analita [8]. Pri uporabi infrardeče spektroskopije v mikropretočnih napravah se pojavijo težave, saj
16
veliko materialov, iz katerih so izdelani mikropretočni čipi, nima dobre prepustnosti za daljše valovne dolžine infrardečega spektra. Ramanska spektroskopija je dobra analizna tehnika za uporabo v mikropretočnih napravah, saj voda pri uporabi te tehnike ne povzroča skoraj nobene interference, a je treba pazljivo izbrati material in debelino substrata, da se minimizira fluorescenca v ozadju. V mikrokanalih majhnega volumna nekateri analiti oddajajo zelo šibke signale, zaradi česar se pojavi potreba po visokih koncentracijah ali dolgih časih analize [17]. Uporaba Ramanske spektroskopije je tudi dražja od infrardeče spektroskopije [8].
17
5 Gojenje bakterij v mikrobioreaktorjih
Gojenje bakterij v kanalih je ena od najpogosteje uporabljenih metod zaradi fleksibilnosti zasnove kanala (slika), preprostosti izdelave naprave in možnosti spremljanja reakcije v realnem času. Gojenje bakterij v mikrokanalih zagotavlja popoln stik gojišča z bakterijo, zaradi šibke pritrditve bakterij pa je treba pretok tekočine uravnati na raven, ki zagotovi, da tok gojišča bakterij ne odplakne iz kanala. Glavni namen gojenja bakterij v kanalih je preučevanje hitrosti rasti, kemotaksije in občutljivosti bakterij z dolgotrajnim spremljanjem. S takšnimi napravami je mogoče dolgotrajno spremljanje programiranega obnašanja bakterijskih populacij in poceni, dolgoročno visokoločljivostno raziskovanje fenotipskih lastnosti številnih različnih sevov celic. Dokazano je bilo, da celice, gojene v takšnih in podobnih napravah, rastejo znatno hitreje kot na primer v stresanih kulturah, kar je mogoče pojasniti s tem, da konstanto okolje znotraj mikropretočnega čipa zagotovi optimalne pogoje za rast celic, v primerjavi s stresanimi kulturami, v katerih so celice izpostavljene neprestanemu spreminjanju koncentracij [6, 10]. Gojenje v kanalu je relativno preprosta metoda, ki je lahko vzporedno povezana s številnimi analiznimi napravami za spremljanje reakcije v realnem času, zaradi česar ima edinstvene prednosti pri analizi bakterijskih lastnosti in metabolitov [10].
Slika 10: Mikropretočni čip za gojenje bakterij v kanalčkih, za primerjavo velikosti je zraven postavljen kitajski kovanec za 1 juan [5]
5.1 Preučevanje bakterijske kemotaksije
Kemotaksija je odziv gibljivih celic na kemijske gradiente v njihovem okolju in migracija proti večjim koncentracijam kemoatraktanta (pozitivna kemotaksija) ali proč od višjih koncentracij repelenta (negativna kemotaksija). Razumevanje bakterijske kemotaksije je pomembno pri uporabi bakterij za reševanje okoljskih problemov (in situ biološka dekontaminacija, fiksiranje dušika, pridobivanje nafte z mikrobi), nadzor okužb s patogeni, razvoj mikrobnih industrijskih projektov in razumevanje premikanja bakterij v zemlji [10, 18]. S preučevanjem bakterijske kemotaksije je bilo ugotovljeno, da bakterije, ki prebivajo v podtalnici, kažejo kemotaksijo proti polutantom, kot so ogljikovodiki, kar
18
je lahko uporabno pri bioremediaciji [18]. Mikropretočne naprave so sposobne izvajati kvalitativno in kvantitativno zaznavanje bakterijske kemotaksije. V primerjavi s tradicionalnimi metodami imajo mikropretočni testi natančen nadzor nad bakterijskim mikrookoljem in boljšo občutljivost. Koncentracijski gradient v kanalu je ključnega pomena za preučevanje kemotaksije in glede na metodo ustvarjanja gradienta se mikropretočne naprave za preučevanje bakterijske kemotaksije delijo na naprave, ki ustvarjajo gradient s pretokom, in naprave, ki ustvarjajo gradient s pomočjo difuzije [10].
5.1.1 Preučevanje kemotaksije v pretoku
Naprave z dinamičnim tokom so sposobne v kanalu v svoji notranjosti ustvarjati kemični gradient, ki temelji na laminarnem toku. Spreminjanje strukture kanala in hitrosti tekočine lahko hitro ustvari več stabilnih koncentracijskih gradientov [18]. V mikropretočnih napravah, ki so povezane v obliki črk T in Y, se tekočini z različnima koncentracijama in sestavama združita v istem kanalu, med njima pa se oblikuje medfazna površina, skozi katero med tokom po kanalu difundira topljenec, kar povzroči nastanek koncentracijskega gradienta [10]. Prva naprava takšne vrste je imela povezavo v obliki črke T in tri dovode, skozi katere se je dovajalo raztopino kemoefektorja, raztopino, ki je vsebovala celice, in pufer. Koncentracijski gradient se je ustvaril v smeri pravokotno na tok. Na koncu naprave so celice vstopile v enega od 22 odvodov, glede na razdaljo, ki so jo prepotovale v gradientu, s čimer je bilo mogoče izvesti kvalitativno in kvantitativno analizo bakterijske kemotaksije. Ta naprava je imela to pomanjkljivost, da sta hitrost toka in turbulentnost v kanalu lahko negativno vplivali na oblikovanje gradienta, kar je povzročilo slabo natančnost meritev. Za premagovanje pomanjkljivosti te naprave je bila izdelana naprava s kanalom v obliki črke T s samo dvema dovodoma, pri kateri sta oba vstopna tokova vsebovala približno enako koncentracijo bakterij, za spremljanje koncentracijskega gradienta bakterij v kanalu pa se je uporabljalo zaznavanje s sipanjem svetlobe. Tretja vrsta naprave za preučevanje kemotaksije ima povezavo v obliki črke Y s tremi vhodi, skozi katere v napravo pritekajo raztopina kemoefektorja, raztopina pufra z bakterijami in raztopina pufra, ob robu kanala pa so koncentratorske strukture, v katere se ujamejo bakterije, s čimer je mogoče preučevati premikanje bakterij glede na gradient.
Generacija gradienta v mikropretočnih čipih je mogoča tudi preko generatorja gradienta v obliki novoletne jelke, v katerem se tokova kemoefektorja in puferske raztopine preko več stopenj razcepita, premešata in ponovno kombinirata. Po več stopnjah je v vsakem toku drugačna koncentracija kemoefektorja, in ko se ti tokovi ponovno združijo v kanalu, se ustvari dobro definiran gradient. V ta gradient se nato vstavi tok tekočine, ki vsebuje bakterije. S to metodo se je mogoče izogniti poškodbam bakterij zaradi hitrih izpostavljenosti visokim koncentracijam kemoefektorja ter zagotavljati, da imajo celice zadosten čas za odziv na gradient (slika 11). Strižne sile v kanalih lahko negativno vplivajo na bakterije, poleg tega pa na natančnost meritev negativno vpliva pretok v kanalu, kar zmoti gradient [10, 18].
19
Slika 11: Naprave za preučevanje bakterijske kemotaksije: (A) čip s tremi dovodi in 12 odvodi, razporejenimi v obliki pahljače; (B) naprava v obliki črke T z dvema dovodoma (C); mikrokanal v obliki črke Y s strukturami v obliki
puščice ob glavnem kanalu; (D) naprava z generatorjem gradienta v obliki novoletne jelke [18]
5.1.2 Preučevanje kemotaksije brez pretoka
Naprave za preučevanje kemotaksije brez pretoka so sposobne premagati pomanjkljivosti naprav z dinamičnim tokom in vzpostaviti statičen koncentracijski gradient z difuzijo v stabilnem okolju brez pretoka. Ta metoda lahko zmanjša vpliv zunanje tekočine na gibanje bakterij, a so njene pomanjkljivosti slab nadzor in fleksibilnost distribucije koncentracijskega gradienta. Porozne strukture med ali pod kanali iz materialov, kot so agaroza ali hidrogeli, so pomembne pri zagotavljanju stabilnega koncentracijskega gradienta kemoefektorjev pod pogoji brez pretoka. Obstajajo tri glavne vrste gradientnih struktur, ki jih ustvarjajo naprave z enim, dvema ali tremi kanalčki. V primeru metode z enim kanalčkom se vanj vbrizgata vzporedna tokova kemoefektorja in puferske raztopine, črpanje se nato ustavi in bakterije se bodo premikale glede na gradient, ki ga ustvari difuzija. Ta metoda je zelo preprosta, a gradienti, ki so tako ustvarjeni, niso dolgo stabilni.
Pri metodi, ki uporablja dva kanalčka (slika 12), se uporablja izvorni in ponikalni kanal, kar ustvari stabilen koncentracijski gradient v območju med kanaloma, kjer se nahajajo bakterije. Pri metodi, ki uporablja tri kanalčke (slika 13), se uporablja izvorni in ponikalni kanal za kemoefektor, med katerima je kanalček za gojenje bakterij, stene pa so iz polprepustnega materiala, kakršen je na primer hidrogel, ki je sposoben prepuščati kemoefektor [18].
20
Slika 12: Naprave za preučevanje kemotaksije, ki delujejo s pomočjo difuzije: (A) shema mikrokanala z ločenimi vstopnimi točkami za bakterije in kemoefektorje; (B) mikrokanal z opazovalnim kanalom in kanalčki iz agaroznega gela; (C) ilustracija strukture kanalčka v mikropretočni napravi, kjer barve odražajo koncentracije barvila glede na
položaj v napravi [18]
Slika 13: (A) Trije kanalčki, ki jih ločuje membrana, skozi katero prehaja topljenec; (B) shema naprave s tremi kanalčki, med izvirnim, testnim in ponikalnim kanalčkom je plast hidrogela; (C) shematski prikaz mikropretočne naprave za ustvarjanje linearnega in nelinearnega gradienta; (D) mikropretočni čip na osnovi hidrogela s tremi
kanalčki in mikroorganizmi znotraj tega čipa [18]
5.2 Analiza heterogenosti celičnih kultur
Konvencionalni celični testi merijo povprečen odziv populacije celic, pri čemer je domnevano, da povprečni odziv populacije dobro predstavlja odziv tipične celice v populaciji, a to lahko vodi do napačnih interpretacij. Dokazano je bilo, da celična heterogenost obstaja znotraj izogenih populacij oziroma populacij posameznih klonov.
Ta heterogenost je lahko rezultat različnih notranjih ali zunanjih dejavnikov. Celična heterogenost lahko močno vpliva na obnašanje in usodo celic, a te stvari lahko zakrije
21
povprečen odziv populacije. Ena od možnih rešitev tega problema je analiza populacije na ravni ene celice, a je za pridobitev primerne količine podatkov potrebna analiza velikega števila celic, za to pa visokozmogljivostna analiza [19]. Za potrebe gojenja in analiz so bili razviti razni mikropretočni bioreaktorji, enocelični habitati, vdolbine za ujetje celic in gojitvene komore. Ti sistemi se tipično ujemajo z dimenzijami posameznih celic [20].
5.2.1 Vrste mikroreaktorjev za študij posameznih celic
Za gojenje in preučevanje celic so bile uporabljene štiri različne vrste perfuzijskih mikropretočnih naprav, ki se jih lahko razvrsti glede na smeri v prostoru, v katere se lahko premikajo celice, in sicer 3D, 2D, 1D in 0D. Vse te naprave so sposobne delovati v kontinuirnem načinu, če je zagotovljeno zadostno hitro odstranjevanje celic, ko komore dosežejo maksimalno kapaciteto. Zasnova mikrokomor je zmožna zagotoviti stabilnejšo okolje za rast in razmnoževanje bakterij. Mikrokomore so povezane z glavnimi kanalčki preko ozkih mikrokanalčkov, skozi katere se v komore dovaja bakterijske celice in gojišče. Gojenje v mikrokomorah je zaradi stabilnejšega okolja primernejše za bakterije, ki zahtevajo točno določene pogoje gojenja. V primerjavi z gojenjem v mikrokanalčkih je relativno statičen proces, ki omogoča akumulacijo bakterij in gojenje osamljenih bakterij, kar je uporabno za testiranje odpornosti proti zdravilom in preučevanje morfologije bakterij. Strukture mikrokomor je mogoče zasnovati s strukturo labirinta, ki posnema kompleksne okoljske strukture, kot so prst, les, listna stelja ter živalska in rastlinska tkiva, to pa omogoča raziskovanje učinkov geometrije okolja na rast bakterij (slika 14) [10].
Slika 14: Mikrofluidika priskrbi dobro platformo za preučevanje mikrobne ekologije. V mikropretočnih napravah lahko posnemamo veliko lastnosti naravnih habitatov mikrobov: (1) več vtokov; (2) hidrogeli za vzpostavitev prostorskih gradientov; (3) zožitve in topološke značilnosti za preučevanje učinkov toka v poroznih okoljih; (4) lijakaste pregrade za ločevanje in koncentriranje plavajočih mikrobov; (5) mikroizdelane strukture za preučevanje bakterijske adhezije; (6) enocelične zaprte strukture za preučevanje rasti in razmnoževanja; (7) zaprte strukture za
preučevanje dinamike populacij mikrobov in konkurenco med njimi [13].
Prav tako lahko delujejo v šaržnem načinu ali v alternirajočih načinih, v primeru, da je zagotovljen zadosten nadzor nad pretokom. Manjše kot je število celic v določenem
22
volumnu, toliko natančneje je mogoče nadzirati okolje, ki obdaja celico. V 3D- in 2D- populacijah celic se hitreje pojavijo okoljska nehomogenost in razni gradienti kot v 1D- in 0D-sistemih, pri katerih se gojišče hitro menja. Pri izbiri primerne strukture za gojenje celic je treba upoštevati namen sistema in uporabljeni mikroorganizem (slika 15) [6].
Slika 15: Pregled različnih struktur za gojenje celic: nanolitrske komore za gojenje v 3D-komorah, pikolitrske 2D- komore za gojenje celic v enem sloju, femtolitrski kanalčki za 1D-linearno gojenje celic v vrsti, 0D-enocelične pasti
[20]
Tipično so te gojitvene komore razporejene vzporedno in v eni napravi je lahko tudi več tisoč regij za preučevanje. Med delovanjem se vanje v idealnem primeru vstavi samo ena celica, kar omogoča raziskovanje izogenih kolonij (slika 16).
Slika 16: Rast celic v gojitvenih komorah, številke prikazujejo čas v urah [21]
Ena od glavnih zahtev pri tej vrsti gojenja je preprosta in hitra inokulacija bakterij iz suspenzije v komore. Postopki inokulacije se razlikujejo in so v veliki meri odvisni od geometrije naprave. Večina postopkov temelji na naključnem ujetju celic, ko se v mikropretočno napravo dovaja suspenzija celic. Ta pristop ima to pomanjkljivost, da celice težko dosledno inokulira, zato so bile izumljene različne metode, pri katerih se je uporabljalo hipne spremembe tlaka za spreminjanje pretoka, inokulacijo bakterij s pomočjo centrifugalne sile, vstavljanje bakterij v komore z optično pinceto, ki je zelo natančna, a počasna metoda, in povezane kanalčke z nadzorovanim tlakom, ki aktivno potegnejo celice v gojitvena mesta, ter inokulacijo bakterij v gojitvena mesta s pomočjo zračnih mehurčkov [22].
23 5.2.2 Preučevanje rasti in morfologije
Rast celic je eden od najpomembnejših kazalcev učinkovitosti v biotehnoloških procesih.
Mikropretočni sistemi omogočajo preučevanje rasti mikroorganizmov ob konstantnem dovajanju svežega gojišča, brez odstranjevanja celic. Pri 3D- in 2D-sistemih se pojavijo težave pri identifikaciji in sledenju posameznim celicam, še posebej v gosto združenih mikrokolonijah, zaradi česar se pojavi potreba po napredni programski opremi za analizo slik. Prav tako je potrebno ločevanje celic glede na njihovo velikost pri ugotavljanju hitrosti rasti izključno iz števila celic in ne iz površine ali volumna celic. V velikih in tesno strnjenih 2D-mikrokolonijah se lahko pojavijo gradienti, ki povzročijo velike variacije v celicah. Koncept ''matičnega stroja'' (slika 17) je bil predstavljen za preprosto in elegantno gojenje mikrobnih celic v slepih 1D-mikrokanalčkih, kar premaga nekatere omejitve prej omenjenih sistemov. Kanalčki matičnega stroja so zmožni vsebovati nekaj celic v vrsti, medtem ko so matične celice ujete na zaprtem koncu mikrokanalčka.
Konstantne pogoje v teh strukturah se zagotavlja z učinkovito difuzijo iz glavnega kanala v gojitvene kanalčke. Zaradi natančne postavitve več vzporednih gojitvenih kanalčkov je samodejna slikovna analiza močno poenostavljena. Originalna zasnova matičnega stroja je bila posodobljena tako, da ima struktura dva odprta konca, kar omogoča gojitev linearne kolonije celic z enako starostjo, ker se z obeh strani sočasno odstranjujejo deleče se celice.
Slika 17: Rast bakterijskih celic v matičnem stroju [13]
Izdelane so bile tudi mikroskopske strukture za ujetje in gojenje posameznih bakterijskih celic v natančno nadzorovanem mikrookolju, kjer obstaja minimalno tveganje za okoljsko nehomogenost (slika 18) [6].
24
Slika 18: Posamezne celice, ujete v celične pasti [19]
5.2.3 Preučevanje metapopulacij
Za preučevanje metapopulacij, tj. zbirk populacij, je bila izdelana naprava z več mikroskopskimi habitati, ki so bili med sabo povezani z majhnimi kanalčki. V njih se je spremljala koncentracija celic. Preko rež se je v te habitate dovajalo hranila in odvajalo odpadne produkte, kakovost habitatov pa se je spreminjala s spreminjanjem števila rež.
Odkrito je bilo, da se populacija bakterij E. coli lahko hitro prilagodi na območje z zelo nizkimi količinami hranil [13]. Z enako napravo je bilo ugotovljeno tudi, da se dva različna seva bakterije E. coli, ki v homogenem okolju med seboj tekmujeta, dokler eden ne izumre, v heterogenem okolju drug drugemu izogibata in si pomagata pri izboljševanju dolgoročne produktivnosti [13, 23]. Enak princip, omogočanje difuzije fiziološko pomembnih molekul in preprečevanje migracije celic iz njihovih habitatov, je bil uporabljen za preučevanje interakcij med tremi sevi bakterij, ki so prisotne v prsti. Pri homogenih laboratorijskih pogojih večina poskusov gojenja stabilne bakterijske mešane kulture ni sposobna ustvariti stabilnih skupnosti mikroorganizmov, večinoma zaradi tekmovanja med vrstami za dostop do hranil. V naravi mikrobne skupnosti prebivajo v okoljih z zapleteno prostorsko strukturo, kjer številne vrste bakterij v prsti prebivajo kot mikrokolonije, ki jih ločuje nekaj sto mikrometrov. Te mikrostrukture je v naravnem okolju težko nadzirati, zato je bila izdelana mikropretočna naprava, v kateri so bile med seboj prostorsko ločene tri različne vrste bakterij divjega tipa, ki so med seboj lahko komunicirale s kemičnimi signali preko polprepustne membrane. V takšnih razmerah so vse tri vrste dobro uspevale tudi ob nizkih količinah hranil, kar kaže na to, da vsaka vrsta opravlja edinstveno funkcijo, ki je ključna za preživetje celotne skupnosti, poleg tega pa je bilo odkrito, da prisotnost ene vrste bakterij, ki je odporna proti antibiotiku, hkrati krepi odpornost drugih vrst na antibiotik [13, 24].
5.2.4 Posnemanje pogojev v velikih bioreaktorjih na mikrofluidnih čipih
V spreminjajočih se okoljih se pri bakterijskih celicah stalno spreminja izražanje genov, ki definirajo njihov metabolizem in življenjski cikel [25]. Kvantitativno preučevanje vpliva tipičnih reaktorskih nehomogenosti na posamezne celice priskrbi pomembne informacije za razvoj sevov z dobro zmogljivostjo pod pogoji, ki so prisotni v proizvodnji.
Poskuse, pri katerih se uporablja mikropretočne sisteme za posnemanje sprememb okolja, ki se dogajajo v velikih bioreaktorjih, je mogoče voditi v mikropretočnih napravah, ki vsebujejo naprave za zajetje celic, pod pogojem, da je mogoče signale na ustrezni časovni lestvici reproducirati v zaporedju ene sekunde. Tipi naprav za zajetje celic, ki se pri teh
25
poskusih najpogosteje uporabljajo, so matični stroji, enoslojne gojitvene komore in naprave za negativno dielektroforezo (nDEP) (slika 19). Naprave za nDEP dajejo slabše rezultate, saj je kljub temu, da je celica ujeta sredi kanala, hitrost toka močno omejena s silo nDEP, zaradi česar naprava ne more delovati v tokovnem režimu, v katerem prevladuje konvekcija. V dovodnih kanalih enoslojnih gojitvenih komor in matičnih strojev je vzpostavljen tokovni režim, v katerem prevladuje konvekcija, a je pri obeh potreben dodaten difuzijski transport od dovodnega kanala do ujetih celic. Samo pri matičnem stroju je dolžina poti difuzijskega transporta dovolj kratka, da omogoča reprodukcijo signalov na nivoju 1 Hz. Odzivnost naprav z enoslojnimi gojitvenimi komorami je mogoče izboljšati z izdelavo dodatnega dovodnega kanala in širjenjem odprtin komore, a tudi takšna naprava ne daje tako kakovostnih rezultatov kot matični stroj [9].
Slika 19: (A) Matični stroj; (B) gojitvena komora (C) nDEP [9]
5.3 Preučevanje občutljivosti za antimikrobna sredstva
Učinkovitost antimikrobnih sredstev je v 21. stoletju pomembna tema, ki vpliva na človeško zdravje in industrijo, kot je na primer kmetijstvo, ker vse več mikrobov razvija odpornost proti antimikrobnim sredstvom. Širok razpon mikropretočnih naprav je omogočil visokozmogljivostno ocenjevanje učinkov antibiotikov na bakterije [13, 26].
Konvencionalne tehnike, ki so trenutno v uporabi, potrebujejo več časa za pridobitev rezultatov, kar lahko zapozni zdravljenje, prav tako pa je brez podatkov o občutljivosti patogena za antimikrobno sredstvo pogosto potrebna uporaba velikih količin antimikrobnih sredstev širokega spektra, to pa lahko predstavlja tveganje za pojav odpornih mikrobov, poleg tega pa zapoznjeno zdravljenje zaradi čakanja na rezultate testov povzroči smrt bolnikov [10, 26, 27]. Iz teh razlogov je bila mikropretočna tehnologija v medicini uporabljena za testiranje občutljivosti bakterij za antibiotike [10, 26]. Mikropretočne metode za določanje minimalne inhibitorne koncentracije vključujejo širok nabor zasnov, od mikroskopskih vdolbinic, ki so predhodno napolnjene z antimikrobnimi sredstvi, v katere se doda celice, do kapljičnih sistemov in nanodelcev iz agaroze ali alginata, v katere so ujete celice patogenega mikroorganizma. Učinek antimikrobnih sredstev na celične mehanizme za popravljanje je bil preučevan tudi z imobilizacijo celic na površinah naprav in v mikropretočnih komorah. Posledice nizkih odmerkov antibiotikov na morfologijo celic so bile preučevane na visokozmogljivostnih napravah, sestavljenih iz več kanalov, ki so bili opremljeni z velikim številom mikropretočnih gojitvenih komor [13]. S temi metodami je mogoče dobiti rezultate v 2–
4 urah, kar je bistveno hitrejše kot metode, ki so trenutno v uporabi. Vsaka izogena
26
populacija lahko vsebuje speče celice, ki so odporne proti antibiotikom, imenovane perzistentne celice, ki so verjetno pomemben vir kroničnih in ponavljajočih se okužb; in mikropretočne naprave so dobro orodje za raziskovanje takih celic [13]. Pričakovano je, da bo uporaba mikropretočnih naprav za testiranje občutljivosti bakterij in gliv za antibiotike ter antimikotike znatno izboljšala zdravljenje nalezljivih bolezni s preudarnejšo uporabo antimikrobnih sredstev, kar bo pripomoglo k zmanjševanju pojava odpornih patogenih mikroorganizmov in učinkovitejšemu zdravljenju okužb [26, 27].
27
6 Kapljični mikrobioreaktorji
Kapljični mikrobioreaktorji izkoriščajo strižno silo med dvema tekočinama, ki se med seboj ne mešata, kot sta na primer voda in olje, za ustvarjanje enakomerno velikih kapljic ene faze, ki so suspendirane drugi fazi (slika 20). Ker so kapljice ločene med sabo, delujejo kot posamezni mikroreaktorji. V take kapljice je mogoče ujeti posamezne celice in preučevati njihovo obnašanje ter jih preprosto razvrščati, kar poveča zmogljivost testov [10].
Slika 20: Ustvarjanje kapljic v mikropretočni napravi [28]
6.1 Prednosti kapljičnih mikrobioreaktorjev
Bakterije so v kanalu in mikrokomori proste. Kljub temu da je mogoče uravnavati natančnost zasnove, je ena sama bakterija majhna in upravljanje je težavno, zaradi česar je proces izdelave čipa zapleten [10]. Poleg tega lahko metode s kontinuirnim tokom postanejo nepraktične zaradi težav, kot so Taylorjeva disperzija, interakcije med topljencem in površino ter navzkrižne kontaminacije, in potreb po relativno velikih dolžinah kanalov. Preprost in eleganten način za premagovanje omenjenih pomanjkljivosti je uporaba segmentiranega toka, v katerem so reagenti, ki nas zanimajo, ujeti v mikroskopskih kapljicah znotraj kontinuirnega toka druge tekočine, s katero se ne morejo mešati. Kapljična mikrofluidika ima sposobnost izvajanja velikega števila reakcij brez povečanja velikosti ali kompleksnosti naprave. Kapljična mikrofluidika vključuje ustvarjanje in manipulacijo diskretnih kapljic znotraj mikropretočnih naprav s hitrostjo do 20000 kapljic na sekundo. Zaradi visokega razmerja med površino in prostornino so časi prenosa toplote in snovi kratki, difuzijske razdalje pa majhne, kar omogoča krajše reakcijske čase. Kapljična mikrofluidika omogoča neodvisen nadzor nad vsako kapljico, kar ustvari mikroskopske reaktorje, ki se jih lahko individualno prenaša, meša in analizira. Ker je s to metodo mogoče v hitro ustvariti veliko število mikroskopskih reaktorskih enot, je preprosto izvajati vzporedno obdelavo in eksperimentiranje, zaradi česar je mogoče hitro pridobiti velike količine podatkov [28]. Kapljična mikrofluidika ima več edinstvenih lastnosti, ki so koristne pri mikrobioloških uporabah: minimizacija kontaminacije med vzorci, hitro mešanje znotraj kapljic, ponovljivost oblikovanja kapljic z natančno določenim volumnom in omejevanje reakcij v majhnem volumnu tekočine [29].
