UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
TAMARA HORVAT
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2021
TAMARA HORVAT
PREGLED MODELOV IN VITRO ZA PROUČEVANJE OBARJANJA DIPIRIDAMOLA IN RAZISKAVA VPLIVA HIDRODINAMSKIH SIL
NA OBARJANJE IZ NJEGOVE PRENASIČENE RAZTOPINE
REVIEW OF IN VITRO MODELS FOR EVALUATION OF DIPYRIDAMOLE PRECIPITATION AND STUDY OF
HYDRODYNAMIC FORCES INFLUENCE ON PRECIPITATION FROM ITS SUPERSATURATED SOLUTION
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE
Ljubljana, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala v laboratorijih na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani pod mentorstvom prof. dr.
Marije Bogataj, mag. farm. in somentorstvom Tjaše Felicijan, mag. farm.
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Mariji Bogataj, mag. farm. za strokovno vodenje pri izdelavi magistrske naloge. Zahvaljujem se tudi somentorici Tjaši Felicijan, mag. farm. za vso pomoč, usmerjanje med pisanjem magistrske naloge in temeljit pregled naloge.
Posebno zahvalo namenjam svoji družini. Hvala, ker ste verjeli vame, ko sama nisem verjela vase.
Hvala tebi Žiga ̶ za vso podporo, vzpodbudne besede in ker mi vedno stojiš ob strani.
In hvala vsem mojim. Z vami so bili lepi trenutki v času faksa, še lepši!
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom prof. dr. Marije Bogataj, mag. farm. in somentorstvom Tjaše Felicijan, mag. farm.
Tamara Horvat
Predsednica komisije: prof. dr. Mirjana Gašperlin, mag. farm.
Član komisije: doc. dr. Stane Pajk, mag. farm.
II
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ... 1
1.1 Lastnosti dipiridamola ... 1
1.2 Vpliv prisotnosti kristalov na kinetiko obarjanja dipiridamola ... 1
1.3 Vpliv hitrosti pretoka na prenasičenje dipiridamola ... 3
1.4 Vpliv priprave vzorcev na prenasičenje dipiridamola ... 4
1.5 Vpliv površinsko aktivnih snovi na prenasičenje dipiridamola... 5
1.6 Vpliv uporabe polimerov na prenasičenje dipiridamola ... 5
1.7 Vpliv uporabe ciklodekstrinov in žolčnih soli na prenasičenje dipiridamola ... 7
1.8 Vpliv večprostornih modelov sklopljenih s programi za modeliranje na raziskovanje prenasičenja dipiridamola ... 8
1.9 Vpliv zvišanega pH v želodcu na prenasičenje dipiridamola ... 9
2 NAMEN DELA ... 12
3 MATERIALI IN METODE ... 13
3.1 MATERIALI ... 13
3.1.1 Kemikalije ... 13
3.1.2 Aparature in laboratorijski pribor ... 13
3.2 METODE... 14
3.2.1 Literaturni pregled ... 14
3.2.2 Eksperimentalni del ... 15
4 REZULTATI ... 21
4.1 Literaturni del ... 21
4.1.1 Klasični modeli ... 22
4.1.2 Pretočni modeli ... 24
4.1.3 Modificirani modeli ... 28
4.2 Eksperimentalni del ... 31
III
4.2.1 Spreminjanje pH vrednosti glede na razmerje 0,01 M HCl in FaSSIFa brez SIF 31
4.2.2 Umeritvena premica za dipiridamol v mediju FaSSIF brez SIF s pH=6,5 ... 31
4.2.3 Poskusi obarjanja dipiridamola iz prenasičene raztopine pri različnih hidrodinamskih vplivih ... 32
5 RAZPRAVA ... 41
5.1 Literaturni pregled ... 41
5.1.1 Primerjava člankov glede na leto objave ... 41
5.1.2 Primerjava člankov glede na uporabljen in vitro model ... 42
5.1.3 Primerjava člankov glede na način s katerim dosežemo prenasičenje ... 42
5.1.4 Primerjava člankov glede na uporabljen pH medija ... 43
5.1.5 Primerjava člankov glede na uporabo polimerov ali površinsko aktivnih snovi kot substanc, ki zavirajo obarjanje ... 44
5.1.6 Čas trajanja prenasičenja pri posameznih modelih ... 45
5.1.7 Primerjava koncentracij raztopljenega DIP pri posameznih in vitro modelih ... 46
5.1.8 Primerjava spremljanja prenasičenja dipiridamola v enakih pretočnih modelih z uporabo različnih medijev ... 53
5.1.9 Vpliv površinsko aktivnih snovi na trajanje prenasičenja in maksimalne koncentracije raztopljenega dipiridamola ... 55
5.2 Eksperimentalni del ... 56
5.2.1 Vpliv razmerja 0,01 M HCl in FaSSIFa brez SIF na vrednost pH ... 57
5.2.2 Umeritvena premica za dipiridamol v FaSSIFu brez SIFa s pH 6,5 ... 57
5.2.3 Testi spremljanja obarjanja dipiridamola iz prenasičene raztopine ... 58
6 SKLEP ... 66
7 Literatura ... 68
IV
POVZETEK
S slabo topnimi, šibko bazičnimi učinkovinami, ki imajo s pH vrednostjo pogojeno topnost, se vzdolž prebavnega trakta lahko doseže prenasičenje in obarjanje zaradi velikih sprememb v topnosti. Med take učinkovine spada tudi dipiridamol. V okviru magistrske naloge smo naredili pregled in vitro modelov, ki so se uporabljali za preučevanje obarjanja dipiridamola in raziskovali vpliv hidrodinamskih sil na obarjanje dipiridamola iz njegove prenasičene raztopine v treh različnih in vitro sistemih.
S pomočjo literaturnega pregleda in vitro modelov, smo našli ključne parametre, ki vplivajo na obarjanje dipiridamola. To so: izbira medija, izbira farmacevtske oblike, izbira primernega in vitro modela ter čas trajanja poskusov. Ugotovili smo, da so se za preučevanje obarjanja dipiridamola uporabljali zelo različni in vitro modeli, zato je bilo težje primerjati čas prenasičenja in maksimalne koncentracije raztopljenega dipiridamola med modeli.
Za raziskovanje vpliva mešanja na obarjanje dipiridamola, smo pripravili raztopino dipiridamola v 0,01 M HCl in jo dodali v medij, ki je predstavljal stanje na tešče v tankem črevesu in tako sprožili proces obarjanja. Poskuse smo izvajali v napravi USP II s klasičnimi mešali in manjšim volumnom medija, v napravi USP II z mini mešali in ozkimi visokimi posodami ter v sistemu s čašo, kjer smo disperzijo mešali z uporabo velikega in malega magneta. V vseh treh in vitro sistemih smo uporabili dve hitrosti mešanja disperzije. V sistemu s čašo smo pri nekaterih poskusih dodali še steklene kroglice, ki so predstavljale dodatno mehansko obremenitev. Spreminjanje koncentracij raztopljenega dipiridamola v odvisnosti od časa smo spremljali in situ s potopno sondo z optičnimi vlakni. Največje razlike v hitrosti obarjanja dipiridamola so se pojavile v sistemu s čašo, kadar so bile prisotne steklene kroglice. Manjše razlike v hitrosti obarjanja dipiridamola, kot posledica različnih hitrosti mešanja, so se pojavile v USP II s klasičnimi mešali in manjšim volumnom medija ter v sistemu s čašo, kjer ni bilo prisotnih steklenih kroglic. V USP II z mini mešali in ozkimi visokimi posodami je bil vpliv mešanja na obarjanje dipiridamola zanemarljiv, kar je v skladu z literaturnimi podatki.
Ključne besede: dipiridamol, obarjanje, hitrost obarjanja, in vitro, potopna sonda z optičnimi vlakni
V
ABSTRACT
With poorly soluble, weakly basic active pharmaceutical ingredients, which have a pH- dependent solubility, supersaturation and precipitation may occur during transit of the gastrointestinal tract due to a large change in solubility. Dipyridamole is one of them. In this master's thesis, we have reviewed the in vitro models which were used to study the precipitation of dipyridamole and investigated the effect of different hydrodynamic forces on the precipitation of dipyridamole from its supersaturated solution in three different in vitro systems.
By reviewing the in vitro models used to monitor dipyridamole precipitation in literature, we have identified the key parameters affecting dipyridamole precipitation and used them to design the experimental work. The key parameters were the choice of medium, the choice of dosage form, the choice of a suitable in vitro model and the duration of the experiments. We found that very different in vitro models were used to study dipyridamole precipitation, making it difficult to compare supersaturation times and maximum dissolved dipyridamole concentrations between models.
To investigate the effect of different hydrodynamic forces on dipyridamole precipitation, a solution of dipyridamole in 0,01 M HCl was prepared and added to a medium representing the fasted state of the small intestine to initiate the precipitation process. The experiments were carried out in a USP II dissolution system with conventional paddles and a smaller volume of medium, in a USP II dissolution system with mini paddles and narrow tall vessels and in a beaker system where the dispersion was stirred using a large and a small magnet. In all three in vitro systems, two stirring speeds were used. In the beaker system, glass beads were added in some experiments to provide additional mechanical stress. The variation of dissolved dipyridamole concentrations with time was monitored in situ with a fiber optic dip probe. The greatest differences in dipyridamole precipitation rates occurred in the beaker system when glass beads were present than when they were absent. Smaller differences in the precipitation rate of dipyridamole, as a result of different stirring speeds, occurred in USP II dissolution system with conventional paddles and a smaller volume of medium and in the beaker system where no glass beads were present. In USP II dissolution system with mini paddles and narrow tall vessels, the effect of stirring on dipyridamole precipitation was negligible, which is consisted with literature data.
Keywords: dipyridamole, precipitation, precipitation rate, in vitro, fiber optic dip probe
VI
SEZNAM OKRAJŠAV
FO = farmacevtska oblika PAS = površinsko aktivna snov ZU = zdravilna učinkovina DIP = dipiridamol
BCS = biofarmacevtski klasifikacijski sistem zdravil FaSSIF = medij, ki ponazarja stanje na tešče v črevesu FeSSIF = medij, ki ponazarja stanje po jedi v črevesu FaSSGF = medij, ki ponazarja stanje na tešče v želodcu
FeSSIF-V2 = druga različica medija, ki ponazarja stanje po jedi v črevesu AUC = površina pod krivuljo koncentracij v časovnem intervalu
SLS = natrijev lavril sulfat
mFaSSGF = modificiran medij, ki ponazarja stanje na tešče v želodcu HPMC = hidroksipropilmetilceluloza
PVP = polivinilpirolidon SD = trdna disperzija
HPMC-AS = hidroksipropilmetilceluloza acetat sukcinat HPC-SSL = hidroksipropilceluloza
PAA = poliakrilna kislina
SGF = ponazorjen želodčni medij GIS = želodčno-črevesni simulator STDEV = standardna deviacija KV = koeficient variacije
1
1 UVOD
Za izboljšanje topnosti učinkovin in povečanja peroralne absorpcije v primerih, ko je ovira slaba topnost učinkovine in ne hitrost raztapljanja, se uporabljajo različni pristopi. Ena izmed obetavnih tehnik povečanja topnosti je priprava farmacevtskih oblik (FO), ki omogočajo pojav prenasičenja. Za dosego prenasičenja se v farmacevtski industriji pogosto poslužujejo priprave soli, polimorfnih in amorfnih oblik učinkovin, trdnih disperzij ali kokristalov (1).
Prav tako je bilo dokazano, da se z uporabo oblik s površinsko aktivnimi snovmi (PAS), ciklodekstrini in lipidnimi emulzijami, kjer je zdravilna učinkovina (ZU) raztopljena lahko doseže prenasičenje, ki nato lahko poveča absorpcijo peroralno zaužitih ZU. Kljub temu, da z omenjenimi tehnikami lahko povzročimo prenasičenje in dosežemo višje koncentracije od termodinamske topnosti, pa sta obseg in trajanje prenasičenja odvisna predvsem od fizikalno- kemijskih lastnosti ZU (1).
1.1 Lastnosti dipiridamola
Dipiridamol (DIP) spada med učinkovine z vazodilatacijskim in antitrombotičnim delovanjem.
Kemijsko je opredeljen kot šibka baza, njegov pKa se giblje okrog 6,4 (2,3,4). Po biofarmacevtskem klasifikacijskem sistemu zdravil (BCS) ga uvrščamo v razred II, kar pomeni, da je slabo topna in dobro permeabilna ZU (5). Dobro je topen v kislem, slabše topen pa v bazičnem in nevtralnem pH. Absorpcija poteka v tankem črevesju, biološka uporabnost pa je
zelo variabilna, giblje se okrog 27-59 % (6). Metabolizem DIP poteka v jetrih, kjer nastanejo konjugati z glukoronsko kislino, ki se izločajo preko žolča (7).
DIP je slabo topen v vodi, vendar z njim lahko dosežemo visoko prenasičenje, zato je idealen kandidat za določanje vplivov prenasičenja na biološko uporabnost v prebavnem traktu (8). V nadaljevanju so tako opisani različni in vitro modeli za spremljanje prenasičenja DIP ter parametri, ki vplivajo na njegovo prenasičenje in obarjanje v teh modelih.
1.2 Vpliv prisotnosti kristalov na kinetiko obarjanja dipiridamola
Absorpcija peroralno zaužitih ZU, ki so šibke baze, je odvisna od profila raztapljanja v želodcu. Zaužita ZU se lahko v želodcu popolnoma raztopi, ker pa raztapljanje in praznjenje
Slika 1: Struktura dipiridamola
2
želodca potekata vzporedno, se lahko zgodi, da se neraztopljeni delci ZU prečrpajo v tanko črevo, preden se v želodcu raztopi celoten odmerek. Koliko neraztopljene ZU bo prišlo v tanko črevo, je odvisno od topnosti in hitrosti raztapljanja ZU v želodcu. Po prehodu ZU v tanko črevo pride do znižanja koncentracije raztopljene ZU. Znižanje koncentracije raztopljene ZU, ki je šibka baza, v črevesu je lahko posledica obarjanja in ne absorpcije, ne glede na obliko, v kateri je le-ta aplicirana. Mehanizem obarjanja šibko bazične ZU se predvidoma razlikuje glede na obliko, v kateri je le-ta aplicirana, torej če je aplicirana v prosti obliki ali kot sol. Kadar je ZU zaužita v prosti obliki, je znižanje koncentracije raztopljene ZU v črevesu lahko posledica rasti kristalov neraztopljene ZU, ki se že nahajajo v tankem črevesu. Če pa je zaužita v obliki soli, mora pri obarjanju najprej priti do tvorbe kristalov, in šele nato do njihove rasti (9).
Vpliv prisotnosti kristalov kot delcev, ki vplivajo na obarjanje ZU, ki so šibke baze so v in vitro modelu preučevali Koyama in sodelavci (9). Opazovali so obnašanje DIP, pioglitazona, topiroksostata, klorpromazina, cinarizina in ketokonazola. Poskuse so izvajali v preprostem in vitro modelu, vse ZU so raztopili v 0,01 M HCl, izbrane koncentracije so bile klinično relevantne. Raztopine ZU so nato 40 minut dovajali pri konstantnem pretoku 2 mL/min v erlenmajerice, ki so vsebovale natrijev in kalijev fosfatni pufer s pH 6,5. V pufru so se nahajali neraztopljeni delci izbranih ZU in na tak način pospeševali obarjanje učinkovin.
Erlenmajerice so bile nežno stresane na stresalniku pod kotom dvajsetih stopinj z deset obrati na minuto, vsebina se iz erlenmajeric ni črpala ven. Dokazali so, da prisotnost neraztopljenih delcev v pufru, ki simulira črevesni medij, pomembno vpliva na koncentracije raztopljene ZU v odvisnosti od časa pri vseh izbranih ZU, razen pri cinarizinu. Nato so ugotavljali vpliv količine in velikosti delcev DIP na koncentracijo raztopljenega DIP v bazičnem mediju.
Različne velikosti delcev DIP so dobili s ponovno kristalizacijo iz vročega etanola, z mletjem in presejanjem. Te delce so nato dodali v bazični medij, masa večjih in manjših delcev je bila enaka, da so bili rezultati bolj primerljivi. Ugotovili so, da večje količine neraztopljenih delcev bolj zmanjšajo maksimalno koncentracijo raztopljenega DIP, pri enakih količinah delcev pa je večji upad maksimalne koncentracije, kadar so uporabljeni manjši delci. V članku niso uporabljali izraza prenasičenje, saj se le-to uporablja, kadar je vključen tudi proces nukleacije, zato so ga zamenjali za izraz prehodno presežna koncentracija (ang. transient excess concentration). Tudi v drugih študijah so preučevali vpliv neraztopljenih ZU na proces obarjanja, vendar je ta študija prva, ki dokazuje, da ima tudi manj kot 2 % delcev glede na celotno maso uporabljene ZU vpliv na obarjanje raztopljene ZU, ki je šibka baza (9).
3
1.3 Vpliv hitrosti pretoka na prenasičenje dipiridamola
Pri študijah prenasičenja se pogosto uporabljajo dvo ali večprostorni modeli, ki črpajo ZU iz enega v drugi prostor, da se in vitro pogoji čim bolj približajo pogojem in vivo. Kostewicz in sodelavci so izbrali preprost dvoprostorni pretočni model, preučevali so vpliv hitrosti mešanja na obarjanje DIP v prostoru, ki je predstavljal tanko črevo, in hitrost pretoka raztopine DIP iz prostora, ki je predstavljal želodec, v prostor, ki je predstavljal tanko črevo (3). V ponazorjenem tankem črevesu so preiskovali vpliv dveh različnih medijev na prenasičenje in obarjanje DIP, in sicer medija, ki ponazarja stanje na tešče (ang. fasted state simulated intestinal fluid, FaSSIF) in medija, ki ponazarja stanje po jedi (ang. fed state simulated intestinal fluid, FeSSIF). Medija sta se razlikovala v večih komponentah, vendar so raziskovalci preverjali predvsem vpliv koncentracije natrijevega tavroholata in lecitina ter vpliv vrednosti pH. V prostoru, ki je predstavljal želodec, so bile izbrane tri različne hitrosti mešanja, ki so predstavljale gibanje v želodcu. Izbrani pretoki so bili od 0,5-9 mL/min in so predstavljali razpon pretokov, ki se lahko pojavijo iz želodca v tanko črevo v fizioloških razmerah. Rezultati so pokazali, da je koncentracija raztopljenega DIP v prostoru, ki je predstavljal tanko črevo, neodvisna od hitrosti mešanja. Pri vseh štirih izbranih pretokih so bile maksimalne dosežene koncentracije podobne, vendar je hitrost pretoka vplivala na kinetiko obarjanja DIP. Raziskovalci so ugotovili, da kadar pride do obarjanja DIP v prostoru, ki je predstavljal tanko črevo, koncentracije raztopljenega DIP obeh medijih (FaSSIF in FeSSIF) najhitreje padajo pri hitrejših pretokih, zato so predvidevali, da obarjanje DIP poteka hitreje tudi in vivo pri hitrejšem praznjenju želodca (3). Rezultati iz eksperimentov kažejo, da se slabo topne, šibko bazične učinkovine, lahko oborijo v tankem črevesju, tudi če so v želodcu popolnoma raztopljene, maksimalne dosežene koncentracije v FaSSIFu pa so ustrezale 6,0-7,4 kratni stopnji prenasičenja. Do kako visoke stopnje prenasičenja bo pred obarjanjem prišlo, ne more biti predvideno na podlagi topnosti ali testov raztapljanja (3).
Enak pretočni model, kot so ga uporabili Kostewicz in sodelavci (3) so izbrali tudi Arnold in sodelavci (2), vendar so v študijo vpeljali nove metode, ki so omogočile vpogled v proces obarjanja DIP. Uporabili so dva biorelevantna medija, medij, ki ponazarja stanje na tešče v želodcu (ang. fasted state simulated gastric fluid, FaSSGF) in drugo različico medija, ki ponazarja stanje po jedi v tankem črevesu (ang. fed state simulated intestinal fluid V2, FeSSIF V2). DIP so raztopili v FaSSGF, raztopino DIP pa so nato dovajali v FeSSIF V2 pri dveh izbranih pretokih, ki sta ponazarjala praznjenje želodca. Proces obarjanja DIP so spremljali z Ramansko spektroskopijo in dinamično slikovno analizo. Za oceno procesa obarjanja so
4
uporabili še matematično modeliranje in rezultate primerjali s podatki, ki so jih dobili z ostalima metodama. Ugotovili so, da se delci, ki se oborijo v FeSSIF V2, tvorijo na enak način pri obeh pretokih. Delci so se oborili kot kristali, bili so zvezdaste ali samo podaljšane osnovne oblike. Opazovali so še število oborjenih delcev/kristalov v odvisnosti od časa, njihovo velikostno porazdelitev, čas pri katerem so se pojavili prvi delci in koncentracijo DIP v odvisnosti od časa. Pri teh parametrih so opazili, da so odvisni od pretoka. Podobno kot Kostewicz in sodelavci (3) so ugotovili, da so maksimalne koncentracije raztopljenega DIP v prostoru, ki je predstavljal tanko črevo, višje pri večjem pretoku, prav tako je obarjanje potekalo hitreje pri večjem pretoku. Potrdili so, da je matematično modeliranje dober pristop pri napovedovanju začetka nastanka jeder, saj se je ocena ujemala z rezultati, dobljenimi z Ramansko spektroskopijo in dinamično slikovno analizo. Tudi Kambayashi in sodelavci (10) so s programom za simulacijo STELLA® s pomočjo podatkov, ki so jih dobili iz in vitro poskusov preučevali, kakšen vpliv ima hitrost praznjenja želodca na obarjanje DIP in ketokonazola. Pri hitrejšem praznjenju želodca je prišlo do večjega obsega obarjanja, pri enaki hitrosti praznjenja želodca pa je bilo večje obarjanje pri višjih odmerkih DIP (10). Do enakih ugotovitev so prišli tudi Arnold (2) in Kostewicz (3). Raziskovalci so ocenili, da lahko z uporabo večih metod pri in-vitro poskusih boljše napovemo obnašanje ZU v in vivo pogojih (2).
1.4 Vpliv priprave vzorcev na prenasičenje dipiridamola
Za dosego stanja prenasičenja se poslužujemo različnih tehnik, ena izmed teh je priprava koncentriranih raztopin učinkovin, ki jih nato uvajamo v izbran medij, v katerem so učinkovine slabše topne (1). V študiji (1) so proučevali vpliv priprave vzorcev na prenasičenje štirih v vodi slabo topnih učinkovin. Cilj študije je bil uveljaviti in vitro metodo, s katero bi ocenili učinek prenasičenja na absorpcijo izbranih peroralno zaužitih ZU in vivo. Uporabljena sta bila dva načina priprave vzorcev. Po prvem načinu so pripravili koncentrirano raztopino DIP v dimetilacetamidu in jo nato dodali v vialo, ki je vsebovala FaSSIF (ang. solvent-shift method). Drug način se je od prvega razlikoval le v tem, da niso pripravili koncentrirane raztopine ampak so DIP v praškasti obliki suspendirali direktno v FaSSIF (ang. powder- suspending method). Rezultate, ki so jih dobili in vitro so primerjali s podatki in vivo, ki so jih pridobili s poskusi na podganah, prav tako z obema načinoma priprave vzorcev. V duodenum podgan so aplicirali 1 mL raztopine DIP ali 1 mL suspenzije DIP ter merili koncentracijo DIP v krvi v enakih časovnih intervalih kot pri in vitro poskusih. Ker se pri drugem načinu priprave vzorcev koncentracija v mediju v opazovanem času in vitro ni bistveno spreminjala
5
in ni prišlo do prenasičenja, so to koncentracijo upoštevali kot termodinamično ravnotežno topnost. Pri prvem načinu priprave vzorcev in vitro so dobili višje koncentracije raztopljenega DIP v FaSSIFu, kot pri drugem načinu priprave, le-te so v odvisnosti od časa padale, zato so sklepali, da prvi način priprave vzorca omogoča dosego prenasičenega stanja. Določili so površino pod krivuljo (AUC) koncentracij v časovnem intervalu za oba načina priprave vzorcev in izračunali razmerje med njima, ki je znašalo 3,1. Podobno razmerje AUC-jev (3,0) so dobili tudi iz in vivo podatkov iz poskusov na podganah.
1.5 Vpliv površinsko aktivnih snovi na prenasičenje dipiridamola
Mitra in sodelavci (11) so v študiji preučevali vpliv površinsko aktivnih snovi (PAS), hitrosti praznjenja želodca in vpliv FO na prenasičenje DIP. Uporabili so štiri prostorni in vitro model, dva prostora sta ponazarjala želodec in dvanajstnik, ostala dva pa sta ponazarjala rezervoar, v katerem sta bila želodčni in črevesni sok. Prednost omenjenega in vitro modela je, da se je DIP s časom odstranjeval iz ponazorjenega dvanajstnika in se je tako posnemal proces absorpcije in potovanje ZU v nižje predele GIT. V študiji (11) so uporabili tri PAS:
natrijev lavrilsulfat (SLS), poloksamer-188 in polisorbat-80. Vse tri so dodali v modificiran medij želodca v stanju na tešče (mFaSSGF), njihova koncentracija je bila pod kritično micelno koncentracijo, površinska napetost je bila konstantna in je bila podobna kot v želodcu na tešče. Prenasičenje so spremljali v prostoru, ki je predstavljal dvanajstnik, v njem je bil medij fosfatni pufer s pH 6,5. Prenasičenje se je najdlje in v največjem obsegu ohranjalo pri SLSu, največja stopnja prenasičenja pa je bila dosežena s poloksamerom-188. Pri dodatku poloksamera-188 in polisorbata-80 se je DIP v ponazorjenem želodcu takoj raztopil, pri dodatku SLSa v mFaSSGF pa se DIP ni raztopil popolnoma, vendar je bila vseeno dosežena desetkratna stopnja prenasičenja. Kljub temu, da so neraztopljeni delci prišli v ponazorjeni dvanajstnik pri uporabi SLSa, je prenasičenje trajalo najdlje, zato so postavili hipotezo, da na trajanje prenasičenja ne vpliva nastanek jeder, ki so bila v tem primeru že prisotna v dvanajstniku, ampak rast kristalov. Hipotezo so potrdili z raziskovanjem vpliva FO – raztopine ali suspenzije, na prenasičenje DIP. V obeh primerih so v ponazorjenem dvanajstniku dobili podobno kinetiko obarjanja in površino pod krivuljo koncentracije v odvisnosti od časa.
1.6 Vpliv uporabe polimerov na prenasičenje dipiridamola
Poleg ciklodekstrinov, PAS in lipidnih emulzij se tudi polimeri pogosto uporabljajo za podaljšanje prenasičenega stanja. V študiji (12) so preiskovali vpliv hidroksipropilmetil celuloze (HPMC) in polivinilpirolidona (PVP), izbrana polimera so vgradili z DIP v binarne
6
trdne disperzije (SD). Poskuse so izvajali v USP II napravi, s katero so ponazorili prehod iz kislega v bazično okolje s pH 6,8. Po dveh urah v kislem mediju in nato prehodu v bazični medij, je bila začetna koncentracija raztopljenega DIP podobna za oba polimera, vendar je ob prehodu iz kislega v bazični medij HPMC boljše zaviral proces obarjanja, saj je po štirih urah v bazičnem mediju največ DIP ostalo raztopljenega pri poskusih, kjer so uporabili HPMC.
Pojav so pojasnili kot posledico nastanka vodikovih vezi med HPMC in DIP. HPMC in PVP se namreč razlikujeta v sposobnosti tvorbe vodikovih vezi, saj se HPMC obnaša kot donor protonov zaradi hidroksilnih skupin v svoji strukturi, PVP pa se obnaša kot proton akceptor zaradi karbonilnih skupin in z DIP ne tvori vezi. Nadalje so v tej študiji opazovali vpliv molekulske mase polimerov na ohranjanje prenasičenja DIP. Ugotovili so, da je najboljše zaviral proces obarjanja HPMC z največjo molekulsko maso, zaradi večjega prepleta verig in posledično večje viskoznosti raztopine. Oba dejavnika sta predstavljala večjo sterično oviranost, s čimer sta zmanjšala možnost za nastanek in rast kristalov DIP. Pri trdnih disperzijah z različno molekulsko maso PVP, je molekulska masa manj vplivala na obarjanje DIP, zato raziskovalci sklepajo, da imajo pomembno vlogo pri zaviranju obarjanja molekulske vezi med polimerom in ZU, kar so potrdili tudi s FT-IR (12).
Zecevic in sodelavci (13) so prav tako kot Vora in sodelavci (12) preučevali vpliv polimerov na topnost in prenasičenje DIP. Z iztiskanjem so naredili binarne in terciarne trdne disperzije, ki so vsebovale različne deleže hidroksipropilmetilceluloza-acetat sukcinata (HPMC-AS) in hidroksipropil celuloze (HPC-SSL). Binarne trdne disperzije so vsebovale ali HPMC-AS ali HPC-SSL, terciarne pa oba polimera. Izbrana polimera so uporabili, ker je HPMC-AS od pH vrednosti odvisno topen polimer, HPC-SSL pa ne. Poskuse so izvajali v in vitro modelu, ki je podoben USP II napravi, le da zajema manjši volumen medija (»MiniDissolution«). Hitrost mešanja je bila konstantna, pH se je s časom spreminjal iz kislega s pH 1,0 v bazični s pH 5,5 in končnim pH 6,8. Uporabili so 0,01 M HCl in fosfatni pufer. Pri binarnih in terciarnih trdnih disperzijah z enakim deležem ZU so opazili enako stopnjo prenasičenja (10 x), vendar se je pri terciarnih disperzijah v kislem mediju sprostil večji odstotek ZU, kot pri binarnih trdnih disperzijah s HPMC-AS. HPMC-AS se uporablja kot gastrorezistenten polimer, zato se je sproščanje ZU iz FO začelo šele pri pH 5,5 in so bile najvišje koncentracije raztopljenega DIP dosežene pri bolj bazični pH vrednosti, medtem ko se DIP brez dodanih polimerov raztopi v kislem mediju in se začne obarjati pri bazični pH vrednosti. S študijo so pokazali, da z uporabo HPMC-AS in dodatkom HPC-SSL kot polimernih ogrodij, lahko dobimo FO, ki imajo od pH vrednosti odvisen profil sproščanja in se lahko uporabijo za mestno specifično
7
sproščanje slabo topnih ZU. Kljub temu da polimer določa, kdaj se bo ZU sprostila in vpliva na stabilnost prenasičenega stanja ter kinetiko obarjanja, pa so ugotovili, da je stopnja prenasičenja odvisna tudi od lastnosti uporabljene ZU (13).
Baghel in sodelavci (14) so izbrali drugačen pristop za preučevanje vpliva polimerov na topnost in prenasičenje DIP kot Vora (12) in Zecevic (13). Sami niso pripravili trdnih disperzij, ampak so izbrana polimera najprej raztopili v mediju, v katerega so nato dodali DIP.
Eksperimente so izvajali v USP II napravi, za medij so uporabili fosfatni pufer s pH 6,8.
Mešanje je bilo skozi ves čas poskusov enako, DIP so predhodno raztopili v metanolu in raztopino nato dodali v medij s polimeri. Izbrali so dva različna polimera, polivinilpirolidon (PVP) in poliakrilno kislino (PAA). Ugotovili so, da PAA boljše stabilizira prenasičeno stanje, ker pride do različnih elektronskih gostot pri funkcionalnih skupinah DIP (pri hidroksilni skupini, piperidinskem obroču in etanol aminu), kar so potrdili z NMR. Poleg elektronskih gostot pa vplivajo tudi vodikove vezi, ki se tvorijo med polimerom in DIP. PAA tvori močnejše vezi z DIP kot PVP, zato, kot je bilo že prej omenjeno, bolj uspešno zavira kristalizacijo DIP in posledično se podaljša čas prenasičenja (14).
1.7 Vpliv uporabe ciklodekstrinov in žolčnih soli na prenasičenje dipiridamola Box in sodelavci (8) so v svoji študiji preiskovali vpliv beta ciklodekstrinov in žolčnih soli na prenasičenje DIP. Poskuse so izvajali s pomočjo CheqSol instrumenta, ki se primarno uporablja za določanje pKa vrednosti ionizirajočih učinkovin s kislinsko-bazično titracijo.
DIP so skupaj z različnimi ciklodekstrini, oziroma z žolčnimi solmi, raztopili v vodnem mediju s kislim pH, nato pa so raztopine titrirali z bazo, dokler se niso pojavili oborjeni delci.
Ugotovili so, da se intrinzična in kinetična topnost v bazičnem mediju povečujeta z večanjem deleža ciklodekstrinov v zmesi, vendar pa se zmanjša stopnja prenasičenja, ki so jo izračunali tako, da so delili kinetično topnost z intrinzično topnostjo. Pri visokih koncentracijah ciklodekstrinov v raztopini (tj. 14,9 % masno-volumskega deleža), pri titraciji do obarjanja DIP pri njegovi izhodni koncentraciji 4,0 mM sploh ni prišlo (8). Prav tako so ugotovili, da različna koncentracija natrijevega tavroholata nima takšnega vpliva na kinetično topnost DIP, kot ga ima koncentracija ciklodekstrinov. Kljub temu pa žolčne soli in ciklodekstrini podaljšajo čas prenasičenja, saj so bile koncentracije, izmerjene z CheqSol instrumentom, po enem tednu še vedno višje od intrinzične topnosti (8).
Hsieh in sodelavci (15) so tako kot Box in sodelavci (8) določevali obseg in trajanje prenasičenja s pomočjo CheqSol instrumenta, vendar pri svojih poskusih niso uporabili
8
ciklodekstrinov ali žolčnih soli. Izbranih je bilo deset ZU, vse so bile šibke baze, ki so jih glede na obnašanje uvrstili med tako imenovane lovilce in nelovilce ravnotežja. Učinkovine so raztopili v 0,5 M HCl pri pH 1,8-2,0 in nato titrirali z 0,5 M KOH. Ionska moč je bila vedno enaka, uravnavali so jo z dodatkom 0,5 M KCl. Točka obarjanja je bila določena z UV- VIS spektroskopijo, s prostim očesom je bila vidna motnost raztopin. Pet učinkovin so interpretirali kot lovilce ravnotežja, pet pa ne. DIP definirali kot lovilec ravnotežja, to pomeni, da kadar ga titriramo z bazo, pH raztopine naraste, če pa pH merimo še nekaj časa, začne pH padati, saj se sproščajo protoni, medtem ko se DIP obarja in prehaja iz ionizirane v neionizirano obliko. Padanje vrednosti pH ob titraciji z bazo je bilo v primeru DIP mogoče opazovati 150 sekund (15). Ravnotežno topnost so izmerili z dvema metodama, opažena je bila minimalna razlika. Stopnjo prenasičenja so definirali kot količnik med kinetično in ravnotežno topnostjo, za DIP je bila stopnja prenasičenja enaka 12,5, prenasičenje je trajalo petnajst minut (15). Oborjene delce so opredelili kot amorfne oziroma kristalinične. Lovilci ravnotežja so se oborili kot kristali, nelovilci ravnotežja pa kot amorfni precipitati. Na podlagi rezultatov so ugotovili, da je pH titracija uporabna metoda za vrednotenje prenasičenja, obnašanje prenasičenih raztopin pa je odvisno od lastnosti ZU, ki jih imajo le-te v trdnem agregatnem stanju (15).
1.8 Vpliv večprostornih modelov sklopljenih s programi za modeliranje na raziskovanje prenasičenja dipiridamola
Pri konvencionalnih in vitro modelih za sproščanje hiter premik pH vrednosti pogosto vodi k hitremu obarjanju ZU, tako je proces obarjanja lahko precenjen, ne samo zaradi hitre spremembe v pHju, ampak tudi zaradi zastajanja ZU v sistemu. Patel in sodelavci (16) so raziskovali trajanje in obseg prenasičenja s pomočjo dveh in vitro modelov. Najprej so uporabili klasično USP II napravo in z njo izvedli dvostopenjski test sproščanja, nato so uporabili pretočni štiriprostorni in vitro model, ki je ponazarjal tudi odvajanje ZU. Pri klasični USP II napravi so tableto DIP prvih trideset minut raztapljali v simuliranem želodčnem mediju s pH 1,8 (SGF), nato so dodali dvakrat koncentriran simuliran črevesni medij na tešče s pH 6,9, s čimer so spremenili pH vrednost na 6,5 in koncentracije spremljali še dve uri. V pretočnem štiriprostornem modelu pa so petnajst minut raztapljali tableto DIP v kislem mediju, nato so vklopili pretok. Raztopina se je iz kislega medija nadalje prečrpala v črevesni prostor, iz črevesnega prostora pa v dodaten prostor, s katerim so ponazorili absorpcijo ZU.
Volumen tekočine in pH v črevesnem prostoru sta bila konstantna, to so zagotovili s še enim prostorom, ki je dovajal bazični medij v črevesni prostor. V obeh in vitro modelih je bilo
9
prenasičenje v bazičnem mediju prisotno skozi celoten čas poskusov, minimalno obarjanje je bilo opaženo v USP II napravi. Podatke, ki so jih dobili iz pretočnega modela so vnesli v in silico model in tako dobili hitrost obarjanja. Dobljene parametre so vnesli v GastroPlus program za modeliranje in na ta način so lahko podatke primerjali s plazemskimi profili iz kliničnih študij. Rezultati, ki so jih dobili s pomočjo GastroPlusa in klinični podatki so se dobro ujemali, zato so raziskovalci sklenili, da uporabljen štiriprostorni in vitro model sklopljen s programom za modeliranje predstavlja dober alternativni pristop za ocenjevanje in vivo obarjanja v tankem črevesu.
In vitro model sklopljen z in silico modeliranjem je bil predstavljen tudi v študiji, ki so jo naredili Kambayashi in sodelavci (10). Izbrali so si različne odmerke DIP in ketokonazola ter jih raztopili v 0,02 M HCl. Pripravljene raztopine so naenkrat prenesli v USP II napravo, ki je vsebovala 450 mL FaSSIF-V2 s pH 6,5. Končni volumen v USP II napravi je bil 500 mL s pH vrednostjo približno 6,3. Primerjali so profile obarjanja in ugotovili, da obarjanje poteka hitreje pri višjih začetnih koncentracijah ZU. Rezultate obarjanja, pridobljene iz in vitro poskusov, ki so ustrezali kinetiki prvega reda, so uporabili v programih za simulacijo, STELLA® in GraphPad Prism®, da bi napovedali celotno koncentracijo učinkovine in koncentracijo raztopljene učinkovine v tankem črevesu na tešče. Koncentracijske profile, ki so jih dobili in silico, so primerjali z in vivo koncentracijskimi profili iz druge študije ter ugotovili, da so koncentracijski profili podobni. Na podlagi tega so sklepali, da je sklopljena metoda uporabna za oceno obarjanja v tankem črevesu, zlasti v fazi zgodnjega razvoja zdravil (10).
1.9 Vpliv zvišanega pH v želodcu na prenasičenje dipiridamola
Zvišan pH v želodcu se lahko pojavi pri ljudeh z aklorhidrijo, lahko pa je zvišan tudi pri ljudeh, ki jemljejo zdravila za zmanjšanje kislosti želodca (antacidi, zaviralci protonske črpalke, zaviralci histaminskih H2 receptorjev). Matsui in sodelavci (17) so v svoji študiji naredili primerjavo profilov DIP v dveh različnih in vitro napravah; namen je bil raziskati, kako povišan pH v želodcu vpliva na koncentracije raztopljenega DIP v prebavnem traktu. V napravi USP II so izvedli samo profile sproščanja v treh različnih medijih z različnimi pH vrednostmi, kot drugo napravo pa so uporabili še želodčno-črevesni simulator (ang.
Gastrointestinal simulator, GIS), ki je bolj natančno simuliral in vivo pogoje. GIS je model, ki je sestavljen iz petih prostorov, trije izmed njih ponazarjajo želodec, dvanajstnik in jejunum.
Prostor, ki je ponazarjal želodec je vseboval 50 mL SGF s pH 2,0 ali SGF s pH 6,0 in 250 mL vode, ki je predstavljala volumen tekočine, s katero se ponavadi zaužije FO. Duodenalni
10
prostor je imel konstanten volumen 50 mL, to je zagotavljala črpalka, ki je odvečno tekočino, ki se je prečrpala iz želodca v dvanajstnik, prečrpala v prostor, ki je predstavljal jejunum in je bil na začetku napolnjen s SIF s pH 6,5. V želodcu in dvanajstniku so s hitrim mešanjem na vsakih 25 sekund ponazorili kontrakcije, ki so prisotne in vivo. V študiji so dosegli 15-kratno stopnjo prenasičenja v dvanajstniku in 7-kratno v jejunumu, koncentracije v dvanajstniku in jejunumu so bile nad intrinzično topnostjo vseh 32 minut trajanja eksperimenta pri poskusih z začetnim pH 2 ponazorjenega želodčnega prostora. Pri začetnem pH 6 v ponazorjenem želodčnem prostoru do prenasičenja ni prišlo. Izračunali so tudi teoretične koncentracije v ponazorjenem prostoru dvanajstnika in jejunuma pri določenih časih in jih primerjali z eksperimentalnimi vrednostmi ter tako ocenili obseg obarjanja oz. raztapljanja DIP.
Eksperimentalne maksimalne koncentracije raztopljenega DIP v dvanajstniku in jejunumu pri ponazorjenem želodcu s pH 2 so primerjali z in vivo pridobljenimi podatki in so dobro korelirale glede na apliciran odmerek (17).
Gu in sodelavci (18) so tako kot Matsui in sodelavci (17) preučevali vpliv vrednosti pH v želodcu na koncentracije DIP v nižjih delih prebavnega trakta. Eksperimente so izvajali v štiriprostornem pretočnem modelu, ki je poleg prostorov, ki so predstavljali želodec in črevesje, imel še absorpcijski prostor. Koncentracije DIP, ki so jih izmerili v absorpcijskem prostoru, so nato primerjali s plazemskimi koncentracijami in vivo. Izbrali so štiri različne začetne pH vrednosti in tako ponazarjali pH okolje želodca, ki je prisotno pri zdravih ljudeh in okolje, ki je prisotno pri ljudeh z aklorhidrijo ter pri ljudeh, ki jemljejo zaviralce protonske črpalke. Uporabili so dva različna pretoka iz simuliranega želodčnega v simuliran črevesni prostor, saj je pri starejših ljudeh počasnejše praznjenje želodca (18). Opazili so, da pri izbranih pH 1,2 oz. pH 2,0 želodčnega prostora pride večja količina DIP v črevesni prostor pri nižji pH vrednosti, v absorpcijskem prostoru pa sta količini približno enaki, ne glede na začetni pH. Prav tako so izrisali teoretične krivulje koncentracij raztopljenega DIP in dobljene vrednosti primerjali z eksperimentalnimi vrednostmi koncentracij v črevesnem prostoru. V prvih 60-ih minutah pri pH 1,2 in izbranem pretoku, ni prišlo do obarjanja DIP, ob koncu poskusa pa se je manj kot 10 % DIP oborilo v črevesnem prostoru. V črevesnem prostoru pri ponazorjenem pHju želodca 1,2 in pretoku 4,5 mL/min so v 60. minuti izmerili 3,8-kratno stopnjo prenasičenja. Do prenasičenja v ponazorjenem prostoru želodca s povišanim pH do prenasičenja ni prišlo. Rezultate, ki so jih dobili in vitro so primerjali s podatki iz druge študije narejene in vivo, iz česar so sklepali, da je povišan pH v želodcu lahko eden izmed
11
razlogov za nižje koncentracije raztopljenega DIP v črevesu in posledično nižjo biološko uporabnost DIP (18).
12
2 NAMEN DELA
Namen magistrske naloge bo pregledati in vitro modele, ki so proučevali obarjanje DIP ter ovrednotiti vpliv hidrodinamskih sil na obarjanje DIP v izbranem in vitro modelu. Magistrsko nalogo bomo razdelili na dva dela, na teoretični del, ki bo vseboval literaturni pregled in vitro modelov in ovrednotenje vplivov na obarjanje DIP, ter na eksperimentalni del.
Glavni namen literaturnega dela bo ciljano zbrati podatke o študijah prenasičenja in obarjanja DIP. Zbrane podatke bomo ovrednotili in jih glede na nekatere parametre med sabo primerjali, ter jih nato uporabili kot pomoč pri načrtovanju eksperimentalnega dela. V tem delu se bomo osredotočili predvsem na to, kakšen in vitro model je bil uporabljen in kakšen je bil način priprave vzorca, kateri mediji so bili najbolj pogosto izbrani, kakšen je bil pH izbranega medija, kakšna je bila topnost DIP v izbranem mediju, kakšne najvišje koncentracije so bile dosežene, koliko časa je trajalo prenasičenje, koliko časa so trajali poskusi in na kakšen način so na koncu poskusov analizirali vzorce.
Glavni namen eksperimentalnega dela poskusov je ovrednotiti hidrodinamske vplive na potek obarjanja DIP. S pomočjo literaturnega pregleda bomo izbrali medij, način priprave vzorca, koncentracijo DIP na začetku poskusov in oddaljenost vesel od dna posode. Poskuse obarjanja bomo izvajali s tremi različnimi sistemi, na vseh sistemih bomo uporabili dva oz. tri različne volumne medija in dve hitrosti mešanja. Obarjanje DIP bomo sprožili tako, da bomo v izbran medij, ki ponazarja stanje na tešče v črevesu in v katerem je DIP slabše topen, dodali določen volumen raztopine DIP med mešanjem. Različne hidrodinamske vplive bo poleg različnih hitrosti mešanja zagotovila tudi uporaba različnih in vitro modelov, saj bomo uporabili dve različni velikosti vesel in magneta dveh velikosti. V sistemu s čašo bomo preverili tudi, kakšen vpliv ima dodatek steklenih kroglic v delovni čaši na potek obarjanja DIP. Potek obarjanja DIP iz prenasičene raztopine bomo spremljali s potopno sondo z optičnimi vlakni.
13
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI3.1.1 Kemikalije
- natrijev hidroksid, Titrisol® za pripravo 1 L 1 M NaOH, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija;
- klorovodikova kislina, Titrisol® za pripravo 1 L 1 M HCl, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija;
- natrijev klorid, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija;
- natrijev dihidrogenfosfat monohidrat, Merck, KGaA, Darmstadt, Nemčija;
- dipiridamol, p.a., Sigma-Aldrich CO, St. Louis, ZDA;
- 96 % etanol, denaturiran, Pharmachem, Sušnik Jožef, Ljubljana, Slovenija;
- deionizirana voda.
3.1.2 Aparature in laboratorijski pribor
- UV-Vis spektrofotometer s potopno sondo z optičnimi vlakni z dolžino poti 0,5 cm Agilent Cary 60, Agilent Technologies, Santa Clara, ZDA;
- naprava za testiranje sproščanja VanKel VK 7000 Series s 500 mL posodami in klasičnimi veslastimi mešali, Vankel Technology, ZDA;
- naprava za testiranje sproščanja VanKel VK 7000 Series z 200 mL ozkimi visokimi posodami in pomanjšanimi veslastimi mešali, Vankel Technology, ZDA;
- čaša in kopel, sistem za testiranje prenasičenja in obarjanja
250 mL delovna čaša brez obrusa
velik magnet (dolžina 50 mm in premer 8 mm)
mali magnet (dolžina 15 mm in premer 8 mm)
steklene kroglice premera 1 mm, Sotax
- analitska tehtnica AG245, Mettler Toledo GmbH, Greifensee, Švica;
- precizna tehnica Exacta 300 EB, Tehtnica, Železniki, Slovenija;
- ultrazvočna kopel Sonis 4, Iskra, Kranj, Slovenija;
- pH meter MP220, Mettler Toledo GmbH, Greifensee, Švica;
- avtomatske pipete z različnimi razponi volumnov, Eppendorf, Hamburg, Nemčija;
- polnilne pipete različnih volumnov, Blaubrand, Nemčija;
- steklovina (merilne bučke, čaše, merilni valji, lij, tehtiči, epruvete);
14
- ostali pribor (spatule, žličke, kapalke, magneti, štoparica).
3.2 METODE
3.2.1 Literaturni pregled
Članke, primerne za literaturni pregled, smo iskali v podatkovni bazi Pubmed. Iskalni profil, ki smo ga uporabili v podatkovni bazi na začetku, je bil »dipyridamole AND precipitation«.
Za omejitev obsega iskanja nismo uporabili nobenih drugih parametrov. Ker smo dobili veliko število člankov in vsi niso ustrezali našemu namenu iskanja, smo nato k prvemu iskalnemu profilu dodali še »in vitro« in tako dobili drugi iskalni profil, ki je bil
»dipyridamole AND precipitation AND in vitro«. V obeh iskalnih nizih smo iskali članke, ki so vsebovali in vitro model (model ni bil točno definiran), ZU DIP (agregatno stanje in FO nista bila definirana) in prenasičenje ali obarjanje.
Izločili smo članke, kateri niso ustrezali:
- glede na naslov,
- niso preučevali prenasičenja ali obarjanja, - so imeli poudarek na in vivo obnašanju DIP,
- so preučevali druge ZU in le posredno preverjali vpliv DIP na druge učinkovine Iskanje je bilo izvedeno na datum 15.06.2020, glede na leto objave člankov ga nismo omejili.
Iz izbranih člankov smo nato pridobili podatke:
- kakšen in vitro model je bil uporabljen,
- kakšen postopek izvedbe in vitro testov so izbrali,
- kako so pripravili vzorec z ZU za spremljanje prenasičenja (raztopina, suspenzija, prašek, tableta, trdna disperzija,…),
- kateri medij so izbrali (sestava medija, pH medija) in - topnost v izbranem mediju.
Zanimale so nas še začetna, končna in najvišja koncentracija DIP pri poskusu. Te vrednosti smo izpisali direktno iz člankov, če so bile podane, kjer pa niso bile, smo s pomočjo programa Engauge Digitizer odčitali številčne vrednosti iz slik. V nekaterih člankih so bili narisani grafi spreminjanja koncentracije v odvisnosti od časa - tam smo
15
lahko odčitali direktno koncentracije raztopljene učinkovine v določeni časovni točki, v drugih pa so bili podani odstotki uporabljenega odmerka v odvisnosti od časa in smo preko odstotkov odmerka in volumna medija izračunali koncentracije raztopljene učinkovine. Pri klasičnih in vitro modelih je bil volumen medija konstanten, oziroma smo upoštevali zmanjšanje volumna zaradi vzorčenja, kjer medij ni bil nadomeščen. Pri modificiranih in pretočnih sistemih pa smo upoštevali še pretok in tako dobili različne volumne medija pri določenih časovnih točkah in dobljene volumne uporabili za računanje koncentracij raztopljene učinkovine. Na koncu smo iz grafov odčitali še čas trajanja prenasičenja, kjer smo kot prenasičenje upoštevali koncentracije, ki so bile višje od topnosti učinkovine v izbranem mediju.
3.2.2 Eksperimentalni del
3.2.2.1 Priprava raztopin - 1 M HCl
V 1 L merilno bučko smo nalili malo deionizirane vode, nato smo vanjo kvantitativno prenesli standardno raztopino klorovodikove raztopine Titrisol® in z deionizirano vodo dopolnili do oznake ter premešali.
- 0,01 M HCl
500 mL merilno bučko smo približno do polovice napolnili z deionizirano vodo in vanjo nalili 50 mL 1 M HCl, katere volumen smo prej odmerili z merilnim valjem, nato smo bučko z deionizirano vodo dopolnili do oznake ter premešali.
- 1 M NaOH
V 1 L merilno bučko smo nalili malo deionizirane vode, nato smo vanjo kvantitativno prenesli standardno raztopino natrijevega hidroksida Titrisol® in z deionizirano vodo dopolnili do oznake in premešali.
- FaSSIF brez SIF praška s pH=6,5
V 2 L merilno bučko smo nalili približno 500 mL deionizirane vode, ji dodali 12,38 g NaCl, 7,90 g NaH2PO4 × H2O in 21 mL 1M NaOH, dolili še približno 1 L deionizirane vode, premešali, da so se soli raztopile in pomerili pH. pH smo uravnali na približno 6,5 z dodatkom nekaj kapljic 1 M NaOH ali 1 M HCl (dovoljena odstopanja so ± 0,05 pH enote). Ko je bil pH približno enak 6,5 smo z deionizirano vodo dopolnili bučko do oznake in raztopino premešali.
16
3.2.2.2 Spreminjanje pH vrednosti in absorpcijskega spektra glede na razmerje FaSSIF brez SIF pH=6,5 in 0,01 M HCl
Da bi spremljali spreminjanje pH vrednosti in absorpcijskega spektra glede na razmerje FaSSIF brez SIF praška s pH=6,5 in 0,01 M HCl, smo si pripravili 5 različnih raztopin in vsem pomerili pH vrednosti ter absorpcijske spektre. Pri vseh izmerjenih absorpcijskih spektrih je bilo izbrisano ozadje, kar smo naredili z vodo. Na koncu smo pomerili pH in spekter tudi FaSSIFu brez SIF. V istem dnevu smo pomerili vse pH vrednosti z enako kalibracijo pH metra, saj bi se pH pripravljenega pufra med dnevi lahko razlikoval. Sestava raztopin je prikazana v tabeli I.
Tabela I: Volumska sestava raztopin A, B, C, D, E in F za preverjanje vpliva razmerij med FaSSIFom in 0,01 M HCl na pH raztopin in absorpcijski spekter
Raztopina Volumen FaSSIF brez SIF
praška pH=6,5 (mL)
Volumen 0,01 M HCl (mL)
A 20,0 1,5
B 20,0 1,2
C 20,0 1,0
D 20,0 0,8
E 20,0 0,5
F 20,0 0
3.2.2.3 Priprava umeritvene premice za dipiridamol
Enačbo za umeritveno premico DIP smo določali v FaSSIFu brez SIF s pH=6,5. Pri vseh meritvah je bil delež 0,01 M HCl enak 5 % začetnega volumna FaSSIFa brez SIFa, kar smo zagotovili z dodajanjem 0,01 M HCl v raztopino. Najprej smo si pripravili tri osnovne raztopine DIP v 0,01 M HCl A, B in C, koncentracija osnovnih raztopin je bila približno enaka 1700 mg/L. Natančno smo natehtali približno 42,5 mg DIP, ga kvantitativno prenesli v 25 mL merilno bučko ter z 0,01 M HCl dopolnili približno do četrtine. Raztopine smo nato za nekaj minut postavili v ultrazvočno kopel in tako dosegli, da se je DIP popolnoma raztopil.
Nato smo vse 3 bučke dopolnili z 0,01 M HCl do oznake. Iz tako pripravljenih osnovnih raztopin z znano koncentracijo DIP smo z nadaljnjim redčenjem pripravili devet raztopin v koncentracijskem območju 0,5 - 80 mg/L. Umeritveno premico za DIP smo izjemoma delali v čašah in ne v bučkah, pri tem smo predpostavili aditivnost volumnov, saj se nam je zaradi hitrega obarjanja DIP nekaj učinkovine oborilo že v vratu bučke, preden smo raztopino lahko premešali in pomerili absorbanco. V bučkah nismo mogli dobiti linearnega odziva ob naraščanju koncentracij DIP, zato smo poskuse izvedli še v čašah, kjer nam je magnetno
17
mešalo omogočalo hitrejše zmešanje raztopine, s tem pa smo lahko hitreje izmerili tudi absorbanco. V čaše smo odpipetirali ustrezno količino FaSSIFa brez SIF s pH 6,5, dodali ustrezno količino 0,01 M HCl, da je le-ta skupaj z volumnom pripravljene osnovne raztopine DIP predstavljala 5 % začetnega volumna medija. Raztopino medija v čaši smo pomešali na magnetnem mešalu in med mešanjem s pipeto čim bolj hitro dodali ustrezno količino osnovne raztopine DIP. Takoj, ko se je vse skupaj pomešalo, smo pomerili absorbanco s pomočjo potopne sonde z optičnimi vlakni. Absorbanco smo odčitali pri 286 nm in 412 nm, saj sta ti valovni dolžini predstavljali maksimum za DIP glede na dobljene absorpcijske spektre.
Vrednosti absorbanc in točne koncentracije DIP v raztopinah smo vnesli v graf in s pomočjo linearne regresije izračunali enačbi umeritvenih premic ter kvadrat Pearsonovega koeficienta korelacije za obe izbrani valovni dolžini. Volumni posameznih raztopin in okvirne koncentracije DIP za izdelavo umeritvene premice so prikazani v tabeli II.
Tabela II: Uporabljeni volumni FaSSIF brez SIF, osnovne raztopine dipiridamola A, B in C ter 0,01 M HCl, da dobimo raztopine z natančno določeno koncentracijo blizu navedeni vrednosti
Okvirna
koncentracija DIP (mg/L)
Volumen FaSSIFa brez SIF pH=6,5 (mL)
Volumen osnovne raztopine DIP s koncentracijo 1700 mg/L (µL)
Volumen dodane 0,01 M HCl (µL)
A 0,5 100 30 4970
B 1,0 50 30 2470
C 5,0 50 150 2350
A 10,0 50 300 2200
B 20,0 50 600 1900
C 30,0 50 1000 1500
A 40,0 25 600 650
B 60,0 25 1000 250
C 80,0 10 500 0
3.2.2.4 Izvedba poskusov obarjanja dipiridamola iz prenasičene raztopine pri različnih hidrodinamskih vplivih
Za izvajanje poskusov obarjanja DIP smo uporabili medij FaSSIF brez SIF praška s pH 6,5.
DIP smo predhodno raztopili v 0,01 M HCl, da smo dobili raztopino z okvirno koncentracijo 1700 mg/L. Na začetku eksperimenta smo v izbran volumen FaSSIFa brez SIF praška dodali tolikšen volumen raztopine DIP v 0,01 M HCl, da je bil volumen 0,01 M HCl enak 5 % začetnega volumna medija (volumni medija in volumni dodane raztopine DIP so predstavljeni v tabeli III). Medij, ki vsebuje 5 % 0,01 M HCl glede na začetni volumen FaSSIFa brez SIF bomo nadalje poimenovali 5 % 0,01 M HCl v FaSSIFu. Na začetku vsakega eksperimenta
18
obarjanja je bila začetna koncentracija DIP v mediju približno enaka 80 mg/L. Poskuse smo izvajali v treh različnih sistemih:
- v napravi USP II s klasičnimi mešali in manjšimi posodami (k-USP) v 250 mL ali 500 mL pri 25 obratih na minuto (rpm) ali 100 rpm,
- v napravi USP II z mini mešali in ozkimi visokimi posodami (m-USP) v 200 mL ali 50 mL medija pri 25 ali 100 rpm,
- v 250 mL čaši (č) v 200 mL ali 50 mL medija pri 50 ali 100 rpm. Za mešanje smo uporabili mali (15 mm) ali veliki (50 mm) magnet, v sistem pa smo pri nekaterih poskusih dodali tudi 25 ali 50 g steklenih kroglic. Steklene kroglice smo stehtali, jih dali v čašo, mešanje pa smo zagotovili z uporabo velikega magneta. Kroglice so se cel čas nahajale na dnu čaše.
Medij smo pri vseh poskusih predhodno segreli na približno 37 ± 0,5 °C in med mešanjem dodali ustrezen volumen osnovne raztopine DIP v 0,01 M HCl. Osnovno raztopino smo dodali naenkrat in kar se da hitro. Ob začetku dodajanja osnovne raztopine smo začeli meriti čas. Pri vsakem poskusu smo izvedli najprej po eno paralelko; pri poskusih, kjer pa so se pokazale razlike v dobljenih rezultatih glede na uporabljene pogoje, pa smo izvedli še eno ali dve dodatni paralelki. Pogoji posameznega poskusa, število paralelk in oznake poskusov so podrobneje predstavljeni v tabeli III.
19
Tabela III: Shema izvedbe poskusov, število izvedenih paralelk in oznaka poskusov spremljanja obarjanja DIP pri različnih hidrodinamskih vplivih - oznake se nadalje uporabljajo v poglavju rezultati in v razpravi
Uporabljen sistem Volumen medija (mL)
Volumen osnovne raztopine (mL)
Hitrost mešanja (rpm)
Izbran magnet in masa dodanih steklenih kroglic (g)
Število paralelk Oznaka poskusa USP II s klasičnimi
mešali in manjšimi posodami
250 12,5 25 / 3 kUSP-Ia
250 12,5 100 / 3 kUSP-Ib
500 25,0 25 / 3 kUSP-Ic
500 25,0 100 / 3 kUSP-Id
USP II z mini mešali in ozkimi visokimi posodami
50 2,5 25 / 1 mUSP-IIa
50 2,5 100 / 1 mUSP-IIb
200 10,0 25 / 1 mUSP-IIc
200 10,0 100 / 1 mUSP-IId
250 mL čaša 50 2,5 50 mali magnet 3 č-IIIa
50 2,5 100 mali magnet 3 č-IIIb
50 2,5 50 veliki magnet 3 č-IIIc
50 2,5 100 veliki magnet 2 č-IIId
50 2,5 50 veliki magnet + 25 g
steklenih kroglic
2 č-IIIe
50 2,5 100 veliki magnet + 25 g
steklenih kroglic
3 č-IIIf
100 5,0 50 veliki magnet + 50 g
steklenih kroglic
1 č-IIIg
100 5,0 100 veliki magnet + 50 g
steklenih kroglic
1 č-IIIh
200 10,0 50 mali magnet 1 č-IIIi
200 10,0 100 mali magnet 1 č-IIIj
200 10,0 50 veliki magnet 3 č-IIIk
200 10,0 100 veliki magnet 3 č-IIIl
200 10,0 50 veliki magnet + 25 g
steklenih kroglic
2 č-IIIm
200 10,0 100 velik magnet + 25 g
steklenih kroglic
2 č-IIIn
20
Vzorčenje ni bilo klasično, ampak je bilo merjenje absorbanc izvedeno in situ. Za analizo vzorcev smo uporabili spektrofotometer Agilent Cary 60, meritve pa smo izvedli s potopno sondo z optičnimi vlakni in dolžino poti 0,5 cm. Za merjenje absorbanc vzorcev smo uporabili program Scan, s katerim smo dobili vrednosti absorbanc po celotnem spektru.
Izbrane nastavitve programa so predstavljene v tabeli IV.
Tabela IV: Nastavitve programa Scan pri merjenju absorpcijskega spektra DIP v poskusih obarjanja Območje merjenja spektra 200 – 800 nm
Interval merjenja absorbance 1,0 nm Čas merjenja signala pri eni valovni dolžini 0,0125 s
Hitrost snemanja 4800 nm/min
Pred meritvami vzorcev smo izbrisali ozadje s čistim medijem. Pri vseh poskusih smo ob enakih časovnih točkah s potopno sondo z optičnimi vlakni izvedli meritve absorpcijskega spektra v preiskovanih disperznih sistemih, izbrane časovne točke so bile 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25 in 30 minut. Ko smo potopno sondo z optičnimi vlakni potopili v disperzijo, smo pred merjenjem preverili, da v reži sonde ni ujetega nobenega zračnega mehurčka, saj bi le-ta motil naše meritve, in šele nato začeli snemati spekter. Pred vsako novo časovno točko smo sondo sprali najprej z deionizirano vodo, nato z etanolom in še enkrat deionizirano vodo. Sondo smo nato previdno obrisali in nadaljevali z merjenjem absorpcijskega spektra naslednjega vzorca. S spiranjem sonde med posameznimi časovnimi točkami smo preprečili nabiranje delcev v reži sonde, etanol pa smo uporabili, ker je DIP v vodi slabo topen in ga samo z vodo ne bi popolnoma odstranili iz sonde. Nato smo pri vsaki meritvi vzorcev dobili vrednosti absorbanc in preko umeritvene premice izračunali koncentracijo DIP v posamezni časovni točki. Vrednosti absorbanc, ki smo jih uporabili za računanje koncentracij, smo dobili tako, da smo od vrednosti absorbance pri 412 nm odšteli vrednost pri 600 nm. Z odštevanjem valovne dolžine pri 600 nm smo nekoliko zmanjšali motnje mikro delcev v sistemu, ki motijo absorpcijo in dvignejo bazno linijo. Tako dobljeno absorbanco smo poimenovali korigirana absorbanca, ki smo jo nato uporabili za izračun koncentracije raztopljenega DIP v posamezni časovni točki. Nadalje smo izračunali in prikazali še odstotek začetne koncentracije za vsako časovno točko.
Začetna koncentracija je bila izračunana iz natehte DIP, ki smo jo vnesli v sistem.
21
4 REZULTATI
4.1 Literaturni delV literaturnem delu bodo prikazani rezultati, ki smo jih dobili iz pregleda člankov o prenasičenju DIP. Zbrane članke smo razdelili po skupinah glede na uporabljen in vitro model. Razdelili smo jih na klasične, pretočne in modificirane modele. Iz vsakega članka smo izpisali podatke, ki so nas zanimali in so prikazani v tabelah. Začetna, najvišja in končna koncentracija DIP ter trajanje prenasičenja so pri vsakem članku zapisani v posameznih stolpcih za isti pogoj. Pogoji se razlikujejo med članki, vendar so največkrat odvisni od načina priprave vzorcev, uporabljene FO, uporabljenih polimerov in izbranega pretoka pri pretočnih modelih. Začetna koncentracija DIP je koncentracija raztopljenega DIP v modelu ob začetku poskusa, oziroma prva točka, ki smo jo lahko odčitali iz grafa.
Končna koncentracija DIP je koncentracija raztopljenega DIP v modelu ob koncu poskusa, oziroma zadnja točka, ki smo jo odčitali iz grafa. Najvišja koncentracija DIP je maksimalna koncentracija raztopljenega DIP, ki je bila tekom poskusa dosežena. Pri pretočnih modelih in nekaterih modificiranih modelih je v oklepajih zapisan tudi čas, kdaj so bile začetna, najvišja in končna koncentracija dosežene. Za čas trajanja prenasičenja smo vzeli čas od začetka poskusov do točke, ko je bila koncentracija raztopljenega DIP v modelu še vedno večja od topnosti v izbranem mediju. Kadar je bilo prenasičenje v modelu prisotno skozi celoten čas poskusov, je to v tabelah označeno in napisano z besedilom z vijolično barvo. Če stanje prenasičenja v modelih ni bilo doseženo, je to prav tako zapisano. Zbrani podatki so prikazani v tabelah, od V do XII.
22 4.1.1 Klasični modeli
Tabela V: Podatki o in vitro modelih, pridobljeni iz člankov (12,14), vse koncentracije so odčitane iz grafov s pomočjo programa Engauge Digitizer, podatki za topnost so bili pridobljeni eksperimentalno v posameznih člankih. Besedilo označeno z vijolično barvo pomeni, da je prenasičenje trajalo celoten čas poskusa.
Avtor članka, leto izdaje, referenca Vora, 2016, (12) Baghel, 2018, (14)
Tip modela Klasični, USP II naprava Klasični, USP II naprava
Opis postopka poskusov Volumen medija je bil 900 mL, hitrost mešanja 50 rpm, pripravili so trdne disperzije s polimeri (SD), masa DIP v SD je 50 mg
Volumen medija je bil 500 mL, predhodno so mu dodali različne koncentracije PVP in PAA – koncentracije so prikazane spodaj. Raztopino DIP so na začetku poskusa dodali v medij, tako da je bila začetna konc DIP 50 µg/mL. Vsi poskusi so trajali 6 ur.
Uporabljen polimer HPMC E5 in E50 ter PVP K-30 in K-90 v trdni disperziji PVP in PAA vmešana v medij Način priprave vzorca / uporabljena FO kristalinični
DIP SD
HPMC E5
SD HPMC E50
SD PVP
K-30 SD PVP
K-90 25 mg DIP raztopljenega v 10 mL metanola
Koncentracija polimera v mediju (µg/mL) / 0
PVP 12,5 PVP
50 PVP
200 PVP
0 PAA
12,5 PAA
50 PAA
200 PAA Začetna koncentracija DIP (µg/mL) 3,3 18,6 39,3 10,3 11,6 7,2 24,9 25,9 31,1 7,3 26,2 26,2 33,6 Najvišja koncentracija DIP (µg/mL) 10,3 33,1 54,2 20,6 23,5 7,2 25,0 26,5 31,5 7,3 26,9 26,8 33,6 Končna koncentracija DIP (µg/mL) 10,3 21,0 39,0 12,5 14,0 5,7 5,7 5,7 11,2 5,4 13,7 13,4 19,2
Uporabljen medij Fosfatni pufer pH 6,8 Fosfatni pufer pH 6,8
pH medija 6,8 6,8
Topnost v izbranem mediju (µg/mL) 6,53 6,9
Čas trajanja prenasičenja 4 ure so trajali poskusi za HPMC in 3 ure za PVP, prenasičenje je bilo prisotno celoten čas poskusov ga ni
bilo 4 ure 4
ure 6 ur ga ni
bilo 6 ur 6 ur 6 ur
