A. actinomycetemcomitans je Gram-negativna, fakultativno anaerobna, negibljiva bakterija iz družine Pasteurellaceae. Najdemo jo v ustni votlini in je prisotna pri agresivnem in kroničnem parodontitisu. Prav tako je povezana z drugimi infekcijami, kot so pljučnica, okužba urinarnega trakta, osteomielitis in druge (Dolores, 2013).
Bakterija je bila premeščena iz rodu Actinobacillus v rod Aggregatibacter. Uspešno raste na obogatenih gojiščih in še bolje v atmosferi s 5 do 10 % ogljikovim dioksidom (CO2). Na rutinskih trdnih gojiščih so celice majhne in kokoidne oblike, na gojiščih, ki vsebujejo sladkor in na tekočih gojiščih s serumom, pa daljše in paličaste oblike (Podržaj, 2011).
Kolonije A. actinomycetemcomitans imajo prvotno temnejši center, ki med inkubacijo zraste v zvezdasto strukturo, kar daje kolonijam videz prekrižanih cigar. Izolati v tekočih gojiščih s serumom rastejo v obliki zrn, ki se pritrdijo na stene ali dno epruvete. Kadar bakterija raste na trdnih površinah, zrna tvorijo lepljiv, težko odstranljiv in gost biofilm. Ta se težko odstrani z detergenti, proteazami, vročino, s strižnimi silami med hitrim mešanjem ali ultrazvokom. V primerjavi s prostimi celicami biofilm omogoča povečano odpornost na antibiotike. Zaradi teh lastnosti je bakterija sposobna kolonizirati ustno votlino ter povzročiti bolezen (Sodja, 2006).
Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo
6
Bakterija naseljuje usta pri več kot tretjini prebivalstva. Ugotovili so, da so posamezniki afriško- ameriškega rodu bolj dovzetni za pojav parodontitisa kot belci. Poleg tega, da bakterija povzroča ustne bolezni, je bakterija članica HACEK (Haemophilus, Actinobacillus, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella) skupine bakterij, ki povzročajo endokarditis pri otrocih.
Da bi se bakterija uspešno kolonizirala, povzročila bolezen in zdržala v gostitelju, mora ohranjati nabor virulenčnih faktorjev. A. actinomycetemcomitans proizvede različne faktorje, med drugim tudi proteine, polisaharide in toksine. Dva najbolj raziskana toksina sta levkotoksin (Ltx) in toksin CDT (ang. Cytolethal Distending Toksin) (Kachlany, 2010).
Slika 2: Aggregatibacter actinomycetemcomitans ("Aggregatibacter, 2013") 2.3.1 LEVKOTOKSIN
A. actinomycetemcomitans izraža levkotoksin, ki selektivno vpliva na človeške celice hematopoetičnega izvora (krvne celice). Levkotoksin se veže na receptor 1 (LFA-1) na celični membrani, ki je povezan s funkcijo levkocitov. S tem povzroči motnje v membranski integriteti.
Spada v RTX-družino toksinov, ki je družina citotoksinov, ki jih proizvajajo Gram-negativne bakterije. Z RTX-proteini je podoben po organizaciji genoma in molekulski strukturi. Izražanje levkotoksina in toksina CDT je različno pri različnih izolatih A. actinomycetemcomitans.
Pokazalo se je, da se levkotoksin močno izraža pri parodontitisu, medtem ko je vloga toksina CDT še vedno manj jasna. Operon levkotoksina je sestavljen iz štirih kodirajočih genov,
7 imenovanih ltxC, ltxA, ltxB, ltxD in promotorske regije, z 652 bp. LtxA kodira strukturo toksina, ltxC kodira komponente, ki so potrebne za postranslacijske modifikacije, toksina LtxA, ltxB in ltxD pa sta potrebna za transport toksina na celično membrano. Promotor se nahaja nasproti toku gena ltxC.
Študije so pokazale, da imajo nekateri kloni bakterije s povečano ekspresijo levkotoksina spremenjen promotor v operonu levkotoksina. Celični in molekulski mehanizmi, pri katerih spremenjeni promotor poveča izražanje levkotoksina, niso znani. Najbolj znan tak primer je izredno levkotoksičen klon JP2 seva A. actinomycetemcomitans s 530 bp in delecijo v promotorju na operonu levkotoksina. Prisotnost klona JP2 je tesno povezana z agresivno obliko parodontitisa. Z genotipizacijo so pred kratkim ugotovili, da klon JP2 kolonizira posameznike severno-evropskega porekla. Analize klona JP2 so pokazale, da imajo vsi sevi klona skupnega prednika iz Severne Afrike. Ekspresija levkotoksina je odvisna tudi od okoljevarstvenih faktorjev, kot sta rastni pogoji in substrat (Johanson, 2011).
Slika 3: Promotorsko področje in geni kompleksa levkotoksina (Dolores, 2013)
Slika 3 prikazuje promotorsko področje in s puščicami kodirajoče gene levkotoksina in klona levkotoksina JP2. Promotorsko področje levkotoksina sestavlja 652 bp, medtem ko je promotorsko področje levkotoksina JP2 zaradi delecije nukelotidov krajše, dolgo 530 bp.
Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo
8
2.3.2 TOKSIN CDT (ang. Cytolethal distending toxin)
CDT so skupina proteinskih toksinov, ki jih proizvajajo različne Gram-negativne bakterije, kot so Escherichia coli, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Haemophilus ducreyi, Shigella dysenteriae, Campylobacter sp., Helicobacter sp., in Salmonella enterica. CDT so prisotni pri bakterijah iz družine Proteobacteria. Spadajo v skupino AB-toksinov in so prvi opisani bakterijski toksini z DNazno aktivnostjo, kar jim omogoča, da hidrolizirajo DNA tarčne celice in jo tako poškodujejo. Toksin sproži zaustavitev v celičnem delitvenem ciklu v G2/M fazi, kar povzroči povečanje oz. nabreklost celice (razširive citoplazme), zaradi česar nastopi apoptoza oz. celična smrt (Jinadasa, 2011).
Toksin CDT je heterotrimeren, sestavljen je iz treh različnih podenot poimenovanih po abecednem vrstnem redu, kot se pojavijo v operonu toksina: CdtA, CtdB in CdtC. Podenota CtdB je katalitično-aktivna podenota kompleksa. CdtA in CdtC skupaj omogočata vezavo in vstop v kasnejši fazi dimernega toksina (dimera CdtA/CdtB) v tarčno celico (Guerra, 2011). Prvič so poročali o toksinu CDT leta 1987 v bakteriji E. coli, ki so jo izolirali iz mladega bolnika. Leta 1994 sta znanstvenika Scott in Kaper uspešno pripravila rekombinantno nukleotidno zaporedje operona CTD iz bakterije E. coli (Jinadasa, 2011).
Slika 4: Vpliv CDT toksina na tarčne celice ("CDT family, n.d.")
9 Slika 4 prikazuje heterotrimerni toksin CDT(ABC), ki ga določajo tri kodirajočih regije – CdtA, CdtB in CtdC. Struktura holotoksina še ni znana. Toksin deluje na tarčne celice in povzroči povečanje evkariontskih celic in s tem celično smrt.