Po vstavitvi v organizem gostitelja se tuja DNA, ki je vstavljena znotraj rekombinantnega plazmidnega konstrukta, lahko izrazi ali pa tudi ne. To pomeni, da se DNA lahko samo podvoji brez nadaljnega izražanja ali pa se prepiše in prevede v nastanek rekombinantnega proteina. Na
27 splošno, izražanje tujega gena zahteva vključevanje sekvenc, ki so potrebne za produkcijo molekule mRNA v procesu transkripcije (prepisa), ki se jo uporabi v nadaljni translaciji (prevajanju). Te sekvence so promotor, translacijski iniciacijski signal (Shine- Dalgarno sekvenca, za pravilno postavitev ribosoma) in transkripcijski terminator, ki določa konec prepisa iz DNA v mRNA (Brondyk H, 2009).
Transkripcijo katalizira encim RNA- polimeraza, ki je sposobna prepoznati pravo mesto za začetek transkripcije, ki ga imenujemo promotor. Promotor sproži transkripcijo in je zato kontrolna točka za izražanje gena (Grabnar 1997).
Pri prokariontih ni izoblikovanega jedra, zato v bakterijski celici potekata transkripcija in translacija istočasno. To jim omogoča hiter in učinkovit odziv na spremenjene spremembe v okolju. Na mRNA je že med njenim nastajanjem večje število ribosomov, ki se pomikajo v isti smeri kot nastaja mRNA. Iz njih izraščajo nastajajoče proteinske molekule in se po končani sintezi sproščajo v citoplazmo. Izražanje genov v celici je strogo nadzorovano. To pomeni, da se geni za proteine, ki jih celica ves čas potrebuje za vzdrževanje svoje zgradbe in za svoje delovanje (metabolizem), izražajo neprestano, vendar tudi usklajeno, drugi geni pa le po potrebi.
Okolje, v katerem organizmi živijo in se razmnožujejo, se nenehno spreminja. Bakterija, ki bo nenadoma prišla v okolje, bogato s prehranskim virom, se bo nemudoma odzvala z izražanjem genov za encime, ki bodo to hrano učinkovito pretvarjali in ji s tem zagotovili hitro rast in delitev. Ko bo hranivo pošlo, se bo izražanje omenjenih genov ustavilo, saj bi bilo nesmiselno in energetsko potratno, da bi celice sintetizirale proteine, ki jih ne potrebujejo (Komel, 2006).
29
5 ZAKLJUČEK IN SKLEPI
V diplomskem delu sem dosegla oba cilja, ki sem si jih zastavila. V diplomski nalogi sem predstavila bakterijo Aggregatibacter actinomycetemcomitans in jo povezala z boleznijo parodontitis, prav tako pa sem pripravila plazmidni konstrukt za preučitev promotorske aktivnosti l toksina CDT v bakteriji A. actinomycetemcomitans. Rekombinantni plazmidni konstrukt za preučevanje promotorske aktivnosti gena za levkotoksin nam ni uspelo pridobiti, najverjetneje zaradi slabe pomnožitve gena ali neustrezne restrikcije. Seznanila sem se z celotnim postopkom priprave rekombinantne DNA.
V postopku sem z encimom razrezala promotorsko področje, (ki uravnava prepisovanje) toksina CDT in levkotoksina, ki ju izloča bakterija A. actinomycetemcomitans in z enakim encimom odprla plazmidnega vektorja pJT5. S tem sem lahko fragment DNA vstavila v plazmidni vektor in nastalo rekombinantno DNA zaprla z encimom ligaza. Ugotovila sem, da je uvajanje tehnik rekombinantne DNA povzročilo velike spremembe v našem pojmovanju življenja.
Rekombinantno DNA lahko tako vnesemo v bakterijsko celico, ki jo zlahka razmnožimo v tekočem gojišču ter z molekulskim in celičnim kloniranjem pridobimo veliko število kopij fragmenta DNA vstavljenega v plazmid. Kadar je ta fragment gen, ki nosi zapis za farmacevtsko zanimiv protein, ga v bakterijskih celicah tudi izrazimo - sprožimo njegovo prepisovanje v mRNA in njeno prevajanje v protein. Na ta način lahko pridobimo zelo velike količine proteina, ki bi ga iz izvornega evkariontskega organizma pridobili veliko manj, ker ga je v njegovih celicah zelo malo ali pa je slabo dostopen (Komel, 2006).
Diplomska naloga temelji na dveh hipotezah. S PCR sem ugotovila, da bakterija izolirana iz pacienta s parodontozo v Sloveniji, nosi zapis promotorskega področja za pomemben toksin za nastanek parodontitisa, in sicer toksin CDT. S tem sem deloma potrdila prvo hipotezo, saj nismo uspeli pripraviti rekombinantnega plazmida s promotorskim področjem za levkotoksin. Izdelala sem plazmidni konstrukt za preučevanje promotorske aktivnosti gena za CDT in s tem potrdila drugo hipotezo.
31
6 VIRI IN LITERATURA
“Aggregatibacter” (2013), Dostopno prek URL:
http://www.vetbook.org/wiki/dog/index.php/Aggregatibacter_spp [ Povzeto: 5.9.2013]
Brondyk W. H. (2009) Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein.Methodss of Enzymology, 463
“CDT Family” (n.d.), Dostopno prek URL:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X99015371 [žPovzeto: 5.9.2013]
Cvetko E., Skalerič U. (2008). Identikacije za sistemsko antibiotično zdravljenje parodontalne bolezni. Zobozdravstveni vestnik, 63: 81-89
Dolores Juarez-Rodriguez M., Torres-Escobar A., Demuth R.D. (2013). Construction of new cloning, lacZ reporter and scarless-markerless suicide vectors for genetic studies in
Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Plasmid, 69: 211-222
Dragaš A. Z. (1996). Oralna bakteriologija. Ljubljana: DZS
Grabnar M. in sod. (1997) . Genetika in Evolucija Biologija 7 in 8. Ljubljana 1997: DZS Grošelj D., Gubina M. (2002). Zobna gniloba in bakterijske okužbe obzobnih tkiv. V M.
Gubina, A. Ihan (Ur.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (363-371)
Guerra L., Cortes-Bratti X., Guidi R., Frisan T. (2011).The Biology of the Cytolethal Distending Toxins. Toxins, 3: 172-190
Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo
32
Herzog-Velikonja H., Gruden K. (2000). Praktikum iz molekularne biologije-Teoretični del.
Ljubljana: Študentska založba
Jinasasa N.R., Bloom E.S., Weiss S.R., Duhamel E.G. (2011). Cytolethal distending toxin: a conserved bacterial genotoxin that blocks cell cycle progression, leading to apoptosis of a broad range of mammalian cell lineages. Microbiology, 157: 1851-1857
Johansson A. (2011). Aggregatibacter actinomycetemcomitans Leukotoxin: A Powerful Tool with Capacity to Cause Imbalance in the Host Inflammatory Response. Toxins, 3: 242-259
Kachlany S.C. (2010). Aggregatibacter actinomycetemcomitans Leukotoxin: from threat to therapy. Critical reviews in oral biology & medicine, 89 (6): 561-570
Komel R. (2006) GENETIKA od dvojne vijačnice do kloniranja Učbenik za gimnazije in srednje tehniške šole. Ljubljana: Rokus
Parodonitis, (n.d.), Dostopno prek URL:
http://www.apotheken-umschau.de/Parodontitis/Parodontitis-Symptome-11648_3.html [Povzeto: 5.9.2013]
Podržaj S. (2011). Protibakterijska učinkovitost različnih vrst medu na parodontopatogene bakterije in ustne streptokoke. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta
Sodja E. (2006). Primerjava klasične bakteriološke diagnostike in molekularne metode za dokazovanje parodontopatogenih bakterij v vzorcih iz parodontalnih žepov. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta