DIPLOMSKO DELO

(1)

IRENA ŠURLA

PRIPRAVA PLAZMIDNIH KONSTRUKTOV ZA PREUČITEV PROMOTORSKE AKTIVNOSTI GENOV BAKTERIJE AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2013

(2)

(3)

BIOLOGIJA IN KEMIJA

IRENA ŠURLA

Mentor: PROF. DR. PETER MAČEK Somentor: DOC. DR. MATEJ BUTALA

PRIPRAVA PLAZMIDNIH KONSTRUKTOV ZA PREUČITEV PROMOTORSKE AKTIVNOSTI GENOV BAKTERIJE AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2013

(4)

(5)

Zahvaljujem se svoji družini, ki mi ji študij omogočila in me spodbujala. Prav tako se zahvaljujem fantu Lovru za pomirjujoče besede in podporo med vsemi leti študija.

Zahvaljujem se tudi mentorju prof. dr. Petru Mačku in somentorju doc. dr. Mateju Butali, ker sta mi namenila svoj čas za vsa vprašanja in mi omogočila izvedbo diplomskega dela.

(6)

(7)

Aggregatibacter actinomycetemcomitans je bakterija, ki povzroča agresivni in kronični parodontitis. Glavna posledica te parodontalne bolezni je propad obzobnih tkiv v zelo kratkem času. Bolezensko stanje se pojavi zaradi virulenčnih faktorjev, ki jih bakterija izloča v parodontalne žepe, med katerimi sta najbolj znana toksina CDT (ang. Cytolethal distending toxin) in levkotoksin.

V diplomskem delu sem se posvetila bakteriji A. actimomycetemcomitans ter jo povezala z boleznijo parodontitis. Osredotočila sem se na pripravo plazmidnih konstruktov za preučitev promotorske aktivnosti za biosintezo levkotoksina in toksina CDT v bakteriji. S plazmidnim konstruktom, ki vsebuje promotorsko regijo toksina CDT ali levkotoksina spojenega s poročevalskim genom za β-galaktozidazo, lahko določimo dejavnike, ki vplivajo na izražanje genov teh toksinov. Posledično lahko določimo signale okolja, ki so pomembni za sintezo teh toksinov.

KLJUČNE BESEDE: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, levkotoksin, toksin CDT, rekombinantni plazmid

(8)

(9)

Aggregatibacter actinomycetemcomitans is a bacterium that causes aggressive and chronic parodontitis. The main effect of this periodontal disease is a collapse of periodontal tissues in a very short period of time. This is caused by virulent factors that the bacteria excrete in periodontal pockets. Most known factors are leukotoxin and toxin CDT (Cytolethal distending toxin).

In my thesis I have focused on the bacteria A. actinomycetecomitans and associated it with parodontitis disease. Most of my work consisted of the preparation of plasmid construct to examine the promoter activity for the biosynthesis of leukotoxin and toxin CDT in bacteria. By engineering the recombinant plasmid that harbours the promoter region of the toxin CDT or of the leukotoxin fused to the β-galactosidase reporter gene we can recognize the transcriptional factors that are important for regulation of the gene expression and therefore determine the environmental signals needed for the induction of either toxin.

KEY WORDS: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, leukotoxin, CDT-toxin, recombinant plasmid

(10)

(11)

I

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ... 1

2 TEORETIČNE OSNOVE ... 3

2.1 PARODONTALNA BOLEZEN ... 3

2.2 OBLIKE PARODONTITISA ... 4

2.3 AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS ... 5

2.3.1 LEVKOTOKSIN ... 6

2.3.2 TOKSIN CDT (ang. Cytolethal distending toxin) ... 8

2.4 PLAZMIDNI VEKTOR ... 9

2.5 PRIPRAVA REKOMBINANTNE DNA ... 10

3 MATERIALI IN METODE ... 13

3.1 MATERIALI ... 13

3.2 METODE ... 16

3.2.1 REAKCIJA VERIŽNE POLIMERIZACIJE (PCR) ... 16

3.2.2 ČIŠČENJE PRODUKTOV PCR ... 17

3.2.3 REZANJE DNA Z RESTRIKCIJSKIMI ENDONUKLEAZAMI ... 17

3.2.4 LIGACIJA ... 18

3.2.5 PRIPRAVA KOMPETENTNIH CELIC BAKTERIJE Escherichia coli SEVA DH5α PO METODI S CaCl2 IN TRANSFORMACIJA ... 19

3.2.6 DOKAZ BAKTERIJSKIH KLONOV Z VKLJUČKI ... 20

3.2.7 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA ... 21

3.2.8 IZOLACIJA REKOMBINNATNEGA PLAZMIDA ... 21

(12)

Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo

II

4 REZULTATI ... 23

4.1 USPEŠNOST TRANSFORMACIJE ... 23

4.2 PREVERJANJE KONCENTRACIJE DNA V VZORCU Z AGAROZNO GELSKO ELEKTROFOREZO ... 24

4.3 ANALIZA NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA REKOMBINANTNE DNA ... 25

5 ZAKLJUČEK IN SKLEPI ... 29

6 VIRI IN LITERATURA ... 31

KAZALO SLIK

Slika 1: Vnetje obzobnega tkiva (“parodontitis" n.d.) ... 4

Slika 2: Aggregatibacter actinomycetemcomitans ("Aggregatibacter, 2013") ... 6

Slika 3: Promotorsko področje in geni kompleksa levkotoksina (Dolores, 2013) ... 7

Slika 4: Vpliv CDT toksina na tarčne celice ("CDT family, n.d.") ... 8

Slika 5: Primer priprave rekombinantne DNA ("Komel, 2006") ... 11

Slika 6: Bakterije po transformaciji. ... 23

Slika 7: Testiranje vstavitve promotorskega področja v vektor. ... 25

Slika 8: Nukleotidno zaporedje določeno iz plazmida PJT5. ... 26

KAZALO TABEL

Tabela 1: Restrikcijski encimi uporabljeni v raziskavi ... 17

Tabela 2: Prikaz restrikcijske zmesi ... 18

Tabela 3: Prikaz ligacijske mešanice ... 19

Tabela 4: Reakcijska zmes za PCR bakterijske kulture za levkotoksin ... 20

Tabela 5: Reakcijska zmes za PCR bakterijske kulture za toksin CDT... 20

(13)

III

SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC

CDT Toksin CDT (ang. Cytolethal distending toxin)

Ltx Levkotoksin

A. actinomycetemcomitans Aggregatibacter actinomycetemcomitans

E. coli Escherichia coli

RTX-toksin skupina citotoksinov, ki jih proizvajajo Gram negativne bakterije AB-toksin dvokomponentni proteinski kompleks, ki ga izločajo patogene

bakterije.

G2/M G2 je interfaza, v celičnem ciklu. Je kontrolna faza, ki omogoča uspešno nadaljno mitozo (M)

dNTP deoksiribonukleotid trifosfat

(14)

(15)

1

1 UVOD

Mikroorganizmi so prisotni povsod v okolju in pomembno prispevajo h kroženju snovi med živim in nežim okoljem. Večina mikroorganizmov ni škodljivih, mnogi so koristni. Sodelujejo pri oksidaciji in fermentaciji različnih snovi in tekočin ali imajo varovalno vlogo, kot to velja za bakterije na človekovi koži in sluznicah. Nekateri pa lahko ogrožajo druge organizme in škodijo tudi človeku. Mikroorganizmi vstopijo v usta s hrano, vodo, zrakom ali z dotikom in se tam zadržijo začasno ali prehodno (začasna ali prehodna flora) največ nekaj minut ali ur, dokler jih antagonisti v ustih z zaviralnimi mehanizmi ne onesposobijo. Veliko mikroorganizmov zaužijemo s slino in jih praviloma uničijo že črevesni encimi ali želodčni sok. V ustih je tudi vsaj 300 stalno naseljenih vrst mikroorganizmov (stalna flora). Stalno floro predstavljajo mikroorganizmi, ki so stalno na nekem področju (jezik, zobna površina) in so v stabilnem odnosu z gostiteljem. Nekateri so značilni predvsem za usno votlino, kot so na primer Streptococcus mutans, Leptotrichia buccalis, Corynebacterium matruchotii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans in drugi.

Bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans sodi med fakultativne anaerobe, negibljive ter po Gramu negativne bacile. Bakterija je prisotna pri progresivnem juvenilnim parodontitisu in drugih oblikah parodontalnih boleznih. Parodontalne bolezni ali bolezni dlesni se lahko pojavijo že v otroških letih in nato napredujejo več let do kritične točke. Pojavijo se zaradi malomarne ustne higiene, kar pripelje do nalaganja zobnega kamna in dolgotrajnih zobnih oblog.

Parodontalne bolezni poznamo že od prazgodovinskih časov. Začnejo se z lažjim vnetjem dlesni, ki napredujejo počasi in se lahko razvijejo v kronična vnetja, kar vodi do stopnje, ko dlesni ne dajejo zobem več podpore in ti izpadejo (Dragaš, 1996).

Pri parodontalnih boleznih A. actinomycetemcomitans izloča v parodontalne žepe različne virulenčne faktorje, med katerimi je najpomembnejši levkotoksin, ki napade tkivo dlesni in levkocite. Pomemben virulenčni faktor pa je tudi toksin CDT (Cytolethal distending toxin).

Diplomsko delo temelji na dveh zastavljenih ciljih. S pregledom literature bom predstavila bakterijo A. actinomycetemcomitans in jo povezala z boleznijo parodontitis. Predstavila bom

(16)

2

toksin CDT in levkotoksin- virulenčna faktorja, ki bolezen povzročata. Za dosego drugega cilja sem pripravila plazmidni konstrukt za preučitev promotorske aktivnosti za biosintezo levkotoksina in toksina CDT v bakteriji A. actinomycetemcomitans.

V diplomskem delu sem si zastavila dve hipotezi:

 sev bakterije A. actinomycetemcomitans izoliran iz bolnika v Sloveniji sintetizira toksina CDT in levkotoksin;

 pomnožimo lahko promotorsko področje toksinov in naredimo plazmidni konstrukt za študije aktivnosti promotorjev toksinov.

(17)

3

2 TEORETIČNE OSNOVE

2.1 PARODONTALNA BOLEZEN

Na funkcionalne lastnosti, in s tem tudi na videz svojih zob, obzobnega tkiva in čeljustnih grebenov, lahko močno vpliva človek sam. Kateri mikrobi bodo prevladovali na določenih delih ust in na njih povzročali bolezenske spremembe, je odvisno od mnogih okoliščin, zlasti prehranjevalnih navad in ustne higiene. Vnetja obzobnih tkiv ali parodontalne bolezni obsegajo različna bolezenska stanja, ki ogrožajo oporna in obzobna tkiva. Vnetja teh tkiv so med najpogostejšimi človeškimi boleznimi. Bolj pogosta je le zobna gniloba. Bolezen obzobnih tkiv se lahko pojavljajo že v otroštvu in puberteti; njihove kronične oblike pa so pogostne pri odraslih ljudeh. Na začetku simptomi navadno niso izraziti, tako da jih lahko spregledamo. Če jih ne zdravimo, so najpogostnejši vzrok za izgubo zob v zreli dobi.

Parodontalna bolezen je posledica oportunistnične okužbe, za katero morajo biti izpolnjeni trije pogoji:

 prisotnost primernega števila izbranih bakterij, ki so sicer normalno prisotne;

 primerna ekološka niša, ki omogoča nemoten razvoj anaerobnih bakterij;

 oslabljen gostiteljev imunski odziv zaradi kroničnih obolenj, kot je npr. sladkorna bolezen.

Gre za kronična, počasi napredujoča vnetja, ki se najprej kažejo kot začetni gingivitis. To je nespecifični vnetni odgovor dlesni na prisotnost bakterijske obloge ob zobnem vratu. Kadar gingivitis napreduje, vnetje zajame pozobnico in alveolarno kost, kar imenujemo parodontitis.

Zanj je značilno, da se gingivalno prirastišče premika apikalno, kar se pokaže kot poglabljanje parodontopatogenih žepov. Parodontitis je v primerjavi z gingivitisom nepovratno stanje. Pri zdravljenju ne pride do popolne obnove. Če ne vzpostavimo pravilne ustne higiene in ne naredimo mehanskega luščenja in glajenja koreninske površine, se lahko globina parodontalnih žepov na vnetnem predelu še poveča. S tem se razširi mikroekološka niša za bakterije, ki tako

(18)

4

niso več izpostavljene naravnemu izpiranju s slino in mehanskim vplivom žvečenja in krtačenja (Gubina, 2002).

Slika 1: Vnetje obzobnega tkiva (“parodontitis" n.d.)

Slika 1 prikazuje vnetje obzobnega tkiva. Na sliki je pod številko 1 označeno zdravo obzobno tkivo brez vnetja. Začne se kot začetni gingivitis (2). Ko gingivitis napreduje, se začnejo poglabljati parodontalni žepi in nastopi parodontitis (3), ki napreduje do kroničnega parodontitisa (4).

2.2 OBLIKE PARODONTITISA

Sodobna razvrstitev bolezni obzobnih tkiv, ki temelji na raznolikosti vzročnih dejavnikov, patogeneze, klinične slike, izida in odziva na zdravljenje, razvršča parodontalno bolezen v naslednje bolezenske skupine:

 bolezni dlesni;

 kronični parodontitis;

 agresivni parodontitis;

 parodontitis v sklopu sistemske bolezni;

 nekrotizirajoče parodontalne bolezni;

 parodontalni absces;

 parodontitis v povezavi z endodontsko lezijo;

 razvojne ter pridobljene nepravilnosti obzobnih tkiv.

(19)

5 Med naštetimi oblikami parodontalne bolezni je pri odraslih najpogostejši kronični parodontitis.

Epidemiološke študije so pokazale, da ima 5–20 % oseb razširjeno in kronično obliko parodontitisa. Prevalenca bolezni se razlikuje glede na spol, narodnost, socialno-ekonomsko stanje ter druge dejavnike. Predispozicijski dejavniki so subgingivalni plak, kajenje in okrnjen imunski odziv gostitelja (npr. sladkorna bolezen, AIDS). Parodontitis je značilen dejavnik tveganja za nastanek sistemskih bolezni, kot so ateroskleroza, aspiracijska pljučnica, prezgodnji porod ter druge. Večina za obzobna tkiva patogenih bakterij je Gram-negativnih in izključno anaerobnih ter medsebojno delujejo sinergistično. Med njimi so najpomembnejše Aggregatibacter actinomicetemcomitans (prej Actinobacillus actinomycetemcomitans), Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola in druge (Cvetko, 2008).

2.3 AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS

A. actinomycetemcomitans je Gram-negativna, fakultativno anaerobna, negibljiva bakterija iz družine Pasteurellaceae. Najdemo jo v ustni votlini in je prisotna pri agresivnem in kroničnem parodontitisu. Prav tako je povezana z drugimi infekcijami, kot so pljučnica, okužba urinarnega trakta, osteomielitis in druge (Dolores, 2013).

Bakterija je bila premeščena iz rodu Actinobacillus v rod Aggregatibacter. Uspešno raste na obogatenih gojiščih in še bolje v atmosferi s 5 do 10 % ogljikovim dioksidom (CO2). Na rutinskih trdnih gojiščih so celice majhne in kokoidne oblike, na gojiščih, ki vsebujejo sladkor in na tekočih gojiščih s serumom, pa daljše in paličaste oblike (Podržaj, 2011).

Kolonije A. actinomycetemcomitans imajo prvotno temnejši center, ki med inkubacijo zraste v zvezdasto strukturo, kar daje kolonijam videz prekrižanih cigar. Izolati v tekočih gojiščih s serumom rastejo v obliki zrn, ki se pritrdijo na stene ali dno epruvete. Kadar bakterija raste na trdnih površinah, zrna tvorijo lepljiv, težko odstranljiv in gost biofilm. Ta se težko odstrani z detergenti, proteazami, vročino, s strižnimi silami med hitrim mešanjem ali ultrazvokom. V primerjavi s prostimi celicami biofilm omogoča povečano odpornost na antibiotike. Zaradi teh lastnosti je bakterija sposobna kolonizirati ustno votlino ter povzročiti bolezen (Sodja, 2006).

(20)

6

Bakterija naseljuje usta pri več kot tretjini prebivalstva. Ugotovili so, da so posamezniki afriško- ameriškega rodu bolj dovzetni za pojav parodontitisa kot belci. Poleg tega, da bakterija povzroča ustne bolezni, je bakterija članica HACEK (Haemophilus, Actinobacillus, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella) skupine bakterij, ki povzročajo endokarditis pri otrocih.

Da bi se bakterija uspešno kolonizirala, povzročila bolezen in zdržala v gostitelju, mora ohranjati nabor virulenčnih faktorjev. A. actinomycetemcomitans proizvede različne faktorje, med drugim tudi proteine, polisaharide in toksine. Dva najbolj raziskana toksina sta levkotoksin (Ltx) in toksin CDT (ang. Cytolethal Distending Toksin) (Kachlany, 2010).

Slika 2: Aggregatibacter actinomycetemcomitans ("Aggregatibacter, 2013") 2.3.1 LEVKOTOKSIN

A. actinomycetemcomitans izraža levkotoksin, ki selektivno vpliva na človeške celice hematopoetičnega izvora (krvne celice). Levkotoksin se veže na receptor 1 (LFA-1) na celični membrani, ki je povezan s funkcijo levkocitov. S tem povzroči motnje v membranski integriteti.

Spada v RTX-družino toksinov, ki je družina citotoksinov, ki jih proizvajajo Gram-negativne bakterije. Z RTX-proteini je podoben po organizaciji genoma in molekulski strukturi. Izražanje levkotoksina in toksina CDT je različno pri različnih izolatih A. actinomycetemcomitans.

Pokazalo se je, da se levkotoksin močno izraža pri parodontitisu, medtem ko je vloga toksina CDT še vedno manj jasna. Operon levkotoksina je sestavljen iz štirih kodirajočih genov,

(21)

7 imenovanih ltxC, ltxA, ltxB, ltxD in promotorske regije, z 652 bp. LtxA kodira strukturo toksina, ltxC kodira komponente, ki so potrebne za postranslacijske modifikacije, toksina LtxA, ltxB in ltxD pa sta potrebna za transport toksina na celično membrano. Promotor se nahaja nasproti toku gena ltxC.

Študije so pokazale, da imajo nekateri kloni bakterije s povečano ekspresijo levkotoksina spremenjen promotor v operonu levkotoksina. Celični in molekulski mehanizmi, pri katerih spremenjeni promotor poveča izražanje levkotoksina, niso znani. Najbolj znan tak primer je izredno levkotoksičen klon JP2 seva A. actinomycetemcomitans s 530 bp in delecijo v promotorju na operonu levkotoksina. Prisotnost klona JP2 je tesno povezana z agresivno obliko parodontitisa. Z genotipizacijo so pred kratkim ugotovili, da klon JP2 kolonizira posameznike severno-evropskega porekla. Analize klona JP2 so pokazale, da imajo vsi sevi klona skupnega prednika iz Severne Afrike. Ekspresija levkotoksina je odvisna tudi od okoljevarstvenih faktorjev, kot sta rastni pogoji in substrat (Johanson, 2011).

Slika 3: Promotorsko področje in geni kompleksa levkotoksina (Dolores, 2013)

Slika 3 prikazuje promotorsko področje in s puščicami kodirajoče gene levkotoksina in klona levkotoksina JP2. Promotorsko področje levkotoksina sestavlja 652 bp, medtem ko je promotorsko področje levkotoksina JP2 zaradi delecije nukelotidov krajše, dolgo 530 bp.

(22)

8

2.3.2 TOKSIN CDT (ang. Cytolethal distending toxin)

CDT so skupina proteinskih toksinov, ki jih proizvajajo različne Gram-negativne bakterije, kot so Escherichia coli, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Haemophilus ducreyi, Shigella dysenteriae, Campylobacter sp., Helicobacter sp., in Salmonella enterica. CDT so prisotni pri bakterijah iz družine Proteobacteria. Spadajo v skupino AB-toksinov in so prvi opisani bakterijski toksini z DNazno aktivnostjo, kar jim omogoča, da hidrolizirajo DNA tarčne celice in jo tako poškodujejo. Toksin sproži zaustavitev v celičnem delitvenem ciklu v G2/M fazi, kar povzroči povečanje oz. nabreklost celice (razširive citoplazme), zaradi česar nastopi apoptoza oz. celična smrt (Jinadasa, 2011).

Toksin CDT je heterotrimeren, sestavljen je iz treh različnih podenot poimenovanih po abecednem vrstnem redu, kot se pojavijo v operonu toksina: CdtA, CtdB in CdtC. Podenota CtdB je katalitično-aktivna podenota kompleksa. CdtA in CdtC skupaj omogočata vezavo in vstop v kasnejši fazi dimernega toksina (dimera CdtA/CdtB) v tarčno celico (Guerra, 2011). Prvič so poročali o toksinu CDT leta 1987 v bakteriji E. coli, ki so jo izolirali iz mladega bolnika. Leta 1994 sta znanstvenika Scott in Kaper uspešno pripravila rekombinantno nukleotidno zaporedje operona CTD iz bakterije E. coli (Jinadasa, 2011).

Slika 4: Vpliv CDT toksina na tarčne celice ("CDT family, n.d.")

(23)

9 Slika 4 prikazuje heterotrimerni toksin CDT(ABC), ki ga določajo tri kodirajočih regije – CdtA, CdtB in CtdC. Struktura holotoksina še ni znana. Toksin deluje na tarčne celice in povzroči povečanje evkariontskih celic in s tem celično smrt.

2.4 PLAZMIDNI VEKTOR

Vektorji za kloniranje so molekule DNA, ki so prirejene in namenjene za vstavljanje odsekov DNA. Ena od uporab plazmidnih vektorjev je, da vstavimo želeni odsek DNA v bakterijo z namenom sinteze večjih količin te DNA ali sinteze proteinov kodiranih na vstavljenem odseku DNA. V ta namen so najprimernejši majhni plazmidi in virusi, saj se v celici samostojno podvajajo in jih lahko na enostaven način izoliramo nepoškodovane. V naši raziskavi smo uporabili plazmid pJT5.

Plazmidi so stabilne izvenkromosomske molekule DNA, ki imajo sposobnost samostojnega podvajanja. So splošno razširjeni pri mnogih bakterijskih vrstah kot oblika DNA, ki se podvaja in deduje neodvisno od kromosomske DNA. Vendar pa je njihova replikacija, kot tudi transkripcija genov, ki jih vsebujejo, odvisna od encimov gostiteljske celice. Plazmidi imajo mesto ori, ki je specifično mesto podvojevanja. Na plazmidih so pogosti genski zapisi za odpornost proti antibiotikom, sintezo antibiotikov, odpornost proti težkim kovinam, itd. Idealni plazmidni vektor mora izpolnjevati naslednje pogoje:

 imeti mora majhno molekulsko maso;

 nositi mora zapis za dominantni selekcijski označevalec;

 vsebovati mora mesto za kloniranje (poliklonsko mesto);

 v celicah mora nastopiti v čim večjem številu kopij.

Majhna velikost predstavlja več prednosti v postopku kloniranja. Plazmid lažje izoliramo nepoškodovan in v večjih količinah, saj so manjši plazmidi zaradi svoje velikosti in močnega dodatnega zvijanja manj dovzetni za poškodbe in so tudi v velikem številu kopij v eni celici.

Poleg tega z majhnimi plazmidi tudi lažje transformiramo bakterijske celice. Dominantni selekcijski označevalec omogoča ločevanje med bakterijskimi celicami, ki so sprejele plazmidno

(24)

10

DNA in tistimi, ki je niso. Običajno so selekcijski označevalci geni za odpornost proti antibiotikom (Herzog- Velikonja, 2000).

V raziskavi smo uporabili antibiotik ampicilin. Ampicilin inhibira encime bakterijske membrane, ki sodelujejo pri sintezi celične stene. Gen za odpornost na plazmidu pa kodira encim, ki v periplazemskem prostoru hidrolizira ß-laktamski obroč ampicilina.

Mesto za kloniranje so lahko posamezna prepoznavna zaporedja za različne restrikcijske endonukleaze na različnih mestih v plazmidu, ali pa je to del plazmida, kjer je skupaj nanizanih več prepoznavnih zaporedij za različne restrikcijske encime. Tak del DNA imenujemo multiplo mesto za kloniranje ali poliklonsko mesto. Večje število prepoznavnih mest v poliklonskem mestu nam daje možnost, da fragment vstavimo v plazmid v želeni orientaciji in da lahko uporabimo restrikcijske encime, ki ne režejo znotraj našega fragmenta (Herzog- Velikonja, 2000).

2.5 PRIPRAVA REKOMBINANTNE DNA

Za pripravo rekombinantne DNA uporabimo molekulsko kloniranje, to je vključevanje gena, ki ga želimo vstaviti v primerno pripravljeni plazmidni vektor. V nadaljevanju na selektivnih gojiščih ločimo bakterije, ki so sprejele rekombinantno DNA. Tako lahko gen v rekombinnatni DNA uporabimo v različnih analizah, določimo natančno organizacijo gena in produkt njegovega zapisa. Shema, ki ponazarja primer priprave in izolacije rekombinantne DNA, je prikazana na sliki 5.

(25)

11 Slika 5: Primer priprave rekombinantne DNA

Pripravili smo plazmid pJT5 z vključkom promotorskega področja. Iz kromosoma bakterije A.

actinomycetemcomitans smo pomnožili promotorsko področje gena za levkotoksin in toksin CDT. Plazmidni vektor in promotorski področji toksinov smo rezali z enakima restrikcijskima endonukleazama, nato pa vstavili fragment promotorskih področij v plazmid. Tako smo dobili rekombinantni plazmid, ki smo ga vstavili v kompetentno bakterijsko celico E. coli, seva DH5α.

Običajno si za vsako stopnjo kloniranja pripravimo vzporeden poskus, s katerim preverimo uspešnost izvedbe določene stopnje. V primeru neuspelega kloniranja lahko na osnovi kontrolnih poskusov sklepamo, na kateri stopnji kloniranje ni bilo uspešno. Posamezne stopnje priprave rekombinatnega plazmida so predstavljene v metodah dela.

(26)

(27)

13

3 MATERIALI IN METODE

3.1 MATERIALI

Bakterijski sev in genom bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Pri delu smo uporabili sev DH5α bakterije Escherichia coli z genotipom thi-1 hsdR17 gyrA96 recA1 endA1 glnV44 relA1 Φ80dlacZΔM15. Sev smo uporabili zaradi njegove učinkovitosti v procesu transformacije. Sev DH5α je laboratorijski sev in nepatogen za človeka in živali.

Pridobili smo izoliran genom bakterije A. actinomycetemcomitans iz pacienta z boleznimi dlesni, v sodelovanju z medicinsko fakulteto v Ljubljani.

Začetni oligonukleotidi

 5’-začetni oligonukleotid:

Sestava: GCG+KpnI+ začetna sekvenca promotorja 5´ GCGGGTACCAACAGATAAGTTTTGACTCTTT 3´;

 3’-začetni oligonukleotid:

Sestava: GCG+BamHI+ končna RC sekvenca promotorja 5´ GCGGGATCCTGTACCTCTCCTTAGATCCATCC 3´.

Bakterijska gojišča

V raziskavi smo uporabili naslednja gojišča:

 Tekoče gojišče LB (Luria Bertani) je bogato gojišče za gojenje bakterij. Tekoče gojišče LB pripravimo tako, da za 1 L gojišča raztopimo 10 g/L kazeinski hidrolizat, 5 g/L kvasni ekstrat in 10 g/L NaCl v ustrezni količini vode ter nato avtoklaviramo. Po potrebi dodamo antibiotike.

(28)

14

 Trdni medij pripravimo tako, da pred avtoklaviranjem dodamo 15 g agarja na liter medija LB. V ohlajen medij LB po potrebi dodamo antibiotike ter ga vlijemo v sterilne petrijevke.

 Gojišče SOB je vseboval 20 g triptona, 5 g kvasnega ekstrakta, 0,5 g NaCl, 10 mL 250 mM KCl ter 5 mL 2 M MgCl2.

Raztopine uporabljene v raziskavi

Raztopine za agarozno elektroforezo Raztopine za pripravo kompetentnih celic

 Pufer TBE (10X) 0,9 M Tris-borat 20 mM EDTA

 Nanašalni pufer (6X)

0,25 % bromfenol modro (m/v) 0,25 % ksilen cianol FF (m/v) 30 % glicerol (m/v)

 Pufer TE

10 mM Tris-Cl (pH 8,0) 1 mM EDTA

 CaCl2, Tris-glicerol 50 mM CaCl2

10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 10 % (m/v) glicerol

Kompleti reagentov

Kompleti reagentov, ki smo jih uporabljali pri delu:

 TransformAid™ Bacterial Transformation Kit (Fermentas),

 QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, ZDA),

 GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit (Fermentas).

(29)

15 Ostale kemikalije

Pri delu smo uporabljali naslednje kemikalije (v abecednem vrstnem redu):

agar Merck, Nemčija agaroza Seakem LE Biozym, Nemčija;

Bacto kvasni ekstrat Difco, ZDA Bacto tripton Difco, ZDA bromfenol modro Sigma, ZDA CaCl2 Merck, Nemčija

BamHI MBI Fermentas, Litva; New England Biolabs etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) Kemika, Hrvaška

glicerol Sigma, ZDA HCl Merck, Nemčija kanamicin Sigma, ZDA kazeinski hidrolizat Sigma, ZDA KCl Merck, Nemčija KpnI Thermo Scientific ksilen cianol FF Sigma, ZDA kvasni ekstrat Merck, Nemčija MgCl2 Merck, Nemčija NaCl Merck, Nemčija DNA-polimeraza Pfu Promega, ZDA

T4 DNA-ligaza MBI Fermentas, Litva.

(30)

16

3.2 METODE

3.2.1 REAKCIJA VERIŽNE POLIMERIZACIJE (PCR)

Reakcija verižne polimerizacije (PCR) je metoda za hitro pomnoževanje DNA in vitro. V reakcijski zmesi so trije tipi molekul DNA:

 osnovni fragment dvoverižne molekule DNA, ki ga želimo pomnožiti,

 dva začetna oligonukleotida (ang. primer), ki sta komplementarna vsak enemu koncu fragmenta.

Reakcijska zmes vsebuje še naslednje komponente:

 encim Taq-polimeraza (DNA-polimeraza, termostabilna in se ohrani med fazo denaturacije),

 pufer (za optimalno delovanje encima),

 deoksiribonukleotid-trifosfati.

Reakcija obsega tri faze:

 denaturacija dvoverižne DNA,

 vezava oligonukleotidov,

 podaljševanje verige DNA s polimerazo.

(Herzog-Velikonja, 2000)

Z metodo verižne reakcije s polimerazo smo pomnožili promotor levkotoksina in toksina CDT, ki ga želimo nato vstaviti v plazmidni vektor. Pomnožitev levkotoksina in toksina CDT je potekalo pri pogojih: DNA smo izpostavili za 3 minute na 95 °C, da smo denaturirali DNA, sledilo je 30 ciklov 30 sekund na 95 °C, 30 sekund na 55 °C in 60 sekund na 72 °C. V teh korakih smo prilegali oligonukleotidna začetnika in podaljševali novonastalo verigo DNA. Sledila je stopnja zaključnega podaljševanja s polimerazo pri 72 °C (5 min).

(31)

17 3.2.2 ČIŠČENJE PRODUKTOV PCR

Po zaključeni reakciji verižne polimerizacije je potrebno produkte PCR očistiti, zato da ostranimo nezreagirane začetne oligonukleotide, dNTP in ostale komponente. Produkte smo čistili s kompletom kemikalij ˝QIAquick PCR Purification Kit˝ (Quiagen, ZDA) po navodilih proizvajalca:

 eni volumski enoti produkta PCR smo dodali 5 volumskih enot pufra PB (angl. binding buffer),. Mešanico smo prenesli v priloženo mikrokolono vloženo v 2 mL zbiralno epruvetko;

 centrifugirali smo 1 minuto, supernatant smo zavrgli;

 v kolono smo dodali 750 µL pufra PE (angl. wash buffer);

 centrifugirali smo 1 minuto;

 mikrokolono smo prestavili v novo epruvetko in dodali 30 - 50 µL pufra EB (angl. elution buffer);

 centrifugirali smo 1 minuto.

3.2.3 REZANJE DNA Z RESTRIKCIJSKIMI ENDONUKLEAZAMI

Restrikcijske endonukleaze (restriktaze) so encimi, ki prepoznajo specifično zaporedje dvoverižne DNA in ga cepijo. Pri delu smo uporabili naslednji restriktazi:

Tabela 1: Restrikcijski encimi uporabljeni v raziskavi

Ime encima Vir Prepoznavno

nukleotidno zaporedje

BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'---G / GATCC---3' 3'---CCTAG / G---5´

KpnI Klebsiella pneumoniae 5'---GGTAC / C---3' 3'---C / CATGG---5'

(32)

18

Restriktazi, uporabljeni v raziskavi, tvorita lepljive konce. Z njihovo pomočjo smo izrezali promotor levkotoksina (Ltx in JP2) in toksina CDT in tako pripravili fragment DNA. Obenem smo rezali plazmid PJT5 z enakima encimoma. Pripravljen fragment želimo vstaviti v plazmidni vektor z ligacijo. Reakcijska zmes za restrikcijo z restriktazama BamHI in KpnI je prikazana v tabeli.

Tabela 2: Prikaz restrikcijske zmesi

Komponenta Volumen [µL]

DNA 15

Pufer 2

restriktaza KpnI 2

restriktaza BamHI 1

20

Mešanico smo prestavili v mikrocentrifugirke in centrifugirali. Nato smo mešanico postavili na 37 ^°C za 15 minut.

3.2.4 LIGACIJA

Ligacija odseka DNA v plasmid je reakcija, pri kateri encim ligaza katalizira nastanek fosfodiesterske vezi med molekulo vektorja in molekulo fragmenta DNA. Ligacija predstavlja ključen korak pri pripravi rekombinantnega plazmida, saj omogoča vstavljanje gena v plazmidni vektor. Produkte PCR s cepitvijo z restrikcijskimi encimi pripravimo tako, da tvorijo lepljive konce. Ti se med ligacijo združijo s komplementarnimi konci plazmidnega vektorja, ki je bil rezan z enakima encimoma. Reakcijska zmes za ligacijo je predstavljena v tabeli 3. Po 15 minutni inkubaciji na 37 °C smo ligacijsko zmes hladili 2 minuti na ledu.

(33)

19 Tabela 3: Prikaz ligacijske mešanice

Komponenta Volumen [µL]

Plazmidni vektor 3

Fragment 4

Encim ligaza 1

Pufer 2

10

3.2.5 PRIPRAVA KOMPETENTNIH CELIC BAKTERIJE Escherichia coli SEVA DH5α PO METODI S CaCl2 IN TRANSFORMACIJA

Kompetentne celice so sposobne sprejeti tujo DNA. Gram-pozitivne bakterije so naravno kompetentne, medtem ko Gram-negativne bakterije niso. Ker je bakterija E. coli po Gramu- negativna, moramo za končno izolacijo rekombinantnega plazmida celici najprej omogočiti možnost sprejema tujega genetskega materiala (celico naredimo kompetentno). To dosežemo s temperaturnim šokom in spiranjem celic s kalcijevim kloridom.

S sterilno cepilno zanko smo prenesli eno kolonijo seva DH5α bakterije E. coli v 50 mL gojišča SOB. Bakterijsko kulturo smo nekaj minut segrevali v vodni kopeli in nato postavili na vibracijski mešalnik, da smo bakterije dobro premešali. Inkubirali smo jih preko noči na rotacijskem stresalniku v termostatirani komori pri 37 °C.

Naslednji dan smo kulturo 10 minut hladili na ledu, nato pa celice ločili z 10 minutnim centrifugiranjem. Usedlino celic smo resuspendirali v 10 mL ledenomrzlega 0,1 M CaCl2 ter 30 minut inkubirali v ledeni kopeli. Po inkubaciji smo celice ločili od raztopine kalcijevega klorida z 10 minutnim centrifugiranjem. Usedlino, ki smo jo dobili po centrifugiranju, smo vnovič resuspendirali v 200 µL raztopine CaCl2, Tris-glicerol ter shranili celice na ledu do transformacije. Transformacija je vstop proste DNA v bakterijsko celico brez neposrednega sodelovanja drugih organizmov. 50 µL kompetentnih celic smo dodali 3 µL ligacijske mešanice ter 5 minut hladili na ledu

(34)

20

3.2.6 DOKAZ BAKTERIJSKIH KLONOV Z VKLJUČKI

Po transformaciji smo celično DNA še enkrat pomnožili z metodo PCR bakterijske kolonije, kjer smo kot matrično DNA uporabili bakterijsko kolonijo s selektivne agarne plošče. Metoda je zelo uporabna za identifikacijo pozitivnih transformant. Pripravili smo naslednji reakcijski zmesi:

Tabela 4: Reakcijska zmes za PCR bakterijske kulture za levkotoksin Komponenta za Ltx Volumen [µL]

dH2O 126,5

5' začetni oligonukleotid 5,5

3'začetni oligonukleotid 5,5

Reakcijska zmes 137,5

Tabela 5: Reakcijska zmes za PCR bakterijske kulture za toksin CDT Komponenta za Cdt Volumen [µL]

dH2O 57,5

Reakcijska zmes 62,5

Kolonijo transformant iz agarne plošče smo s pomočjo sterilnih zobotrebcov inokulirali v reakcijsko zmes, ki smo jo držali v plastičnih epruvetkah. PCR reakcija je potekala pod enakimi pogoji, kot že opisano zgoraj.

(35)

21 3.2.7 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA

Sledila je agarozna gelska elektroforeza, s katero smo preverjali velikost, izolacijo in čistost pridobljenih vzorcev DNA. Gelska elektroforeza temelji na ločevanju molekul RNA in DNA glede na njihovo velikost. To smo dosegli tako, da smo produkte pridobljene z metodo PCR izpostavili električnemu toku. Najprej smo pripravili gel. Natehtali smo 0,4 g agaroze, ter 40 mL Pufra TBE. Zmes smo segrevali, dodali etidijev bromid in vlili v model za elektroforezo. Agaroza ob ohlajanju polimerizira in tvori gel, v katerega smo vstavili vzorce in prelili z nanašalnim pufrom. Nukleinske kisline so negativno nabite, zato je naš vzorec potoval proti anodi. Gel smo osvetlili s svetlobo spectra UV in fotografirali. Prikaz DNA v gelu je bila omogočen zaradi dodanega fluorescentnega barvila- editijevega bromida, ki smo ga dodali vzorcu tik pred nanosom v gel. Po elektroforezi smo ugotovili, katere celice so primerne za izolacijo plazmida (na podlagi vizualizacije). Izbrane celice smo nagojili v tekoče gojišče in jih čez noč inkubirali v termostatirani komori pri 37 C.

3.2.8 IZOLACIJA REKOMBINNATNEGA PLAZMIDA

Izolacijo plazmida določenih bakterijskih klonov smo izvedli s kompletom ˝GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit˝ (Fermentas) po navodilih proizvajalca:

 celice, ki smo jih nagojili v tekoče gojišče, prelijemo v mikrocentrifugirko;

 centrifugiramo 1 minuto ter supernatant odlijemo, ponovimo 2x;

 usedlino smo s pomočjo pipete resuspendirali v 250 µL ˝raztopine za resuspendiranje˝;

 suspenziji celic smo dodali 250 µL ˝raztopine za lizo˝ in premešali z obračanjem mikrocentrifugirke;

 dodali smo 350 µL ˝raztopine za nevtralizacijo˝ in takoj premešali z obračanjem mikrocentrifugirke;

 vzorec smo centrifugirali 5 minut ter supernetent prenesli v priloženo GeneJET™

kolono;

 kolone z vzorci smo centrifugirali 1 minuto. Tekočino, ki je stekla skozi kolono, smo zavrgli, kolono pa vstavili nazaj v priloženo zbirno mikrocentrifugirko;

(36)

22

 v kolono smo dodali 500 µL ˝raztopine za spiranje;

 centrifugirali smo 1 minuto in zavrgli tekočino, ki je stekla skozi kolono;

 centrifugirali smo še dodatno 1 minuto, da smo odstranili preostalo ˝raztopino za spiranje˝;

 kolono smo prenesli v čisto 1,5 mL mikrocentrifugirko ter odpipetirali 50 µL ˝pufra za spiranje˝;

 vzorec smo inkubirali pri sobni temperaturi 2 minuti, nato pa vzorec centrifugirali 2 minuti;

 kolono smo zavrgli, mikrocentrifugirko z izolirano rekombinantno plazmidno DNA pa zalepili s parafilmom ter poslali na določanje nukleotidnega zaporedja.

(37)

23

4 REZULTATI

4.1 USPEŠNOST TRANSFORMACIJE

Celice smo naredili kompetentne tako, da so lahko sprejele rekombinantno plazmidno DNA.

Uporabili smo sev DH5α bakterije E. coli kot gostiteljske celice, ki so z metodo transformacije sprejele rekombinantni plasmid. Selekcijo za bakterije, ki so sprejele želeni plazmidni konstrukt, smo izvedli na agarnih ploščah LB s kanamicinom (30 µg/ml), nato smo nacepljene transformante čez noč inkubirali v termostatirani komori pri 37 °C. Naslednji dan smo preverili število celic zraslih na gojišču ter jih primerjali s kontrolno ploščo. Nacepljene celice so prikazane na sliki 6. Na sliki je z K označena kontrola transformacije (ligiran rezan plazmidni vektor dodan kompetentnim celicam). Z LTX in JP2 je označeno promotorsko področje levkotoksina vstavljeno v plazmidni vektor ter transformiran v bakterije, z CDT-pa promotorsko področje toksina CDT vstavljeno v plazmidni vektor ter transformiran v bakterije.

Slika 6: Bakterije po transformaciji.

(38)

24

Za razlikovanje med tranformiranimi in netransformiranimi celicami običajno uporabljamo selekcijo na antibiotik. Plazmidni vektorji nosijo zapis za odpornost proti enemu ali več antibiotikom. V našem primeru so na agarske plošče zrasle transformirane celice, ki so odporne proti antibiotiku LB kanamicinu, ki smo ga pred nacepitvijo celic dodali v gojišče. Iz slike 6 lahko opazimo, da je bila uspešna transformacija pri vključku promotorskih področij toksina CDT in levkotoksina JP2, medtem ko je pri poskusu vključitve področja levkotoksina Ltx zraslo premalo celic v primerjavi s kontrolno ploščo.

4.2 PREVERJANJE KONCENTRACIJE DNA V VZORCU Z AGAROZNO GELSKO ELEKTROFOREZO

Po transformaciji smo vzorce DNA še enkrat pomnožili z metodo PCR, nato pa izvedli agarozno gelsko elektroforezo. Po elektroforezi lahko dvoverižno DNA zasledimo z etidijevim bromidom, ki se interkalira med bazne pare. Pri obsevanju z ultravijolično svetlobo etidijev bromid fluorescira oranžno svetlobo valovne dolžine 590 nm. V primerjavi s standardno raztopino DNA lahko na podlagi intenzivnosti emitirane svetlobe ocenimo koncentracijo DNA v vzorcu. Tako preverimo, kateri vzorec ustreza za nadaljnjo izolacijo rekombinantnega plazmida. Preverjanje primernosti vzorca z obsevanjem z ultravijolično svetlobo je prikazano na sliki 7. Slika prikazuje Testiranje vstavitve promotorskega področja v vektor. PCR je bil narejen na bakterijah zraslih na selektivnem gojišču.

S pomočjo te analize smo ugotovili, katere celice vsebujejo rekombinnatni plazmid. Nato smo pri tistih celicah, ki ga vsebujejo, rekombinnatni plazmid izolirali. Ugotovili smo, da sta bila primerna vzorca s promotorskim področjem za levkotoksin (JP2) ter toksin CDT. Pri levkotoksinu (Ltx) je bilo opaziti premajhno koncentracijo DNA in zato ni bila vidna pri obsevanju z ultravijolično svetlobo. V nadaljevanju smo za izolacijo rekombinantnega plazmida uporabili samo levkotoksin JP2 ter toksin CDT.

(39)

25 Slika 7: Testiranje vstavitve promotorskega področja v vektor.

4.3 ANALIZA NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA REKOMBINANTNE DNA

Izolirane rekombinantne plazmide smo poslali v podjetje Macrogen, kjer so določili nukleotidno zaporedje plazmidov. Poslali smo plazmide toksina CDT in levkotoksina JP2. Zaporedje toksina JP2 ni bila uspešno določena. Napaka je bila lahko narejena s strani podjetja, lahko pa rekombinantni plazmid že predhodno ni bil uspešno izoliran. Ustrezno pa so določili nukleotidno zaporedje za toksin CDT. Dve sekvenci enega plazmida smo združili v eno. Eno zaporedje smo naredili reverzno komplementarno in kjer sta se zaporedji prikrivali, smo ju združili v eno. V nadaljevanju smo uporabili program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), ki je algoritem za primerjavo nukleotidnih ali aminokislinskih zaporedij. Ugotovili smo, da je bila sekvenca CDT toksina identična z bakterijo A. actinomycetemcomitans. Zaporedje, določeno iz rekombinantnega plazmida pJT5 z vključkom, je prikazano na sliki 7. Na sliki so z rdečo označena prepoznavna restrikcijska mesta. Na 5´ koncu je prikazano mesto za restrikcijski encim

(40)

26

KpnI (zaporedje GGTACC), na 3´ koncu pa za BamHI (zaporedje GGATCC). Krepko so označeni začetni nukleotidi. Z rumeno označeno je predvideno Shine- Dalgarnovo zaporedje.

Slika 8: Nukleotidno zaporedje določeno iz plazmida PJT5.

Po vstavitvi v organizem gostitelja se tuja DNA, ki je vstavljena znotraj rekombinantnega plazmidnega konstrukta, lahko izrazi ali pa tudi ne. To pomeni, da se DNA lahko samo podvoji brez nadaljnega izražanja ali pa se prepiše in prevede v nastanek rekombinantnega proteina. Na

(41)

27 splošno, izražanje tujega gena zahteva vključevanje sekvenc, ki so potrebne za produkcijo molekule mRNA v procesu transkripcije (prepisa), ki se jo uporabi v nadaljni translaciji (prevajanju). Te sekvence so promotor, translacijski iniciacijski signal (Shine- Dalgarno sekvenca, za pravilno postavitev ribosoma) in transkripcijski terminator, ki določa konec prepisa iz DNA v mRNA (Brondyk H, 2009).

Transkripcijo katalizira encim RNA- polimeraza, ki je sposobna prepoznati pravo mesto za začetek transkripcije, ki ga imenujemo promotor. Promotor sproži transkripcijo in je zato kontrolna točka za izražanje gena (Grabnar 1997).

Pri prokariontih ni izoblikovanega jedra, zato v bakterijski celici potekata transkripcija in translacija istočasno. To jim omogoča hiter in učinkovit odziv na spremenjene spremembe v okolju. Na mRNA je že med njenim nastajanjem večje število ribosomov, ki se pomikajo v isti smeri kot nastaja mRNA. Iz njih izraščajo nastajajoče proteinske molekule in se po končani sintezi sproščajo v citoplazmo. Izražanje genov v celici je strogo nadzorovano. To pomeni, da se geni za proteine, ki jih celica ves čas potrebuje za vzdrževanje svoje zgradbe in za svoje delovanje (metabolizem), izražajo neprestano, vendar tudi usklajeno, drugi geni pa le po potrebi.

Okolje, v katerem organizmi živijo in se razmnožujejo, se nenehno spreminja. Bakterija, ki bo nenadoma prišla v okolje, bogato s prehranskim virom, se bo nemudoma odzvala z izražanjem genov za encime, ki bodo to hrano učinkovito pretvarjali in ji s tem zagotovili hitro rast in delitev. Ko bo hranivo pošlo, se bo izražanje omenjenih genov ustavilo, saj bi bilo nesmiselno in energetsko potratno, da bi celice sintetizirale proteine, ki jih ne potrebujejo (Komel, 2006).

(42)

(43)

29

5 ZAKLJUČEK IN SKLEPI

V diplomskem delu sem dosegla oba cilja, ki sem si jih zastavila. V diplomski nalogi sem predstavila bakterijo Aggregatibacter actinomycetemcomitans in jo povezala z boleznijo parodontitis, prav tako pa sem pripravila plazmidni konstrukt za preučitev promotorske aktivnosti l toksina CDT v bakteriji A. actinomycetemcomitans. Rekombinantni plazmidni konstrukt za preučevanje promotorske aktivnosti gena za levkotoksin nam ni uspelo pridobiti, najverjetneje zaradi slabe pomnožitve gena ali neustrezne restrikcije. Seznanila sem se z celotnim postopkom priprave rekombinantne DNA.

V postopku sem z encimom razrezala promotorsko področje, (ki uravnava prepisovanje) toksina CDT in levkotoksina, ki ju izloča bakterija A. actinomycetemcomitans in z enakim encimom odprla plazmidnega vektorja pJT5. S tem sem lahko fragment DNA vstavila v plazmidni vektor in nastalo rekombinantno DNA zaprla z encimom ligaza. Ugotovila sem, da je uvajanje tehnik rekombinantne DNA povzročilo velike spremembe v našem pojmovanju življenja.

Rekombinantno DNA lahko tako vnesemo v bakterijsko celico, ki jo zlahka razmnožimo v tekočem gojišču ter z molekulskim in celičnim kloniranjem pridobimo veliko število kopij fragmenta DNA vstavljenega v plazmid. Kadar je ta fragment gen, ki nosi zapis za farmacevtsko zanimiv protein, ga v bakterijskih celicah tudi izrazimo - sprožimo njegovo prepisovanje v mRNA in njeno prevajanje v protein. Na ta način lahko pridobimo zelo velike količine proteina, ki bi ga iz izvornega evkariontskega organizma pridobili veliko manj, ker ga je v njegovih celicah zelo malo ali pa je slabo dostopen (Komel, 2006).

Diplomska naloga temelji na dveh hipotezah. S PCR sem ugotovila, da bakterija izolirana iz pacienta s parodontozo v Sloveniji, nosi zapis promotorskega področja za pomemben toksin za nastanek parodontitisa, in sicer toksin CDT. S tem sem deloma potrdila prvo hipotezo, saj nismo uspeli pripraviti rekombinantnega plazmida s promotorskim področjem za levkotoksin. Izdelala sem plazmidni konstrukt za preučevanje promotorske aktivnosti gena za CDT in s tem potrdila drugo hipotezo.

(44)

(45)

31

6 VIRI IN LITERATURA

“Aggregatibacter” (2013), Dostopno prek URL:

http://www.vetbook.org/wiki/dog/index.php/Aggregatibacter_spp [ Povzeto: 5.9.2013]

Brondyk W. H. (2009) Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein.Methodss of Enzymology, 463

“CDT Family” (n.d.), Dostopno prek URL:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X99015371 [žPovzeto: 5.9.2013]

Cvetko E., Skalerič U. (2008). Identikacije za sistemsko antibiotično zdravljenje parodontalne bolezni. Zobozdravstveni vestnik, 63: 81-89

Dolores Juarez-Rodriguez M., Torres-Escobar A., Demuth R.D. (2013). Construction of new cloning, lacZ reporter and scarless-markerless suicide vectors for genetic studies in

Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Plasmid, 69: 211-222

Dragaš A. Z. (1996). Oralna bakteriologija. Ljubljana: DZS

Grabnar M. in sod. (1997) . Genetika in Evolucija Biologija 7 in 8. Ljubljana 1997: DZS Grošelj D., Gubina M. (2002). Zobna gniloba in bakterijske okužbe obzobnih tkiv. V M.

Gubina, A. Ihan (Ur.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (363-371)

Guerra L., Cortes-Bratti X., Guidi R., Frisan T. (2011).The Biology of the Cytolethal Distending Toxins. Toxins, 3: 172-190

(46)

32

Herzog-Velikonja H., Gruden K. (2000). Praktikum iz molekularne biologije-Teoretični del.

Ljubljana: Študentska založba

Jinasasa N.R., Bloom E.S., Weiss S.R., Duhamel E.G. (2011). Cytolethal distending toxin: a conserved bacterial genotoxin that blocks cell cycle progression, leading to apoptosis of a broad range of mammalian cell lineages. Microbiology, 157: 1851-1857

Johansson A. (2011). Aggregatibacter actinomycetemcomitans Leukotoxin: A Powerful Tool with Capacity to Cause Imbalance in the Host Inflammatory Response. Toxins, 3: 242-259

Kachlany S.C. (2010). Aggregatibacter actinomycetemcomitans Leukotoxin: from threat to therapy. Critical reviews in oral biology & medicine, 89 (6): 561-570

Komel R. (2006) GENETIKA od dvojne vijačnice do kloniranja Učbenik za gimnazije in srednje tehniške šole. Ljubljana: Rokus

Parodonitis, (n.d.), Dostopno prek URL: http://www.apotheken-

umschau.de/Parodontitis/Parodontitis-Symptome-11648_3.html [Povzeto: 5.9.2013]

Podržaj S. (2011). Protibakterijska učinkovitost različnih vrst medu na parodontopatogene bakterije in ustne streptokoke. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta

Sodja E. (2006). Primerjava klasične bakteriološke diagnostike in molekularne metode za dokazovanje parodontopatogenih bakterij v vzorcih iz parodontalnih žepov. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta