REAKCIJA VERIŽNE POLIMERIZACIJE (PCR)

Reakcija verižne polimerizacije (PCR) je metoda za hitro pomnoževanje DNA in vitro. V reakcijski zmesi so trije tipi molekul DNA:

 osnovni fragment dvoverižne molekule DNA, ki ga želimo pomnožiti,

 dva začetna oligonukleotida (ang. primer), ki sta komplementarna vsak enemu koncu fragmenta.

Reakcijska zmes vsebuje še naslednje komponente:

 encim Taq-polimeraza (DNA-polimeraza, termostabilna in se ohrani med fazo denaturacije),

 pufer (za optimalno delovanje encima),

 deoksiribonukleotid-trifosfati.

Reakcija obsega tri faze:

 denaturacija dvoverižne DNA,

 vezava oligonukleotidov,

 podaljševanje verige DNA s polimerazo.

(Herzog-Velikonja, 2000)

Z metodo verižne reakcije s polimerazo smo pomnožili promotor levkotoksina in toksina CDT, ki ga želimo nato vstaviti v plazmidni vektor. Pomnožitev levkotoksina in toksina CDT je potekalo pri pogojih: DNA smo izpostavili za 3 minute na 95 °C, da smo denaturirali DNA, sledilo je 30 ciklov 30 sekund na 95 °C, 30 sekund na 55 °C in 60 sekund na 72 °C. V teh korakih smo prilegali oligonukleotidna začetnika in podaljševali novonastalo verigo DNA. Sledila je stopnja zaključnega podaljševanja s polimerazo pri 72 °C (5 min).

17 3.2.2 ČIŠČENJE PRODUKTOV PCR

Po zaključeni reakciji verižne polimerizacije je potrebno produkte PCR očistiti, zato da ostranimo nezreagirane začetne oligonukleotide, dNTP in ostale komponente. Produkte smo čistili s kompletom kemikalij ˝QIAquick PCR Purification Kit˝ (Quiagen, ZDA) po navodilih proizvajalca:

 eni volumski enoti produkta PCR smo dodali 5 volumskih enot pufra PB (angl. binding buffer),. Mešanico smo prenesli v priloženo mikrokolono vloženo v 2 mL zbiralno epruvetko;

 centrifugirali smo 1 minuto, supernatant smo zavrgli;

 v kolono smo dodali 750 µL pufra PE (angl. wash buffer);

 centrifugirali smo 1 minuto;

 mikrokolono smo prestavili v novo epruvetko in dodali 30 - 50 µL pufra EB (angl. elution buffer);

 centrifugirali smo 1 minuto.

3.2.3 REZANJE DNA Z RESTRIKCIJSKIMI ENDONUKLEAZAMI

Restrikcijske endonukleaze (restriktaze) so encimi, ki prepoznajo specifično zaporedje dvoverižne DNA in ga cepijo. Pri delu smo uporabili naslednji restriktazi:

Tabela 1: Restrikcijski encimi uporabljeni v raziskavi

Ime encima Vir Prepoznavno

Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo

18

Restriktazi, uporabljeni v raziskavi, tvorita lepljive konce. Z njihovo pomočjo smo izrezali promotor levkotoksina (Ltx in JP2) in toksina CDT in tako pripravili fragment DNA. Obenem smo rezali plazmid PJT5 z enakima encimoma. Pripravljen fragment želimo vstaviti v plazmidni vektor z ligacijo. Reakcijska zmes za restrikcijo z restriktazama BamHI in KpnI je prikazana v

Mešanico smo prestavili v mikrocentrifugirke in centrifugirali. Nato smo mešanico postavili na 37 ^°C za 15 minut.

3.2.4 LIGACIJA

Ligacija odseka DNA v plasmid je reakcija, pri kateri encim ligaza katalizira nastanek fosfodiesterske vezi med molekulo vektorja in molekulo fragmenta DNA. Ligacija predstavlja ključen korak pri pripravi rekombinantnega plazmida, saj omogoča vstavljanje gena v plazmidni vektor. Produkte PCR s cepitvijo z restrikcijskimi encimi pripravimo tako, da tvorijo lepljive konce. Ti se med ligacijo združijo s komplementarnimi konci plazmidnega vektorja, ki je bil rezan z enakima encimoma. Reakcijska zmes za ligacijo je predstavljena v tabeli 3. Po 15 minutni inkubaciji na 37 °C smo ligacijsko zmes hladili 2 minuti na ledu.

19

3.2.5 PRIPRAVA KOMPETENTNIH CELIC BAKTERIJE Escherichia coli SEVA DH5α PO METODI S CaCl2 IN TRANSFORMACIJA

Kompetentne celice so sposobne sprejeti tujo DNA. Gram-pozitivne bakterije so naravno kompetentne, medtem ko Gram-negativne bakterije niso. Ker je bakterija E. coli po Gramu-negativna, moramo za končno izolacijo rekombinantnega plazmida celici najprej omogočiti možnost sprejema tujega genetskega materiala (celico naredimo kompetentno). To dosežemo s temperaturnim šokom in spiranjem celic s kalcijevim kloridom.

S sterilno cepilno zanko smo prenesli eno kolonijo seva DH5α bakterije E. coli v 50 mL gojišča SOB. Bakterijsko kulturo smo nekaj minut segrevali v vodni kopeli in nato postavili na vibracijski mešalnik, da smo bakterije dobro premešali. Inkubirali smo jih preko noči na rotacijskem stresalniku v termostatirani komori pri 37 °C.

Naslednji dan smo kulturo 10 minut hladili na ledu, nato pa celice ločili z 10 minutnim centrifugiranjem. Usedlino celic smo resuspendirali v 10 mL ledenomrzlega 0,1 M CaCl2 ter 30 minut inkubirali v ledeni kopeli. Po inkubaciji smo celice ločili od raztopine kalcijevega klorida z 10 minutnim centrifugiranjem. Usedlino, ki smo jo dobili po centrifugiranju, smo vnovič resuspendirali v 200 µL raztopine CaCl2, Tris-glicerol ter shranili celice na ledu do transformacije. Transformacija je vstop proste DNA v bakterijsko celico brez neposrednega sodelovanja drugih organizmov. 50 µL kompetentnih celic smo dodali 3 µL ligacijske mešanice ter 5 minut hladili na ledu

Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo

20

3.2.6 DOKAZ BAKTERIJSKIH KLONOV Z VKLJUČKI

Po transformaciji smo celično DNA še enkrat pomnožili z metodo PCR bakterijske kolonije, kjer smo kot matrično DNA uporabili bakterijsko kolonijo s selektivne agarne plošče. Metoda je zelo uporabna za identifikacijo pozitivnih transformant. Pripravili smo naslednji reakcijski zmesi:

Tabela 4: Reakcijska zmes za PCR bakterijske kulture za levkotoksin Komponenta za Ltx Volumen [µL]

dH2O 126,5

5' začetni oligonukleotid 5,5

3'začetni oligonukleotid 5,5

Reakcijska zmes 137,5

Tabela 5: Reakcijska zmes za PCR bakterijske kulture za toksin CDT Komponenta za Cdt Volumen [µL]

dH2O 57,5

5' začetni oligonukleotid 2,5

3' začetni oligonukleotid 2,5

Reakcijska zmes 62,5

Kolonijo transformant iz agarne plošče smo s pomočjo sterilnih zobotrebcov inokulirali v reakcijsko zmes, ki smo jo držali v plastičnih epruvetkah. PCR reakcija je potekala pod enakimi pogoji, kot že opisano zgoraj.

21 3.2.7 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA

Sledila je agarozna gelska elektroforeza, s katero smo preverjali velikost, izolacijo in čistost pridobljenih vzorcev DNA. Gelska elektroforeza temelji na ločevanju molekul RNA in DNA glede na njihovo velikost. To smo dosegli tako, da smo produkte pridobljene z metodo PCR izpostavili električnemu toku. Najprej smo pripravili gel. Natehtali smo 0,4 g agaroze, ter 40 mL Pufra TBE. Zmes smo segrevali, dodali etidijev bromid in vlili v model za elektroforezo. Agaroza ob ohlajanju polimerizira in tvori gel, v katerega smo vstavili vzorce in prelili z nanašalnim pufrom. Nukleinske kisline so negativno nabite, zato je naš vzorec potoval proti anodi. Gel smo osvetlili s svetlobo spectra UV in fotografirali. Prikaz DNA v gelu je bila omogočen zaradi dodanega fluorescentnega barvila- editijevega bromida, ki smo ga dodali vzorcu tik pred nanosom v gel. Po elektroforezi smo ugotovili, katere celice so primerne za izolacijo plazmida (na podlagi vizualizacije). Izbrane celice smo nagojili v tekoče gojišče in jih čez noč inkubirali v termostatirani komori pri 37 C.

3.2.8 IZOLACIJA REKOMBINNATNEGA PLAZMIDA

Izolacijo plazmida določenih bakterijskih klonov smo izvedli s kompletom ˝GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit˝ (Fermentas) po navodilih proizvajalca:

 celice, ki smo jih nagojili v tekoče gojišče, prelijemo v mikrocentrifugirko;

 centrifugiramo 1 minuto ter supernatant odlijemo, ponovimo 2x;

 usedlino smo s pomočjo pipete resuspendirali v 250 µL ˝raztopine za resuspendiranje˝;

 suspenziji celic smo dodali 250 µL ˝raztopine za lizo˝ in premešali z obračanjem zavrgli, kolono pa vstavili nazaj v priloženo zbirno mikrocentrifugirko;

Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo

22

 v kolono smo dodali 500 µL ˝raztopine za spiranje;

 centrifugirali smo 1 minuto in zavrgli tekočino, ki je stekla skozi kolono;

 centrifugirali smo še dodatno 1 minuto, da smo odstranili preostalo ˝raztopino za spiranje˝;

 kolono smo prenesli v čisto 1,5 mL mikrocentrifugirko ter odpipetirali 50 µL ˝pufra za spiranje˝;

 vzorec smo inkubirali pri sobni temperaturi 2 minuti, nato pa vzorec centrifugirali 2 minuti;

 kolono smo zavrgli, mikrocentrifugirko z izolirano rekombinantno plazmidno DNA pa zalepili s parafilmom ter poslali na določanje nukleotidnega zaporedja.

23

4 REZULTATI

4.1 USPEŠNOST TRANSFORMACIJE

Celice smo naredili kompetentne tako, da so lahko sprejele rekombinantno plazmidno DNA.

Uporabili smo sev DH5α bakterije E. coli kot gostiteljske celice, ki so z metodo transformacije sprejele rekombinantni plasmid. Selekcijo za bakterije, ki so sprejele želeni plazmidni konstrukt, smo izvedli na agarnih ploščah LB s kanamicinom (30 µg/ml), nato smo nacepljene transformante čez noč inkubirali v termostatirani komori pri 37 °C. Naslednji dan smo preverili število celic zraslih na gojišču ter jih primerjali s kontrolno ploščo. Nacepljene celice so prikazane na sliki 6. Na sliki je z K označena kontrola transformacije (ligiran rezan plazmidni vektor dodan kompetentnim celicam). Z LTX in JP2 je označeno promotorsko področje levkotoksina vstavljeno v plazmidni vektor ter transformiran v bakterije, z CDT-pa promotorsko področje toksina CDT vstavljeno v plazmidni vektor ter transformiran v bakterije.

Slika 6: Bakterije po transformaciji.

Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo

24

Za razlikovanje med tranformiranimi in netransformiranimi celicami običajno uporabljamo selekcijo na antibiotik. Plazmidni vektorji nosijo zapis za odpornost proti enemu ali več antibiotikom. V našem primeru so na agarske plošče zrasle transformirane celice, ki so odporne proti antibiotiku LB kanamicinu, ki smo ga pred nacepitvijo celic dodali v gojišče. Iz slike 6 lahko opazimo, da je bila uspešna transformacija pri vključku promotorskih področij toksina CDT in levkotoksina JP2, medtem ko je pri poskusu vključitve področja levkotoksina Ltx zraslo premalo celic v primerjavi s kontrolno ploščo.

4.2 PREVERJANJE KONCENTRACIJE DNA V VZORCU Z AGAROZNO GELSKO ELEKTROFOREZO

Po transformaciji smo vzorce DNA še enkrat pomnožili z metodo PCR, nato pa izvedli agarozno gelsko elektroforezo. Po elektroforezi lahko dvoverižno DNA zasledimo z etidijevim bromidom, ki se interkalira med bazne pare. Pri obsevanju z ultravijolično svetlobo etidijev bromid fluorescira oranžno svetlobo valovne dolžine 590 nm. V primerjavi s standardno raztopino DNA lahko na podlagi intenzivnosti emitirane svetlobe ocenimo koncentracijo DNA v vzorcu. Tako preverimo, kateri vzorec ustreza za nadaljnjo izolacijo rekombinantnega plazmida. Preverjanje primernosti vzorca z obsevanjem z ultravijolično svetlobo je prikazano na sliki 7. Slika prikazuje Testiranje vstavitve promotorskega področja v vektor. PCR je bil narejen na bakterijah zraslih na selektivnem gojišču.

S pomočjo te analize smo ugotovili, katere celice vsebujejo rekombinnatni plazmid. Nato smo pri tistih celicah, ki ga vsebujejo, rekombinnatni plazmid izolirali. Ugotovili smo, da sta bila primerna vzorca s promotorskim področjem za levkotoksin (JP2) ter toksin CDT. Pri levkotoksinu (Ltx) je bilo opaziti premajhno koncentracijo DNA in zato ni bila vidna pri obsevanju z ultravijolično svetlobo. V nadaljevanju smo za izolacijo rekombinantnega plazmida uporabili samo levkotoksin JP2 ter toksin CDT.

25 Slika 7: Testiranje vstavitve promotorskega področja v vektor.

4.3 ANALIZA NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA REKOMBINANTNE DNA

Izolirane rekombinantne plazmide smo poslali v podjetje Macrogen, kjer so določili nukleotidno zaporedje plazmidov. Poslali smo plazmide toksina CDT in levkotoksina JP2. Zaporedje toksina JP2 ni bila uspešno določena. Napaka je bila lahko narejena s strani podjetja, lahko pa rekombinantni plazmid že predhodno ni bil uspešno izoliran. Ustrezno pa so določili nukleotidno zaporedje za toksin CDT. Dve sekvenci enega plazmida smo združili v eno. Eno zaporedje smo naredili reverzno komplementarno in kjer sta se zaporedji prikrivali, smo ju združili v eno. V nadaljevanju smo uporabili program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), ki je algoritem za primerjavo nukleotidnih ali aminokislinskih zaporedij. Ugotovili smo, da je bila sekvenca CDT toksina identična z bakterijo A. actinomycetemcomitans. Zaporedje, določeno iz rekombinantnega plazmida pJT5 z vključkom, je prikazano na sliki 7. Na sliki so z rdečo označena prepoznavna restrikcijska mesta. Na 5´ koncu je prikazano mesto za restrikcijski encim

Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo

26

KpnI (zaporedje GGTACC), na 3´ koncu pa za BamHI (zaporedje GGATCC). Krepko so označeni začetni nukleotidi. Z rumeno označeno je predvideno Shine- Dalgarnovo zaporedje.

Slika 8: Nukleotidno zaporedje določeno iz plazmida PJT5.

Po vstavitvi v organizem gostitelja se tuja DNA, ki je vstavljena znotraj rekombinantnega plazmidnega konstrukta, lahko izrazi ali pa tudi ne. To pomeni, da se DNA lahko samo podvoji brez nadaljnega izražanja ali pa se prepiše in prevede v nastanek rekombinantnega proteina. Na

27 splošno, izražanje tujega gena zahteva vključevanje sekvenc, ki so potrebne za produkcijo molekule mRNA v procesu transkripcije (prepisa), ki se jo uporabi v nadaljni translaciji (prevajanju). Te sekvence so promotor, translacijski iniciacijski signal (Shine- Dalgarno sekvenca, za pravilno postavitev ribosoma) in transkripcijski terminator, ki določa konec prepisa iz DNA v mRNA (Brondyk H, 2009).

Transkripcijo katalizira encim RNA- polimeraza, ki je sposobna prepoznati pravo mesto za začetek transkripcije, ki ga imenujemo promotor. Promotor sproži transkripcijo in je zato kontrolna točka za izražanje gena (Grabnar 1997).

Pri prokariontih ni izoblikovanega jedra, zato v bakterijski celici potekata transkripcija in translacija istočasno. To jim omogoča hiter in učinkovit odziv na spremenjene spremembe v okolju. Na mRNA je že med njenim nastajanjem večje število ribosomov, ki se pomikajo v isti smeri kot nastaja mRNA. Iz njih izraščajo nastajajoče proteinske molekule in se po končani sintezi sproščajo v citoplazmo. Izražanje genov v celici je strogo nadzorovano. To pomeni, da se geni za proteine, ki jih celica ves čas potrebuje za vzdrževanje svoje zgradbe in za svoje delovanje (metabolizem), izražajo neprestano, vendar tudi usklajeno, drugi geni pa le po potrebi.

Okolje, v katerem organizmi živijo in se razmnožujejo, se nenehno spreminja. Bakterija, ki bo nenadoma prišla v okolje, bogato s prehranskim virom, se bo nemudoma odzvala z izražanjem genov za encime, ki bodo to hrano učinkovito pretvarjali in ji s tem zagotovili hitro rast in delitev. Ko bo hranivo pošlo, se bo izražanje omenjenih genov ustavilo, saj bi bilo nesmiselno in energetsko potratno, da bi celice sintetizirale proteine, ki jih ne potrebujejo (Komel, 2006).

29

5 ZAKLJUČEK IN SKLEPI

V diplomskem delu sem dosegla oba cilja, ki sem si jih zastavila. V diplomski nalogi sem predstavila bakterijo Aggregatibacter actinomycetemcomitans in jo povezala z boleznijo parodontitis, prav tako pa sem pripravila plazmidni konstrukt za preučitev promotorske aktivnosti l toksina CDT v bakteriji A. actinomycetemcomitans. Rekombinantni plazmidni konstrukt za preučevanje promotorske aktivnosti gena za levkotoksin nam ni uspelo pridobiti, najverjetneje zaradi slabe pomnožitve gena ali neustrezne restrikcije. Seznanila sem se z celotnim postopkom priprave rekombinantne DNA.

V postopku sem z encimom razrezala promotorsko področje, (ki uravnava prepisovanje) toksina CDT in levkotoksina, ki ju izloča bakterija A. actinomycetemcomitans in z enakim encimom odprla plazmidnega vektorja pJT5. S tem sem lahko fragment DNA vstavila v plazmidni vektor in nastalo rekombinantno DNA zaprla z encimom ligaza. Ugotovila sem, da je uvajanje tehnik rekombinantne DNA povzročilo velike spremembe v našem pojmovanju življenja.

Rekombinantno DNA lahko tako vnesemo v bakterijsko celico, ki jo zlahka razmnožimo v tekočem gojišču ter z molekulskim in celičnim kloniranjem pridobimo veliko število kopij fragmenta DNA vstavljenega v plazmid. Kadar je ta fragment gen, ki nosi zapis za farmacevtsko zanimiv protein, ga v bakterijskih celicah tudi izrazimo - sprožimo njegovo prepisovanje v mRNA in njeno prevajanje v protein. Na ta način lahko pridobimo zelo velike količine proteina, ki bi ga iz izvornega evkariontskega organizma pridobili veliko manj, ker ga je v njegovih celicah zelo malo ali pa je slabo dostopen (Komel, 2006).

Diplomska naloga temelji na dveh hipotezah. S PCR sem ugotovila, da bakterija izolirana iz pacienta s parodontozo v Sloveniji, nosi zapis promotorskega področja za pomemben toksin za nastanek parodontitisa, in sicer toksin CDT. S tem sem deloma potrdila prvo hipotezo, saj nismo uspeli pripraviti rekombinantnega plazmida s promotorskim področjem za levkotoksin. Izdelala sem plazmidni konstrukt za preučevanje promotorske aktivnosti gena za CDT in s tem potrdila drugo hipotezo.

31

6 VIRI IN LITERATURA

“Aggregatibacter” (2013), Dostopno prek URL:

http://www.vetbook.org/wiki/dog/index.php/Aggregatibacter_spp [ Povzeto: 5.9.2013]

Brondyk W. H. (2009) Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein.Methodss of Enzymology, 463

“CDT Family” (n.d.), Dostopno prek URL:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X99015371 [žPovzeto: 5.9.2013]

Cvetko E., Skalerič U. (2008). Identikacije za sistemsko antibiotično zdravljenje parodontalne bolezni. Zobozdravstveni vestnik, 63: 81-89

Dolores Juarez-Rodriguez M., Torres-Escobar A., Demuth R.D. (2013). Construction of new cloning, lacZ reporter and scarless-markerless suicide vectors for genetic studies in

Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Plasmid, 69: 211-222

Dragaš A. Z. (1996). Oralna bakteriologija. Ljubljana: DZS

Grabnar M. in sod. (1997) . Genetika in Evolucija Biologija 7 in 8. Ljubljana 1997: DZS Grošelj D., Gubina M. (2002). Zobna gniloba in bakterijske okužbe obzobnih tkiv. V M.

Gubina, A. Ihan (Ur.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (363-371)

Guerra L., Cortes-Bratti X., Guidi R., Frisan T. (2011).The Biology of the Cytolethal Distending Toxins. Toxins, 3: 172-190

Univerza v Ljubljani – Pedagoška fakulteta Irena Šurla; Diplomsko delo

32

Herzog-Velikonja H., Gruden K. (2000). Praktikum iz molekularne biologije-Teoretični del.

Ljubljana: Študentska založba

Jinasasa N.R., Bloom E.S., Weiss S.R., Duhamel E.G. (2011). Cytolethal distending toxin: a conserved bacterial genotoxin that blocks cell cycle progression, leading to apoptosis of a broad range of mammalian cell lineages. Microbiology, 157: 1851-1857

Johansson A. (2011). Aggregatibacter actinomycetemcomitans Leukotoxin: A Powerful Tool with Capacity to Cause Imbalance in the Host Inflammatory Response. Toxins, 3: 242-259

Kachlany S.C. (2010). Aggregatibacter actinomycetemcomitans Leukotoxin: from threat to therapy. Critical reviews in oral biology & medicine, 89 (6): 561-570

Komel R. (2006) GENETIKA od dvojne vijačnice do kloniranja Učbenik za gimnazije in srednje tehniške šole. Ljubljana: Rokus

Parodonitis, (n.d.), Dostopno prek URL:

http://www.apotheken-umschau.de/Parodontitis/Parodontitis-Symptome-11648_3.html [Povzeto: 5.9.2013]

Podržaj S. (2011). Protibakterijska učinkovitost različnih vrst medu na parodontopatogene bakterije in ustne streptokoke. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta

Sodja E. (2006). Primerjava klasične bakteriološke diagnostike in molekularne metode za dokazovanje parodontopatogenih bakterij v vzorcih iz parodontalnih žepov. Diplomsko delo, Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta

In document DIPLOMSKO DELO (Strani 30-0)