V nalogi smo želeli s pomočjo rezultatov izvedenih meritev ovrednotiti pomen določanja prokalcitonina pri pacientih z okužbo SARS-COV-2. Ugotavljali smo ali je merjenje prokalcitonina v pomoč pri postavitvi diagnoze ter ali iz njegovih vrednosti lahko sklepamo na nadaljnji potek in razplet bolezni. Poleg tega smo raziskali kako se vrednosti prokalcitonina, C-reaktivnega proteina, interlevkina-6, D-dimera in razmerja nevtrofilcev proti limfocitom (NLR) spreminjajo glede na potek in težavnost okužbe ter kako našteti parametri korelirajo med seboj. Na koncu smo primerjali še rezultate meritev prokalcitonina, ki jih dajeta analizatorja Pathfast in Advia Centaur XP. V ta namen smo odvzeli 112 vzorcev serumske krvi ter izvedli potrebne analize in izračune.
Ugotovili smo, da je bilo 71 % vrednosti naših vzorcev povišanih nad referenčno vrednost 0,1 µg/L s povprečno vrednostjo 2,3798 µg/L pri analizatorju Pathfast in 2,8446 µg/L pri analizatorju Advia Centaur XP. To pomeni, da je prokalcitonin kot označevalec lahko v pomoč pri diagnozi okužbe s SARS-CoV-2 in uporaben v kombinaciji z ostalimi. Samega ga za diagnozo bolezni ne moremo uporabiti, saj ni specifičen samo za COVID-19, ampak se poviša tudi pri različnih bakterijskih in drugih vnetnih stanjih. Povprečni mnogokratnik povišanja je za vzorce serumskih koncentracij PCT vseh pacientov znašal 23,8 (Pathfast) in 28,4 (Advia Centaur XP), kar označuje močno vnetje. Večina pacientov ima ob sprejemu nizke vrednosti PCT in povišane vrednosti CRP, kar govori o vnetnem dogajanju v pljučih.
V določeni fazi vrednosti PCT začnejo naraščati, ponavadi zaradi bakterijske soinfekcije. To je pogosto predvsem pri pacientih, kjer virus uniči pljučno tkivo in s tem omogoči invazijo bakterijam, ki povzročijo sekundarno bakterijsko pljučnico. Drug možni razlog za naraščanje vrednosti PCT pa je hudo poslabšanje zdravstvenega stanja, ko pacient razvije sistemski vnetni odziv s citokinsko nevihto in endotelijsko disfunkcijo. Zaradi bakterijske translokacije skozi membrane črevesja pride do povečane produkcije PCT (35).
V študiji z 271 bolniki na intenzivnem oddelku so Theresa F. in sodelavci primerjali PCT z ostalimi markerji (CRP, število nevtrofilcev in limfocitov, AST, LDH) in ugotovili, da je PCT pokazal največjo napoved za sprejem v intenzivno enoto. Povprečne vrednosti PCT so pri preživelih znašale 3.155 ± 2.02 µg/L, pri umrlih pa 10,18 ± 3,01 µg/L (53).
45
Prav tako so Rui H. in sodelavci ugotovili, da bi PCT lahko bil indikator resnosti bolezni in v pomoč pri napovedovanju prognoze. Opazovali so 95 bolnikov, okuženih s SARS-CoV-2.
Med njimi je 12 bolnikov imelo kritičen potek bolezni, 21 težji potek ter 62 zmeren potek bolezni. Rezultati so pokazali, da so povprečne vrednosti PCT pri težjem poteku bolezni 4 x višje kot pri blagem poteku in 8 x višje pri kritičnem poteku. Ugotovili so, da so se pri preživelih bolnikih vrednosti PCT zniževale z izboljšanjem zdravstvenega stanja, pri umrlih pa so PCT vrednosti z resnostjo okužbe naraščale (10).
Podobno nakazuje študija Charlotte V., kjer so opazovali 66 kritično bolnih pacientov na intenzivnem oddelku. Povprečna vrednost PCT pri umrlih je znašala 4,22 µg/L, pri preživelih pa 0,53 µg/L. Razlog povišanih vrednosti PCT bi lahko bila sočasna bakterijska okužba (pojavila se je pri polovici umrlih), ki vpliva na povišanje izmerjenih vrednosti PCT in prispeva k težjemu poteku bolezni. PCT bi v tem primeru lahko pomagal pri odkrivanju sekundarne okužbe in s tem preprečevanju slabega izida. Za razliko od navedene študije, pa študija Alberto Dolcija in ostalih sodelavcev z opazovanimi 427 pacienti poroča, da prokalcitonin ni imel posebne dodane vrednosti pri spremljanju okužbe z virusom SARS-CoV-2. PCT je pokazal relativno dobro sposobnost napovedovanja smrtnega izida (AUC = 0,815), vendar nič boljšo kot laktat dehidrogenaza, albumin in številčne vrednosti limfocitov ter nevtrofilcev. Njegov največji doprinos je visoka negativna napovedna vrednost za izključitev sočasne bakterijske okužbe ob vrednosti PCT manjši od 0,25 µg/L (54).
Da bi preučili, kako se vrednosti zgoraj naštetih krvnih parametrov spreminjajo glede na potek in težavnost bolezni, smo podrobneje preučili krvno sliko dveh pacientov, hospitaliziranih na intenzivni enoti in jo primerjali s kliničnim poročilom. Prav tako smo preučili, kako opazovani krvni parametri medsebojno korelirajo. Najvišji Speramanov koeficient korelacije opazimo med spremenljivkama CRP ter IL-6 z vrednostjo 0,507, kar označuje srednjo moč povezanosti med njima. IL-6 deluje na hepatocite, da le-ti pričnejo sintezo mediatorja vnetja CRP, zato je bila takšna korelacija med njima pričakovana. Tudi z opazovanjem grafov lahko opazimo poraste vrednosti IL-6, ki jim sledi porast CRP vrednosti. Prav tako je bila izmerjena zmerna moč povezanosti med PCT in CRP (0,437) ter nekoliko nižja med PCT in IL-6 (0,339). Torej PCT bolje korelira s CRP kot z IL-6. Takšne korelacije so bile pričakovane, saj vse naštete spremenljivke sodijo med vnetne dejavnike.
Če bi bile korelacije med spremenljivkami zelo visoke, bi to pomenilo, da nakazujejo na enake procese v telesu, tako pa lahko sklepamo, da vsaka spremenljivka zajema nekaj
46
svojega, kar druga ne. Nižje korelacije so bile med vnetnimi dejavniki ter D-dimerom.
Zavzele so vrednosti med 0,153 in 0,194. Gre za nizko korelacijo, ki priča o temu, da so ostale spremenljivke z D-dimerom slabše povezane. Nizko korelacijo pojasnjuje dejstvo, da za razliko od ostalih D-dimer ni vnetni dejavnik, temveč se uporablja za napovedovanje motenj strjevanja krvi. Kljub temu je D-dimer pomemben parameter pri spremljanju poteka bolezni COVID-19.
Ugotovili smo, da vsi parametri ob močnem povišanju opozarjajo na resnost poteka bolezni in možnost komplikacij. Povprečni mnogokratnik povišanja serumskih koncentracij PCT je pri prvem pacientu znašal 100,5 pri drugem pa 3,2. Pri prvem pacientu je bil mnogokratnik veliko višji od povprečja mnogokratnikov vseh vzorcev in je sam po sebi opozarjal na veliko verjetnost smrtnega izida. Pri prvem pacientu je začetna koncentracija PCT znašala okoli 1 µg/L, najvišja izmerjena pa okoli 45 µg/L. Glede na visoko izmerjeno prvo koncentracijo, veliko razliko med prvo in najvišjo koncentracijo, kritičen potek bolezni, ki so mu PCT vrednosti sledile in smrtni izid, lahko v tem primeru PCT označimo kot dober prognostični kazalec. Pri drugem pacientu je bila izmerjena začetna koncentracija 0,08 µg/L in najvišja 1,22 µg/L. Glede na nizko začetno koncentracijo, zapleten potek bolezni ter smrtni izid v tem primeru prokalcitonina ne moremo označiti kot dobrega prognostičnega markerja.
Vseeno ima določeno prognostično vrednost, saj je razlika med prvo in najvišjo koncentracijo opazna, prav tako pa so se vrednosti PCT ob zapletih zviševale in ob izboljšanju stanja zniževale. Pri obeh pacientih se je potreba po kisiku odražala v zvišani vrednosti CRP in IL-6, ki pričata o vnetnem dogajanju v pljučih. Ob sprejemu na intenzivni oddelek in intubaciji so bile pri prvem pacientu vse vrednosti drastično povišane (PCT je znašal 32 µg/L, CRP 290 mg/L, NLR 17,6, IL-6 304,1pg/mL, D-dimer pa 6900 ng/mL) ob upoštevanju, da je imel pacient že pred tem bakterijsko okužbo noge in zato povišane vrednosti CRP. Druga pacientka pa je imela ob intubaciji močno povišane vrednosti CRP, NLR in D-dimera (133 mg/L, 15,6 in 7077). S slabšanjem zdravstvenega stanja so se slabšali vnetni parametri, z izboljšanjem pa so se njihove vrednosti bližale referenčnim območjem.
Ob izboljšanju zdravstvenega stanja in ekstubaciji je bil PCT pri obeh pacientih nižji od 0,5 µg/L, povišani pa so bili ostali krvni parametri. Ob in pred smrtjo so bile pri prvem pacientu močno povišane vrednosti vseh parametrov, pri drugem pa sta bili drastično povišani predvsem vrednosti NLR in D-dimera. Ugotovili smo, da se je bakterijska okužba odražala predvsem v povišanju PCT in CRP; PCT je bil povišan nad 0,1 µg/L, CRP pa nad 100 mg/L.
Ob ustrezni antibiotični terapiji so vrednosti obeh parametrov pričele padati.
47
Čeprav D-Dimer ni vnetni dejavnik, je bil pri obeh pacientih močno povišan skoraj celotni čas. Ob hospitalizaciji sta vrednosti znašali 4951 ng/mL in 2722 ng/mL, najvišji izmerjeni vrednosti pa sta bili 12872 ng/mL in 16731 ng/mL. V študiji Yahase in sodelavcev, kjer so obravnavali 182 pacientov je bila povprečna vrednost D-dimera ob hospitalizaciji pri preminulih 3208 ng/mL, pri preživelih pa 1067 ng/mL. Zhang in sodelavci so v študiji, izvedeni na Kitajskem, ugotovili, da je optimalna mejna vrednost D-dimera 2000 ng/mL, saj so bile višje vrednosti ob sprejemu povezane z večjo umrljivostjo (18).
V študiji bolnikov, hospitaliziranih v bolnišnici za pljučne bolezni v Wuhanu so ugotovili, da je bolj kot začetna vrednost D-dimera pomembna najvišja izmerjena vrednost D-dimera tekom hospitalizacije. Bolniki z najvišjo izmerjeno vrednostjo več kot 3780 ng/mL so imeli večje tveganje za poslabšanje zdravstvenega stanja in smrt. Poleg tega so povišane vrednosti D-dimera povezane z vztrajnimi motnjami strjevanja krvi ter z njimi povezanimi zapleti.
V študiji, izvajani v portugalski bolnici Barga, osredotočeni predvsem na vpliv IL-6, so obravnavali 47 bolnikov okuženih s SARS-CoV-2 in ugotovili, da vrednosti IL-6 korelirajo z resnostjo bolezni. Mejna vrednost za napoved slabega izida je bila opredeljena z 86,95 pg/ml. Vrednosti IL-6 so bile v srednji fazi bolezni višje pri tistih, ki se jim je stanje poslabšalo in nižje pri tistih, kjer je prišlo do izboljšanja zdravstvenega stanja, prav tako so bile izmerjene vrednosti IL-6 veliko višje pri umrlih v primerjavi s preživelimi. To nakazuje na potencialno prognostično uporabnost markerja IL-6. Kljub temu, da je bila izmerjena pozitivna korelacija med IL-6 in CRP, Spearmenov koeficient med njima je bil 0,55, pri CRP niso prišli do enakih zaključkov. Visoke vrednosti IL-6, katerim so sledile povišane vrednosti CRP so nakazovale na potrebe po kisiku in mehanski ventilaciji (52).
Kaplan-Meierjeve krivulje preživetja retrospektivne kohortne študije, ki je vključevala 140 pacientov z blagim potekom bolezni in 107 z resnim potekom, so pokazale, da so imeli pacienti z vrednostmi PCT, IL-6 in CRP povišanimi nad dogovorjenim pragom (treshold) veliko večjo verjetnost za razvoj hujšega poteka bolezni. Wan S.X je s sodelavci odkril, da je citokinska nevihta ključnega pomena za napredovanje bolezni in smrti. Analiza Coxovega sorazmernega modela nevarnosti je pokazala, da se lahko IL-6, CRP in PCT uporabijo kot neodvisni dejavniki za napovedovanje resnosti COVID-19. Yang P.H je poudaril, da bi IL-6 lahko uporabili kot neodvisen dejavnik napovedovanja poslabšanja bolezni COVID-19, med drugim tudi zaradi tega, ker je glaven sprožilec citokinske nevihte (17).
48
Na koncu smo ovrednotili še ujemanje rezultatov med POCT in klasično laboratorijsko metodo z Passing-Bablok regresijsko analizo ter Bland-Altmanovo analizo. Iz meritev smo odstranili dva para meritev z največjo medsebojno izmerjeno razliko. Prvi par predstavljata vrednost 100 µg/L izmerjena s Pathfast analizatorjem (POCT metoda) in vrednost 243,3 µg/L izmerjena z analizatorjem Advia Centaur XP. Do takšne razlike med rezultatoma je prišlo zato, ker je merilno območje analizatorja Pathfast navzgor omejeno s 100 µg/L in se zato ta vrednost ni mogla približati vrednosti, ki jo je podal analizator Advia Centaur XP.
Drugi par meritev predstavljata vrednost 28,4 µg/L analizatorja Pathfast in vrednost 42,2 µg/L analizatorja Advia Centaur XP. Do takšne razlike med metodama je lahko prišlo zaradi napak pri rokovanju z vzorci. Če bi vzorec pri 100 µg/L ustrezno redčili, bi se le ta bolje prilegal v linearno območje.
Najprej smo ujemanje metod ovrednotili z Passing&Bablok regresijsko analizo. Za uporabo te analize je potreben dovolj velik vzorec, ustrezna linearnost ter dobra korelacija med metodama. Linearnost smo preverili s Cusumovim testom, ki je podal vrednost p = 0,14, kar pomeni, da ni večjih odstopanj od linearnosti. Korelacijo med metodama smo izračunali s Speramanovim koeficientom, ki z vrednostjo 0,986 nakazuje na odlično korelacijo.
Regresijska analiza je pokazala, da med metodama ni prisotne stalne niti sorazmerne napake.
Odsotnost sorazmerne napake odčitamo iz 95 % intervala zaupanja za naklon (0,9664–
1,0768). Interval vsebuje vrednost 1, kar potrjuje odsotnost sorazmerne napake. Stalno napako, pa odčitamo iz 95 % intervala zaupanja za odsek (–0,001144–0,01601). Le ta vsebuje vrednost 0 in s tem potrjuje odsotnost stalne napake. Iz tega lahko zaključimo, da metodi dajeta medsebojno primerljive rezultate in sta medsebojno zamenljivi.
Ujemanje med metodama smo prikazali tudi z grafom rezidualov, ki je pokazal, da približno 60 vzorcev z najnižjimi koncentracijami leži na premici z vrednostjo 0, kar pomeni, da je razlika med meritvami metod enaka 0. Približno 7 vzorcev z najvišjimi koncentracijami, pa signifikantno odstopa od vrednosti 0, kar pomeni, da so razlike parov meritev med metodama veliko večje kot razlike med pari meritev nižjih koncentracij.
Na koncu smo ujemanje rezultatov dveh metod preverili še z Bland-Altmanovo analizo.
Analiza je pokazala, da analizator Pathfast daje povprečno za –0,3527 µg/L nižje rezultate meritev kot metoda Advia Centaur XP. Večina točk se nahaja v okolici premice z vrednostjo 0, kar pomeni, da je med večino parov meritev skoraj ničelna razlika. 95 % interval zaupanja za povprečje razlik vsebuje vrednost 0 (–0,7063–0,0009839), kar pomeni, da je sistematična
49
napaka zanemarljiva. Zgolj nekaj točk leži izven mej sprejemljivosti (na grafu črtkano rdeči premici), kar pomeni majhno variabilnost. Opazimo, da je pri večjih povprečnih vrednostih parov meritev večja tudi pripadajoča razlika med meritvama. Zaradi zanemarljive sistematične napake in majhne variabilnosti lahko zaključimo, da sta metodi medsebojno primerljivi.
50