INTERLEVKIN 6 - LABORATORIJSKI PARAMETRI - UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

I. UVOD

4. LABORATORIJSKI PARAMETRI

4.4. INTERLEVKIN 6

Vsak izmed interlevkinov ima svojo funkcijo, skupna pa jim je medcelična komunikacija, usklajevanje razvoja in aktivnosti imunskega sistema ter uravnavanje celične rasti in gibljivosti (23). Kot primarni sprožilec citokinskih neviht in dejavnik tveganja za napredovanje poteka COVID-19 se je izmed interlevkinov uveljavil IL-6 z referenčno vrednostjo 0-16,4 pg/ml (24). Gre za večnamenski citokin s pomembno vlogo koordiniranja prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, saj vpliva na zorenje makrofagov, diferenciacijo in zorenje limfocitov T in B ter s tem na izločanje imunoglobulinov.

Interlevkin 6 inducira sproščanje CRP ter ostalih proteinov akutne faze (25). Prav tako ima pomembno vlogo pri uravnavanju presnove, homeostazi celic in organov, razvoju in preživetju živcev, hematoloških boleznih ter vzdrževanju različnih vrst raka. Biokemično ga uvrščamo v razred štiri-spiralnih citokinov. Deluje preko receptorja za IL-6, izraženega na celični površini, ki se ob nasičenju poveže s signalnim receptorjem za glikoprotein130, ki nato postane dimeriziran in s tem sproži znotrajcelično signalizacijo. Čeprav se IL-6 večinoma obravnava kot vnetni citokin ima tudi zaščitno in regenerativno funkcijo (26).

9 4.5. C-REAKTIVNI PROTEIN

C-reaktivni protein je beljakovina akutne faze vnetja, ki se primarno proizvaja v jetrih v odgovor na povišane ravni vnetnih citokinov, predvsem IL-6. Poleg jetrnih hepatocitov se lahko proizvaja tudi v makrofagih, endotelijskih celicah, gladkih mišičnih celicah in adipocitih. Po sestavi je homopentamerni glikoprotein sestavljen iz petih enakih nekovalentno povezanih enot, ki so enakomerno razporejene okoli centralne pore. Glavni induktor gena za CRP, ki ga najdemo na kromosomu 1 je IL-6, IL-1 ter TNF-α pa še dodatno okrepita njegovo delovanje. V prisotnosti kalcija se CRP veže na polisaharide, kot je npr.

fosfoholin in s tem sproži aktivacijo komplementa prirojene imunosti. CRP ima pomembno vlogo pri vnetnih procesih in imunskem odgovoru gostitelja, saj poleg aktivacije komplementa sodeluje tudi pri apoptozi, fagocitozi, sprostitvi dušikovega oksida (27).

Prednosti merjenja CRP v zdravniški praksi:

• Visoka negativna napovedna vrednost in visoka občutljivost.

• Ločevanje med virusno in bakterijsko infekcijo.

• Hiter padec vrednosti ob ustrezni antibiotični terapiji omogoča spremljanje uspešnosti terapije in poteka bolezni.

• Hitra meritev za katero zadostuje majhna količina krvi (28).

Slabosti merjenja CRP v zdravniški praksi:

• Ni specifičen pokazatelj okužbe, saj se vrednosti povišajo tudi pri operativnih posegih, vnetjih in poškodbah tkiva (29).

Pri zdravih osebah so njegove vrednosti praviloma nizke in ne presegajo 5 mg/L. Med vnetne dražljaje, ki zvišajo koncentracijo CRP sodijo virusne ter bakterijske infekcije, poškodbe in vnetja tkiva ter kirurški posegi. Koncentracija v plazmi začne naraščati 6 ur po okužbi in svoj vrh doseže po 48 urah. Pri virusnih okužbah je njegova koncentracija v krvi le rahlo zvišana, pri bakterijskih infekcijah pa se njegova koncentracija lahko poveča za več 100 x (28). Za virusne okužbe so značilne vrednosti 10-20 mg/L. Na lokalizirano bakterijsko infekcijo lahko posumimo pri koncentraciji 40 mg/L, vrednosti nad 100 mg/L pa z veliko

gotovostjo napovedujejo bakterijsko okužbo. Pri zelo invazivnih bakterijskih okužbah ali pri sepsi vrednosti dosežejo tudi 500 mg/L. Koncentracije CRP v krvi so povišane tudi pri nekrozah ter pri neinfekcijskih vnetnih boleznih (29). Merjenje koncentracij CRP se uporablja za razlikovanje med virusno in bakterijsko okužbo, saj so pri virusni koncentracije v krvi veliko nižje kot pri bakterijski. Prav tako se uporablja pri spremljanju uspešnosti terapije zdravljenja z antibiotiki, pri določitvi postoperativnih zapletov in pri terapevtskem spremljanje poteka revmatične bolezni (28).

Vrednosti virusnih infekcij:

• prehlad: 10 mg/L,

• infekcija zgornjih dihalnih poti: 10 mg/L,

• pljučnica: 10–20 mg/L,

• virusni meningitis: 10–20 mg/L.

Vrednosti bakterijskih infekcij:

• vnetje srednjega ušesa: 10–40 mg/L,

• tonzilitis: 30–60 mg/L,

• pljučnica: 80–200 mg/L,

• pielonefritis: 60–200 mg/L,

• bakterijski meningitis: 80–200 mg/L.

Vrednosti pri nekrozah:

• miokardni infarkt: 10–30 mg/L,

• rakava obolenja: 10–40 mg/L.

Vrednosti neinfekcijskih vnetnih bolezni:

• akutni pankreatitis: 10–30 mg/L,

• sistemski lupus eritemaozus: 10–20 mg/L,

• revmatoidni artritis: 30–200 mg/L (28).

11 4.6. PROKALCITONIN

Prokalcitonin je beljakovina akutne faze vnetja, sestavljena iz 116 aminokislin z molekulsko maso približno 13 kilodaltonov (kDa) in razpolovnim časom do 30 ur. Je predhodnik hormona kalcitonina, ki nastaja v C celicah ščitnice in je odgovoren za zniževanje vrednosti kalcija v odgovor na hiperkalciemijo. Običajno se sintetizira in sprošča iz C celic ščitnice, lahko pa se sintetizira tudi v nevroendokrinih celicah pljuč, jeter in prebavil. Na sintezo v ostalih tkivih lahko sklepamo tudi zato, ker je koncentracija prokalcitonina lahko povišana kljub normalnim ravnem kalcitonina (30). Dvig vrednosti nad referenčno območje (0,1 µg/L) opazimo predvsem pri bakterijskih okužbah, saj bakterijski endotoksini predstavljajo najmočnejši dražljaj za izločanje PCT. Ob vnetnih pogojih se PCT izloča iz adipocitov (31).

Do povišanja serumskih koncentracij pride tudi pri okužbi z virusom SARS-CoV-2, večina študij pa nakazuje na to, da močno povišane vrednosti predstavljajo 5 x večje tveganje za pojav težje oblike bolezni COVID-19 (10).

PCT je sestavljen iz treh sekcij, imenovanih: N-terminalna sekvenca (N-PCT), nezreli kalcitonin in kalcitonin karboksil terminalni peptid 1 (CCP-1) imenovan tudi katakalcin.

PCT kodira gen CALC-1, ki je lokaliziran na kromosomu 11. Ob cepitvi na enem mestu primarnega prepisa gena CALC-1 nastane pre-PCT. Ta se nato premakne v endoplazmatski retikulum, kjer pride do proteolitičnega odcepa signalnega peptida z endopeptidazo in s tem do nastanka PCT (32).

Ob odsotnosti okužbe je transkripcija gena CALC1 za PCT v ne-nevroendokrinih tkivih zavrta, razen v C celicah ščitnične žleze, kjer zaradi izražanja gena pride do nastanka prokalcitonina, prekurzorja kalcitonina pri zdravih posameznikih. Iz nastalega PCT sledi encimski odcep N-PCT dela in nato še CCP-1 dela, kjer nato ostane samo nezreli kalcitonin.

Z odcepom C-terminalnega glicina iz nezrelega kalcitonina s pomočjo peptidglicin-alfa-amidirajoče monooksigenaze (PAM) nastane zrel kalcitonin in manjši peptidi (30). Zrel kalcitonin se shranjuje v sekretornih granulah in nato izloča v kri z namenom uravnavanja koncentracij kalcija. Ob prisotnosti mikrobiološke infekcije, pa tudi ne-nevroendokrina tkiva izražajo gen za CALC-1. Tako pride do znatno povečane ekspresije gena CALC-1 in s tem produkcije PCT tudi v ostalih, zunaj ščitničnih tkivih, kot so vranica, jetra, ledvice, trebušna slinavka, pljuča, debelo črevo in maščoba. Ta tkiva niso sposobna proizvesti zrelega kalcitonina, saj verjetno citokini onemogočajo proteolizo PCT do kalcitonina. To nakazuje

na zmožnost povišanja vrednosti PCT pri okužbah ob hkrati normalnih vrednostih kalcitonina (33).

Najmočnejši dražljaj za izločanje PCT predstavlja sistemski učinek bakterijskih endotoksinov. PCT je v serumu zdravih prostovoljcev prvič detektiran štiri ure po intravenskem vbrizganju bakterije Escherichia coli. Najvišjo vrednost doseže po šestih urah in tako ostane zvišan do 24 ur. Nato prične padati in v dveh dneh doseže izhodiščno vrednost (30).

Pri zdravih posameznikih je koncentracija PCT v krvi manjša od 0,1 µg/L, saj se skoraj ves PCT pretvori v kalcitonin. Serumske koncentracije PCT med 0,5 in 3 µg/L veljajo za nizke, vrednosti med 3 in 30 µg/L za visoke, vrednosti nad 30 µg/L pa za zelo visoke. Pri hudih bakterijskih okužbah in organskih odpovedih, lahko vrednosti dosežejo tudi 100–1000 µg/L (31).

Rahlo povišane vrednosti PCT lahko izmerimo pri različnih virusnih in glivičnih okužbah, alergijah ter rakavih obolenjih, vendar le-te praviloma ne presegajo 0,5 µg/L. Izjeme z višjimi izmerjenimi koncentracijami so C celični karcinom ščitnice in drugi nevroendokrini tumorji, kot feokromocitom in drobnocelični karcinom. Do povišanih ravni pride tudi pri sindromu sistemskega vnetnega odziva, povzročenega s travmami, operacijami ali opeklinami, vendar v primerjavi z bakterijskimi infekcijami dvig ni tako visok in dolgotrajen (30). Povišanje vrednosti opazimo tudi v prvih dneh po presaditvi organov, predvsem ledvic in jeter z gibanjem koncentracij PCT med 3–5 µg/L. Povišane koncentracije po presaditvi organov lahko opozarjajo na možno zavrnitev organa ali bakterijsko infekcijo. Za razliko od do sedaj omenjenih primerov, pa pri sepsi lahko pride do več stokrat preseženih normalnih koncentracij PCT. Vrednosti PCT v serumu bolnikov s sepso se gibljejo v območjih med 0,5 –3.5 µg/L, pri bolnikih s hudo sepso med 3–10 µg/L ter pri bolnikih s septičnim šokom med 8–16 µg/L. Višja kot je koncentracija PCT, bolj resen je zaplet in bolj prizadeti bodo organi, zato lahko glede na koncentracijo ocenjujemo resnost zapleta in razplet okužbe. Meritve PCT se izvajajo tudi pri boleznih osrednjega živčevja z namenom ločevanja virusnega in bakterijskega meningitisa (34).

VREDNOSTI PROKALCITONINA

• normalna vrednost: < 0,05 µg/L,

• lokalno vnetje: < 0,5 µg/L,

• lokalizirana okužba s sistemskimi znaki vnetja: 0,5-2 µg/L,

• sistemski odziv, možnost sepse in odpovedi organov: 2-10 µg/L,

• hud sistemski odziv, prisotnost sepse in odpoved organov: > 10 µg/L.

PROKALCITONIN DOLOČAMO PRI:

• sumu na sepso v primeru nizke koncentracije C-reaktivnega proteina,

• klinični sliki septičnega šoka ali hude sepse,

• meningitisu, če s preiskavo likvorja ne izključimo bakterijske okužbe,

• febrilni nevropatiji,

• neinfekcijskih boleznih s povišano vrednostjo CRP in prisotnostjo znakov sistemskega vnetnega odziva (34).

Merjenje PCT je v pomoč pri razlikovanju med virusno in bakterijsko okužbo ter lokalno in sistemsko bakterijsko okužbo. Pri virusnih in lokaliziranih okužbah so vrednosti značilno nižje, višje pa nakazujejo na sistemski vnetni odgovor in s tem razširitev okužbe naprej po telesu. V primeru dalj časa trajajočega povišanja PCT ali izrazitejšega porasta njegove koncentracije to nakazuje na dodatni zaplet in razširitev okužbe po telesu (31). Prav tako je spremljanje PCT v pomoč pri vodenju antibiotične terapije. Ob ustrezni izbiri antibiotika je pričakovan 50 % padec vrednosti PCT dnevno, če vrednosti ne padajo, terapija ne učinkuje.

Ob 80–90 % padcu od najvišje izmerjene vrednosti je varno prekiniti z antibiotično terapijo (35). Številne študije so pokazale, da je uporaba antibiotikov na podlagi spremljanja vrednosti PCT zmanjšala izpostavljenost antibiotikom in z njimi povezanih neželenih učinkov, brez sprememb v kliničnih izidih (32).

5. POINT OF CARE TESTING (POCT)

Klinično-kemijske raziskave so se do nedavnega izvajale zgolj v laboratoriju, z razvojem tehnologije analiznih postopkov na prenosnih aparatih pa se je testiranje premaknilo bližje k pacientu (36). Laboratorijsko testiranje ob preiskovancu, kjer gre za preiskave biološkega materiala človeškega telesa, izvedene izven tradicionalnega medicinskega laboratorija imenujemo POCT (37). Pogosto ga opišejo sinonimi, kot so: testi ob pacientu, testi ob postelji, analiza ob postelji, analiza ob pacientu, hitri testi, testi na domu (36). Tako kot testiranja v medicinskem laboratoriju, morajo tudi ta testiranja potekati v skladu s predpisi

in standardi za vzdrževanje ustrezne kakovosti. Namen uporabe POCT analizatorja je pridobiti laboratorijsko kakovostne rezultate v najkrajšem možnem času, kar v primerjavi z laboratorijem pomeni takojšnjo razpoložljivost rezultata analize. To je še posebej pomembno v enotah za nujno medicinsko pomoč, oddelkih za intenzivno medicino, intervencijskih enotah in operacijskih sobah, ko je pacientovo zdravje ogroženo. Poleg naštetih se POCT analizatorji uporabljajo še v lekarnah, zdravstvenih domovih, sprejemnih ambulantah, mobilnih zdravstvenih enotah, rešilcu in na domu pacienta (37). Testiranje se izvaja s pomočjo majhnih, prenosnih analizatorjev, enostavnih za uporabo. Dobljeni rezultati so v pomoč pri hitrejši triaži pacientov, pri diagnosticiranju, spremljanju odziva na zdravljenje in napovedovanju izida bolezni (38).

Prednosti in slabosti preiskav ob bolniku:

Prednosti:

• enostavna izvedba testov, ni potrebe po laboratorijsko usposobljenem osebju, pacient si lahko meritve napravi tudi sam,

• kratek čas obdelave vzorca, krajši čas od vzorčenja do končnih rezultatov, hitrejše zdravniške odločitve,

• za analizo zadostujejo majhni volumni vzorca,

• transport do laboratorija ni potreben.

Slabosti:

• premajhna usposobljenost osebja lahko vodi v napake,

• slabša ponovljivost,

• POCT analiza je dražja,

• težje primerljivo z rezultati klasične laboratorijske metode (39).

6. KLASIČNA LABORATORIJSKA METODA

Za kvantitativno določanje PCT so se v laboratorijih uveljavile imunokemijske metode, katerih značilnost je visoka analitska občutljivost, raznolikost in specifičnost.

Imunokemijske metode temeljijo na reakciji med protitelesom in antigenom, ki skupaj tvorita kompleks in s tem omogočita kvantitativno določanje analita (40). Prvi komercialno dostopen test je bil BRAHMS PCT LIA – luminometrični imunološki test, ki temelji na

vezavi dveh antigen specifičnih protiteles na PCT (antigen), pri čemer je eno protitelo označeno z luminiscenčnim barvilom. Kasneje je na trg prišel hitrejši in občutljivejši avtomatiziran test, znan kot BRAHMS PCT Kryptor, imunofluorescenčni test, ki je bil kot prvi odobren s strani FDA leta 2008 za diagnostiko sepse in septičnega šoka (41). V diagnostiki jih lahko uporabimo za merjenje prostega antigena, protiteles ali celic, pri čemer je eden označen z označevalcem, ki je lahko encim ali luminiscenčna snov. Ločimo različne načine detekcije, in sicer: fluorescenčno, luminiscenčno, spektrofotometrično, nefelometrično in turbidimetrično. V primeru merjenja protitelesa ali antigena le-ta nastopata kot analit, lahko pa nastopita tudi kot biokemijski reagent za merjenje ostalih molekul. Na ustreznost rezultatov, ki jih dobimo z imunokemijskimi metodami, vplivajo lastnosti antigena in protitelesa (specifičnost, afiniteta) ter priprava biološkega vzorca (40).

II. NAMEN

V okviru magistrske naloge bomo:

Ovrednotili pomen določanja prokalcitonina pri pacientih z okužbo SARS-COV-2. Naš cilj je ugotoviti, kakšna je diagnostična vrednost prokalcitonina, in ali ima tudi prognostični pomen.

Preučili, kakšne so vrednosti prokalcitonina glede na potek in težavnost okužbe ter dobljene rezultate primerjali z ostalimi pokazatelji vnetja. Želimo preveriti, kako rezultati PCT korelirajo z IL-6, CRP in D-dimerom.

Izvedli analize prokalcitonina v serumski krvi na dveh analizatorjih, in sicer PATHFAST in Advia Centaur XP. Naš cilj je preveriti ujemanje rezultatov med POCT in klasično laboratorijsko metodo.

III. MATERIALI IN METODE

1. KLINIČNO OKOLJE

Raziskavo smo izvedli v UKC Ljubljana v obdobju oktober 2020 – junij 2021. Pacienti z okužbo SARS-CoV-2 so bili hospitalizirani na oddelku intenzivne enote diagnostično-terapevtskega servisa (DTS). Biološki material pacientov je bil poslan v laboratorije Kliničnega inštituta za klinično kemijo in biokemijo (KIKKB), kjer so bile izvedene vse rutinske analize, vključno z meritvami IL-6, CRP ter D-dimera. Analize so bile izvedene po standardnih postopkih z ustrezno kontrolo kakovosti. Meritve PCT smo izvedli v R&R laboratoriju na Polikliniki.

2. ZBIRANJE VZORCEV IN OPIS SKUPINE PACIENTOV

Za namen naloge smo izbrali 112 vzorcev serumske krvi v starostni skupini od 41 do 86 let, pri čemer je 62 vzorcev pripadalo osebam moškega spola in 50 osebam ženskega spola.

Povprečna starost preiskovancev je bila 69 let, povprečna ležalna doba pa 34 dni (Dovoljenje Republiske komisije za medicinsko etiko: 0120-60/2021/5). Vsi vzorci so bili odvzeti s strani medicinskega osebja v epruvete brez dodatka z rdečim zamaškom ob prihodu na oddelek ter nato vsakodnevno v primeru hospitalizacije. V primeru hujšega poteka bolezni je bila kri nekaterim pacientom odvzeta tudi večkrat dnevno. Vzorce so po odvzemu krvi analizirali na analizatorju Advia Centaur XP in jih kasneje shranili pri temperaturi –20°C. Vsak vzorec je bil označen s črtno kodo, vpisan v računalniški sistem ter v zvezek za lažji pregled. V mesecu aprilu smo s pomočjo računalniškega sistema LIS izbrali 112 vzorcev, katerim je bila predhodno izmerjena koncentracija na analizatorju Advia Centaur XP. Izbrali smo vzorce raznolikih koncentracij, od najnižjih do najvišjih, jih poiskali v laboratoriju ter jim s pomočjo analizatorja Pathfast izmerili serumske koncentracije prokalcitonina.

3. DOLOČANJE KONCENTRACIJ PROKALCITONINA Z METODO PATHFAST

Pathfast analizator je popolnoma avtomatiziran kemiluminiscenčni imunoanalizator, ki spada v skupino POCT namiznih analizatorjev. Je majhen, lahek, enostaven za uporabo in

ne zahteva dodatne usposobljenosti osebja. Ima vgrajen zaslon na dotik, preko katerega z njim upravljamo, črtalnik kod, računalnik in tiskalnik, s pomočjo katerih se natisnejo dobljeni rezultati meritev. Omogoča analizo 6 enakih vzorcev hkrati in rezultate znotraj 17 minut. Analiziramo lahko vzorec seruma, plazme in polne krvi, pri čemer hemoliza ne vpliva na rezultate testiranja (42). Zagotavlja visoko točnost, natančnost ter ponovljivost rezultatov, ki korelirajo z laboratorijskimi analizami.

Slika 2: Analizator Pathfast (povzeto po (43))

Tehnične specifikacije analizatorja :

• Metoda: kemiluminiscenčna encimska imunološka metoda (CLEIA) in MAGTRATION® tehnologija,

• Vzorci: plazma, serum, polna kri,

• Volumen vzorca: 100 μl,

• Merilno območje: 0,020 – 100 ng/ml,

• Število vzorcev: do 6 hkrati,

• Čas merjenja: manj kot 17 minut za 6 vzorcev,

• Temperatura reakcije: 37 °C,

• Shranjevanje podatkov: do 1000 pacientov (43).

3.1. PRINCIP METODE

Analizator Pathfast združuje kemiluminiscenčno encimsko imunološko metodo (CLEIA) in patentirano tehnologijo Magtration®. Postopek poteka v štirih spodaj opisanih stopnjah.

• Imunoreakcija: Najprej se pacientovemu vzorcu doda monoklonska protitelesa proti PCT, označena z alkalno fosfatazo in protitelesa proti PCT, označena z magnetnimi delci. Sledi petminutna inkubacija pri 37 C. Med inkubacijo pride do vezave analita iz vzorca na protitelesa, označena z magnetnimi delci in do vezave konjugata alkalne fosfataze na kompleks analit-protitelesa z magnetnimi delci. Med njimi nastane encimski kompleks imenovan 'sendvič' imunokompleks.

• Ločevanje: Po inkubaciji sledi ločevanje komponent s tehnologijo Magtration®, kjer pride do ločitve vezane in nevezane frakcije ter odstranitve odvečnih nevezanih protiteles. Magnetni delci se sprva vežejo na notranje stene pipete in s tem povzročijo ločitev prostih komponent od komponent, vezanih na magnetne delce.

• Encimska reakcija: Očiščenemu encimskemu kompleksu se doda kemiluminiscentni substrat, ki reagira z alkalno fosfatazo v nestabilen vmesni produkt in pri prehodu v osnovno stanje odda energijo v obliki fotonov.

• Detekcija: Fotone zazna fotopomnoževalka, ki je vgrajena v analizator Pathfast.

Aparat izvaja merjenje luminiscence pri 461 nm. Izmerjen signal je sorazmeren koncentraciji PCT v vzorcu, katero se določi s standardno umeritveno krivuljo (43, 44, 45).

Slika 3: Princip metode Pathfast (povzeto po (43))

3.2. MATERIALI

Raziskavo smo izvedli na analizatorju Pathast proizvajalca Mitsubishi chemical Mediance Corporation. Uporabili smo reagenčni komplet, sestavljen iz kalibratorjev, reagenčnih kartuš ter raztopine za raztapljanje. Delo smo opravljali v skladu z navodili v priročniku za operaterje analizatorja in v času dela opravili potrebne kalibracije, kontrole kakovosti in čiščenje.

REAGENČNA KARTUŠA

Kartuša z reagenti ima 16 vdolbin. Prva je prazna in namenjena nanosu vzorca, sedem vdolbin je napolnjenih z reagenti potrebnimi za izvedbo analize, preostalih osem pa je praznih. Vse razen 1 in 10 so prekrite z zaščitno aluminijasto folijo in označene s črtno kodo ter imenom analizirane snovi. Zaščitne aluminijaste folije se ne odstranjuje. Kartuše z reagenti so pripravljene za uporabo, potrebno jih je shranjevati pri temperaturi 2–8 C.

Prazne vdolbine kartuše: #1,6,8,910,12,14,15,16 Polne vdolbine kartuše: #2,3,4,5,7,13,11

#2: monoklonska protitelesa označena z alkalno fosfatazo, MES pufer

#3,4,5: pufer za izpiranje, natrijev azid, MES pufer

#7: monoklonska protitelesa označena z magnetnimi delci

#11: pufer za redčenje vzorcev, HEPES pufer

#13: kemiluminiscentni substrat CDP-Star (45)

Slika 4: Reagenčna kartuša analizatorja Pathfast (povzeto po (42))

KALIBRATORJI

Uporabili smo kalibrator 1, ki je že pripravljen za uporabo in kalibrator 2, ki ga je potrebno raztopiti v topilu, v našem primeru v destilirani vodi. Izvedli smo dvotočkovno kalibracijo.

Kalibracijo je potrebno opraviti najmanj vsakih 28 dni in ob uporabi reagenčne kartuše z novo serijsko (LOT) številko. Kalibratorje se shranjuje pri temperaturi 2–8 C.

KONTROLE

Kontrole kakovosti smo uporabili po kalibraciji za preverjanje ustreznosti kalibracijske krivulje. Kontrole kakovosti je potrebno izvajati na vsake 3 dni. V primeru padca vrednosti izven območja je potrebno kalibracijo ponoviti.

3.3. OPIS POSTOPKA ANALIZE

Najprej smo si pripravili delovno mesto, pripomočke in materiale za izvedbo analize.

Pripravili smo si stojalo za vzorce, ki jih je potrebno analizirati in stojalo, namenjeno za vzorce po analizi ter s tem preprečili podvajanje meritev. Počakali smo, da se vzorci odtalijo in jih nato premešali na centrifugirki. Pripravili smo si stojalo analizatorja za reagenčne kartuše in vanj vstavili 6 kartuš, vsako v svojo režo. Pred začetkom izvedbe analize smo v

sistem analizatorja ročno vnesli številčne oznake vzorcev pacientov. Tik pred uporabo vzorca smo le tega na rahlo premešali in nato s kapalko napolnili vdolbino reagenčne kartuše do črte v vdolbini, ki je nakazovala na ustrezno napolnjenost vdolbine. To je ustrezalo 100 μl vzorca. Po nanosu šestih vzorcev, vsakega v svojo reagenčno kartušo, smo stojalo vstavili v analizator in vanj dodali nastavke za pipetiranje. Na koncu smo zaprli vrata analizatorja

In document UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO (Strani 18-0)