UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NINA ČIŽMAN
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NINA ČIŽMAN
POMEN KONCENTRACIJE PROKALCITONINA V SERUMU PRI PACIENTIH OKUŽENIH S SARS-COV-2 SIGNIFICANCE OF PROCALCITONIN SERUM LEVELS IN
PATIENTS WITH SARS-COV-2 INFECTION
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2022
Magistrsko nalogo sem opravljala na Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani, na Kliničnem inštitutu za kemijo in biokemijo, pod mentorstvom prof. dr. Joška Osredkarja, mag. farm., spec. med. biokem., višjega svetnika.
ZAHVALA
Zahvaljujem se svojemu mentorju prof. dr. Jošku Osredkarju, mag. farm., spec. med.
biokem., višjemu svetniku za vso pomoč, nasvete in vodenje pri pisanju magistrske naloge.
Iskreno se zahvaljujem svojim staršem, mami Darji in očetu Marjanu ter bratu Alešu, ker preprosto verjamete vame. Hvala za vse vzpodbudne besede, pomoč in podporo tekom študija. Hvala tudi tebi dragi Aleks, da mi vedno stojiš ob strani, brezmejno verjameš vame ter me spodbujaš na moji življenjski poti.
Zahvaljujem se tudi vsem prijateljem in sošolcem za nepozabna študentska leta in prečudovite spomine.
Brez vas mi ne bi uspelo.
IZJAVA
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja prof. dr.
Joška Osredkarja, mag. farm., spec. med. biokem.
Nina Čižman
Predsednik komisije: prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm.
Član komisije: doc. dr. Rok Frlan, mag. farm.
I
KAZALO VSEBINE
POVZETEK ... IV ABSTRACT ... V SEZNAM OKRAJŠAV ... VI
I. UVOD ... 1
1. EPIDEMIOLOGIJA BOLEZNI COVID-19 ... 1
1.1. IZVOR VIRUSA SARS-COV-2 ... 1
2. OPIS VIRUSA SARS-COV-2 ... 1
2.1. TAKSONOMIJA KORONAVIRUSOV ... 1
2.2. ZGRADBA, SESTAVA IN GENOM ... 2
2.3. STRUKTURNI IN NESTRUKTURNI PROTEINI ... 2
2.4. VSTOP VIRUSA V CELICO ... 3
3. KLINIČNI POTEK BOLEZNI ... 4
3.1. KLASIFICIRANJE OKUŽBE GLEDE NA KLINIČNI POTEK BOLEZNI... 4
3.2. PRENOS VIRUSA IN ŠIRJENJE OKUŽBE ... 5
3.3. POTEK BOLEZNI S SIMPTOMI ... 5
3.4. ODZIV ORGANIZMA NA OKUŽBO IN CITOKINSKA NEVIHTA ... 5
4. LABORATORIJSKI PARAMETRI ... 6
4.1. SPREMEMBE V LABORATORIJSKIH PARAMETRIH ... 6
4.2. D-DIMER ... 7
4.3. RAZMERJE MED NEVTROFILCI IN LIMFOCITI (NLR) ... 8
4.4. INTERLEVKIN 6 ... 8
4.5. C-REAKTIVNI PROTEIN ... 9
4.6. PROKALCITONIN ... 11
5. POINT OF CARE TESTING (POCT) ... 13
6. KLASIČNA LABORATORIJSKA METODA ... 14
II. NAMEN ... 16
III. MATERIALI IN METODE ... 17
1. KLINIČNO OKOLJE ... 17
2. ZBIRANJE VZORCEV IN OPIS SKUPINE PACIENTOV ... 17
3. DOLOČANJE KONCENTRACIJ PROKALCITONINA Z METODO PATHFAST ... 17
3.1. PRINCIP METODE ... 18
3.2. MATERIALI ... 20
3.3. OPIS POSTOPKA ANALIZE ... 21
4. DOLOČANJE PROKALCITONINNA Z METODO ADVIA CENTAUR XP ... 22
II
4.1. PRINCIP METODE ... 22
4.2. MATERIAL ... 23
4.3. OPIS POSTOPKA ANALIZE ... 23
5. STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ... 23
6. STATISTIČNE METODE ZA OVREDNOTENJE UJEMANJA REZULTATOV MED POCT IN KLASIČNO LABORATORIJSKO METODO ... 25
IV. REZULTATI ... 27
4.1. NORMALNOST PORAZDELITVE ... 27
4.2. OPISNA STATISTIKA ... 28
4.3. KORELACIJSKA ANALIZA ... 30
4.4. VPLIV POTEKA BOLEZNI NA PREUČEVANE KRVNE PARAMETRE ... 32
4.5. VREDNOTENJE UJEMANJA REZULTATOV POCT IN KLASIČNE LABORATORIJSKE METODE ... 39
V. DISKUSIJA ... 44
VI. SKLEP ... 50
VII. VIRI ... 51
KAZALO SLIK
Slika 1: Struktura virusa SARS-CoV-2 ... 3Slika 2: Analizator Pathfast ... 18
Slika 3: Princip metode Pathfast ... 20
Slika 4: Reagenčna kartuša analizatorja Pathfast ... 21
Slika 5: Potek koncentracij PCT in CRP glede na datum odvzema vzorca ... 35
Slika 6: Potek koncentracij PCT in IL-6 glede na datum odvzema vzorca ... 35
Slika 7: Potek koncentracij PCT in D-dimera glede na datum odvzema vzorca ... 36
Slika 8: Passing-Bablok regresijska analiza, primerjava POCT (Pathfast) in klasične laboratorijske metode (Advia Centaur XP) pri merjenju prokalcitonina ... 41
Slika 9: Passing-Bablok regresijska analiza, graf rezidualov, primerjava POCT (Pathfast) in klasične laboratorijske metode (Advia Centaur XP) pri merjenju prokalcitonina ... 42
Slika 10: Bland-Altmanova analiza, primerjava POCT (Pathfast) in klasične laboratorijske metode (Advia Centaur XP) pri merjenju prokalcitonina ... 43
III
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: P-vrednosti D'Agostino-Pearsonovega testa pred transformacijo ... 27
Preglednica II: P-vrednosti D'Agostino-Pearsonovega testa po transformaciji ... 28
Preglednica III: Vrednosti opisne statistike prokalcitonina, izmerjenega s Pathfast analizatorjem . 28 Preglednica IV: Vrednosti opisne statistike prokalcitonina, izmerjenega z Advia Centaur XP ... 28
Preglednica V: Vrednosti opisne statistike C-reaktivnega proteina ... 29
Preglednica VI: Vrednosti opisne statistike interlevkina 6 ... 30
Preglednica VII: Vrednosti opisne statistike D-dimera ... 30
Preglednica VIII: Korelacijski koeficienti opazovanih spremenljivk ... 31
Preglednica IX: Vrednosti izmerjenih koncentracij PCT, CRP, IL-6, D-dimera in NLR glede na datum odvzema vzorca pri prvem pacientu ... 32
Preglednica X: Vrednosti izmerjenih koncentracij PCT, CRP, IL-6, D-dimera in NLR glede na datum odvzema vzorca pri drugem pacientu ... 36
Preglednica XI: Vrednosti opisne statistike, delež vzorcev nad referenčnim območjem, mnogokratnik povišanja PCT-primerjava analizatorja Pathfast in Advia Centaur XP ... 39
Preglednica XII: Passing-Bablok regresijska analiza med analizatorjema Pathfast in Advia Centaur XP ... 40
Preglednica XIII: Bland-Altmanova analiza med metodama Pathfast in Advia Centaur XP ... 42
IV
POVZETEK
Decembra 2019 se je na Kitajskem prvič pojavil nov sev koronavirusa, imenovan SARS- CoV-2. Virus se je hitro razširil čez celoten svet ter povzročil več milijonov okužb in smrti.
Bolezen COVID-19 je lahko asimptomatska ali simptomatska z najpogosteje izraženim kašljem, vročino, oteženim dihanjem ter izgubo vonja in okusa. Pojavi pa se lahko tudi težja oblika bolezni, kjer je potrebno zdravljenje na intenzivni enoti. Za prepoznavanje kritično bolnih, spremljanje poteka bolezni, napovedovanje izida bolezni ter ocenjevanje uspešnosti zdravljenja je pomembna uporaba rutinskih laboratorijskih testov. V okviru magistrske naloge smo želeli preučiti pomen prokalcitonina pri pacientih okuženih s SARS-CoV-2.
Meritve PCT smo izvajali na analizatorju Pathfast in Advia Centaur XP na 112 vzorcih serumske krvi pacientov, hospitaliziranih na oddelku intenzivne enote diagnostično terapevtskega servisa. 71 % vzorcev je imelo koncentracijo PCT povišano nad referenčno območje (0,1 µg/L). Povprečna koncentracija PCT, izmerjena na analizatorju Pathfast je bila 2,3798 µg/L in 2,8446 µg/L na analizatorju Advia Centaur XP. Podrobneje smo preučili dva pacienta, kjer smo opazovali potek krvnih parametrov glede na datum odvzema vzorca.
Vrednosti PCT so se spreminjale s potekom bolezni, ob zapletih so se poviševale, ob izboljšanju zdravstvenega stanja pa zniževale. Ob bakterijski okužbi sta bila povišana predvsem PCT in CRP, ki sta se ob ustreznem antibiotičnem zdravljenju zniževala. Pred dodajanjem kisika sta bili povišani predvsem vrednosti IL-6 in CRP. PCT najbolje korelira s CRP, sledi IL-6 in najslabše z D-dimerom (Spearmanov koeficient: 0,507, 0,437 in 0,194).
Zaključimo lahko, da je PCT v kombinaciji z ostalimi v pomoč pri diagnosticiranju ter napovedovanju prognoze bolezni. Z napredovanjem tehnologije se je uveljavilo testiranje ob pacientu (POCT), ki je še posebej pomembno v enotah intenzivne medicine, saj omogoča takojšnjo razpoložljivost rezultata. Ujemanje rezultatov meritev PCT med POCT (analizator Pathfast) in klasično laboratorijsko metodo (analizator Advia Centaur XP) smo preverili s Passing-Bablok regresijsko analizo in Bland-Altmanovo analizo v programu MedCalc.
Spearmanov korelacijski koeficient med metodama znaša 0,986, kar označuje odlično korelacijo. Analizator Pathfast izmeri povprečno za 0,3527 µg/L nižje rezultate, do razlik med meritvama prihaja predvsem ob višjih koncentracijah. Metodi sta medsebojno primerljivi in zamenljivi.
Ključne besede: COVID-19, SARS-CoV-2, prokalcitonin, analizator Pathfast
V
ABSTRACT
In December 2019, a new strain of coronavirus called SARS-CoV-2 first appeared in China.
The virus has spread rapidly around the world, causing millions of infections and deaths.
The COVID-19 disease can be asymptomatic or symptomatic, with the most common symptoms being cough, fever, shortness of breath, and loss of smell and taste. A more severe form of the disease may also occur, requiring treatment in an intensive care unit. The use of routine laboratory tests is important to identify critically ill patients, monitor the course of the disease, predict the outcome of the disease and evaluate the effectiveness of treatment.
As part of the master's thesis, we aimed to study the significance of procalcitonin in patients infected with SARS-CoV-2. Procalcitonin measurements were performed using a Pathfast and Advia Centaur XP analyzer on 112 serum blood samples from patients hospitalized in the intensive care unit of the diagnostic and therapeutic service. In 71 % of the samples, the concentration of PCT was above the reference range (0.1 µg / L). The mean PCT concentration measured on the Pathfast analyzer was 2.3798 µg / L and 2.8446 µg / L on the Advia Centaur XP analyzer. We observed more closely two patients in whom we observed changes in blood parameters depending on the date of sampling. Values of the PCT changed with the progression of the disease, increasing as a result of complications and decreasing when the health condition improved. In the presence of bacterial infection, PCT and CRP were elevated, but decreased with appropriate antibiotic treatment. Elevated IL-6 and CRP levels indicated oxygen demands. The highest correlation is between PCT and CRP, followed by correlation with IL-6 and, finally, the lowest correlation with D-dimer (Spearman coefficient: 0.507, 0.437 and 0.194). We can conclude that PCT in combination with other blood parameters is helpful in diagnosis and prediction of the disease prognosis.
POCT is especially important in intensive care units, where it allows immediate availability of the result. We have confirmed the agreement of PCT measurements between POCT and the classical laboratory method with the Passing-Bablok regression analysis and Bland- Altman analysis. The Spearman's correlation coefficient between the methods is 0.986, indicating an excellent correlation. The Pathfast analyzer measures on average 0.3527 µg / L lower results, the differences between the measurements occur mainly at higher concentrations. The methods are comparable and interchangeable.
Key words: COVID-19, SARS-CoV-2, procalcitonin, Pathfast analyzer
VI
SEZNAM OKRAJŠAV
ACE2: angiontenzin konvertaza 2 (ang. angiotensin-converting enzyme 2) ALT: alanin aminotransferaza
APC: antigen predstavitvene celice (ang. antigen-presenting cells)
ARDS: sindrom akutne dihalne stiske (ang. acute respiratory distress syndrome) AST: aspartat aminotransferaza
ATP: adenozin tri-fosfat (ang. adenosine triphosphate)
CCP-1: kalcitonin karboksil terminalni peptid 1 (ang. calcitonin carboxyl-terminus peptide-1)
CD4+: celice T pomagalke CD8+: citotoksični limfociti T
CLEIA: kemiluminiscenčna encimska imunološka metoda
COVID-19: koronavirusna bolezen 2019 (ang. coronavirus disease 2019) CRP: C-reaktivni protein
DTS: diagnostično-terapevtski servis E protein: protein ovojnica
HIF1: s hipoksijo aktiviran faktor 1 (ang. hypoxia-inducible factor 1) HIF2: s hipoksijo aktiviran faktor 2 (ang. hypoxia-inducible factor 2) IL-1β: interlevkin 1 beta
IL-6: interlevkin 6
KIKKB: klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo LDH: laktat dehidrogenaza
M protein: protein membrana
MERS-CoV: virus bližnjevzhodnega respiratornega sindroma (ang. Middle East respiratory syndrome coronavirus)
N protein: protein nukleokapsida
N-PCT: N-terminalna sekvenca prokalcitonina (ang. N terminal region of procalcitonin) NLR: razmerje med nevtrofilci in limfociti (ang. neutrophil to lymphocyte ratio)
PAM: peptidglicin-alfa-amidirajoča monooksigenaza (ang. peptidylglycine α-amidating monooxygenase)
VII
PAMP: evolucijsko ohranjene strukture virusa (ang. pathogen-associated molecular patterns)
PCT: prokalcitonin
PLpro: papainu podobna proteaza (ang. papain-like protease) POCT: testiranje ob preiskovancu (ang. Point of care testing)
RDRP: od RNA odvisna RNA-polimeraza (ang. RNA-dependent RNA polymerase) PRP: receptorji za prepoznavanje vzorcev virusa (ang. pattern recognition receptors) RNA: ribonukleinska kislina (ang. Ribonucleic acid)
S protein: spike protein
SARS-CoV-2: virus hudega akutnega respiratornega sindroma 2 (ang. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)
SARS-CoV: virus hudega akutnega respiratornega sindroma (ang. severe acute respiratory syndrome coronavirus)
TNF-α: dejavnik tumorske nekroze alfa (ang. tumor necrosis factor alpha) UKC: univerzitetni klinični center
WHO: Svetovna zdravstvena organizacija (ang. World Health Organization)
ssRNA(+): enoverižna pozitivno polarna veriga RNA (ang. positive sense single-stranded ribonucleic acid)
3CLpro: glavna cistein proteaza (ang. 3C like protease)
1
I. UVOD
1. EPIDEMIOLOGIJA BOLEZNI COVID-19
1.1. IZVOR VIRUSA SARS-COV-2
Konec decembra 2019 so v kitajskem mestu Wuhan, v provinci Hubei zaznali več primerov pljučnic neznanega vzroka. Sprva so predvidevali, da je izvor okužbe tržnica z morskimi sadeži v Wuhanu, kasneje pa so ta predvidevanja ovrgli. Zaradi izključitve običajnih povzročiteljev respiratornih obolenj so lahko potrdili, da gre za okužbo z novim koronavirusom (1). Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) je 11. februarja 2020 virus poimenovala kot virus hudega akutnega respiratornega sindroma 2 (SARS-CoV-2), bolezen, ki jo virus povzroča, pa koronavirusna bolezen 2019 (COVID-19) (2). Virus se je hitro razširil po celem svetu, 2. 3. 2020 je bil zabeležen na šestih celinah in v 66 državah. Do tega dne je bilo na Kitajskem zabeleženih okoli 80 tisoč okužb, v ostalih državah po svetu pa okoli 10 tisoč okužb (1). Zaradi hitrega širjenja je Svetovna zdravstvena organizacija 11. 3.
2020 razglasila globalno pandemijo. V začetku novembra je bilo zabeleženih približno 45 milijonov okužb ter 1 milijon smrtnih primerov. Bolezen je prizadela tudi Slovenijo (3).
Strokovnjaki domnevajo, da SARS-CoV-2 izvira iz netopirjev, na ljudi pa se je prenesel preko vmesnega gostitelja, najverjetneje pangolina, ob njihovem tesnem stiku. Nadaljnji prenos virusa je potekal neposredno med ljudmi s kapljičnim ali kontaktnim prenosom (1,4).
2. OPIS VIRUSA SARS-COV-2
2.1. TAKSONOMIJA KORONAVIRUSOV
Koronaviruse uvrščamo v družino Coronaviridae, poddružino Orthocoronavirinae ter red Nidovirale. Delimo jih na štiri razrede, in sicer alfa in beta, ki izvirata iz naravnih gostiteljev netopirjev ter gama in delta, ki izvirata iz ptic in prašičev. SARS-CoV-2 predstavlja sedmi identificiran virus, s katerimi se lahko okuži človek. Seva HCoV-229E in HCoV-NL63 uvrščamo med alfakoronaviruse, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, virus bližnjevzhodnega respiratornega sindroma (MERS-CoV), virus hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV) in virus SARS-CoV-2 pa med betakoronaviruse (5). Genom SARS-CoV-2 si
2
s SARS-CoV in MERS-CoV deli okoli 82 % sekvenčne enakosti ter več kot 90 % enakosti za esencialne encime in strukturne proteine (6). Alfakoronavirusi ter virusa HCoV-HKU1 in HCoV-OC43 krožijo med živalmi in ljudmi že mnogo let ter povzročajo zgolj prehladna obolenja. Virusi SARS-CoV, SARS-CoV-2 in MERS-CoV, pa sodijo med nevarnejše viruse, saj povzročajo okužbe spodnjih dihal, katerim lahko sledi odpoved organov ali celo smrt (7). V primerjavi z do sedaj poznanimi koronavirusi, ki lahko okužijo ljudi, je za novi sev značilna blažja patogeneza, vendar višja raven prenosa, kar potrjuje kontinuirano naraščanje potrjenih okužb (5).
2.2. ZGRADBA, SESTAVA IN GENOM
SARS-CoV-2 je relativno velik virus okrogle oblike s premerom od 50 nm do 200 nm (8).
Genom virusa vsebuje enoverižno pozitivno polarno verigo RNA (ssRNA(+)), sestavljeno iz 30 kilobaz in ovito z membransko ovojnico z glikoproteinskimi bodicami v obliki krone (3). Celoten gemom kodira približno 7096 ostankov dolgega poliproteina, sestavljenega iz številnih strukturnih in nestrukturnih proteinov. Nukleotidna vsebina virusnega genoma je skladiščena predvsem v dveh nestrukturnih proteinih ORF1a in ORF1ab (6). Primerjava genoma SARS-CoV-2 s tesno povezanim SARS-CoV je pokazala zamenjavo v 27 aminokislinah, ki kodirajo zaporedje za beljakovino bodice, od tega je 6 zamenjav v domeni, ki se veže na receptor (5).
2.3. STRUKTURNI IN NESTRUKTURNI PROTEINI
SARS-CoV-2 virusni genom vsebuje štiri strukturne ter šestnajst nestrukturnih proteinov.
Najpomembnejši strukturni protein je spike protein (S), ki je odgovoren za vezavo na receptor angiontenzin konvertaza 2 (ACE2) na površini membrane gostiteljske celice.
Sestavljata ga dve funkcionalni podenoti S1, odgovorna za vezavo na receptor in S2, odgovorna za zlitje celične membrane in virusa. Spike protein novega seva koronavirusa se razlikuje od spike proteina pri SARS-CoV predvsem v dveh regijah, ki se vežeta z receptorjem ACE2. To je povzročilo, da predhodno odkrita zdravila z delovanjem na S protein pri novem sevu niso dovolj učinkovita. Poleg tega strukturnega proteina so prisotni še proteini membrane (M), nukleokapsida (N) ter ovojnica (E) (6). Protein E je sposoben oligomerizacije in lahko tvori dimere, trimere in pentamere. Pomembno vlogo ima pri združevanju posameznih delcev v končno obliko, sproščanju virusa iz celice ter ukrivljenosti membrane. Za tvorbo virusnega delca je poleg proteina E pomemben tudi M protein, za
3
katerega so značilne tri transmembranske domene. Protein N sodeluje pri zlaganju verige RNA (6,8).
Med najpomembnejše nestrukturne proteine sodijo od RNA odvisna RNA-polimeraza, ki je pomembna za replikacijo virusnega genoma (RDRP), papainu podobna proteaza (PLpro) in glavna cisteinska proteaza (3CLpro). Naloga PLpro in 3CLpro je razcep poliproteinov v manjše komponente za sestavo virionov ter s tem povezano stalno širjenje okužbe (7). Poleg zgoraj omenjenih funkcij nestrukturni proteini sodelujejo še pri transkripciji, predelavi beljakovin, aktivnosti endopeptidaze, transferaze, in eksoribonukleaze, vezavi ATP in cinkovih ionov. Zaradi pomembnosti teh encimov pri preživetju, replikaciji in širjenju virusa ta mesta predstavljajo tarče za terapevtsko zdravljenje z zdravili (6).
Slika 1: Struktura virusa SARS-CoV-2 (povzeto po (3))
2.4. VSTOP VIRUSA V CELICO
Virus SARS-CoV-2 v celico vdre tako, da prepozna receptor ACE2, ki je predvsem močno izražen v spodnjih dihalnih poteh, zlasti v pnevmocitih tipa 2. Virus se lahko razširi tudi na ostala tkiva v telesu, saj je ACE2 prisoten tudi v srcu, mehurju, žilnem endoteliju, ledvicah, koži in prebavnem traktu (2).Vstop virusa v gostiteljsko celico se prične z vezavo spike proteina na receptor ACE2 na plazemski membrani gostiteljske celice, čemur sledi zlitje
4
virusne in celične membrane. Po fuziji membran transmembranska serinska proteaza tipa 2 cepi in aktivira spike protein, kar vodi v konformacijske spremembe in s tem olajšan vstop virusa v celico.
V gostiteljski celici nato pride do sproščanja genoma v obliki ssRNA(+) (9). V okuženi celici se v predelu endoplazmatskega retikuluma tvorijo mehurčki z dvojno membrano, ki predstavljajo zaščito genomu in hkrati omogočajo podvajanje s pomočjo replikacijsko- transkripcijskega kompleksa (7). Sledi prevajanje dela RNA v nefunkcionalni virusni poliprotein, ki ga nato virusni proteazi PLpro in 3CLpro cepita v funkcionalne proteine.
Virusni genom se sintetizira z RNA replikacijo, stukturni proteini S, M, N in E pa s transkripcijo in translacijo. V Golgijevem aparatu in endoplazmatskem retikulumu tako nastanejo novi virioni, ki celico zapustijo z eksocitozo in z vezavo na novo gostiteljsko celico okužbo raznesejo po telesu (3).
Ob intenzivnem množenju in sproščanju virusa iz gostiteljske celice pride do vnetnega procesa. To privede do aktivacije okoliških celic endotelija, epitelija in makrofagov, ki začnejo izločati kemokine in citokine. Le-ti naprej privabljajo monocite, limfocite, dendritične celice in makrofage, vse skupaj pa vodi do vedno večjega vnetja v pljučih (7).
3. KLINIČNI POTEK BOLEZNI
3.1. KLASIFICIRANJE OKUŽBE GLEDE NA KLINIČNI POTEK BOLEZNI Glede na program za preprečevanje in obvladovanje koronavirusne bolezni je stopnja bolezni klasificirana na 4 skupine: blaga, zmerna, huda in kritična. K blagi okužbi sodi asimptomatski ali potek z blagimi znaki okužbe, brez neobičajnih sprememb v prsnem košu.
Zmerna okužba je definirana kot okužba s kliničnimi znaki in pridruženimi spremembami prsnega koša. Resni potek bolezni označuje povišana frekvenca dihanja z ≥ 30 vdihov na minuto ali nasičenost krvi s kisikom ≤ 93 % v stanju mirovanja ali delni tlak kisika/delež vdihanega kisika ≤ 300 mmHg (10). Kritični potek bolezni pa se pojavi ob hitrem napredovanju bolezni s pridruženo odpovedjo organov, ki zahteva oskrbo na intenzivni enoti. Lahko se pojavi tudi šok ali respiratorna odpoved, ki zahteva mehansko predihavanje.
Posebno nevarnost predstavlja tiha hipoksemija, kjer pride do zmanjšanja zasičenosti krvi s kisikom ter do obsežnejših poškodb pljuč, kljub temu, da bolnik težkega dihanja ne občuti, saj ga uravnava s hitrim in globokim dihanjem (4, 10).
5 3.2. PRENOS VIRUSA IN ŠIRJENJE OKUŽBE
Virus se med ljudmi prenaša predvsem kapljično, tako da s kihanjem, kašljanjem ali pospešenim dihanjem okužene osebe preide v stik s sluznico nosu, oči ali ust zdrave osebe.
Kužne kapljice ob tem padejo tudi na površine, kar pomeni, da se virus prenaša tudi preko stika z okuženim predmetom in nato vnosom virusa v nos, oči ali usta. Okužba se najpogosteje širi med ljudmi, ki so med seboj v tesnem stiku, predvsem v zaprtih prostorih.
Reprodukcijsko število prenosa okužbe novega koronavirusa (oktober 2020) znaša 2,2, tako povprečno ena okužena oseba naprej okuži dva do tri zdrave ljudi (7, 11).
Osebe so kužne od dva dni pred pojavom simptomov in do deset dni od začetka bolezni, največjo kužnost pa predstavljajo prvi dnevi okužbe, saj se virus takrat najintenzivnejše množi. Inkubacijska doba traja od 1 do 14 dni, v povprečju 5 dni (12).
3.3. POTEK BOLEZNI S SIMPTOMI
Bolezen COVID 19 se po simptomih bistveno ne razlikuje od ostalih virusnih bolezni.
Približno 80 % okuženih ima blažji potek bolezni (12), ki ga običajno spremljajo suh kašelj, vročina, dispneja, izguba vonja in okusa ali pa manj pogosti simptomi, kot so: slabost, bruhanje, driska, omedlevica, boleče grlo in glava (10). Ostalih 20 % okuženih prizadene težji potek bolezni, pri čemer jih 5 % potrebuje zdravljenje na intenzivnem oddelku (12). Pri otrocih bolezen večinoma poteka v blažji obliki in brez zapletov, pri starejših s pridruženimi kroničnimi boleznimi pa lahko pride do hujšega poteka bolezni z okužbo spodnjih dihalnih poti (1). Težji potek spremlja pljučnica ali sindrom akutne dihalne stiske (ARDS), za katerega je značilno razširjeno vnetje pljuč, ki se kaže kot dispneja, tahipneja in cianoza.
Lahko pride tudi do zastoja srca, sepse ali celo do večsistemske odpovedi organov in smrti (2,7).
Virusna okužba s SARS-CoV-2 je potrjena z mikrobiološkim testiranjem z odvzemom iz zgornjih (žrelo, nosno-žrelni prostor) ali spodnjih dihal (aspirat traheje, izkašljan sputum) (1).
3.4. ODZIV ORGANIZMA NA OKUŽBO IN CITOKINSKA NEVIHTA
Vstop virusa v telo sproži stimulacijo imunskega odziva gostitelja z namenom zajezitve okužbe, a čezmerna in nekontrolirana aktivacija lahko vodi v težji potek bolezni. Prvo linijo obrambe proti virusnim delcem predstavlja nespecifičen prirojen imunski odziv z antigen
6
predstavitvenimi celicami (APC) – dendritične celice in makrofagi. APC na svoji površini vsebujejo receptorje PRP, ki prepoznajo evolucijsko ohranjene strukture virusa (PAMP) kot so: dvoverižna RNA, glikoproteini, lipoproteini, ostanki ogljikovih hidratov. SARS-CoV-2 običajno prepoznajo Tollu podobni receptorji (ang. Toll-like receptors), Nodu podobni receptorji (ang. nucleotide-binding oligomerization domainlike receptors) in Rigu podobni receptorji (ang. retinoic acid-inducible gene-I like receptors). Po aktivaciji receptorjev vsak izmed njih sproži ustrezno signalno pot (9). Po vstopu virusa v telo okužene celice pričnejo sproščati citokine ter privabljati alveolarne makrofage, prav tako pa pride do aktivacije okoliških epitelijskih in endotelijskih celic. Le-te nadaljnje sproščajo vnetne citokine, predvsem interlevkin 6 (IL-6) in interlevkin 1 beta (IL-1β) ter kemokine, ki na mesto vnetja privabljajo monocite, nevtrofilce in dendritične celice (13). Prirojenemu imunskemu odzivu po enem tednu sledi aktivacija specifičnega pridobljenega imunskega odziva. Celice T pomagalke (CD4+) aktivirajo citotoksične limfocite T (CD8+), kar vodi v apoptozo okuženih celic, prav tako pa aktivirajo limfocite B, kar potrjuje nastanek protiteles IgM, IgG in IgA. Vedno večja sekrecija citokinov vodi v nepovratne poškodbe pljučnega tkiva in sindroma akutne respiratorne stiske. Temu lahko sledi odpoved večih organov, septični šok in smrt. Opisan pojav nenadzorovanega sproščanja citokinov povzroči sistemski vnetni odziv, ki ga imenujemo citokinska nevihta in je pri bolnikih, okuženih s SARS-CoV-2 povezan s težjim potekom bolezni in tveganji za smrtni izid (13,14).
4. LABORATORIJSKI PARAMETRI
4.1. SPREMEMBE V LABORATORIJSKIH PARAMETRIH
Za oceno bolnikovega zdravstvenega stanja se uporabljajo rutinski laboratorijski testi, ki zajemajo kemične, biokemične in hematološke označevalce. Spremenjeni laboratorijski parametri niso specifični samo za virusne okužbe in njihove izmerjene vrednosti ne zadostujejo za potrditev okužbe s SARS-CoV-2. Uporabni pa so za spremljanje poteka bolezni, ocenjevanje uspešnosti zdravljenja, napovedovanje izida bolezni in za ločevanje med hudo in blago okužbo. Prav tako se uporabljajo skupaj z diagnostičnimi slikanji za boljšo oceno stanja vpletenosti bolezni v spodnje dihalne poti, saj pridobivanje vzorcev spodnjih dihalnih poti ni vedno možno (15). Pri kritično bolnih so napram bolnikom z blažjim potekom bolezni COVID-19 izmerili povišane vrednosti označevalcev prirojenega
7
imunskega sistema, kot so C-reaktivni protein (CRP), razmerje med nevtrofilci in limfociti (NLR), interlevkin 6 (IL-6) in serumski feritin, ter znižane vrednosti označevalcev pridobljenega imunskega sistema – limfocitov in njihovih podskupin (celice CD3+,CD4+, CD8+). Različni avtorji razlagajo, da do zmanjšanega števila limfocitov vodi apoptoza inducirana z vztrajno povišano ravnjo citokinov. Pri bolnikih s težjim potekom bolezni je moč zaznati tudi povišane vrednosti označevalcev poškodb tkiv in organov, kot so jetrni encimi (ALT, AST), laktat dehidrogenaza (LDH), označevalcev delovanja ledvic (sečnina, kreatinin, kreatinin kinaza) in označevalcev delovanja miokarda (troponin 1). Ta opažanja je mogoče razložiti s poškodbo organov zaradi vezave na receptorje ACE2, ki se poleg pljuč nahajajo tudi v ledvicah, srcu, arterijah in črevesju, možna pa je tudi poškodba organov zaradi sistemskega vnetja in hipoksije, kot posledica citokinske nevihte. Poleg zgoraj naštetih je za težji potek bolezni značilno tudi povišanje koncentracij prokalcitonina (PCT) in D-dimera ter podaljšan protrombinski čas (16). Učinkovitost in specifičnost večjo od 50
% so za COVID-19 pokazali zgolj trije označevalci in sicer IL-6, CRP ter znižano število limfocitov (15). Po drugi strani pa je analiza Coxovega modela sorazmernega tveganja pokazala, da se lahko IL-6, CRP in PCT uporabijo kot neodvisni dejavniki za napovedovanje resnosti COVID-19 (17).
4.2. D-DIMER
Kljub temu, da je COVID-19 predvsem respiratorna bolezen, lahko prizadane več organskih sistemov ter povzroči motnje v strjevanju krvi. D-dimer je razgradnji produkt fibrina in se pogosto uporablja kot biomarker za trombotične motnje. Vrednosti, manjše od 500 μg/L, se štejejo za normalne, povečujejo pa se s starostjo in nosečnostjo. Najpogostejši razlog za povišane vrednosti D-dimera pri pacientih, okuženih s SARS-CoV-2, sta virusna okužba in sindrom citokinske nevihte (18). Vnetje in nenadzorovano sproščanje citokinov vodi do poslabšanja fibrinolize, vnetnih sprememb endotelijskih celic ter vpliva na koagulacijsko homeostazo. Prav tako hipoksija sama vodi v aktivacijo signalnih poti odvisnih od transkripcijskih faktorjev (HIF1 in HIF2) ter tako vpliva na koagulacijsko homeostazo, zmanjšuje nastanek trombomodulina in tako povzroča protrombotične spremembe (19). Pri bolnikih z znatno povečanimi vrednosti D-dimera so odkrili pogoste motnje v strjevanju krvi ter mikrotrombotične tvorbe v perifernih krvnih žilah, verjetno pa so povišane vrednosti povezane tudi s pljučno embolijo, miokardnim infarktom, odpovedjo dihanja in smrtjo (20).
8
4.3. RAZMERJE MED NEVTROFILCI IN LIMFOCITI (NLR)
Glavno naravno obrambo organizma proti okužbam predstavljajo levkociti ali bele krvne celice. Levkociti se delijo na limfocite, monocite in granulocite (nevtrofilci, bazofilci, eozinofilci). Nevtrofilni granulociti predstavljajo približno 60 % levkocitov pri odrasli osebi in pri obrambi organizma sodelujejo v sklopu prirojene imunosti. Glavni cilj delovanja nevtrofilcev je fagocitoza tujih celic (21). Limfociti so obrambne celice pridobljene specifične imunosti. Pri bolnikih s kritičnim potekom COVID-19 so ugotovili neustrezen odziv pridobljenega imunskega sistema na okužbo, kar nakazujejo znižane ravni limfocitov (16). Limfociti na svoji površini izražajo receptorje ACE2, zato lahko pride do neposredne okužbe in lize teh celic. Prav tako apoptozo limfocitov spodbujajo povišane ravni interlevkinov in dejavnika tumorske nekroze alfa (TNF-α), do katerih pride pri težjem poteku bolezni (22). Pri bolnikih s hudo obliko COVID-19 so ugotovili izrazito povišanje vrednosti NLR. Spremljanje krvnih vrednosti NLR omogoča vpogled v delovanje prirojenega in pridobljenega imunskega sistema in je tako v pomoč pri napovedovanju kliničnega poteka bolezni, saj povišane vrednosti korelirajo s slabšim kliničnim izidom (16).
4.4. INTERLEVKIN 6
Vsak izmed interlevkinov ima svojo funkcijo, skupna pa jim je medcelična komunikacija, usklajevanje razvoja in aktivnosti imunskega sistema ter uravnavanje celične rasti in gibljivosti (23). Kot primarni sprožilec citokinskih neviht in dejavnik tveganja za napredovanje poteka COVID-19 se je izmed interlevkinov uveljavil IL-6 z referenčno vrednostjo 0-16,4 pg/ml (24). Gre za večnamenski citokin s pomembno vlogo koordiniranja prirojenega in pridobljenega imunskega sistema, saj vpliva na zorenje makrofagov, diferenciacijo in zorenje limfocitov T in B ter s tem na izločanje imunoglobulinov.
Interlevkin 6 inducira sproščanje CRP ter ostalih proteinov akutne faze (25). Prav tako ima pomembno vlogo pri uravnavanju presnove, homeostazi celic in organov, razvoju in preživetju živcev, hematoloških boleznih ter vzdrževanju različnih vrst raka. Biokemično ga uvrščamo v razred štiri-spiralnih citokinov. Deluje preko receptorja za IL-6, izraženega na celični površini, ki se ob nasičenju poveže s signalnim receptorjem za glikoprotein130, ki nato postane dimeriziran in s tem sproži znotrajcelično signalizacijo. Čeprav se IL-6 večinoma obravnava kot vnetni citokin ima tudi zaščitno in regenerativno funkcijo (26).
9 4.5. C-REAKTIVNI PROTEIN
C-reaktivni protein je beljakovina akutne faze vnetja, ki se primarno proizvaja v jetrih v odgovor na povišane ravni vnetnih citokinov, predvsem IL-6. Poleg jetrnih hepatocitov se lahko proizvaja tudi v makrofagih, endotelijskih celicah, gladkih mišičnih celicah in adipocitih. Po sestavi je homopentamerni glikoprotein sestavljen iz petih enakih nekovalentno povezanih enot, ki so enakomerno razporejene okoli centralne pore. Glavni induktor gena za CRP, ki ga najdemo na kromosomu 1 je IL-6, IL-1 ter TNF-α pa še dodatno okrepita njegovo delovanje. V prisotnosti kalcija se CRP veže na polisaharide, kot je npr.
fosfoholin in s tem sproži aktivacijo komplementa prirojene imunosti. CRP ima pomembno vlogo pri vnetnih procesih in imunskem odgovoru gostitelja, saj poleg aktivacije komplementa sodeluje tudi pri apoptozi, fagocitozi, sprostitvi dušikovega oksida (27).
Prednosti merjenja CRP v zdravniški praksi:
• Visoka negativna napovedna vrednost in visoka občutljivost.
• Ločevanje med virusno in bakterijsko infekcijo.
• Hiter padec vrednosti ob ustrezni antibiotični terapiji omogoča spremljanje uspešnosti terapije in poteka bolezni.
• Hitra meritev za katero zadostuje majhna količina krvi (28).
Slabosti merjenja CRP v zdravniški praksi:
• Ni specifičen pokazatelj okužbe, saj se vrednosti povišajo tudi pri operativnih posegih, vnetjih in poškodbah tkiva (29).
Pri zdravih osebah so njegove vrednosti praviloma nizke in ne presegajo 5 mg/L. Med vnetne dražljaje, ki zvišajo koncentracijo CRP sodijo virusne ter bakterijske infekcije, poškodbe in vnetja tkiva ter kirurški posegi. Koncentracija v plazmi začne naraščati 6 ur po okužbi in svoj vrh doseže po 48 urah. Pri virusnih okužbah je njegova koncentracija v krvi le rahlo zvišana, pri bakterijskih infekcijah pa se njegova koncentracija lahko poveča za več 100 x (28). Za virusne okužbe so značilne vrednosti 10-20 mg/L. Na lokalizirano bakterijsko infekcijo lahko posumimo pri koncentraciji 40 mg/L, vrednosti nad 100 mg/L pa z veliko
10
gotovostjo napovedujejo bakterijsko okužbo. Pri zelo invazivnih bakterijskih okužbah ali pri sepsi vrednosti dosežejo tudi 500 mg/L. Koncentracije CRP v krvi so povišane tudi pri nekrozah ter pri neinfekcijskih vnetnih boleznih (29). Merjenje koncentracij CRP se uporablja za razlikovanje med virusno in bakterijsko okužbo, saj so pri virusni koncentracije v krvi veliko nižje kot pri bakterijski. Prav tako se uporablja pri spremljanju uspešnosti terapije zdravljenja z antibiotiki, pri določitvi postoperativnih zapletov in pri terapevtskem spremljanje poteka revmatične bolezni (28).
Vrednosti virusnih infekcij:
• prehlad: 10 mg/L,
• infekcija zgornjih dihalnih poti: 10 mg/L,
• pljučnica: 10–20 mg/L,
• virusni meningitis: 10–20 mg/L.
Vrednosti bakterijskih infekcij:
• vnetje srednjega ušesa: 10–40 mg/L,
• tonzilitis: 30–60 mg/L,
• pljučnica: 80–200 mg/L,
• pielonefritis: 60–200 mg/L,
• bakterijski meningitis: 80–200 mg/L.
Vrednosti pri nekrozah:
• miokardni infarkt: 10–30 mg/L,
• rakava obolenja: 10–40 mg/L.
Vrednosti neinfekcijskih vnetnih bolezni:
• akutni pankreatitis: 10–30 mg/L,
• sistemski lupus eritemaozus: 10–20 mg/L,
• revmatoidni artritis: 30–200 mg/L (28).
11 4.6. PROKALCITONIN
Prokalcitonin je beljakovina akutne faze vnetja, sestavljena iz 116 aminokislin z molekulsko maso približno 13 kilodaltonov (kDa) in razpolovnim časom do 30 ur. Je predhodnik hormona kalcitonina, ki nastaja v C celicah ščitnice in je odgovoren za zniževanje vrednosti kalcija v odgovor na hiperkalciemijo. Običajno se sintetizira in sprošča iz C celic ščitnice, lahko pa se sintetizira tudi v nevroendokrinih celicah pljuč, jeter in prebavil. Na sintezo v ostalih tkivih lahko sklepamo tudi zato, ker je koncentracija prokalcitonina lahko povišana kljub normalnim ravnem kalcitonina (30). Dvig vrednosti nad referenčno območje (0,1 µg/L) opazimo predvsem pri bakterijskih okužbah, saj bakterijski endotoksini predstavljajo najmočnejši dražljaj za izločanje PCT. Ob vnetnih pogojih se PCT izloča iz adipocitov (31).
Do povišanja serumskih koncentracij pride tudi pri okužbi z virusom SARS-CoV-2, večina študij pa nakazuje na to, da močno povišane vrednosti predstavljajo 5 x večje tveganje za pojav težje oblike bolezni COVID-19 (10).
PCT je sestavljen iz treh sekcij, imenovanih: N-terminalna sekvenca (N-PCT), nezreli kalcitonin in kalcitonin karboksil terminalni peptid 1 (CCP-1) imenovan tudi katakalcin.
PCT kodira gen CALC-1, ki je lokaliziran na kromosomu 11. Ob cepitvi na enem mestu primarnega prepisa gena CALC-1 nastane pre-PCT. Ta se nato premakne v endoplazmatski retikulum, kjer pride do proteolitičnega odcepa signalnega peptida z endopeptidazo in s tem do nastanka PCT (32).
Ob odsotnosti okužbe je transkripcija gena CALC1 za PCT v ne-nevroendokrinih tkivih zavrta, razen v C celicah ščitnične žleze, kjer zaradi izražanja gena pride do nastanka prokalcitonina, prekurzorja kalcitonina pri zdravih posameznikih. Iz nastalega PCT sledi encimski odcep N-PCT dela in nato še CCP-1 dela, kjer nato ostane samo nezreli kalcitonin.
Z odcepom C-terminalnega glicina iz nezrelega kalcitonina s pomočjo peptidglicin-alfa- amidirajoče monooksigenaze (PAM) nastane zrel kalcitonin in manjši peptidi (30). Zrel kalcitonin se shranjuje v sekretornih granulah in nato izloča v kri z namenom uravnavanja koncentracij kalcija. Ob prisotnosti mikrobiološke infekcije, pa tudi ne-nevroendokrina tkiva izražajo gen za CALC-1. Tako pride do znatno povečane ekspresije gena CALC-1 in s tem produkcije PCT tudi v ostalih, zunaj ščitničnih tkivih, kot so vranica, jetra, ledvice, trebušna slinavka, pljuča, debelo črevo in maščoba. Ta tkiva niso sposobna proizvesti zrelega kalcitonina, saj verjetno citokini onemogočajo proteolizo PCT do kalcitonina. To nakazuje
12
na zmožnost povišanja vrednosti PCT pri okužbah ob hkrati normalnih vrednostih kalcitonina (33).
Najmočnejši dražljaj za izločanje PCT predstavlja sistemski učinek bakterijskih endotoksinov. PCT je v serumu zdravih prostovoljcev prvič detektiran štiri ure po intravenskem vbrizganju bakterije Escherichia coli. Najvišjo vrednost doseže po šestih urah in tako ostane zvišan do 24 ur. Nato prične padati in v dveh dneh doseže izhodiščno vrednost (30).
Pri zdravih posameznikih je koncentracija PCT v krvi manjša od 0,1 µg/L, saj se skoraj ves PCT pretvori v kalcitonin. Serumske koncentracije PCT med 0,5 in 3 µg/L veljajo za nizke, vrednosti med 3 in 30 µg/L za visoke, vrednosti nad 30 µg/L pa za zelo visoke. Pri hudih bakterijskih okužbah in organskih odpovedih, lahko vrednosti dosežejo tudi 100–1000 µg/L (31).
Rahlo povišane vrednosti PCT lahko izmerimo pri različnih virusnih in glivičnih okužbah, alergijah ter rakavih obolenjih, vendar le-te praviloma ne presegajo 0,5 µg/L. Izjeme z višjimi izmerjenimi koncentracijami so C celični karcinom ščitnice in drugi nevroendokrini tumorji, kot feokromocitom in drobnocelični karcinom. Do povišanih ravni pride tudi pri sindromu sistemskega vnetnega odziva, povzročenega s travmami, operacijami ali opeklinami, vendar v primerjavi z bakterijskimi infekcijami dvig ni tako visok in dolgotrajen (30). Povišanje vrednosti opazimo tudi v prvih dneh po presaditvi organov, predvsem ledvic in jeter z gibanjem koncentracij PCT med 3–5 µg/L. Povišane koncentracije po presaditvi organov lahko opozarjajo na možno zavrnitev organa ali bakterijsko infekcijo. Za razliko od do sedaj omenjenih primerov, pa pri sepsi lahko pride do več stokrat preseženih normalnih koncentracij PCT. Vrednosti PCT v serumu bolnikov s sepso se gibljejo v območjih med 0,5 –3.5 µg/L, pri bolnikih s hudo sepso med 3–10 µg/L ter pri bolnikih s septičnim šokom med 8–16 µg/L. Višja kot je koncentracija PCT, bolj resen je zaplet in bolj prizadeti bodo organi, zato lahko glede na koncentracijo ocenjujemo resnost zapleta in razplet okužbe. Meritve PCT se izvajajo tudi pri boleznih osrednjega živčevja z namenom ločevanja virusnega in bakterijskega meningitisa (34).
VREDNOSTI PROKALCITONINA
• normalna vrednost: < 0,05 µg/L,
• lokalno vnetje: < 0,5 µg/L,
13
• lokalizirana okužba s sistemskimi znaki vnetja: 0,5-2 µg/L,
• sistemski odziv, možnost sepse in odpovedi organov: 2-10 µg/L,
• hud sistemski odziv, prisotnost sepse in odpoved organov: > 10 µg/L.
PROKALCITONIN DOLOČAMO PRI:
• sumu na sepso v primeru nizke koncentracije C-reaktivnega proteina,
• klinični sliki septičnega šoka ali hude sepse,
• meningitisu, če s preiskavo likvorja ne izključimo bakterijske okužbe,
• febrilni nevropatiji,
• neinfekcijskih boleznih s povišano vrednostjo CRP in prisotnostjo znakov sistemskega vnetnega odziva (34).
Merjenje PCT je v pomoč pri razlikovanju med virusno in bakterijsko okužbo ter lokalno in sistemsko bakterijsko okužbo. Pri virusnih in lokaliziranih okužbah so vrednosti značilno nižje, višje pa nakazujejo na sistemski vnetni odgovor in s tem razširitev okužbe naprej po telesu. V primeru dalj časa trajajočega povišanja PCT ali izrazitejšega porasta njegove koncentracije to nakazuje na dodatni zaplet in razširitev okužbe po telesu (31). Prav tako je spremljanje PCT v pomoč pri vodenju antibiotične terapije. Ob ustrezni izbiri antibiotika je pričakovan 50 % padec vrednosti PCT dnevno, če vrednosti ne padajo, terapija ne učinkuje.
Ob 80–90 % padcu od najvišje izmerjene vrednosti je varno prekiniti z antibiotično terapijo (35). Številne študije so pokazale, da je uporaba antibiotikov na podlagi spremljanja vrednosti PCT zmanjšala izpostavljenost antibiotikom in z njimi povezanih neželenih učinkov, brez sprememb v kliničnih izidih (32).
5. POINT OF CARE TESTING (POCT)
Klinično-kemijske raziskave so se do nedavnega izvajale zgolj v laboratoriju, z razvojem tehnologije analiznih postopkov na prenosnih aparatih pa se je testiranje premaknilo bližje k pacientu (36). Laboratorijsko testiranje ob preiskovancu, kjer gre za preiskave biološkega materiala človeškega telesa, izvedene izven tradicionalnega medicinskega laboratorija imenujemo POCT (37). Pogosto ga opišejo sinonimi, kot so: testi ob pacientu, testi ob postelji, analiza ob postelji, analiza ob pacientu, hitri testi, testi na domu (36). Tako kot testiranja v medicinskem laboratoriju, morajo tudi ta testiranja potekati v skladu s predpisi
14
in standardi za vzdrževanje ustrezne kakovosti. Namen uporabe POCT analizatorja je pridobiti laboratorijsko kakovostne rezultate v najkrajšem možnem času, kar v primerjavi z laboratorijem pomeni takojšnjo razpoložljivost rezultata analize. To je še posebej pomembno v enotah za nujno medicinsko pomoč, oddelkih za intenzivno medicino, intervencijskih enotah in operacijskih sobah, ko je pacientovo zdravje ogroženo. Poleg naštetih se POCT analizatorji uporabljajo še v lekarnah, zdravstvenih domovih, sprejemnih ambulantah, mobilnih zdravstvenih enotah, rešilcu in na domu pacienta (37). Testiranje se izvaja s pomočjo majhnih, prenosnih analizatorjev, enostavnih za uporabo. Dobljeni rezultati so v pomoč pri hitrejši triaži pacientov, pri diagnosticiranju, spremljanju odziva na zdravljenje in napovedovanju izida bolezni (38).
Prednosti in slabosti preiskav ob bolniku:
Prednosti:
• enostavna izvedba testov, ni potrebe po laboratorijsko usposobljenem osebju, pacient si lahko meritve napravi tudi sam,
• kratek čas obdelave vzorca, krajši čas od vzorčenja do končnih rezultatov, hitrejše zdravniške odločitve,
• za analizo zadostujejo majhni volumni vzorca,
• transport do laboratorija ni potreben.
Slabosti:
• premajhna usposobljenost osebja lahko vodi v napake,
• slabša ponovljivost,
• POCT analiza je dražja,
• težje primerljivo z rezultati klasične laboratorijske metode (39).
6. KLASIČNA LABORATORIJSKA METODA
Za kvantitativno določanje PCT so se v laboratorijih uveljavile imunokemijske metode, katerih značilnost je visoka analitska občutljivost, raznolikost in specifičnost.
Imunokemijske metode temeljijo na reakciji med protitelesom in antigenom, ki skupaj tvorita kompleks in s tem omogočita kvantitativno določanje analita (40). Prvi komercialno dostopen test je bil BRAHMS PCT LIA – luminometrični imunološki test, ki temelji na
15
vezavi dveh antigen specifičnih protiteles na PCT (antigen), pri čemer je eno protitelo označeno z luminiscenčnim barvilom. Kasneje je na trg prišel hitrejši in občutljivejši avtomatiziran test, znan kot BRAHMS PCT Kryptor, imunofluorescenčni test, ki je bil kot prvi odobren s strani FDA leta 2008 za diagnostiko sepse in septičnega šoka (41). V diagnostiki jih lahko uporabimo za merjenje prostega antigena, protiteles ali celic, pri čemer je eden označen z označevalcem, ki je lahko encim ali luminiscenčna snov. Ločimo različne načine detekcije, in sicer: fluorescenčno, luminiscenčno, spektrofotometrično, nefelometrično in turbidimetrično. V primeru merjenja protitelesa ali antigena le-ta nastopata kot analit, lahko pa nastopita tudi kot biokemijski reagent za merjenje ostalih molekul. Na ustreznost rezultatov, ki jih dobimo z imunokemijskimi metodami, vplivajo lastnosti antigena in protitelesa (specifičnost, afiniteta) ter priprava biološkega vzorca (40).
16
II. NAMEN
V okviru magistrske naloge bomo:
Ovrednotili pomen določanja prokalcitonina pri pacientih z okužbo SARS-COV-2. Naš cilj je ugotoviti, kakšna je diagnostična vrednost prokalcitonina, in ali ima tudi prognostični pomen.
Preučili, kakšne so vrednosti prokalcitonina glede na potek in težavnost okužbe ter dobljene rezultate primerjali z ostalimi pokazatelji vnetja. Želimo preveriti, kako rezultati PCT korelirajo z IL-6, CRP in D-dimerom.
Izvedli analize prokalcitonina v serumski krvi na dveh analizatorjih, in sicer PATHFAST in Advia Centaur XP. Naš cilj je preveriti ujemanje rezultatov med POCT in klasično laboratorijsko metodo.
17
III. MATERIALI IN METODE
1. KLINIČNO OKOLJE
Raziskavo smo izvedli v UKC Ljubljana v obdobju oktober 2020 – junij 2021. Pacienti z okužbo SARS-CoV-2 so bili hospitalizirani na oddelku intenzivne enote diagnostično- terapevtskega servisa (DTS). Biološki material pacientov je bil poslan v laboratorije Kliničnega inštituta za klinično kemijo in biokemijo (KIKKB), kjer so bile izvedene vse rutinske analize, vključno z meritvami IL-6, CRP ter D-dimera. Analize so bile izvedene po standardnih postopkih z ustrezno kontrolo kakovosti. Meritve PCT smo izvedli v R&R laboratoriju na Polikliniki.
2. ZBIRANJE VZORCEV IN OPIS SKUPINE PACIENTOV
Za namen naloge smo izbrali 112 vzorcev serumske krvi v starostni skupini od 41 do 86 let, pri čemer je 62 vzorcev pripadalo osebam moškega spola in 50 osebam ženskega spola.
Povprečna starost preiskovancev je bila 69 let, povprečna ležalna doba pa 34 dni (Dovoljenje Republiske komisije za medicinsko etiko: 0120-60/2021/5). Vsi vzorci so bili odvzeti s strani medicinskega osebja v epruvete brez dodatka z rdečim zamaškom ob prihodu na oddelek ter nato vsakodnevno v primeru hospitalizacije. V primeru hujšega poteka bolezni je bila kri nekaterim pacientom odvzeta tudi večkrat dnevno. Vzorce so po odvzemu krvi analizirali na analizatorju Advia Centaur XP in jih kasneje shranili pri temperaturi –20°C. Vsak vzorec je bil označen s črtno kodo, vpisan v računalniški sistem ter v zvezek za lažji pregled. V mesecu aprilu smo s pomočjo računalniškega sistema LIS izbrali 112 vzorcev, katerim je bila predhodno izmerjena koncentracija na analizatorju Advia Centaur XP. Izbrali smo vzorce raznolikih koncentracij, od najnižjih do najvišjih, jih poiskali v laboratoriju ter jim s pomočjo analizatorja Pathfast izmerili serumske koncentracije prokalcitonina.
3. DOLOČANJE KONCENTRACIJ PROKALCITONINA Z METODO PATHFAST
Pathfast analizator je popolnoma avtomatiziran kemiluminiscenčni imunoanalizator, ki spada v skupino POCT namiznih analizatorjev. Je majhen, lahek, enostaven za uporabo in
18
ne zahteva dodatne usposobljenosti osebja. Ima vgrajen zaslon na dotik, preko katerega z njim upravljamo, črtalnik kod, računalnik in tiskalnik, s pomočjo katerih se natisnejo dobljeni rezultati meritev. Omogoča analizo 6 enakih vzorcev hkrati in rezultate znotraj 17 minut. Analiziramo lahko vzorec seruma, plazme in polne krvi, pri čemer hemoliza ne vpliva na rezultate testiranja (42). Zagotavlja visoko točnost, natančnost ter ponovljivost rezultatov, ki korelirajo z laboratorijskimi analizami.
Slika 2: Analizator Pathfast (povzeto po (43))
Tehnične specifikacije analizatorja :
• Metoda: kemiluminiscenčna encimska imunološka metoda (CLEIA) in MAGTRATION® tehnologija,
• Vzorci: plazma, serum, polna kri,
• Volumen vzorca: 100 μl,
• Merilno območje: 0,020 – 100 ng/ml,
• Število vzorcev: do 6 hkrati,
19
• Čas merjenja: manj kot 17 minut za 6 vzorcev,
• Temperatura reakcije: 37 °C,
• Shranjevanje podatkov: do 1000 pacientov (43).
3.1. PRINCIP METODE
Analizator Pathfast združuje kemiluminiscenčno encimsko imunološko metodo (CLEIA) in patentirano tehnologijo Magtration®. Postopek poteka v štirih spodaj opisanih stopnjah.
• Imunoreakcija: Najprej se pacientovemu vzorcu doda monoklonska protitelesa proti PCT, označena z alkalno fosfatazo in protitelesa proti PCT, označena z magnetnimi delci. Sledi petminutna inkubacija pri 37 C. Med inkubacijo pride do vezave analita iz vzorca na protitelesa, označena z magnetnimi delci in do vezave konjugata alkalne fosfataze na kompleks analit-protitelesa z magnetnimi delci. Med njimi nastane encimski kompleks imenovan 'sendvič' imunokompleks.
• Ločevanje: Po inkubaciji sledi ločevanje komponent s tehnologijo Magtration®, kjer pride do ločitve vezane in nevezane frakcije ter odstranitve odvečnih nevezanih protiteles. Magnetni delci se sprva vežejo na notranje stene pipete in s tem povzročijo ločitev prostih komponent od komponent, vezanih na magnetne delce.
• Encimska reakcija: Očiščenemu encimskemu kompleksu se doda kemiluminiscentni substrat, ki reagira z alkalno fosfatazo v nestabilen vmesni produkt in pri prehodu v osnovno stanje odda energijo v obliki fotonov.
• Detekcija: Fotone zazna fotopomnoževalka, ki je vgrajena v analizator Pathfast.
Aparat izvaja merjenje luminiscence pri 461 nm. Izmerjen signal je sorazmeren koncentraciji PCT v vzorcu, katero se določi s standardno umeritveno krivuljo (43, 44, 45).
20
Slika 3: Princip metode Pathfast (povzeto po (43))
3.2. MATERIALI
Raziskavo smo izvedli na analizatorju Pathast proizvajalca Mitsubishi chemical Mediance Corporation. Uporabili smo reagenčni komplet, sestavljen iz kalibratorjev, reagenčnih kartuš ter raztopine za raztapljanje. Delo smo opravljali v skladu z navodili v priročniku za operaterje analizatorja in v času dela opravili potrebne kalibracije, kontrole kakovosti in čiščenje.
REAGENČNA KARTUŠA
Kartuša z reagenti ima 16 vdolbin. Prva je prazna in namenjena nanosu vzorca, sedem vdolbin je napolnjenih z reagenti potrebnimi za izvedbo analize, preostalih osem pa je praznih. Vse razen 1 in 10 so prekrite z zaščitno aluminijasto folijo in označene s črtno kodo ter imenom analizirane snovi. Zaščitne aluminijaste folije se ne odstranjuje. Kartuše z reagenti so pripravljene za uporabo, potrebno jih je shranjevati pri temperaturi 2–8 C.
Prazne vdolbine kartuše: #1,6,8,910,12,14,15,16 Polne vdolbine kartuše: #2,3,4,5,7,13,11
#2: monoklonska protitelesa označena z alkalno fosfatazo, MES pufer
21
#3,4,5: pufer za izpiranje, natrijev azid, MES pufer
#7: monoklonska protitelesa označena z magnetnimi delci
#11: pufer za redčenje vzorcev, HEPES pufer
#13: kemiluminiscentni substrat CDP-Star (45)
Slika 4: Reagenčna kartuša analizatorja Pathfast (povzeto po (42))
KALIBRATORJI
Uporabili smo kalibrator 1, ki je že pripravljen za uporabo in kalibrator 2, ki ga je potrebno raztopiti v topilu, v našem primeru v destilirani vodi. Izvedli smo dvotočkovno kalibracijo.
Kalibracijo je potrebno opraviti najmanj vsakih 28 dni in ob uporabi reagenčne kartuše z novo serijsko (LOT) številko. Kalibratorje se shranjuje pri temperaturi 2–8 C.
KONTROLE
Kontrole kakovosti smo uporabili po kalibraciji za preverjanje ustreznosti kalibracijske krivulje. Kontrole kakovosti je potrebno izvajati na vsake 3 dni. V primeru padca vrednosti izven območja je potrebno kalibracijo ponoviti.
3.3. OPIS POSTOPKA ANALIZE
Najprej smo si pripravili delovno mesto, pripomočke in materiale za izvedbo analize.
Pripravili smo si stojalo za vzorce, ki jih je potrebno analizirati in stojalo, namenjeno za vzorce po analizi ter s tem preprečili podvajanje meritev. Počakali smo, da se vzorci odtalijo in jih nato premešali na centrifugirki. Pripravili smo si stojalo analizatorja za reagenčne kartuše in vanj vstavili 6 kartuš, vsako v svojo režo. Pred začetkom izvedbe analize smo v
22
sistem analizatorja ročno vnesli številčne oznake vzorcev pacientov. Tik pred uporabo vzorca smo le tega na rahlo premešali in nato s kapalko napolnili vdolbino reagenčne kartuše do črte v vdolbini, ki je nakazovala na ustrezno napolnjenost vdolbine. To je ustrezalo 100 μl vzorca. Po nanosu šestih vzorcev, vsakega v svojo reagenčno kartušo, smo stojalo vstavili v analizator in vanj dodali nastavke za pipetiranje. Na koncu smo zaprli vrata analizatorja (varnostni mehanizem) in pritisnili gumb START za začetek analize. Analiza je potekla po zgoraj opisanem postopku. Po končani analizi je sledil samodejni izpis rezultatov, nato pa smo odprli vrata analizatorja ter odstranili porabljene pipete in reagenčne kartuše.
4. DOLOČANJE PROKALCITONINNA Z METODO ADVIA CENTAUR XP
V UKC Ljubljana se kot standardni operativni postopek za določanje koncentracije prokalcitonina uporablja analizator Advia Centaur XP proizvajalca Siemens. Temelji na imunokemijski metodi dvojnega sendviča z uporabo direktne kemiluminiscence.
Tehnične specifikacije analizatorja:
• Metoda: imunokemijska metoda dvojnega sendviča z uporabo direktne kemiluminiscence,
• Vzorec: serum, plazma z dodatkom EDTA, plazma z dodatkom heparina,
• Volumen vzorca: 100 μL,
• Čas merjenja do rezultata prvega vzorca: 18 minut, nato vsakih 15 sekund,
• Merilno območje: 0,02–75 μg/L (46, 47).
4.1. PRINCIP METODE
Test je sestavljen iz treh reagentov: reagent trdne faze, pomožni reagent ter Lite reagent.
Trdna faza vsebuje s fluoresceinom označeno monoklonsko protitelo, ki je kovalentno vezano na paramagnetne delce-oksidirane kristale železa, ki jih privlači magnetno polje.
Med inkubacijo se le-te vežejo na tarčo. Pomožni Ancillary reagent vsebuje dve protitelesi, ki sta označeni s fluoresceinom in usmerjeni proti PCT. Kot kemiluminiscenčni označevalec se uporablja na Lite reagent vezan arkidinijev ester, ki se kovalentno veže na protitelo.
Arkidinijev ester se oksidira z vodikovim peroksidom, pri tem pa se spremeni PH območje iz kislega v bazično (maksimiziranje svetlobne emisije-oddajanja svetlobe). Oksidacija
23
poteče hitro z vrhom svetlobne emisije znotraj 1 sekunde. Na koncu aparat izvede detekcijo svetlobnega signala ter izmeri intenziteto relativnih svetlobnih enot (RLU), ki nastanejo med reakcijo. RLU signal je izračunan iz kalibracijske krivulje in je premosorazmeren koncentraciji analita (48).
4.2. MATERIAL REAGENTI
Proizvajalec: Siemens
- Primarni reagent: reagent trdne faze (Solid Phase), - Pomožni reagent: Ancillary reagent,
- Lite reagent,
- Wash 1 za izpiranje, - Kisli in bazični reagent.
KALIBRATORJI Proizvajalec: Siemens
Kalibracija je potrebna ob vsaki menjavi serijske (LOT) številke primarnega reagenta, najmanj vsakih 28 dni, ob padcu kontrol kakovosti izven dovoljenega območja ter ob vsakih večjih posegih v sistem. ADVIA Centaur XP zahteva dvotočkovno kalibracijo.
4.3. OPIS POSTOPKA ANALIZE
Sistem avtomatsko izvaja naslednje po vrstnem redu navedene korake:
• pipetiranje 100 µl vzorca v kiveto, inkubacija 15 sekund,
• pipetiranje 45 µl reagenta Ancillary, inkubacija 5,75 minut pri 37 °C,
• pipetiranje 100 µl reagenta trdne faze (Solid Phase) in 50 µl reagenta Lite, inkubacija 18 minut pri 37 °C,
• sledi separacija, aspiracija in izpiranje kivete z Wash 1 reagentom,
• pipetiranje 300 µl kislega in 300 µl bazičnega reagenta v kiveto, za sprožitev kemiluminiscentne reakcije,
• detekcija svetlobnega signala in pridobivanje rezultatov (49).
24
5. STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV
Za namen naloge smo uporabili v prilogi 1 prikazane podatke: vrednosti PCT izmerjenega s POCT in klasično laboratorijsko metodo, mnogokratnike povečanja vrednosti PCT izven referenčnega območja, število dni hospitalizacije, vrednosti CRP, IL-6 ter D-dimera. Za obdelavo podatkov smo uporabili računalniški program Microsoft Office Excel in program MedCalc.
Statistično analizo smo začeli s testom normalnosti porazdelitve. Uporabili smo D'Agostino- Pearsonov test. Testirali smo ničelno hipotezo, ki pravi, da se vrednosti porazdeljujejo normalno, nasprotno pa alternativna hipoteza trdi, da se vrednosti ne porazdeljujejo normalno. Kadar dobimo vrednost p > 0,05 sprejmemo ničelno hipotezo, kadar pa je vrednost p < 0,05 ničelno hipotezo zavržemo in sprejmemo alternativno hipotezo.
Normalnost porazdeljevanja vpliva na nadaljnjo izbiro bodisi parametričnih bodisi neparametričnih testov. Testom normalnosti porazdelitve je sledil izračun parametrov opisne statistike.
Poleg tega smo izračunali tudi delež vzorcev, katerih vrednosti presegajo referenčno območje ter povprečni mnogokratnik povišanja. Izračune smo uporabili za določanje diagnostične in prognostične vrednosti PCT.
Povezanost med dvema spremenljivkama smo preučili s korelacijsko analizo. Pearsonov korelacijski koeficient uporabljamo, kadar je porazdeljenost vrednosti normalna, kadar pa gre za nenormalno porazdeljevanje vrednosti, uporabljamo Spearmanov korelacijski koeficient. Odvisnost med spremenljivkami smo prikazali v tabelah spodaj.
Na koncu smo podrobnejše preučili spreminjanje krvnih parametrov glede na potek okužbe s SARS-CoV 2 pri dveh pacientih ter grafično prikazali spreminjanje parametrov v odvisnosti od datuma odvzema vzorca.
25
6. STATISTIČNE METODE ZA OVREDNOTENJE UJEMANJA REZULTATOV MED POCT IN KLASIČNO LABORATORIJSKO METODO
Vrednotenje ujemanja rezultatov je pomembno in se uporablja z namenom preverjanja ali na novo uvedena metoda, ki ima določene prednosti (enostavnost, hitrost izvedbe, volumen vzorca) zagotavlja primerljive rezultate referenčni metodi.
Za ovrednotenje ujemanja rezultatov meritev prokalcitonina dobljenih z analizatorjem Pathfast (POCT metoda) in analizatorjem Advia Centaur XP (klasična laboratorijska metoda) smo uporabili Bland-Altmanovo analizo ter Passing-Bablok regresijsko analizo.
PASSING-BABLOK REGRESIJSKA ANALIZA
Passing-Bablok regresijska analiza je neparametrična statistična metoda za ocenjevanje primerljivosti rezultatov meritev dveh metod. Uporabimo jo lahko kadar obstaja visoka raven korelacije ter ustrezna linearnost med meritvami, izmerjenimi z dvema analitskima metodama. Linearnost preverimo s Cusumovim testom linearnosti, pri čemer mora biti za ustrezno linearnost vrednost p > 0,05. V primeru vrednosti p < 0,05 med meritvami ni ustrezne linearne povezave in zato regresijska analiza ni primerna.
Enačba regresijske premice (y = a + bx) vsebuje koeficienta a in b, ki predstavljata a-odsek na ordinati in b-naklon premice.
Rezultate se podaja s 95 % intervalom zaupanja za koeficienta a in b. V primeru, da 95 % interval zaupanja za odsek na ordinati vključuje vrednost 0, stalna napaka med dvema metodama ni prisotna. Sorazmerna napaka pa ni prisotna, kadar 95 % interval zaupanja za naklon premice vključuje vrednost 1.
Za pravilno interpretacijo rezultatov je pomembna tudi velikost vzorca, n ≥ 50, saj se z manjšanjem vzorca veča 95 % interval zaupanja za odsek in naklon in s tem verjetnost, da vsebujeta vrednost 0 in 1 (50).
26 BLAND-ALTMANOVA ANALIZA
Bland-Altmanova analiza je grafična metoda za vrednotenje ujemanja rezultatov meritev dveh metod. Graf sestavljajo povprečja meritev, ki se nanašajo na abscisno os in pripadajoče razlike meritev, ki se nanašajo na ordinatno os. V primeru, da je ena izmed metod referenčna ali se uporablja kot zlati standard, je razlike meritev na ordinati mogoče prikazati tudi proti meritvam referenčne metode na abscisi.
Prisotnost sistematične napake ovrednotimo grafično iz povprečja razlik. Le ta je prisotna, kadar se povprečje razlik razlikuje od vrednosti 0 in statistično značilna kadar 95 % interval zaupanja ne vključuje vrednosti 0 (51).
27
IV. REZULTATI
V raziskavo je bilo vključenih 62 oseb moškega spola ter 50 oseb ženskega spola, kar skupno predstavlja 112 vzorcev serumske krvi, na katerih smo izvajali meritve. Rezultati analiz, uporabljenih v nalogi, so predstavljeni v prilogi 1.
4.1. NORMALNOST PORAZDELITVE
Najprej smo izvedli test normalne porazdelitve, saj smo želeli ugotoviti, ali se naši podatki porazdeljujejo normalno-simetrično, torej sledijo Gaussovi krivulji, ali se porazdeljujejo nesimetrično. Uporabili smo D'Agostino-Pearsonov test. Preverjali smo ničelno hipotezo, ki pravi, da se naši podatki porazdeljujejo normalno pri p > 0,05. Alternativna hipoteza pa pravi, da se podatki ne porazdeljujejo normalno in jo sprejmemo pri p < 0,05. Normalnost porazdelitve smo preverjali za spremenljivke: PCT izmerjen s POCT metodo, PCT izmerjen s klasično laboratorijsko metodo, CRP, IL-6 ter D-dimer in dobljene p vrednosti prikazali v preglednici I. Kadar porazdelitev ni normalna se poslužujemo transformacije podatkov z namenom zmanjševanja asimetrije.
Preglednica I: P-vrednosti D'Agostino-Pearsonovega testa pred transformacijo
Zaradi vrednosti p < 0,05 smo pri vseh spremenljivkah zavrgli ničelno hipotezo o normalnosti porazdelitve ter sprejeli alternativno, ki pravi, da se vrednosti porazdeljujejo nenormalno. Vrednosti smo logaritemsko transformirali in ponovno izvedli test normalnosti porazdelitve za zgoraj naštete spremenljivke in dobljene p vrednosti prikazali v preglednici II.
PCT, izmerjen s POCT metodo P < 0,0001
PCT, izmerjen s klasično laboratorijsko metodo P < 0,0001
CRP P = 0,0127
IL-6 P < 0,0001
D-dimer P < 0,0001
28
Preglednica II: P-vrednosti D'Agostino-Pearsonovega testa po transformaciji
Po transformaciji je bila vrednost p > 0,05 za logaritemsko transformiran D-dimer, kar pomeni, da se ta spremenljivka porazdeljuje normalno. Pri ostalih spremenljivkah je bila vrednost p < 0,05, torej se vrednosti kljub transformaciji ne porazdeljujejo normalno. Zaradi poenostavitve nadaljnjih testov smo se odločili uporabiti netransformirane vrednosti, kjer se vse spremenljivke porazdeljujejo nenormalno in naprej zato izvajali neparametrične teste.
4.2. OPISNA STATISTIKA
Testom normalnosti porazdelitve je sledil izračun parametrov osnovne statistike. Izračunali smo aritmetično sredino, njen interval zaupanja, minimalno in maksimalno vrednost, mediano in njen interval zaupanja. Izračunani parametri so prikazani v preglednici III, VI, V, VI in VII spodaj. Aritmetična sredina predstavlja povprečno vrednost, mediana središčno vrednost, interval zaupanja, ki ga določata njegova spodnja in zgornja meja, pa je interval, v katerem se s 95 % verjetnostjo nahaja opazovana spremenljivka.
Preglednica III: Vrednosti opisne statistike prokalcitonina, izmerjenega s Pathfast analizatorjem SPREMENLJIVKA PCT, izmerjen s POCT metodo
Število vzorcev 112
Minimalna vrednost 0,02000
Maksimalna vrednost 100,0000
Aritmetična sredina 3,2514
95 % interval zaupanja povprečne vrednosti Spodnja meja Zgornja meja
0,7241 5,7788
Mediana 0,3575
95 % interval zaupanja mediane Spodnja meja
Zgornja meja 0,2065 0,5299
PCT, izmerjen s POCT metodo P = 0,0029
PCT, izmerjen s klasično laboratorijsko metodo P = 0,0005
CRP P = 0,0002
IL-6 P = 0,0259
D-dimer P = 0,0731
29
Preglednica IV: Vrednosti opisne statistike prokalcitonina, izmerjenega z Advia Centaur XP SPREMENLJIVKA PCT, izmerjen s klasično laboratorijsko metodo
Število vzorcev 112
Minimalna vrednost 0,02000
Maksimalna vrednost 243,9200
Aritmetična sredina 5,0356
95 % interval zaupanja povprečne vrednosti Spodnja meja Zgornja meja
0,2553
9,8159
Mediana 0,3400
95 % interval zaupanja mediane Spodnja meja
Zgornja meja 0,2509 0,5130
Maksimalna izmerjena vrednost PCT z analizatorjem Pathfast je 100 µg/L, z analizatorjem Advia Centaur XP pa 243,92 µg/L zaradi razlik v merilnem območju obeh naprav. Zaradi boljše primerljivosti rezultatov, smo ti dve vrednosti izključili in ponovno izračunali parametre opisne statistike ter jih prikazali v preglednici XI. Mediana in aritmetična sredina sta po izbrisu dveh vrednosti bolj primerljivi.
Preglednica V: Vrednosti opisne statistike C-reaktivnega proteina SPREMENLJIVKA CRP
Število vzorcev 112
Minimalna vrednost 8,0000
Maksimalna vrednost 444,0000
Aritmetična sredina 140,8378
95 % interval zaupanja povprečne vrednosti Spodnja meja Zgornja meja
123,7492 157,9265
Mediana 133,0000
95 % interval zaupanja mediane Spodnja meja
Zgornja meja 98,0000 166,1189
