Slika 34: Izračunani vezavni modeli aktivnih triazinonov 4 (zgoraj), 9a (spodaj levo) ter 9b (spodaj desno) v vezavnem mestu za ATP na N-terminalni domeni človeške topo IIα (PDB:1ZXM).
Vizualizacija dobljenih sidranih poz je pokazala, da vse tri spojine tvorijo primerljive interakcijske vzorce, kar sovpada z izmerjenimi vrednostmi inhibitorne aktivnosti. Amidna skupina triazinonskega obroča spojin 4, 9a in 9b tvori vodikovo vez s karbonilnim kisikom aminokisline Asn120. Ta interakcija se je v prejšnjih računskih vezavnih študijah triazinonskih inhibitorjev topo IIα izkazala za pomembno, saj omogoča medmolekulsko
53
prepoznavanje tega kemijskega razreda (41,42). Nosilni triazinonski skelet se namreč veţe v adeninski del aktivnega mesta. Pri vseh treh spojinah opazimo tudi tvorbe dodatnih vodikovih vezi z vodama W924 ter W931.
Oba substituenta vezana na nosilni trizaninonski skelet, tj. biciklični element na mestu 6 ter 1-fluoro-3-(trimetil)benzenski substituent na mestu 4, lahko tvorita tako hidrofobne interakcije kot tudi vodikove vezi z aminokislinami vezavnega mesta (Slika 34).
Spojina 4 tvori H-vezi z aminokislinskima ostankoma Ser148 ter Ser149 v sladkornem delu ATP vezavnega ţepa, trifluorometilni in flouro substituent na R2 fenilnem obroču pa vodikovi vezi z Ala167 ter Lys168.
Izračunani sidrani pozi obeh triazinonov, ki sestavljata zmes produktov 9a/9b, sta podobno orientirani v aktivnem mestu (Slika 34). Spojina 9a s trifluorometilnim in flouro substituentom tvori vodikove vezi z ostanki Ser149, Asn167 ter Lyr168 sladkornega in fosfatnega dela. Pri spojini 9b pa klorov atom 5-kloro-3-metilbenzotiofenskega substituenta tvori interakcije z ostankom Asn150 sladkornega dela, medtem ko trifluorometilni in fluoro substituent na R2 fenilnem obroču tvorita H-vezi z Asn150 sladkornega in Lys167 fosfatnega dela vezavnega mesta. Bromov atom, prisoten v tej spojini kot del R2 substituenta, interagira z vezavnim mestom preko hidrofobnih interakcij.
Izračunani konformaciji spojini 9a/9b torej omogočata vzpostavitev več interakcij s tarčnim vezavnim mestom, spojina 9b celo nekoliko več kot 9a, kar je na prvi pogled v skladu z eksperimentalnimi opaţanji. Moramo pa vseeno poudariti, da prispevkov k celokupni prosti energiji vezave ne moremo natančno oceniti le z molekulskim sidranjem (npr. s cenilno funkcijo ali še bolj enostavnim štetjem opaţenih interakcij) (50). Zato bo za pridobitev dokončne informacije, katera izmed spojin v zmesi močneje zavre topo IIα, potrebno eksperimentalno ovrednotiti aktivnost vsake posamezne spojine ter izvesti fizično ločbo le-teh.
54
6. SKLEP
V sklopu magistrske naloge smo uspešno sintetizirali ter eksperimentalno ovrednotili nove predstavnike 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)-onov, ki delujejo kot katalitični zaviralci človeške DNA topo IIα, da bi razširili poznavanje odnosa med strukturo in delovanjem (SAR) tega obetavnega kemijskega razreda. Pri razvoju smo izhajali iz predhodno sintetiziranih spojin. Na obročnem mestu 4 smo obdrţali najobetavnejše substituirane benzilne fragmente, na mesto 6 pa uvedli nove biciklične substituente, ki smo jih izbrali iz serije sorodnih spojin farmacevtske druţbe Novartis. Z načrtovanimi spojinami smo ţeleli izboljšati zaviralno aktivnost ter optimizirati fizikalno-kemijske lastnosti.
Nosilni 1,3,5-triazin-2(1H)-onski obroč smo uspešno pripravili s kondenzacijo strukturno novih bicikličnih derivatov amidin izotiouree in etoksikarbonil izotiocianata. Na obročno mesto 4 smo nato pripeli benzilne substituente, ki so se predhodno izkazali za učinkovite.
Kljub temu, da smo v nekaterih primerih sintetizirali zmes dveh spojin, ki ju med seboj nismo uspeli ločiti, smo z različnimi spektroskopskimi in analitičnimi metodami (TLC, NMR in HRMS) uspeli potrditi identiteto vseh produktov.
Končnim produktom ter dobljenim zmesem smo z in vitro testom razpletanja kinetoplastne DNA določili zaviralno topo IIα aktivnost. Vse sintetizirane spojine in zmesi spojin so izkazovale boljšo zaviralno aktivnost kot referenčni etopozid ter predhodno sintetizirana izhodna spojina SAK-31, ki na mestu 6 ţe vsebuje biciklični substituent. Določili smo dobro zaviralno aktivnost vseh spojin z benzotiofenskim substituentom na mestu 6; še posebej pa so po aktivnosti izstopale spojine/zmesi z alkil bromidno skupino na mestu 2 benzotiofenskega obroča. Ker je alkil bromidna skupina reaktivna in bi lahko tvorila nespecifične kovalentne interakcije, bo potrebno pred nadaljnjimi zaključki vse zmesi s temi spojinami ločiti ter ovrednotiti zaviralno aktivnost vsake posamezne komponente.
Ločbo bi lahko poskusili izpeljati s semi-preparativno HPLC metodo. Po drugi strani so spojine 4, 5 in 6, ki so bile sintetizirane kot čiste snovi, ţe dobri kandidati za nadaljnje ovrednotenje njihovega protirakavega delovanja na celičnem nivoju.
Za izbrane aktivne triazinone smo izvedli tudi molekulsko sidranje v tarčno vezavno mesto za ATP na N-terminalni domeni topo IIα ter ugotovili, da triazinonski obroč pri vseh sidranih spojinah tvori ključno vodikovo vez s karbonilnim kisikom aminokisline Asn120.
55
Spojine so za R1 in R2 substituenta na mestih 4 in 6 izkazovale primerljive interakcijske vzorce s tarčnim ATP vezavnim mestom, kar sovpada z izmerjenimi vrednostmi topo IIα zaviralne aktivnosti. Nova spoznanja, pridobljena tekom predstavljenih raziskav, bodo uporabna pri nadaljnjem razvoju 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)-onskih zaviralcev kot potencialnih novih protirakavih učinkovin.
56
7. LITERATURA
(1) Serša G: Biološke in molekularne značilnosti malignih celic ter njihove tarče pri zdravljenju raka. Farmacevtski Vestnik 2009; 60: 43–47.
(2) Pirkmajer S: Patološka fiziologija, učbenik za študente farmacije, 2. izdaja. Univerza v Ljubljani - Medicinska fakulteta, Ljubljana, 2017: 53-70.
(3) Hanahan D, Weinberg RA: Hallmarks of cancer: The next generation. Cell 2011; 144:
646–674.
(6) Onkološki inštitut Ljubljana: Zdravljenje. Pridobljeno 17.10.2020, s strani https://www.onko-i.si/za-javnost-in-bolnike/zdravljenje.
(7) Drţavni program obvladovanja raka: Diagnostika in zdravljenje. Pridobljeno 17.10.2020, s strani http://www.dpor.si/diagnostika-in-zdravljenje/zdravljenje/.
(8) Borštnar S: Hormonsko zdravljenje raka, informativna knjiţica za bolnike, 1. izdaja.
Društvo onkoloških bolnikov Slovenije, Ljubljana, 2014: 1-45.
(9) Drţavni program obvladovanja raka: Zgodnje odkrivanje in presejanje. Pridobljeno 17.10.2020, s strani http://www.dpor.si/zgodnje-odkrivanje-in-presejanje/.
(10) Urbančič V: Kresnik prvencu Belo se pere na devetdeset Bronje Ţakelj. Pridobljeno 18.3.2021, s strani https://www.delo.si/kresnik/kresnik-prvencu-belo-se-pere-na-devetdeset-bronje-zakelj/.
(11) Ţakelj B: Belo se pere na devetdeset. Beletrina, Ljubljana, 2018: 159.
(12) Ussery DW: DNA Structure: A-, B- and Z-DNA Helix Families. Encyclopedia of Life Sciences, Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group, 2002: 1-7.
(13) Mirkin SM: DNA Topology: Fundamentals. Encyclopedia of Life Sciences, Nature Publishing Group, 2001: 1-11.
(14) Ghosh A, Bansal M: A glossary of DNA structures from A to Z. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography 2003; 59: 620–626.
57
(15) Microbenotes: Different forms of DNA - A form, B form, Z form. Pridobljeno 20.4.2021, s strani https://microbenotes.com/different-forms-of-dna-b-form-a-form-z-form/.
(16) Vologodskii AV: Circular DNA. Cyclic Polymers, Second Edition, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 2000: 47–83.
(17) Deweese JE, Osheroff MA, Osheroff N: DNA topology and topoisomerases.
Biochemistry and Molecular Biology Education 2009; 37: 2–10.
(18) Annunziato AT: DNA Packaging: Nucleosomes and Chromatin. Nature Education 2008; 1: 26.
(19) Shmoop: Dna Packaging. Pridobljeno 20.4.2021, s strani https://www.shmoop.com/study-guides/biology/dna/dna-packaging.
(20) Golov AK, Razin SV, Gavrilov AA: Nucleosomal packaging of eukaryotic DNA and regulation of transcription. Biopolymers and Cell 2014; 30: 413–425.
(21) Valjavec K, Bavcon S, Perdih A: DNA topoizomeraze pomembne tarče protirakavih zdravilnih učinkovin. Kemija v šoli in druţbi 2018, št. 1.
(22) Bates AD, and Maxwell A: DNA topology: Topoisomerases keep it simple. Current Biology 1997; 7: 778-781.
(23) Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J: The Role of Topoisomerases in DNA Replication. Molecular Cell Biology 4th edition, W. H.
Freeman, 2000.
(24) Nitiss JL: DNA topoisomerase II and its growing repertoire of biological functions.
Nature Reviews Cancer 2009; 9: 327–337.
(25) Pogorelčnik B, Janţič M, Perdih A: Zaviralci DNA topoizomeraze IIα – pomembne tarče protirakavih učinkovin. Farmacevtski vestnik 2015; 66: 326-333.
(26) Vávrová A, Šimůnek T: DNA topoisomerase IIβ: A player in regulation of gene expression and cell differentiation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2012; 44: 834–837.
(27) Schmidt BH, Osheroff N, Berger JM: Structure of a topoisomerase II-DNA-nucleotide complex reveals a new control mechanism for ATPase activity. Nature Structural and Molecular Biology 2012; 19: 1147–1154.
(28) Wei H, Ruthenburg AJ, Bechis SK, Verdine GL: Nucleotide-dependent domain movement in the ATPase domain of a human type IIA DNA topoisomerase. Journal of Biological Chemistry 2005; 280: 37041–37047.
58
(29) Broeck AV, Lotz C, Drillien R, Haas L, Bedez C, Lamour V: Structural basis for allosteric regulation of Human Topoisomerase IIα. Nature Communications 2021; 12:
2962.
(30) McClendon AK, Osheroff N: DNA Topoisomerase II, Genotoxicity, and Cancer.
Mutation research 2007; 623: 83-97.
(31) Laponogov I et al: Exploring the active site of the Streptococcus pneumoniae topoisomerase IV-DNA cleavage complex with novel 7,8-bridged fluoroquinolones.
Open Biology 2016; 6.
(32) Pogorelčnik B, Perdih A, Solmajer T: Recent Developments of DNA Poisons - Human DNA Topoisomerase IIα Inhibitors - as Anticancer Agents. Current Pharmaceutical Design 2013; 19: 2474–2488.
(33) Skok Ţ, Zidar N, Kikelj D, Ilaš J: Dual Inhibitors of Human DNA Topoisomerase II and Other Cancer-Related Targets. Journal of Medicinal Chemistry 2019; 63: 884–
904.
(34) Pilati P, Nitti D, Mocellin S: Cancer resistance to type II topoisomerase inhibitors.
Current Medicinal Chemistry 2012; 19: 3900-3906.
(35) Felix CA: Secondary leukemias induced by topoisomerase-targeted drugs.
Biochimica et Biophysica Acta 1998; 1400: 233-255.
(36) Minotti G, Menna P, Salvatorelli E, Cairo G, Gianni L: Anthracyclines: Molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity.
Pharmacological Reviews 2004; 56: 185-229.
(37) Pogorelčnik B, Perdih A, Solmajer T: Recent Advances in the Development of Catalytic Inhibitors of Human DNA Topoisomerase IIα As Novel Anticancer Agents.
Current Medicinal Chemistry 2013; 20: 694-709.
(38) Chène P et al: Catalytic inhibition of topoisomerase II by a novel rationally designed ATP-competitive purine analogue. BMC Chemical Biology 2009; 9: 1.
(39) Baenteli R, Chene P, Collingwood SP, Furet P, Meier P, Schoeper J: Use of 9H-purine-2,6-diamine derivatives in the treatment of proliferative diseases and novel 9H-purine-2,6-diamine derivatives. United States Patent, Patent number US 20070249639A1, date of patent Oct. 25, 2007.
(40) Pogorelčnik B, Brvar M, Zajc I, Filipić M, Solmajer T, Perdih A: Monocyclic 4-amino-6-(phenylamino)-1,3,5-triazines as inhibitors of human DNA topoisomerase IIα. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2014; 24: 5762-5768.
59
(41) Pogorelčnik B, Janeţič M, Sosič I, Gobec S, Solmajer T, Perdih A: 4,6-substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIα targeting the ATP binding site. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2015; 23: 4218-4229.
(42) Bergant K, Janeţič M, Valjavec K, Sosič I, Pajk S, Štampar M, Ţegura B, Gobec S, Filipič M, Perdih A: Structure-guided optimization of 4,6-substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIα. European Journal of Medicinal Chemistry 2019; 175: 330-348.
(43) Korošec A: Optimizacija in vrednotenje 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)-onov kot katalitičnih zaviralcev človeške DNA topoizomeraze IIα. Magistrska naloga, Ljubljana. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2019.
(44) PerkinElmer. ChemOffice+ Cloud Suite. Pridobljeno 5.8.2020, s strani https://perkinelmerinformatics.com/products/research/chemdraw/.
(45) Jones G, Willett P, Glen RC, Leach AR, Taylor R: Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking. Journal of Molecular Biology 1997; 267: 727-748.
(46) Wolber G, Langer T: LigandScout: 3-D Pharmacophores Derived from Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters. Journal of Chemical Information and Modeling 2005; 45: 160-169.
(47) Bergant K, Janeţič M, Perdih A: Bioassays and In Silico Methods in the Identification of Human DNA Topoisomerase IIα Inhibitors. Current Medicinal Chemistry 2018; 25: 1-33.
(48) Inspiralis. Human Topo II Alpha Decatenation Assay Protocol. Pridobljeno 15.6.2021, s strani https://www.inspiralis.com/assets/TechnicalDocuments/Human-Topo-II-Alpha-Decatenation-Assay-Protocol.pdf.
(49) WB Wu et al: Synthesis and evaluation of mansonone F derivatives as topoisomerase inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry 2011; 46: 3339–3347.
(50) Wang G, Zhu W: Molecular docking for drug discovery and development: A widely used approach but far from perfect. Future Medicinal Chemistry 2016; 8: 1707-1710.