Za sintezo načrtovanih spojin smo uporabili kemikalije proizvajalcev Acros, Apollo Scientific, Carlo Erba, Fluka, Fluorochem, Maybridge, Merck, Sigma-Aldrich in TCI.
3.2. Aparature in laboratorijska oprema
- Analizna tehtnica: Mettler Toledo PM400, Švica - Precizna tehtnica: Mettler Toledo AG245, Švica - Pipete: Brand, Schott
- Magnetno mešalo: IKA RCT basic, Nemčija - Rotavapor: Büchi 461 Water Bath, Švica - UV svetilka: Camag, Švica
3.3. Programska oprema
Za risanje reakcijskih shem, kemijskih struktur, računanje molekulskih mas produktov in poimenovanje spojin (po IUPAC-u) smo uporabili ChemDraw Professional 18.0 proizvajalca PerkinElmer. Tridimenzionalne strukture spojin smo generirali s programom Chem 3D proizvajalca CambridgeSoft (44).
S programom GOLD proizvajalca Cambridge Crystalographic Data Centre (CCDC) (45) smo aktivne molekule sidrali v ATP-vezavno mesto ATPazne domene človeške topo IIα.
Sledila je primerjava sidranih konformacij in vizualizacija, ki smo jo izvedli s programom LigandScout proizvajalca Inte:Ligand (46).
3.4. Analizne metode
3.4.1. Tankoplastna kromatografija (TLC)
Z metodo tankoplastne kromatografije (ang.: Thin layer chromatography, TLC) smo spremljali potek reakcij, iskali primerne mobilne faze za gravitacijsko »flash« kolonsko kromatografijo in določevali frakcije, v katerih se je po kolonski kromatografiji nahajala spojina, ki smo jo ţeleli izolirati. Uporabljali smo TLC ploščice proizvajalca Merck (Silica gel 60 F254, 20 cm × 20 cm). Spojine smo detektirali bodisi s pomočjo UV svetlobe
19
valovnih dolţin 254 nm in 366 nm ali pa smo TLC ploščico orosili z ustreznim orositvenim reagentom (Slika 13).
Slika 13: TLC ploščice s frakcijami pod valovno dolţino 254nm.
Kot mobilno fazo smo uporabljali zmes različnih organskih topil (etilacetat (EtOAc), heksan (hex), diklorometan (CH2Cl2), metanol (MeOH)) v ustreznih razmerjih.
3.4.2. Kolonska »flash« kromatografija
Kolonsko kromatografijo smo uporabili za čiščenje vmesnih spojin in končnih produktov.
Izvajali smo jo v steklenih kolonah, katerih velikosti smo določili glede na maso vzorca.
Za stacionarno fazo smo uporabili Silica Gel 60 proizvajalca Merck z velikostjo delcev 0,04–0,063 mm. Za mobilne faze smo uporabili mešanico organskih topil v ustreznih razmerjih (podrobno so opisane pri posameznih sinteznih postopkih).
Slika 14: Kolonska »flash« kromatografija.
20
3.4.3. Jedrska magnetnoresonančna spektroskopija (NMR)
Z NMR smo potrjevali identitete spojin in preverjali njihovo čistoto. 1H spektre spojin smo snemali na napravi Bruker AVANCE III 400 pri 400 MHz. Kot topili za raztapljanje vzorcev smo uporabili devteriran kloroform (CDCl3) ali devteriran dimetilsulfoksid (DMSO-d6). Kemijske premike (δ) smo podali glede na signal topila v enotah parts per million (ppm). Sklopitvene konstante (J) so podane v hertzih (Hz), vrhove pa smo označili z naslednjimi oznakami: singlet (s), široki singlet (br s), multiplet (m), dublet (d), triplet (t), kvartet (q), septet (sept), dublet dubleta (dd), dublet dubleta dubleta (ddd). Spektre smo obdelali s programom MestReNova proizvajalca Mestrelab Research S.L.
3.4.4. Masna spektrometrija (MS)
Masne spektre smo posneli na masnem spektrometru Q Exactive Plus proizvajalca Thermo Scientific s tehniko ionizacije z razprševanjem v električnem polju (ang.: Electrospray ionisation, ESI).
3.4.5. Ovrednotenje zaviralne aktivnosti z in vitro testom razpletanja kinetoplastne DNA, ki ga katalizira topo IIα
Test aktivnosti razpletanja človeške DNA topo IIα (angl. human DNA topo IIα mediated decantenation assay) smo uporabili za določevanje zaviralne aktivnosti testiranih spojin.
Človeška DNA topoizomeraza II je namreč encim, ki je sposoben razplesti dvovijačno molekulo DNA in tako poenostaviti njeno topologijo. Z izvajanjem testa smo ugotavljali, ali testirane spojine zavrejo delovanje encima topo IIα in s tem preprečijo razpletanje zvite DNA (47).
Za substrat smo uporabili kinetoplasto DNA (kDNA), ki je sestavljena iz mreţe številnih malih kroţnih DNA in nekaj velikih kroţnih DNA. Če je encim prisoten, mreţo kDNA lahko razplete in iz nje sprosti male kroţne molekule DNA. Po dodatku etidijevega bromida sproščene kroţne DNA na elektroforeznem gelu lahko zaznamo kot liso, ki je potovala navzdol. Če pa je bila topo IIα zavrta zaradi zaviralne aktivnosti testiranih spojin, je velik kDNA substrat ostal na začetku elektroforeznega gela (Slika 15) (47,48).
21
Slika 15: Princip testa razpletanja kataliziran s topo IIα in tipičen razvoj elektroforeznega gela. Prirejeno po viru (47).
Test razpletanja kDNA za sintetizirane triazinone so po uveljavljenem protokolu pri štirih koncentracijah spojine (7,8 μM, 15,6 μM, 31,25 μM in 125 μM) in v dveh ponovitvah izvedli v visokotehnološkem podjetju Inspiralis (Velika Britanija):
1 U encima (človeška DNA topo IIα) so inkubirali za 30 min z 200 ng kDNA v 30 µL reakcijski zmesi pri 37 °C. Zmes je vsebovala: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 0.1 mg/mL govejega serumskega albumina (BSA), 1 mM ATP. Spojine so bile dodane v reakcijsko zmes pred dodatkom encima.
Nato so reakcijo ustavili z dodatkom 30 µL kloroform/izoamil alkohola (26:1) in 30 µL STOP barvila, sestavljenega iz 40 % sukroze (w/v), 100 mM Tris-HCl (Ph 7,5), 10 mM EDTA in 0,5 μg/mL bromofenol modro. Na koncu so zmes nanesli na 1 % agarozni gel ter gel razvijali 2 uri pri napetosti 90 V. Lise, ki so nastale na gelu, so vizualizirali z uporabo barvila etidijev bromid (48).
Vse spojine, ki smo jih testirali, so imele čistoto, določeno s HPLC, višjo od 95 %.
22
3.4.6. Molekulsko sidranje aktivnih spojin v vezavno mesto za ATP na N-terminalni domeni človeške DNA topo IIα
Molekulsko sidranje izbranih aktivnih triazinonov 4
ter
9a in 9b smo izvedli na Kemijskem Inštitutu skupaj z mlado raziskovalko Barbaro Herlah. Uporabili smo razvit in preizkušen in silico računski protokol, ki ga povzemamo v nadaljevanju (42).Začetne 2D strukture izbranih spojin smo najprej narisali s programom ChemDraw Professional 20.1.1.125, njihove 3D konformacije pa generirali s programom Chem3D 20.1.1.125 (PerkinElmer) (44). Začetne konformacije 3D struktur smo z MMFF94 poljem sil geometrijsko optimizirali v istem programu do prevzetih pogojev konvergence.
Molekulsko sidranje smo izvedli s programom za sidranje GOLD (45) proizvajalca Cambridge Crystalographic Data Centre (CCDC) in z njim izračunali moţne vezane konformacije teh spojin v vezavnem mestu za ATP, ki se nahaja na N-terminalni domeni človeške DNA topo IIα. Uporabili smo en protomer te domene, ki je vseboval ţe vezan ligand - nehidrolizirajoči derivat ATP, AMP-PNP (PDB: 1ZXM). Ta kristalna struktura je javno dostopna v proteinski banki PDB (28).
Vezavno mesto človeške topo IIα za sidranje smo definirali kot sfero okoli referenčnega liganda AMP-PNP (koordinate središča krogle: x = 35,7113; y = 0,452; z = 40,0306), katere premer je bil 10 Å. V aktivnem mestu smo upoštevali dve molekuli vode, W924 ter W931, saj naj bi po dosedanjih modelih imeli pomembno vlogo pri vezavi molekule ATP v vezavno mesto tako, da vzpostavijo dodatne vodikove vezi med ligandom ter aminokislinami vezavnega mesta (42).
Kot iskalni algoritem smo uporabili genetski algoritem (GA) s prevzetimi nastavitvami ter cenilno funkcijo GoldScore za ocenitev energijske ugodnosti posamezne izračunane sidrane konformacije liganda. Vsako molekulo smo sidrali desetkrat v definirano aktivno mesto in rezultate sidranj vizualizirali in analizirali s programom LigandScout (46).
23