1. UVOD
1.2. Molekula DNA in njene topološke lastnosti
Deoksiribonukleinska kislina (DNA) je nosilka genetske informacije v vseh ţivih organizmih. DNA je nerazvejan polimer, katerega osnovna enota je nukleotid. Ima obliko dvojne vijačnice, pri čemer se dve molekuli DNA ovijeta ena okrog druge in tvorita stabilno tridimenzionalno obliko. Razpletanje teh dveh verig, ki je pomembno pri praktično vseh genskih procesih, je prav zaradi tega izjemno teţko (12,13).
1.2.1. Različne oblike DNA vijačnice
Poznamo tri najpomembnejše oblike DNA – A, B in Z (Slika 2). Omenimo še obliko H-DNA, kjer gre v osnovi za trojno vijačnico. Najpogosteje prisotna oblika je B-H-DNA, ki jo sestavljata dve desnosučni verigi, med seboj povezani z vodikovimi vezmi. Vodikove vezi, ki v pare povezujejo purinske in pirimidinske baze, so pravokotne na os molekule, kar vijačnici omogoča konstantno širino. A-DNA je širša desnosučna vijačnica s krajšo
6
razdaljo med osnovnimi pari (bolj sploščene oblike). Z-DNA oblika pa je prisotna kot levosučna dvojna vijačnica. Konformacije DNA molekule v organizmu se nekoliko razlikujejo od opisanih idealnih struktur. Ne moremo namreč z gotovostjo trditi, katero obliko bodo prevzela posamezna zaporedja nukleotidov (12,13,14).
V kateri konformaciji se bo DNA nahajala, je praviloma odvisno od sledečih treh pogojev.
Prvi pogoj je ionsko oz. hidracijsko okolje, ki olajša pretvorbo med različnimi vijačnimi oblikami. V primeru dehidracije je B-DNA podvrţena reverzibilni konformacijski spremembi v A-DNA, v okolju z veliko vsebnostjo soli pa se B-DNA pretvori v Z-DNA.
Drugi pogoj, ki pomembno vpliva na zvijanje, je DNK zaporedje. A-DNA se pogosteje izrazi pri purinskih in pirimidinskih ostankih v anti konformaciji, medtem ko se Z-DNA izrazi v primeru, ko purin in pirimidin izmenično zavzemata anti in syn konformacijo.
Tretji pogoj je prisotnost beljakovin, ki se lahko veţejo na DNA v eni vijačni konformaciji in jo silijo v drugo konformacijo, na primer iz B-DNA v A-ali Z-oblike. V ţivih celicah je večina DNA v mešanici konformacij A in B-DNA, nekaj manjših predelov je sposobno tvoriti tudi Z-DNA (12,14).
Slika 2: Različne oblike DNA vijačnice. Prirejeno po viru (15).
Linearna oblika DNA molekule se lahko prosto zvija in spreminja število navojev. Kroţna oblika DNA pa ima omejeno število navojev. Kroţne molekule dvojne vijačnice DNA so značilne predvsem za bakterije, mitohondrije, kloroplaste in številne viruse (16). Če so kroţne molekule še dodatno zvite, temu pravimo superzvitje (ang. supercoiling). To ima ključno vlogo pri shranjevanju DNA v celično jedro in pri razvijanju dvojne verige pri
7
prepisovanju in podvajanju DNA (13). Pojav opišemo z enačbo Lk = Tw + Wr. Lk oz.
linking number predstavlja število zavojev, ki jih prva veriga naredi okoli druge. Tw oz.
twist je število vseh obratov, ki jih ena od verig DNA naredi okoli osi dvojne vijačnice, Wr oz. writhing number pa opisuje število zavojev, ki jih dvojna vijačnica naredi okoli spiralne osi. Iz zgornje teorije sklepamo, da je Lk moţno spremeniti zgolj na dva načina: s spremembo zasuka dvojnega heliksa ali s kovalentno prekinitvijo polinukleotidne verige. S tem natančno definiramo vlogo topoizomeraze (13,16,17).
1.2.2. Pakiranje DNA molekule v celično jedro
Človeški dedni zapis vsebuje pribliţno tri milijarde baznih parov DNA, zapakiranih v 23 kromosomov. Večina celic v telesu (razen moških in ţenskih spolnih celic) je diploidnih, skupno to pomeni okoli šest milijard baznih parov DNA na celico. Ker je vsak osnovni par dolg pribliţno 0,34 nanometra, vsaka diploidna celica vsebuje okrog 2 metra DNA materiala. Do najbolj dramatične kondenzacije DNA pride med celično delitvijo v metafazi, ko se kromatin nadalje zapakira v visoko organizirane strukture kromosome (Slika 3) (18).
V evkariontskih celicah ima kromatin dve nalogi: spraviti dva metra dolgo DNA v nekaj mikrometrov veliko celično jedro in omogočiti dodatno kontrolo pri procesu izraţanja genov s tem, da različne dele DNA različno gosto pakira. Na ta način lahko celica natančno nadzoruje prepisovanje, podvajanje, popravljanje in rekombinacijo DNA (18).
Slika 3: Pakiranje DNA v kromosome. Prirejeno po viru (19).
8
Osnovna enota kromatina je nukleosom, ki vsebuje osem histonskih proteinov in pribliţno 146 baznih parov DNA. Nukleosom sestavlja proteinsko jedro iz osmih histonov: H2A, H2B, H3 in H4 (po dve kopiji vsakega), okrog katerega je 1,65 × ovita DNA. Dodatek enega H1 proteina zavije še dodatnih 20 baznih parov, kar ima za posledico dva polna obrata okoli oktamera, in tvori strukturo, imenovano kromatosom. DNA, ki poteka med številčnimi nukleosomi in jih med seboj povezuje, imenujemo povezovalna DNA. Vsak kromosom je torej dolga veriga nukleosomov, ki pri opazovanju z elektronskim mikroskopom daje videz nanizanih kroglic. Nukleosomi se nato zloţijo in tvorijo 30 nanometrov veliko kromatinsko vlakno, ki v nadaljnjem zvijanju tvori 300 nanometrov dolge zanke. 300 nm vlakna se stisnejo in zloţijo, da nastanejo 250 nm široka vlakna, ki so tesno navita v kromatido kromosoma (18,20).
1.2.3. Topološki izzivi pri podvajanju in prepisovanju DNA
Iz opisanega kompleksnega mehanizma pakiranja DNA v celici je razvidno, da se mora dvojno zvita veriga DNA znotraj kromosoma odviti in ponovno zviti, da lahko steče podvajanje in prepisovanje molekule DNA ter s tem prenos dedne informacije. Če se to ne zgodi, se v molekuli DNA pričenja nabirati sterična napetost, ki lahko vodi do ustavitve teh procesov (21,22).
Slika 4: Topološke spremembe, ki jih katalizirajo encimi druţine topoizomeraz. Prirejeno po viru (21).
9
Da ti procesi potekajo nemoteno, je narava razvila obseţno skupino encimov, imenovanih topoizomeraze. Tako jih imenujemo, ker lahko spreminjajo topološko stanje molekule DNA oz. število njenih zavojev (L), ne pa tudi njene kovalentne strukture. Nekaj topoloških sprememb, ki jih DNA topoizomeraze lahko katalizirajo, prikazujemo na Sliki 4 (17,21,23).